Deteção individual
de TCA:
Implementação e
validação de um
sistema para
análise de rolhas
naturais e de
champanhe
Catarina Quelhas Ribeiro
Tecnologia e Ciência Alimentar
Departamento de Química e Bioquímica
2016
Orientador
Prof. Dr. Victor Freitas, Professor Catedrático, Faculdade de
Ciências da Universidade do Porto
Coorientador
Prof. Dr. Miguel Cabral, Diretor do Departamento de
Investigação e Desenvolvimento da Amorim&Irmãos ,SA.
O Presidente do Júri,
Agradecimentos
Agradeço à direção do departamento de I&D do grupo Amorim, Prof. Dr. Miguel Cabral, meu orientador, por ter tornado possível este estágio pela disponibilidade e acompanhamento.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Victor Freitas, pela orientação e conceção deste relatório.
A todos os colaboradores do I&D que me acolheram inicialmente, apoiaram e ajudaram sempre que necessário.
Um obrigado em especial ao Carlos Costa pelos conhecimentos que me transmitiu e pelo apoio que prestou nesta etapa.
Ao Zé Pedro pela persistência e ajuda no champomi.
A todos os colaboradores do NDtech pelo auxílio, momentos de convívio e amizade.
Aos meus colegas estagiários por todos os momentos de amparo e descontração.
Aos meus pais e irmã que me deram todo o apoio necessário e ajuda ao longo destes meses.
Aos meus amigos, por todos estes anos. Pela amizade, preocupação, momentos em que nos apoiamos, desabafamos, estudamos e não desistimos. Pelos dias e noites na casa da Gaby.
Resumo
A indústria da cortiça portuguesa tentou sempre alcançar os mais altos padrões de qualidade nas suas diferentes fases e aspetos da produção, com especial ênfase para a produção de rolhas, onde o esforço de identificar e erradicar possíveis falhas tem sido a principal prioridade.
Os haloanisóis, nas suas variadas formas, são um dos principais contaminantes presentes na cortiça que, uma vez em contacto com o vinho, contribuem com um gosto de cartão molhado - o "gosto a mofo".
Este projeto foi desenvolvido do Departamento de Investigação e Desenvolvimento, I&D da Amorim &Irmãos, e teve como objetivo a otimização de um inovador sistema de deteção individual de TCA, inserido no processo industrial de produção de rolhas de cortiça natural.
Numa primeira fase, procedeu-se à otimização e validação de três máquinas - S1, S2 e S3, através do método de deteção GC-ECD, para um tempo de análise de 20 segundos e limite de deteção na ordem dos 0,5 ng.L-1, previamente
validado e comparado com o método de referencia -método de análise de TCA extraível por SPME-GC-ECD. Os resultados obtidos confirmam a eficiência e viabilidade proposta por este sistema de deteção.
Numa segunda fase procedeu-se à otimização e validação de uma máquina (uni-modelar) customizada para análise de rolhas de champanhe, seguindo os mesmos parâmetros e obtendo resultados coerentes.
Abstract
The Portuguese cork industry has always tried to achieve the highest quality standards in its different phases and aspects of production, with special emphasis on the production of stoppers, where the effort of identifying and eradicating possible flaws has been the main priority.
Haloanisoles, in its various forms, are a main contaminant present in cork that once in contact with wine contributes with a wet cardboard taste – the “musty taste”.
This project was developed in the Department of Research and Development, I&D, of Amorim&Irmãos, and aimed at the optimization of an innovative individual detection system of 2,4,6 -tricloroanisole (TCA), inserted in the industrial process of production of natural cork stoppers.
Initially, an optimization and validation of three machines - S1, S2 and S3, by GC-ECD detection method for an analysis time of 20 seconds and detection limit in the range of 0.5 ng. L-1, previously validated and compared with the
analytical method of extractable TCA by SPME-GC-ECD. The results obtained confirmed the efficiency and viability proposed by this detection system.
In a second phase the optimization and validation of a machine – E1 - (uni-modular) for the custom analysis of champagne corks, following the same parameters of merit, obtaining coherent results.
Índice
1. Introdução ... 13
1.1. Amorim & Irmãos, S. A ... 13
1.2. Objetivos do trabalho de estágio ... 13
1.3. Estrutura do relatório ... 14
2. Aspetos gerais ... 15
2.1. O que é a cortiça? ... 15
2.2. Descortiçamento do sobreiro ao fabrico da rolha ... 15
2.3. Controle de qualidade na Indústria Corticeira ... 21
2.3.1. Garantia de qualidade ... 21
3. 2,4,6-tricloroanisol ... 24
3.1. Mecanismo de formação ... 24
3.2. Contaminação e migração... 25
3.3. Estratégias de prevenção ... 26
4. Cromatografia em fase gasosa ... 28
5. Descrição técnica ... 30
5.1. Análise de TCA extraível por SPME-GC-ECD ... 30
5.2. Deteção individual em rolhas de cortiça natural por GC-ECD ... 32
5.2.1. Descrição do equipamento ... 32
5.2.1.1. Sistema de análise para rolhas naturais ... 32
5.2.1.2. Sistema de análise para rolhas de champanhe ... 37
5.2.2. Modo operatório do equipamento ... 38
5.2.2.1. Princípio Cromatográfico ... 39
5.2.2.1.1. Modo manual ... 39
5.2.2.1.2. Modo automático ... 40
5.2.2.2. Modo operatório pós análise ... 43
5.2.3. Procedimento de validação ... 44
5.2.3.1. Procedimento de validação dos módulos de análise individual para rolhas naturais……… ………44
5.2.3.2. Procedimento de validação do protótipo experimental de análise individual, E1, para rolhas de champanhe ... 45
6. Resultados e discussão ... 46
6.1. Otimização do método cromatográfico ... 46
6.1.1. Temperatura das colunas cromatográficas ... 46
6.1.2. Temperatura do injetor ... 47
6.1.4. Fluxos de gás de arraste das colunas cromatográficas ... 47
6.1.5. Fluxo de gás de arraste ... 48
6.1.6. Fluxo do gás auxiliar – Make up ... 48
6.1.7. Corrente elétrica ECD ... 48
6.1.8. Sensibilidade ... 49
6.1.9. Heartcut ... 49
6.1.10. Otimização dos módulos de análise individual para rolhas naturais ... 50
6.1.11. Otimização do E1 ... 53
6.1.11.1. Parâmetros analíticos... 53
6.1.11.2. Câmaras de incubação ... 54
6.1.11.3. Pré-incubador ... 56
6.2. Validação dos módulos no equipamento para rolhas naturais ... 56
6.3. Validação do E1 ... 58
7. Conclusões ... 60
7.1. Trabalho futuro ... 61
8. Referências bibliográficas ... 62
Índice de figuras
Figura 1 - Etapa "Abrir" ... 16
Figura 2 - Etapa "Separar" ... 16
Figura 3 - Pranchas de cortiça empilhadas ... 17
Figura 4 - Processo de cozedura ... 18
Figura 5 - Marcação das rolhas ... 19
Figura 6 - Mecanismo de formação do TCA [5] ... 24
Figura 7 - Detetor de captura eletrónica, ECD ... 29
Figura 8 - Maceração individual de rolhas naturais ... 30
Figura 9 - Corte dos discos de rolhas de champanhe ... 31
Figura 10 - Maceração individual de discos de rolhas de champanhe ... 31
Figura 11 – Sistema de análise S1 com os módulos (1-6) e respetivos pré-incubadores (a-f) ... 33
Figura 12 - Pré-incubador ... 33
Figura 13 - Sistema de funcionamento de um pré-incubador ... 34
Figura 14 - Módulo; 1 - robô, 2 - câmaras de incubação ... 34
Figura 15 - Interior de um módulo; A - interior de um forno, B - sistema de controlo de fluxo das câmaras, C - computador ... 35
Figura 16 – 1-válvula de rotação STF (stream valve), 2-motor da válvula, 3-transfer-line ... 35
Figura 17 - Interior do forno cromatográfico: A - válvula de diafragma, B - loop, C - pré-coluna, D - válvula STF, E - colunas analíticas, F - colunas de "lixo", G - válvula SC, H - linha para o detetor ... 36
Figura 18 - Protótipo experimental E1 ... 37
Figura 19 - Câmaras de incubação do E1 ... 37
Figura 20 - Sistema de alimentação exterior com elevador e centrífugo ... 38
Figura 21 - Sistema de alimentação a colocar uma rolha num pré-incubador ... 38
Figura 22 - Inserção de rolha pelo robô numa câmara ... 39
Figura 23 - Remoção de uma rolha pelo robô de uma câmara ... 39
Figura 24 - Cromatograma da análise de uma rolha, pico de TCA com tempo de retenção aos 45 segundos ... 40
Figura 25 - Processo de funcionamento de uma válvula de diafragma ... 41
Figura 26 - Representação do princípio cromatográfico ... 42
Figura 27 - Representação esquemática do processo analítico sucessivo do sistema de deteção individual ... 43
Figura 28 - Robô do módulo a transportar uma rolha para o tapete rolante após a análise
... 44
Figura 29 - Cestos no exterior da alimentação ... 44
Figura 30 - Influência da temperatura das colunas cromatográficas na definição e tempo de retenção do pico de TCA ... 46
Figura 31 - Influência da temperatura do detetor na definição do pico de TCA ... 47
Figura 32 - Cromatogramas representativos da influência do make-up na definição dos picos ... 48
Figura 33 - Cromatogramas representativos da influência da corrente ECD no pico de TCA ... 49
Figura 34 - Cromatogramas representativos da influência do heartcut na resolução do pico ... 50
Figura 35 - Controlos do software AmorimCleanCork ... 51
Figura 36 - Software AmorimCleanCork... 51
Figura 37 - Cromatograma representativo de uma injeção ineficaz de amostra ... 54
Figura 38 - Cromatograma representativo de uma injeção eficaz de amostra ... 55
Figura 39 - Rolhas incorretamente posicionadas ... 55
Figura 40 - Pré-incubador desalinhado ... 56
Figura 41 - Representação gráfica da validação de um módulo ... 57
Figura 42 - Representação gráfica dos resultados inferiores a 10 mV.s obtidos em modo manual ... 58
Figura 43 - Representação gráfica dos valores obtidos inferiores a 10 mV.s em modo automático ... 59
Índice de tabelas
Tabela 1 - Tipos de rolhas fabricadas na Amorim&Irmãos, S.A. e respetiva descrição. ... 20 Tabela 2 - Estrutura química de alguns haloanisóis e respetivo limite de perceção sensorial ... 23 Tabela 3 - Parâmetros experimentais de otimização analítica do módulo P1 ... 52 Tabela 4 - Parâmetros experimentais de otimização analítica do módulo E1 ... 53 Tabela 5 – Imagens e características das válvulas utilizadas nos módulos de deteção individual ... 65 Tabela 6 - Resultados obtidos na validação do módulo P1 ... 68 Tabela 7 - Resultados obtidos na validação do protótipo experimental E1, em modo manual ... 69 Tabela 8 - Resultados obtidos na validação do protótipo experimental E1, em modo automático ... 72
Abreviaturas
Letras Gregas:
β Beta (emissões beta)
Siglas
:APCOR Associação Portuguesa da Cortiça CIPR Código Internacional das Práticas Rolheiras
ECD Electronic Capture Detection / Deteção por Captura Eletrónica GC Gas Chromatography / Cromatografia Gasosa
I&D Investigação e Desenvolvimento LD Limite de deteção
ND Não detetável
PDMS Dimetilpolissiloxano
ROSA Rate of Optimal Steam Aplication
SPME Solid Phase Micro Extraction / Microextração em Fase Sólida TCA 2,4,6-tricloroanisol
1. Introdução
1.1.
Amorim & Irmãos, S. A
A Amorim & Irmãos S.A. integra a Corticeira Amorim SGPS, a maior empresa transformadora de produtos de cortiça do mundo, gerando um volume de negócios superior a 392 milhões de euros em 103 países. A sua atividade foi iniciada no ano de 1870, no entanto, a Amorim & Irmãos, S.A. foi formalmente fundada em 1922, sendo considerada como a maior empresa produtora de rolhas de cortiça em todo o mundo. Com uma produção na ordem das 4,2 mil milhões de rolhas, as suas operações estendem-se por todo o mundo, sendo asseguradas por oito unidades industriais em Portugal, duas em Espanha e 18 empresas de comercialização de rolhas no exterior, localizados nos mais importantes países produtores de vinho e que são responsáveis pela distribuição dos produtos à escala mundial.
Em 1999 foi fundado o departamento de Investigação & Desenvolvimento da Amorim & Irmãos, S.A. tendo como foco a melhoria qualitativa. São aprofundados conhecimentos que potenciam a otimização de processos e de tecnologias, bem como, a conceção de novos produtos. O objetivo é alcançar a excelência na qualidade e variedade de soluções que a empresa disponibiliza no mercado. A área de investigação ligada à cortiça contribuiu assim, para o melhoramento e alargamento da aplicação da cortiça. Deste modo, ao longo dos anos, surgiram novas patentes relacionadas com processos e produtos.
1.2.
Objetivos do trabalho de estágio
Os objetivos deste estágio consistiram na implementação, desenvolvimento do método cromatográfico e validação do NDtech, equipamento que analisa rolhas de forma individual detetando TCA a valores de 0,5ng/L.
Na etapa da implementação, o objetivo passava por instalar e programar cada um dos cromatógrafos assim como a montagem de todos os componentes mecânicos a eles associados. Finda esta etapa, iniciou-se o desenvolvimento dos métodos cromatográficos, no qual foram otimizados todos os parâmetros cromatográficos, de maneira a garantir a deteção de TCA naquele nível de
quantificação. Finalmente, procedeu-se à validação de cada um dos cromatógrafos.
Paralelamente, procedeu-se de igual forma na implementação do módulo experimental E1, cujo objetivo é a deteção de TCA, nos mesmos níveis de quantificação, em rolhas de champanhe.
1.3.
Estrutura do relatório
O presente relatório encontra-se dividido em seis principais capítulos.
No primeiro capítulo, que agora termina, encontra-se uma introdução ao trabalho realizado familiarizando o leitor com a empresa onde o estágio foi realizado, bem como, os objetivos do trabalho de estágio.
Num segundo capítulo, é apresentado a matéria-prima, a cortiça, bem como, todo o processo de fabrico de rolhas e processos de controle de qualidade aplicados no seu fabrico.
No terceiro capítulo, apresenta-se a molécula de TCA. É descrito o mecanismo de formação, processo de contaminação e sua migração e as estratégias de prevenção aplicadas para combater este composto nas rolhas.
No quarto capítulo, encontram-se aspetos teóricos relativos à cromatografia em fase gasosa.
No quinto capítulo, há a descrição técnica do trabalho. A descrição e modo operatório do equipamento utilizado estão aqui detalhados, bem como, os procedimentos de validação utilizados.
No sexto capítulo, encontra-se a parte experimental e representação dos resultados.
Finaliza com conclusão, trabalho futuro a desenvolver no projeto, bibliografia e anexos.
2. Aspetos gerais
2.1.
O que é a cortiça?
A cortiça é a “casca” do sobreiro, Quercus suber L., árvore que cresce essencialmente nas regiões mediterrâneas. Em Portugal existem 716 mil hectares desta árvore que vive em média 150 a 200 anos e que envolve uma importante industria e valor económico significativo. O seu valor e importância estão relacionados com a cortiça da sua casca que tem propriedades únicas:
Muito leve;
Impermeável a líquidos e gases;
Elástica e compressível;
Isolante térmico e acústico;
Combustão lenta;
Muito resistente ao atrito.
Para além destas características, é um material 100% natural, reciclável e renovável. [1]
2.2.
Descortiçamento do sobreiro ao fabrico da rolha
Todo o processo do fabrico de rolhas de cortiça inicia-se com o descortiçamento. Um sobreiro apto a ser descortiçado tem de ter um mínimo de 25 anos e um tronco com 70 cm de perímetro a 1,5 m do chão. A partir do momento em que a árvore é considerada apta, pode ser iniciado o seu descortiçamento que irá decorrer entre meados de Maio até Agosto. A partir deste momento a sua exploração durará em média 150 anos. Em toda a sua vida um sobreiro será alvo de 15 a 16 descortiçamentos uma vez que a técnica apenas é efetuada de nove em nove anos, período no qual a cortiça cresce e matura. Num primeiro descortiçamento, desbóia, obtém-se a chamada cortiça virgem que é bastante irregular e rígida. Estas características tornam-na imprópria para o fabrico de rolhas, pelo que é designada para produção de pavimentos e isolamentos. Nove anos depois faz-se o segundo descortiçamento, cortiça secundeira, menos rígida, mas ainda imprópria para o fabrico de rolhas, fruto da sua irregularidade. Só no terceiro ano de
descortiçamento e seguintes se obtém uma cortiça que apresenta características favoráveis ao fabrico de rolhas. Deste ano em diante toda a cortiça produzida é própria para a produção de rolhas. [1]
O processo de descortiçamento é ancestral e apenas deve ser realizado por pessoas adequadas e especialistas, os descortiçadores, de modo a não maltratar a árvore. São efetuadas cinco etapas:
Numa primeira etapa, (figura 1) é feito um golpe no sentido vertical, escolhendo a ranhura da casca mais profunda, torcendo o gume do machado para separar a prancha do entrecasco. [1]
Figura 1 - Etapa "Abrir"
Na segunda etapa (figura 2), separa-se a prancha introduzindo o gume do machado entre a barriga da prancha e o entrecasco. Executa-se um movimento de torção do machado entre o tronco e a cortiça e a mesma separa-se da árvore. [1]
Figura 2 - Etapa "Separar"
Na terceira etapa, delimita-se o tamanho da prancha com um corte horizontal na cortiça a sair. [1]
Na quarta etapa, retira-se cuidadosamente a prancha da árvore sem a partir. Quanto maior o seu tamanho maior será o seu valor comercial. A habilidade dos descortiçadores permite a obtenção de pranchas por inteiro. [1]
Na quinta e última etapa, após a extração das pranchas, permanecem na base do tronco alguns fragmentos de cortiça. Estes, por estarem mais próximas do solo, apresentam maior quantidade de microrganismos. Para retirar possíveis parasitas que existam nos calços do sobreiro o descortiçador dá algumas pancadas com o machado. [1]
Por fim, a árvore é marcada com o último algarismo do ano do descortiçamento. Depois do descortiçamento as pranchas de cortiça são empilhadas ou na floresta ou em estaleiros dentro das instalações da fábrica por um período de tempo nunca inferior a seis meses (figura 3). Todas as pilhas são formadas tendo em conta regras restritas definidas pelo CIPR e empilhadas sobre materiais que não contaminem a cortiça. Por exemplo, a madeira é expressamente proibida por poder transmitir fungos. Ao longo deste tempo, chamado período de repouso, dá-se a maturação e estabilização da matéria-prima. [1]
Figura 3 - Pranchas de cortiça empilhadas
Após este processo manual de descortiçamento, a cortiça é submetida ao processo industrial. Este processo engloba uma série de etapas feitas em fábrica até obtenção das rolhas de cortiça.
Processo industrial
Este processo inicia-se com a cozedura das pranchas (figura 4), que são submersas em água limpa a ferver durante pelo menos uma hora, tendo como objetivo:
Higienização da cortiça;
Extração de substâncias hidrossolúveis;
Aumento de espessura;
Torná-la mais macia e elástica
Este processo melhora a estrutura interna da cortiça e contribui para uma redução da microflora. [1]
Figura 4 - Processo de cozedura
Segue-se a estabilização, fase do processo em que aproveitando o facto de as pranchas estarem mais macias pela cozedura, são aplanadas durante um período de tempo que vai de duas a três semanas, permitindo obter a forma necessária para a transformação em rolhas. [1]
De seguida efetua-se a escolha da cortiça nos calibres adequados, conforme a altura e características. Posteriormente é feito o corte em tiras na medida adequada ao tamanho das rolhas que se querem obter. [1]
Depois efetua-se a brocagem, que pode ser manual ou semiautomática, com a perfuração das tiras de cortiça, que asseguram assim rolhas em conformidade com os limites dimensionais desejados. Todos os desperdícios feitos nesta etapa são aproveitados para granulado de cortiça. [1]
A regularização da superfície da rolha e obtenção das dimensões finais previamente especificadas é feita na retificação. [1]
Posteriormente, na seleção ou escolha, são retiradas todas as rolhas com defeito. As que se encontram em boas condições são separadas em classes: Flor, Extra, Superior, Primeiro, Segundo, Terceiro, Quarto, Quinto e Sexto, atendendo às suas características. As rolhas que passaram na seleção são submetidas à lavação, efetuada com peroxido de hidrogénio ou ácido paracético que permite limpar, homogeneizar, desinfetar e reduzir a quantidade de pó das rolhas. Nesta etapa, é necessário fazer uma correção de pH que é feita com hidróxido de sódio. Após este tratamento são estabilizados os níveis de humidade que se pretende ter nas rolhas. [2]
As rolhas de cortiça natural que apresentam poros são submetidas à
colmatagem com uma mistura feita à base de cola e de pó de cortiça,
proveniente do acabamento das rolhas. Assim, homogeneízam-se as rolhas, melhorando a sua apresentação e qualidade de vedação. [2]
Por fim, segue-se a marcação (figura 5) que pode ser feita com impressão a tinta (de qualidade alimentar), marcação a fogo ou lazer, de acordo com as indicações do cliente. Posteriormente, a superfície da rolha é tratada com parafina ou silicone de modo a permitir a sua introdução na garrafa e posterior extração pelo consumidor. [1]
Nesta fase as rolhas estão prontas a ser transportadas para o cliente. São embaladas em sacos de plástico cheios com SO2 (anidro sulfuroso), gás inibidor de desenvolvimento microbiológico e então transportadas até ao engarrafador. [1]
Na tabela 1 encontram-se descritos os vários tipos de rolhas que são fabricadas na Amorim & Irmãos S.A. [3]
Tabela 1 - Tipos de rolhas fabricadas na Amorim&Irmãos, S.A. e respetiva descrição[3]
Designação Exemplo Descrição
Rolha Natural
Esta rolha é extraída de um único corte na placa de cortiça. Assegura a vedação ideal e é ideal para vinhos que necessitem estagiar em garrafa, permitindo a correta evolução do vinho e maturação perfeita.
Rolha Natural Colmatada Acquamark®
Rolha natural com maior número de orifícios. Estes são preenchidos por uma mistura de uma cola de base aquosa e pó de cortiça. As
lenticelas são então preenchidas, aumentando a capacidade de vedação e homogeneidade visual.
Rolha Aglomerada
É constituída por um corpo aglomerado de cortiça e produtos aglomerantes. Tem uma boa performance e é aconselhada para vinhos de consumo rápido.
Rolha técnica Twin Top®
É constituída por um corpo aglomerado e um disco em cada topo da rolha. Responde com eficácia às exigências mais elevadas. É ideal para vinhos frutados destinados a um período curto de estágio em garrafa.
Helix®
Constituída por microaglomerado, é uma rolha que combina o seu design com uma garrafa de vidro com rosca no interior. Desta forma mantém-se a clássica rolha de cortiça sem necessidade de saca-rolhas.
Rolha de Champanhe
Spark®
Composta por um corpo aglomerado e dois discos de cortiça natural na extremidade que entra em contacto com o vinho. Concebidas para vedar champanhe e espumantes.
Apresenta elevada performance física, química e enológica.
Rolhas Capsuladas
– Top Series®
Rolha de cortiça natural, cujo topo contém uma capsula que pode ser de plástico, porcelana, metal, entre outros materiais. Destinada a vinhos licorosos e cujo conteúdo não é consumido num curto espaço de tempo.
Todos os produtos Amorim & Irmãos, S.A. respeitam a regulamentação e legislação existente (Europeia e FDA – Food and Drug Administration) para produtos em contacto com géneros alimentícios.
2.3.
Controle de qualidade na Indústria Corticeira
2.3.1. Garantia de qualidade
A indústria portuguesa da cortiça tem procurado atingir o maior nível de qualidade nas suas diferentes fases e vertentes produtivas focando o seu esforço na identificação e erradicação de possíveis falhas. [4]
A garantia de qualidade na fabricação de rolhas de cortiça tem como principais objetivos:
obter uma funcionalidade adequada da rolha de cortiça como vedante;
a inocuidade da rolha de cortiça;
a eficiência dos processos produtivos.
De modo a categorizar o nível de qualidade verificado na produção de rolhas de cortiça foi criada uma escala de nove classes dependendo da matéria-prima utilizada e dos processos produtivos adotados pelo fabricante. [4]
Devido à emergente necessidade de rigor e qualidade na indústria corticeira, entre 1992 e 1996 foi encomendado, pela Confederação Europeia da Cortiça (CELiège), um estudo sobre as fases da produção de rolhas de cortiça – do descortiçamento à armazenagem – com o objetivo de avaliar cientificamente a possibilidade de a cortiça ser responsável por alterações organoléticas nos vinhos - Projeto Quercus. [4]
Na sequência dos resultados do Projeto Quercus, foi editado, promovido e implementado o Código Internacional das Práticas Rolheiras (CIPR). Este código descreve e estabelece os procedimentos a serem observados pela indústria de cortiça e foi criado com o intuito de implementar normas de controlo de qualidade ao longo de todo o processo produtivo, garantindo aos produtores e engarrafadores de vinho um produto livre de contaminações e com controlo absoluto de qualidade. Associado ao CIPR, foi criado o sistema de acreditação SYSTECODE. As empresas que se candidatam à certificação são auditadas pelo Bureau Veritas, organismo independente a quem compete determinar se
a empresa cumpre os requisitos estabelecidos. Esta certificação constitui para os clientes uma garantia da qualidade do produto fornecido. [4]
As rolhas de cortiça são submetidas a vários testes para o seu controlo de qualidade. Entre estes testes, destacam-se:
Análise visual;
Determinação do teor de humidade;
Dimensões (comprimento, diâmetro);
Controlo de oxidante residual;
Análise microbiológica;
Capilaridade;
Capacidade de vedação;
Elasticidade/Recuperação dimensional;
Força de extração das rolhas de cortiça;
Análise sensorial [4]
Estando as rolhas de cortiça em contacto com o vinho, e sendo este um produto que é, não só bebido, mas também cheirado, a questão organolética adquire uma importância considerável. É neste contexto que a análise sensorial das rolhas de cortiça é realizada. Na cortiça poderão ser encontrados haloanisóis que transferem um sabor a bolor ou mofo ao vinho. Os haloanisóis mais encontrados no vinho são apresentados na tabela 2. Destes, o TCA, é sem dúvida aquele que mais importância tem pela sua frequente presença em rolhas de cortiça e por ser capaz de, em ínfimas quantidades da ordem dos ng/L, afetar organoleticamente o vinho.
Tabela 2 - Estrutura química de alguns haloanisóis e respetivo limite de perceção sensorial[5]
Composto Estrutura
química
Limite de perceção sensorial
2,4,6-Tricloroanisol (TCA) Em água: 30 – 300 pg/L Em solução alcoólica: 1,5 – 3 ng/L 2,4,6-Tribromoanisol (TBA) Em água: 8 - 30 pg/L Em solução alcoólica: 3 ng/L 2,3,4,6-Tetracloroanisol (TeCA) Em água: 4 pg/L Em solução alcoólica: 15 ng/L
Pentacloroanisol (PCA) Em solução alcoólica: 10000
3. 2,4,6-tricloroanisol
3.1.
Mecanismo de formação
Os haloanisóis são os compostos responsáveis por desvios sensoriais nos vinhos. A formação dos haloanisóis dá-se devido a um mecanismo de defesa de alguns microorganismos quando expostos a ambientes poluídos por halofenóis. Os clorofenóis, foram durante décadas, utilizados em sistemas agroflorestais como inseticidas e biocidas. Durante bastante tempo era incerta a forma como os haloanisóis se formavam na cortiça. Atualmente, foi comprovado que a origem dos haloanisóis estará na biometilação dos clorofenóis.(Figura 6) [5]
Os halofenóis podem ser gerados por diferentes vias:
i) compostos resultantes da degradação da lenhina e de açúcares reagem com átomos de cloro e bromo presentes na natureza; a biodegradação de compostos organo-clorados provenientes do tratamento da madeira;
ii) uso indevido de preservantes e desinfectantes industriais com clorofenóis ou bromofenóis na sua constituição. [5]
A única via, cientificamente comprovada, de formação de cloroanisois a partir de clorofenóis, dá-se através de reações de biometilação, realizadas maioritariamente por fungos filamentosos (Streptomyces spp., Trichoderma
spp., Penicillium spp., Cephalouscus spp, etc), que proliferam em materiais
como a madeira. Para estes organismos, os cloroanisóis, são o produto de um mecanismo de defesa contra os clorofenóis. A reação é catalizada pela enzima clorofenol O-metiltransferase, que promove a conversão entre a forma fenólica e a forma anisólica. [5] [6]
Os clorofenóis, devido ao facto de possuírem toxicidade para com animais e plantas, têm sido utilizados intensivamente, nas últimas décadas, como pesticidas e fungicidas, tornando-se num dos grupos mais importantes de contaminantes na biosfera. Atualmente, a sua utilização está proibida pela UE, uma vez que são considerados compostos com alguma toxicidade para a saúde humana. [7]
3.2.
Contaminação e migração
A presença de TCA nas rolhas de cortiça é uma importante causa de desvios organoléticos em vinhos. Estudos demonstram que cerca de 80% das rolhas com alteração organolética continham TCA. [8] Como tal, geralmente a rolha de
cortiça está associada à contaminação do vinho com este composto.
A contaminação das rolhas de cortiça pode ser de origem intrínseca, no caso de a cortiça ter sido contaminada durante o processo de crescimento da árvore, ou extrínseca, tendo origem da adsorção de TCA do meio. Hoje sabe-se que a contaminação pode advir de diversas fontes extrínsecas. Plásticos, cartão, papel, borracha, entre outros materiais são também fontes prováveis de contaminação por TCA. [9] Tanto o vinho como a cortiça, ao entrarem em
contacto com fontes infetadas são alvos de adsorção de TCA. [10] Mesmo
quando a cortiça não se encontra em contacto físico direto com uma fonte contaminada, mas está em contacto com uma atmosfera contaminada, tem a
capacidade de adsorver TCA e posteriormente contaminar o vinho.[11] Nestes
casos verifica-se que a cortiça funciona como um transmissor da contaminação, mas a origem não está na mesma.
No entanto, a presença de TCA, advém, maioritariamente de origem intrínseca. Isto sugere que o 2,4,6-triclorofenol, percursor da formação de TCA, encontra-se no montado. A utilização de pesticidas e inencontra-seticidas com este composto proliferaram a sua presença. Nos anos 80 estas práticas foram abandonadas. No entanto, os seus efeitos nefastos são sentidos até aos dias de hoje. [12]
O TCA é um composto quimicamente estável que não se degrada facilmente ao longo do tempo, mesmo em concentrações muito baixas. É muito volátil e pode facilmente migrar. [5]
Um aspeto de extrema importância é a localização do TCA na rolha. Estudos demonstram que apenas quando uma superfície contaminada de cortiça entra em contacto direto com o vinho ou com a atmosfera gasosa localizada entre a rolha e o vinho é passível de haver transferência TCA. [13] Ou seja, mesmo no
caso de uma rolha estar contaminada com TCA numa extremidade, se essa extremidade não entrar em contacto com o vinho ou headspace não há transferência de TCA para o vinho.
3.3.
Estratégias de prevenção
As rolhas de cortiça são, há muito, consideradas a maior fonte de contaminação de vinhos por TCA, o que induziu na indústria uma forte necessidade em desenvolver mecanismo de combate deste contaminante, através da implementação de novos processos e tecnologias. Foi criado o Código Internacional das Práticas Rolheiras, CIPR, concebido por empresas da indústria corticeira, de modo a prevenir a formação de TCA. Os processos foram revistos e o regulamento surgiu. As regras são inúmeras e passam desde o rastreio da matéria-prima, controlo de todos os passos do processo industrial, armazenamento, embalagem e transporte.
Na A&I a luta contra o TCA engloba um largo espectro de medidas e normas. Para além disso, a A&I apostou no departamento de I&D de modo a inovar e criar métodos de eliminação do TCA. Ao longo dos anos, a investigação, alcançou assim, métodos eficazes, muitos deles patenteados.
Em 1998 foi criado o INOS II®, com a patente EP1108507. Este método é relativo a discos de cortiça e envolve uma lavação hidrodinâmica, na qual, água
a 70˚C é bombeada seguindo-se ciclos de pressurização e despressurização. Assim, as lenticelas da cortiça contraem e expandem, permitindo que a água entre na estrutura e ocorra uma limpeza. A eficiência de remoção de TCA com este método é de 40%.
Em 2004 surgiu o ROSA®, com a patente DE60306404 T, é um método com aplicação em grânulos de cortiça, através de destilação por uma corrente de vapor controlada. Deste modo, o vapor possibilita a extração de compostos voláteis. A eficácia deste método é de 80%.[14]
Em 2007 foi concebido o ROSA® Evolution, com a patente PT103910 B. É um método semelhante ao ROSA® mas com aplicação a discos e rolhas de cortiça natural. Por isso, foram também otimizados a temperatura e humidade de modo a não prejudicar as qualidades físico-mecânicas das rolhas naturais. A eficiência do método é entre 77% a 82%.
Ao longo do processo produtivo, as rolhas de cortiça são controladas para a presença de TCA através de um método de análise em maceração composta de acordo com a norma ISO 20752. [15] Este método baseia-se na quantificação
do TCA extraível, após a dessorção do TCA das rolhas para solução hidroalcoólica ao fim de 24h, no qual se dá o equilíbrio. É então feita a micoextração em fase sólida (SPME), seguida de análise por GC-ECD.
Os valores individuais de TCA obtidos em cada amostra, bem como os valores médios do lote são indicadores importantes para a aceitação ou rejeição dos lotes.
Assim, a A&I controla de forma muito apertada a presença de TCA nas rolhas que produz.
4. Cromatografia em fase gasosa
Este é uma técnica de análise instrumental, na qual há uma separação cromatográfica em fase gasosa. A amostra liquida ou gasosa, com os solutos é injetada e vaporizada sendo arrastada pelo gás de transporte ao longo da coluna. Cada diferente componente da amostra é transportado a uma velocidade própria formando-se assim uma banda correspondente a cada elemento. O tempo de retenção de cada pico identifica cada componente da mistura. [16] Trata-se de um método que, para além de permitir acoplar
diferentes tipos de detetores, consegue a análise de misturas complexas com elevada rapidez, resolução e sensibilidade. [17]
Nesta técnica, as amostras volatilizadas, são transportadas por um gás ao longo da coluna cromatográfica. Cada substância presente na mistura, interage de forma diferente tanto com o gás de arraste como com a fase estacionária. Estas diferentes interações físico-químicas são a base dos métodos de separação, pois permitem que diferentes componentes de uma mistura sejam retidos na coluna em tempos diferentes, possibilitando a sua distinção.
Basicamente, o cromatógrafo de gás é constituído por quatro elementos:
A fonte do gás de arraste, num cilindro a alta pressão, munido de reguladores de pressão e de fluxómetros
O sistema de injeção da amostra
A coluna de separação
O detetor
O gás de arraste a usar deve ser quimicamente inerte e de elevada pureza. Apesar do gás não interferir diretamente com o soluto pode ter influência na separação e na resposta do detetor. Os gases mais utilizados são o hidrogénio (H2), hélio (He), azoto (N2) e árgon (Ar). [16] [17]
No sistema de injeção da amostra, para conseguir a maior eficiência da coluna, a amostra deve ser de volume adequado. A injeção lenta ou de elevado volume de amostra causa alargamento do pico e resolução pobre. A amostra é injetada automaticamente no injetor aquecido, sempre a temperaturas superiores ao ponto de ebulição do componente menos volátil. [16] [17]
As colunas de separação podem ser de tamanho variado e possuir diferentes fases estacionárias. Deve-se, portanto, ao usar uma coluna, ter em conta as suas características e em que tipo de compostos apresentará os melhores resultados. Deve-se também ter em conta que a polaridade da coluna deve ser semelhante à dos compostos a separar de modo a se obter uma análise eficiente. [16] Neste trabalho foram utilizadas as colunas MTX-1 e MTX-5 cujas
características se encontram descriminadas no anexo 1.
Figura 7 - Detetor de captura eletrónica, ECD
Na figura 7 está representado um detetor. Este tipo de detetor contem um emissor de partículas β que, aquando da passagem da fase móvel, a ioniza, através de uma corrente entre um par de elétrodos. Quando uma molécula com alta afinidade para capturar eletrões sai da coluna, a corrente diminui. Esta alteração na corrente é medida através do sinal elétrico do detetor e é proporcional à quantidade de eletrões capturados. Desta forma, a partir do cálculo da área do pico formado, é possível quantificar a quantidade de moléculas que atingiram o detetor. [17]
Um detetor ECD é altamente seletivo relativamente a solutos com grupos funcionais eletronegativos halogenados. Por outro lado, é relativamente insensível para aminas, álcoois e hidrocarbonetos. Como tal, este tipo de detetor é uma escolha apropriada para a deteção de TCA. [17]
5. Descrição técnica
Diariamente, nas diferentes UI da Amorim & Irmãos são produzidos lotes de rolhas para os mais variados clientes em todo o mundo. Estes lotes são submetidos a rigorosos testes de controlo de qualidade, nomeadamente testes físicos e químicos.
Relativamente à problemática do TCA, a empresa faz hoje diferentes tipos de análise de TCA consoante a exigência do cliente e o respetivo valor económico das rolhas em causa.
Alguns destes tipos de análise fizeram parte do trabalho realizado neste estágio, pelo que serão descritos mais detalhadamente:
i) Os métodos de análise de deteção de TCA por SPME-GC-ECD utilizado diariamente pelo I&D;
ii) Os sistemas de deteção individual de TCA S1, S2, S3, para rolhas naturais; iii) O módulo experimental de deteção individual de TCA para rolhas de
champanhe, E1.
5.1.
Análise de TCA extraível por SPME-GC-ECD
Foram utilizadas rolhas de cortiça natural na validação dos sistemas de deteção individual S1, S2 e S3 e rolhas de champanhe na validação do módulo experimental E1. Estas foram analisadas pelo método SPME-GC-ECD, utilizado diariamente no departamento de I&D.
A preparação das amostras é feita por maceração em frascos de 60 mL com solução hidroalcoólica a 12% (v/v).
As rolhas naturais são totalmente submersas na solução até se perfazer o volume do frasco (figura 8).
Nas rolhas de champanhe é necessário que estas sejam cortadas (figura 9), de modo a apenas se macerar os dois discos relativos à porção da rolha que é incubada e analisada nas câmaras do módulo. Os dois discos são cortados da rolha e então macerados em 50 mL de solução hidroalcoólica (figura 10).
Figura 9 - Corte dos discos de rolhas de champanhe
Figura 10 - Maceração individual de discos de rolhas de champanhe
A maceração decorre durante 24h, de modo a permitir a extração do TCA da superfície da rolha para a solução.
Ao fim deste tempo, retiram-se as rolhas dos frascos e pipetam-se 10 mL da solução para tubos de 20 mL. Estes contêm 3 g de NaCl para favorecer a volatilização do TCA para o headspace. São adicionados 100 µL de padrão interno 2,3,6-tricloroanisol com concentração 20 ng/L. As amostras são seguidamente analisadas por SPME-GC-ECD (anexo 3).
5.2.
Deteção individual em rolhas de cortiça natural por
GC-ECD
O método de deteção de TCA extraível por maceração de rolhas, embora tenha em muito ajudado a indústria a melhorar a sua performance no que diz respeito à contaminação de TCA nos lotes de rolhas, já não é suficiente para as exigências atuais do mercado, principalmente aquele associado aos vinhos de maior qualidade.
Assim, aquele método permite uma avaliação geral do lote de rolhas de cortiça, através de um conjunto pequeno de amostras, que levam à obtenção dum valor médio de TCA do lote. Este, porém, dada a heterogeneidade de contaminação que é conhecida em rolhas naturais, a maior parte das vezes não representa a realidade da contaminação individual de cada uma. É neste contexto que surge o NDtech.
O NDtech, é um equipamento construído de raiz, com vista à análise cromatográfica de cada rolha, para a deteção de TCA.
Cada rolha é incubada de forma a volatilizar TCA, sendo este posteriormente encaminhado para o forno cromatográfico onde se dá a separação dos compostos, dando origem a um cromatograma onde se identificará o pico de TCA presente. Uma rolha positiva será então encaminhada para tapetes de rolhas positivas. As rolhas negativas são separadas das anteriores para tapetes diferentes.
Desta forma a empresa, através do NDTech, é capaz de garantir rolhas livres de TCA, o que é significativamente valorizado pelos clientes e em particular os produtores de vinhos de maior qualidade.
5.2.1. Descrição do equipamento
5.2.1.1.
Sistema de análise para rolhas naturais
NDtech, é um equipamento concebido para a deteção individual de TCA rolha a rolha, o qual é composto por módulos individuais que beneficiam da mesma alimentação e saída de rolhas. Cada linha de alimentação e respetiva saída de rolhas está anexa a 6 módulos de análise. Estes são compostos por um pré-incubador respetivo e um módulo de análise propriamente dito. Na figura 11,
está representada uma linha de NDtech, onde é possível ver a alimentação com tapetes de entrada e saída de rolhas, os pré-incubadores e os respetivos módulos de análise.
Figura 11 – Sistema de análise S1 com os módulos (1-6) e respetivos pré-incubadores (a-f)
A alimentação permite que as rolhas fiquem disponíveis em linha, de forma a ser possível que um robô da alimentação pegue em cada rolha e a coloque no pré-incubador.
Cada pré-incubador (figuras 12 e 13) é composto por um carrossel de 16 câmaras, o qual é usado para o pré-aquecimento em simultâneo de 15 rolhas. A 16ª câmara está vazia durante um ciclo de análise de modo a permitir a limpeza.
Figura 13 - Sistema de funcionamento de um pré-incubador
O módulo de análise está equipado com um robô que permite a movimentação das rolhas para dentro e para fora das câmaras de análise (figura 14). Tem 8 câmaras de análise, um forno e um detetor cromatográfico de ECD. Tem também controladores de fluxo do gás que é injetado nas câmaras de incubação e um computador que controla o software do sistema (figura 15).
Figura 15 - Interior de um módulo; A - interior de um forno, B - sistema de controlo de fluxo das câmaras, C - computador
As câmaras de análise estão horizontalmente dispostas e têm 60×28 mm de dimensão, o que permite a incubação de todos os calibres de rolhas comercializadas pela A&I. Estas câmaras têm um permanente fluxo de azoto, controlado pelos controladores de fluxo, um sistema pneumático na abertura e fecho, sendo vedadas com um vedante de teflon que tem no seu interior uma mola. O vedante vai permitir que não haja qualquer tipo de fuga de amostra para o exterior.
As oito câmaras estão ligadas a uma válvula de rotação STF (stream valve), (ver características no anexo 2) cuja função é selecionar a câmara que vai enviar a amostra para o forno, através da transfer-line (figura 16).
O forno cromatográfico está termicamente isolado e possui uma ventoinha no interior de modo a dispersar uniformemente o calor.
No forno (figura 17), encontra-se também uma válvula de diafragma, que comanda a entrada da amostra no loop e a sua injeção numa pré-coluna. Possui ainda duas válvulas de rotação (STF e SC, ver características no anexo 2) para selecionar a coluna de análise e 8 colunas cromatográficas. Quatro das colunas são usadas para purgar os compostos da amostra que não TCA e as restantes 4 são de análise, estando responsáveis pela separação e envio da porção da amostra com interesse para o detetor.
Figura 17 - Interior do forno cromatográfico: A - válvula de diafragma, B - loop, C - pré-coluna, D - válvula STF, E - colunas analíticas, F - colunas de "lixo", G - válvula SC, H - linha para o detetor
O mesmo robô usado para alimentar as câmaras de análise com rolhas, vai retira-las enviando-as para os tapetes de saída do equipamento. A escolha do tapete é feita de forma automática, em função dos resultados obtidos nos cromatogramas, o que permite separar as rolhas positivas das livres de TCA.
5.2.1.2.
Sistema de análise para rolhas de champanhe
Este módulo (figura 18) é muito semelhante com os módulos já descritos, no entanto, como se pretende apenas analisar os discos da rolha de champanhe, as câmaras de incubação foram adaptadas (figura 19).
Figura 18 - Protótipo experimental E1
O módulo E1, dispõe então, de 8 câmaras de incubação onde as rolhas são inseridas através de um pistão, sendo incubados os dois discos.
Figura 19 - Câmaras de incubação do E1
Relativamente ao principio cromatográfico, mecânica e composição do módulo é exatamente igual ao descrito no 5.2.1.1.
Para além disso, tratando-se de um módulo experimental, não possui ainda uma alimentação de rolhas, pelo que estas são inseridas manualmente no pré-incubador.
5.2.2. Modo operatório do equipamento
O robô do sistema da alimentação do equipamento NDtech é alimentado através de um elevador que faz chegar as rolhas a um centrifugo (figura 20) e que as coloca em linha e desta forma disponíveis para serem enviadas para o sistema. Este processo é controlado por sensores de presença/ausência de rolha.
Figura 20 - Sistema de alimentação exterior com elevador e centrífugo
O robô da alimentação introduz as rolhas nos pré-incubadores (figura 21) onde cada uma ficará 3 minutos em pré-incubação.
Figura 21 - Sistema de alimentação a colocar uma rolha num pré-incubador
Seguidamente o robô do módulo de análise transporta a rolha para a câmara de análise ficando esta em incubação cerca de 2 minutos (figura 22). Os cerca de 5 minutos de incubação a 120˚C permitem a volatilização do TCA da rolha.
Após a inserção da rolha na câmara de análise ela irá ser analisada após cerca de 2 min conforme o princípio cromatográfico destes equipamentos. De seguida o robô do módulo remove a rolha da câmara (figura 23).
5.2.2.1.
Princípio Cromatográfico
Os cromatógrafos aplicados neste sistema permitem dois tipos de operação: o modo manual e o modo automático.
5.2.2.1.1.
Modo manual
Para localizar o pico de TCA e calibrar o equipamento é inicialmente usado o modo manual. Neste modo seleciona-se a coluna cromatográfica onde se pretende fazer a análise e em qual das câmaras a amostra será enviada para o forno. A amostra da câmara selecionada é então injetada e, após a separação dos compostos na coluna, é possível obter o cromatograma correspondente a todos os compostos presentes na amostra. Para separar a molécula de TCA das restantes é necessário calibrar certos parâmetros de maneira a obter um tempo de retenção do TCA da ordem de 45 s (figura 24).
Figura 22 - Inserção de rolha pelo robô numa câmara
Figura 23 - Remoção de uma rolha pelo robô de uma câmara
Figura 24 - Cromatograma da análise de uma rolha, pico de TCA com tempo de retenção aos 45 segundos
5.2.2.1.2.
Modo automático
Em operação contínua (modo automático) existem outros elementos do cromatógrafo que intervêm no processo e permitem um tempo de análise de apenas 20 segundos.
O processo em automático inicia-se, preenchendo o pré-incubador com rolhas que são incubadas a 120˚C. Seguidamente as rolhas são transportadas para as câmaras de análise onde estão 2 minutos sujeitas a um fluxo de azoto de 25 mL/min.
Após incubação, inicia-se a análise. A amostra é enviada para a stream valve, seguindo através da transfer-line até à válvula de diafragma. Esta é responsável pela receção da amostra e comporta duas posições: Load e Inject (figura 25). Em Load, a válvula recebe a amostra proveniente da câmara de incubação e pressuriza o diafragma, concentrando toda a amostra num loop cromatográfico. O loop tem um volume de 500 µL e garante que, em cada injeção, o volume de amostra é sempre o mesmo. A válvula permanece em
Load durante 12 segundos que é o tempo necessário para perfazer todo o
volume do loop com amostra. Findo este período, a válvula muda para a posição Inject na qual se dá um relaxamento do diafragma que permite a passagem do fluxo de azoto, Carrier gas, que transporta toda a amostra para a pré-coluna.
Figura 25 - Processo de funcionamento de uma válvula de diafragma
A pré-coluna permite uma separação parcial do TCA das moléculas que são mais pesadas. Foi dimensionada em termos de comprimento e tipo de adsorvente para que a passagem do TCA se dê ao fim de 3 segundos. Assim, tudo o que passe na pré-coluna após este período de tempo, são moléculas com peso molecular superior ao do TCA e que não são objeto de análise do sistema. Após passagem na pré-coluna a amostra atravessa a válvula STF, responsável pela seleção da coluna onde vai ser injetada. Esta válvula permite a injeção da primeira porção da amostra (até aos 3 s) numa coluna analítica. Findo este tempo, a válvula roda e insere a restante porção da amostra (moléculas irrelevantes para a análise) numa coluna de lixo. Desta forma, é possível garantir que a coluna analítica se encontra limpa após a chegada do TCA ao detetor, uma vez que o TCA é a molécula com maior tempo de retenção a ser injetada neste tipo de coluna. Esta configuração elimina a necessidade de paragem do sistema para limpeza da coluna, proporcionando uma operação em contínuo.
O cromatógrafo é constituído por 4 colunas analíticas de modo a se conseguir uma análise em contínuo e transformar um tempo de separação de 45 segundos num tempo de ciclo de 20 segundos.
Assim, como pode ser observado na figura 26 enquanto numa coluna está a haver a passagem da amostra e separação dos compostos, na coluna seguinte já está a ser injetada a amostra da câmara seguinte, prosseguindo o ciclo consecutivamente. Aquando do momento da injeção da amostra da câmara 3, a amostra da câmara 2 encontra-se a ser separada e já a amostra da câmara 1 foi completamente separada e o TCA está a passar na válvula SC.
Figura 26 - Representação do princípio cromatográfico
Como pode ser observado na figura 27, as análises realizam-se em paralelo, desfasadas entre si de 20 s. O processo inicia-se com a injeção da amostra da rolha A na coluna 1. Enquanto este processo decorre, começa a chegar ao loop a amostra da rolha B, que permanece em “load” durante 12 s. Passados 20 s da injeção da amostra A, é injetada a amostra B na coluna 2. Por esta altura, já a amostra A se encontra a meio da coluna 1, parcialmente separada e a amostra da rolha C começa a fluir pelo loop. Novamente, passados 20 s, dá-se a injeção da amostra C na coluna 3. Neste momento, a amostra B está a meio da separação na coluna 2, e a amostra A atravessa a válvula SC e atinge o detetor.
A válvula SC, à semelhança da válvula STF, permite a seleção da coluna que está em linha com o detetor, purgando as restantes colunas. A introdução desta válvula no sistema permite fazer um processo de heartcutting, que consiste na
seleção da porção da amostra que chega realmente ao detetor. Desta forma, enquanto a amostra A percorre a coluna 1, a válvula SC alinha esta coluna com a purga, enquanto se dá a chegada dos compostos com menor tempo de retenção, comparativamente ao TCA. Poucos segundos antes da chegada da molécula de TCA ao fim da coluna, esta válvula roda, alinhando a coluna com o detetor. Assim, ao detetor chegará apenas a porção da amostra contendo a molécula de interesse.
Figura 27 - Representação esquemática do processo analítico sucessivo do sistema de deteção individual
Após a análise da rolha o software vai repartir as rolhas em três divisões conforme o valor da área do pico de TCA:
Grupo 1: área ˂ 6mV.s (rolhas ND)
Grupo 2: 6mV.s ≤ área ˂ 12 mV.s
Grupo 3: área ≥ 12 mV.s
5.2.2.2.
Modo operatório pós análise
Após a análise, o robô transporta a rolha da câmara para o respetivo tapete de saída referente a uma das divisões (figura 28).
Figura 28 - Robô do módulo a transportar uma rolha para o tapete rolante após a análise
As rolhas, caem, então, em cestos que estão no exterior. Cada cesto é referente a cada divisão (figura 29).
Figura 29 - Cestos no exterior da alimentação
5.2.3. Procedimento de validação
5.2.3.1.
Procedimento de validação dos módulos de análise
individual para rolhas naturais
Foram analisadas 50 rolhas em cada módulo, perfazendo um total de 900 rolhas nos 18 módulos testados. A amostragem foi realizada aleatoriamente a partir de um lote de rolhas naturais. Estas, foram identificadas através de uma
letra (A até R) e respetiva numeração (1 a 50). Procedeu-se à análise das rolhas em modo automático através do método GC-ECD, registando-se a área do pico de TCA observado. Após a análise, as rolhas foram enviadas para o laboratório do I&D onde foram maceradas e analisadas por SPME-GC-ECD conforme descrito no ponto 5.1.
5.2.3.2.
Procedimento
de
validação
do
protótipo
experimental de análise individual, E1, para rolhas de
champanhe
A partir de um lote de discos com TCA (discos positivos) foram acabadas rolhas de 2 discos, dos calibres 48×31 mm e 48×30,5 mm, sendo o disco interior de um lote limpo e o disco de espelho do lote positivo.
Rolhas neutras de calibre 48×30,5 mm, previamente controladas por análise sensorial, foram usadas como controlo negativo.
Analisaram-se 539 rolhas no modo manual e 500 rolhas no modo automático. Os dois discos foram incubados e analisados.
O modo manual foi calibrado utilizando rolhas neutras com adição de 2,4,6-tricloroanisol 100 ppb no disco de espelho. As rolhas foram colocadas nas câmaras de incubação a 120ºC durante 5 minutos e posteriormente fez-se a análise cromatográfica.
O modo automático foi calibrado utilizando rolhas neutras com adição de 2,4,6-tricloroanisol 100 ppb no disco de espelho. Posteriormente, as rolhas foram colocadas sequencialmente no pré-incubador onde cada rolha permaneceu durante cerca de 3 minutos. Foram depois transportadas através do robô para as câmaras de incubação onde permaneceram 2 minutos e 20 segundos. O ciclo de análise por rolha foi de 20 segundos.
Todas as rolhas analisadas no E1 foram analisadas posteriormente no método de maceração individual.
6. Resultados e discussão
6.1.
Otimização do método cromatográfico
6.1.1. Temperatura das colunas cromatográficas
Como se pode observar na figura 28, a temperatura das colunas permite controlar o tempo de retenção dos picos de TCA, influenciando diretamente a sua separação. Para temperaturas mais baixas, é maior a interação entre a fase estacionária e a molécula de TCA, aumentando o tempo de retenção e tornando a separação mais eficaz. À medida que se aumenta a temperatura a interação entre fases torna-se menos acentuada, diminuindo o seu tempo de retenção em detrimento da separação. Torna-se por isso necessário otimizar este parâmetro. Por outro lado, temperaturas mais altas favorecem a formação de picos altos e estreitos e temperaturas mais baixas tendem a formar picos mais largos, fruto da maior retenção da coluna que tende a arrastar as moléculas.
A temperatura definida foi de 105 °C, apresentando o pico de TCA boa definição (figura 30).
6.1.2. Temperatura do injetor
É importante que a temperatura do injetor seja superior à temperatura das câmaras de modo a não ocorrer condensação da amostra. Este parâmetro não tem influência direta na análise, pelo que foi definida uma temperatura de 150 ˚C para todos os módulos, para a qual não se notou acumulação de amostra.
6.1.3. Temperatura do detetor
A temperatura do detetor deve ser sempre superior à das colunas cromatográficas, de maneira a evitar a deposição de compostos no seu interior. A gama ótima de operação deste tipo de detetor para a análise da molécula pretendida varia entre 180 e 250ºC. Ao aumento de temperatura está associado uma diminuição do ruído de sinal. Assim, foi definida a temperatura de 250 ˚C em todos os módulos pois a esta temperatura consegue-se maximizar a área dos picos facilitando a sua integração (figura 31).
Figura 31 - Influência da temperatura do detetor na definição do pico de TCA
6.1.4. Fluxos de gás de arraste das colunas cromatográficas
Este parâmetro tem uma influência direta no tempo de retenção e, consequentemente, na separação dos compostos. Quanto maior o fluxo, maior é a velocidade com que a amostra percorre a coluna. Assim, o tempo disponível para interação entre a fase estacionária e a molécula de TCA é curto, conduzindo a tempos de retenção curtos e de fraca separação. Em sentido contrário, para fluxos mais baixos, a interação é maior, aumentando os tempos de retenção e melhorando a separação. Torna-se, portanto, necessário arranjar um compromisso entre os fluxos de azoto, que agregados à temperatura das colunas, definem as condições para garantir um tempo de retenção para o TCA de 45 s.
Cada uma das colunas cromatográficas vai ter um valor específico de modo a criar homogeneidade entre elas e compensar as suas diferenças físicas.
6.1.5. Fluxo de gás de arraste
O fluxo de Carrier gas, é o fluxo responsável pelo transporte da amostra do
loop e sua passagem pela pré-coluna cromatográfica. Este parâmetro tem de
ser otimizado de maneira a que a molécula de TCA atravesse a pré-coluna ao fim de 3 s. O valor definido foi de 18 mL/min.
6.1.6. Fluxo do gás auxiliar – Make up
O fluxo de make-up é um fluxo de azoto que é injetado dentro do detetor, para auxiliar o transporte da amostra no seu interior. Este parâmetro não tem influência na separação uma vez que entra em ação após a passagem da amostra nas colunas. No entanto, permite otimizar a resolução e geometria do pico, como se pode observar na figura 32.
Para a mesma área de pico ele pode ser mais baixo e largo para valores menores de fluxo de make-up e mais alto e estreito para valores maiores. O fluxo ideal para este parâmetro é entre 5 e 10 mL/min. Quando o fluxo é superior dilui a amostra e diminui a sensibilidade do detetor.
Figura 32 - Cromatogramas representativos da influência do make-up na definição dos picos
6.1.7. Corrente elétrica ECD
Variando o valor da intensidade da corrente elétrica no detetor consegue-se aumentar ou diminuir o número de eletrões presentes. Quanto maior for a intensidade da corrente, maior será o número de eletrões disponíveis para
ionizar as moléculas de TCA presentes na amostra, levando a um aumento da área dos picos e consequentemente ao aumento da sensibilidade do detetor. O valor de corrente elétrica está geralmente situado entre 10 e 40 mV, variando conforme as características do módulo em questão. No entanto, o valor 30 mV foi aquele que apresentou a maior área sem afetar a boa resolução entre picos (figura 33).
Figura 33 - Cromatogramas representativos da influência da corrente ECD no pico de TCA
6.1.8. Sensibilidade
A sensibilidade é um parâmetro determinado pelas características do detetor. Assim, a área dos picos vai ser influenciada pelo valor de sensibilidade aplicada, tentando reduzir o ruído associado a cada cromatograma. Os valores definidos variam conforme o módulo em questão e a própria sensibilidade do detetor. Os valores foram definidos criando homogeneidade entre a totalidade dos módulos.
6.1.9. Heartcut
Este parâmetro permite selecionar qual a porção de amostra que chega ao detetor. A abertura das válvulas STF (antes das colunas) e SC (no final das colunas) é dessincronizada de modo a eliminar o pico de ar do cromatograma, conseguindo-se ter uma maior definição do pico. O tempo de dessincronização pode ser alterado. Este parâmetro contribuiu para a diminuição da quantidade de oxigénio injetada no detetor, permitindo a obtenção de cromatogramas
isentos deste pico e assim aumentando a sensibilidade do detetor para o TCA (figura 34).
Figura 34 - Cromatogramas representativos da influência do heartcut na resolução do pico
6.1.10. Otimização dos módulos de análise individual para rolhas
naturais
A otimização dos módulos foi feita através de um processo de calibração individual, o que teve como consequência a alteração de alguns dos valores acima referidos para os diferentes parâmetros. São introduzidos tubos de cromatografia com TCA nas câmaras de cada módulo para a sua calibração em modo manual. Nos controlos do software (figura 35) seleciona-se a câmara na qual está a amostra que se pretende injetar e a coluna na qual se pretende que se faça a análise. De seguida, faz-se a injeção e conforme os cromatogramas obtidos vai-se manipulando o fluxo do carrier gas de modo a se obter um tempo de retenção para o pico de TCA aos 45 s.
230.000 235.000 240.000 245.000 250.000 255.000 260.000 265.000 270.000 275.000 280.000 1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 97 105 113 121 129 137 145 153 161 169 177 185 193 Volt agem /m V t /s Heartcut 0s Heartcut 1s Heartcut 3s Heartcut 4s
Figura 35 - Controlos do software AmorimCleanCork
Posteriormente, cada equipamento é posto a trabalhar em modo automático calibrando-se os fluxos das colunas e valor de heartcut de modo a que o pico seja visível nos 20 segundos do ciclo de análise (figura 36).
Figura 36 - Software AmorimCleanCork
Nesta fase, é apenas necessário programar o software para identificar o pico como sendo de TCA. Para isso registam-se no software o tempo de retenção do pico e o intervalo no qual deve ocorrer a integração.
A partir deste momento o módulo encontra-se apto a funcionar em modo automático.
Na tabela 3 estão apresentadas as condições experimentais de cada parâmetro do método de análise para um dos 18 módulos.
Tabela 3 - Parâmetros experimentais de otimização analítica do módulo P1
Parâmetros de otimização Resultado
Temperatura das colunas (˚C) 105
Temperatura do detetor (˚C) 250
Temperatura do injetor (˚C) 150
Corrente do ECD (mV) 30
Heartcut (s) 3
Fluxo Carrier gas 1300 (18,7 mL/min)
Fluxo Make-up gas (mL/min) 5,6
Fluxo da coluna 1 926 (16,4 mL/min)
Fluxo da coluna 2 965 (16,9 mL/min)
Fluxo da coluna 3 957 (17,2 mL/min)
6.1.11. Otimização do E1
Como o módulo E1 é um protótipo experimental, a sua otimização passou, não só pelos parâmetros cromatográficos descritos nos pontos 6.1.1 a 6.1.9, mas também por parâmetros mecânicos.
6.1.11.1.
Parâmetros analíticos
A calibração analítica do módulo E1, passou pelos mesmos passos descritos nos 6.1.1 a 6.1.9.
No caso deste protótipo, pelo facto das câmaras de incubação não permitirem a utilização de tubos de cromatografia, a calibração foi feita utilizando-se rolhas de champanhe neutras às quais foi adicionado TCA no disco de espelho conforme descrito no ponto 5.2.3.2.
Os resultados obtidos encontram-se na tabela 4.
Tabela 4 - Parâmetros experimentais de otimização analítica do módulo E1
Parâmetros de otimização Resultado
Temperatura das colunas (˚C) 105
Temperatura do detetor (˚C) 250
Temperatura do injetor (˚C) 150
Corrente do ECD (mV) 30
Heartcut (s) 1
Fluxo Carrier gas 1450 (19,3 mL/min)
Fluxo Make-up gas (mL/min) 6,7
Fluxo da coluna 1 948 (17,2 mL/min)
Fluxo da coluna 2 957 (17,5 mL/min)
Fluxo da coluna 3 993 (18,3 mL/min)
![Tabela 1 - Tipos de rolhas fabricadas na Amorim&Irmãos, S.A. e respetiva descrição [3]](https://thumb-eu.123doks.com/thumbv2/123dok_br/15691714.1065555/20.892.186.766.215.1101/tabela-tipos-rolhas-fabricadas-amorim-irmãos-respetiva-descrição.webp)
