UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUACAO EM BIOTECNOLOGIA & BIOCIÊNCIAS
Naissa Maria Danielli
RESPOSTAS MOLECULARES EM TILÁPIAS DO NILO (OREOCHROMIS NILOTICUS) EXPOSTAS IN SITU A UMA REGIÃO CONTAMINADA DA BACIA DO RIO CUBATÃO DO
NORTE, JOINVILLE, SC.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Centro de Ciências Biológicas, da Universidade do Federal de Santa Catarina.
Orientador: Prof. Dr. Afonso Celso Dias Bainy
FLORIANÓPOLIS 2013
Este trabalho é fruto de muito esforço e da companhia de muitas pessoas de grande valor ao meu lado.
Agradeço:
Aos meus pais que um dia sonharam e hoje compartilham este importante momento comigo. Obrigada por serem meu sólido alicerce em todos os momentos de minha vida. Nenhuma palavra nunca será suficiente para agradecer tudo o que vocês fizeram por mim. Obrigada por tudo! Meus maiores exemplos na vida.
Ao Afonso, pela orientação na realização da dissertação, oportunidades que me foram concedidas e amizade em todo o período em que estive no Laboratório de Biomarcadores de Contaminação Aquática; proporcionando todas as condições para meu crescimento profissional. Ao Alcir, pela co-orientação, oportunidade deste projeto, companheirismo que admiro.
À Risoleta, pelo apoio e pelos conhecimentos transmitidos;
À banca examinadora pela Aceitação do convite e atenção dada ao trabalho.
Aos colegas que fizeram parte da incansável batalha, que foram muito além das suas obrigações, essenciais para a realização desse trabalho. Muito obrigada: Alcir, Samira, Trevisan, Lila, Talita, Marcela.
Ao apoio fundamental, de grandes colegas, no incansável trabalho de campo: Alcir, Samira, Trevisan, Lila, Talita, Marcela, Jacó, Juliano, Elisa, Clei.
A Fundação Municipal 25 de Julho e a Roberto Hoppe, pelo fornecimento dos animais e de toda a estrutura para a realização dos experimentos.
Ao Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo, pela parceria nas análises químicas das amostras.
Ao Parque Integrado de Esportes, Lazer e Cultura Ltda-Kartódromo Internacional de Joinville, SC, por aceitarem e compreenderem a realização dos experimentos.
Ao senhor do alambique e ao casal de senhores que nos disponibilizaram a entrada de nossa equipe em suas propriedades para a realização dos experimentos.
Ao meu amado namorado Julio, que me apoiou e me ajudou muito neste último ano que foi tão difícil, longe da minha família e com muitas doenças que me perturbaram e dificultaram minha vida neste ano. Sem esta pessoa especial não teria terminado minha dissertação, muito obrigada.
A minhas amigas Rafaela, Daiane, Maya, Christiely, Dani, Karim pelo mútuo aprendizado de vida, durante nossa convivência, no campo profissional e particular, compartilhando comigo os momentos de tristezas e também de alegrias, nesta etapa, em que, com a graça de Deus, está sendo vencida.
Especialmente a Angelica Francesca Maris, e no passar desses anos uma grande amiga, foi minha maior incentivadora, agradeço muito por contribuir para minha formação e motivação profissional.
Aos integrantes e colegas do LABCAI, dentre os que não participam mais e os novos integrantes, foi muito bom conviver com vocês.
Ao apoio financeiro deste trabalho concedido pela CNPq, além da bolsa de DTI.
A bolsa REUNI concedida pelo programa de pós-graduação em Biotecnologia & Biociências.
E a todos aqueles que fazem de sua vida, uma luta diária pela melhoria deste mundo.
“Cada dia a natureza produz o suficiente para nossa carência. Se cada um tomasse o que lhe fosse necessário, não havia pobreza no mundo e ninguém morreria de fome.” “Há riqueza bastante
no mundo para as
necessidades do homem, mas não para a sua ambição.”
(Mahatma Gandhi)
RESUMO
A bacia hidrográfica do Rio Cubatão é o complexo hídrico mais importante da Baía da Babitonga. Está localizada na região nordeste do estado de Santa Catarina inserida em sua maior parte no município de Joinville. Esta bacia vem sofrendo degradação por ação antrópica decorrente de várias atividades socioeconômicas, as quais exercem impactos diretos na vegetação, no solo e na qualidade das águas nos vários afluentes que a compõem. As metodologias tradicionais de classificação de águas não são suficientes para identificar e quantificar as substâncias químicas na água. Para estabelecer métodos que possam evidenciar situações de risco ambiental, é de fundamental importância a aplicação de análises integradas da qualidade da água, unindo as respostas obtidas através dos métodos tradicionais de avaliação às respostas biológicas dos animais. Este trabalho avaliou respostas moleculares no fígado de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) mantidas em áreas contaminadas na Bacia do Rio Cubatão, no distrito industrial do local citado. Os locais de estudo foram três áreas no encontro do Rio Cubatão com o Rio do Braço e como local referência foi utilizada a Estação de Piscicultura. O experimento foi realizado no mês de outubro de 2009, e após o período de dois e sete dias de exposição os animais foram coletados para análise molecular, e para a análise química, onde para esta também foi coletado o sedimento de cada ponto de exposição. Como resultados das análises químicas observamos uma maior contaminação por esgoto doméstico e/ou poluentes químicos orgânicos, no local denominado S2, seguindo pelos locais S3, S1 e REF. Através da técnica de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) foi obtido um panorama da resposta da Tilápia do Nilo, frente aos contaminantes encontrados nos locais de exposição da Bacia. Foram identificados genes envolvidos em diversas funções biológicas, tais como cadeia respiratória, reparação de DNA, metabolismo de lipídios, estrutura celular, entre outros. Através da técnica de PCR quantitativo em tempo real foram realizados testes de validação de alguns genes escolhidos da lista obtida pelo SSH. Entre os resultados, foi observada uma diminuição da transcrição de genes que codificam proteínas do sistema imune sugerindo uma supressão deste, e a repressão de alguns genes nos animais expostos aos contaminantes. Estas informações poderão auxiliar na compreensão, de uma forma integrada, dos efeitos biológicos a nível transcricional causados pelos
ABSTRACT
The hydrographic basin of River Cubatão is the most important hydric complex at Baía da Babitonga. It is located in the Northeastern state of Santa Catarina, inserted mostly in the city of Joinville. This basin has suffered degradation by human action due to various socio-economic activities, which direct impacts on vegetation, soil and water quality in the various affluents that comprise it. The traditional methods of classifying waters are not enough to identify and quantify chemicals in the water. To establish methodologies that can demonstrate environmental risk, it is of fundamental importance to the application of integrated analysis of water quality, combining the responses obtained through the traditional methods for assessing the biological responses of animals. This study evaluated molecular responses in the liver of Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) maintained in contaminated areas of Bacia do Rio Cubatão do Norte, in the industrial district of said local. The study sites were three areas in the Rio Cubatão meeting with Rio do Braço and reference site was used as the Fish Culture Station. The experiment was conducted in October 2009, and after a period of two and seven days of exposure the animals were collected for molecular analyses, and chemical analyses, for this was also where the sediment collected from each point of exposure.The results of chemical analysis found a higher contamination by domestic sewage and/or organic chemical pollutants at the site called S2, followed by local S3, S1 and REF. Through the technique Suppressive Subtractive Hybridization (SSH) was obtained an overview of the response of Nile tilapia, compared to contaminants found in local exposure Basin. We identified genes involved in several biological functions, such as respiratory chain, DNA repair, lipid metabolism, cell structure, among others. Finally, techniques using quantitative RT-PCR tests were performed to validate some genes chosen from the list obtained by SSH. Among the results was observed a decrease in the transcription of genes encoding proteins of the immune system suggesting a suppression of the immune system, and repression of certain genes in animals exposed to contaminants. This information may help to understand, in an integrated manner, the transcriptional level the biological effects caused by contaminants in the environment and help future programs of evaluation and monitoring water resources with suspected environmental contamination.
Figura 1. Representação da região da bacia do Rio Cubatão, indicando os locais de referência (REF) e de exposição (S1, S2, S3)...26 Figura 2. Eletroforese de RNA. Verificação da integridade do material (foi utilizado pool de amostras). Observam-se duas bandas que representam o RNA ribossomal 18S e 28S...30 Figura 3. Níveis de hidrocarbonetos alifáticos totais quantificados em amostras de sedimento coletadas na área referência e nos locais de estudo nos rios Cubatão e do Braço (Joinville, SC)...38 Figura 4. Níveis de Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (com e sem perileno) em amostras de sedimentos...39 Figura 5. Porcentagem do número total dos fragmentos obtidos na biblioteca de SSH dos genes induzidos de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas em áreas contaminadas da Bacia do Rio Cubatão e classificados por função biológica. ...44 Figura 6. Porcentagem do número total dos fragmentos obtidos na biblioteca de SSH dos genes reprimidos de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas em áreas contaminadas da Bacia do Rio Cubatão e classificados por função biológica...45 Figura 7. Níveis de transcrição gênica relativa por PCR quantitativo em tempo real dos genes induzidos pela técnica de SSH. O asterisco (*) indica diferença significativa (p < 0,05) em relação ao grupo controle que é representado pelo eixo Y. Os dados estão mostrados na forma de média e intervalo de erro, calculados pelo programa REST2009. APPR - Apolipoproteína AI; TTN - Tetraspanina 3; AKD - Alfa-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada E1; CG1- Ciclina-G1; CRP- Ceruloplasmina; CC3- Componente complemento; A2M - Alfa-2-macroglobulina; CNN - Coriogenina L; FAS - Ácido Graxo sintase....58 Figura 8. Níveis de transcrição gênica relativa por PCR quantitativo em tempo real dos genes reprimidos pela técnica de SSH. O asterisco (*) indica diferença significativa (p < 0,05) em relação ao grupo controle que é representado pelo eixo Y. Os dados estão mostrados na forma de média e intervalo de erro, calculados pelo programa REST2009. RDY- Retinol desidrogenase 3; PPN - Fator complemento properdina; P450 - Citocromo p450 2j6; WTA - Aclimatação a temperatura alta; FBG - Fibrinogênio beta...59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Iniciadores das seguências selecionadas para validação por PCR quantitativo em tempo real...33 Tabela 2. Valores médios de temperatura, pH e O2 dissolvido da água em cada local de estudo após dois e sete dias de exposição das tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) nos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC...36 Tabela 3. Peso e comprimento médio de Oreochromis niloticus expostos durante dois e sete dias nos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SCm...37 Tabela 4. Concentração de pesticidas organoclorados em amostras de sedimentos dos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC...40 Tabela 5. Concentração de esteróis em amostras de sedimentos dos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC...40 Tabela 6. Concentrações de contaminantes orgânicos em amostras de fígado de Tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas por sete
dias nos Rios Cubatão e do Braço, Joinville,
SC...41 Tabela 7. Concentração de metais (µg.g-1) no músculo de Oreochromis niloticus, mantidas por sete dias nos rios do Braço e Cubatão, Joinville, SC...42 Tabela 8. Lista de genes identificados como induzidos na técnica de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH)...47 Tabela 9. Lista de genes identificados como reprimidos na técnica de Hibridização Subtrativa Supressiva...51 Tabela 10. Eficiência de cada reação de PCR quantitativo em tempo real de cada gene em amostras de fígado de Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas por dois e sete dias em áreas contaminadas da Bacia do Rio Cubatão do Norte...56
A2M – Alpha-2-macroglobulin
HAs – Hidrocarbonetos alifáticos (Aliphatic hydrocarbon) AKD – Alpha-ketoacid dehydrogenase E1
APPR – Apolipoprotein AI As – Arsênio
BCAKD – Branched-chain alpha-ketoacid dehydrogenase CC3 – Complement component C3
Cd – Cádmio
CDKs – Proteína ciclina dependente outra quinase CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC CG1 – Cyclin-G1
CNN – Choriogenin L
CPI – Índice de preferência de carbono Cr – Cromo
CRP – Ceruloplasmin Cu – Cobre
DDE – Diclorodifenildicloroetileno DNA – Ácido desoxirribonucléico cDNA – DNA complementar DTT – Ditiotreitol
EROs – Espécies reativas de oxigênio FAS – Fatty acid synthase
FBG – Fibrinogen beta Fe – Ferro
FURG – Universidade Federal do Rio Grande GenBank – Banco de genes
Hg – Mercúrio
HPA – Hidrocarboneto policíclico aromático (PAHs –Polycyclic aromatic hydrocarbons)
HPLC – Cromatógrafo líquido de alto desempenho IPTG – Isopropylthio-β-galactoside
LAB – Alquilbenzeno lineares (Linear alkylbenzene) Mn – Manganês Ni – Níquel O2 – Oxigenio OD – Oxigênio dissolvido P450 – Cytochrome p450 2j6 Pb – Chumbo
PCBs – Bifenilas policlorados (Polychlorinated biphenyls)
PCR – Reação em cadeia da polimerase (Polymerase chain reaction) PPN – Fator complemento factor properdina
RDY – Retinol dehydrogenase 3 pH – Potencial hidrogeniônico RNA – Ácido ribonucléico mRNA – RNA mensageiro
REF – Ponto referência na estação de piscicultura da Fundação Municipal de Extensão Rural 25 de Julho, Joinville, SC
S1, S2 ou S3 – Pontos de exposição dos animais na Bacia do Rio Cubatão, Joinville, SC
S18 – Ribosomo 18s
SEM – Materiais de referência certificados SIM – Single ion monitoring
SSH – Hibridização Subtrativa Supressiva (Suppression Subtractive Hybridization)
TTN – Tetraspanin 3
USP – Universidade de São Paulo
UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina
X-Gal – 5-bromo-4-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside Zn – Zinco
WTA – Warm temperature acclimation
RESUMO...7
ABSTRACT... 9
LISTA DE FIGURAS... 10
LISTA DE TABELAS... 11
LISTA DE BREVIATURAS DE SIGLAS...12
1 INTRODUÇÃO...17 1.1 Contaminação Ambiental...17 1.2 Contaminantes...18 1.3 Biomarcadores...20 1.4 Biomarcadores Moleculares...22 1.5 Local de estudo...23 1.6 Caracterização da espécie ...24 2. OBJETIVO GERAL...25 2.1 Objetivos Específicos...25 3 MATERIAIS E MÉTODOS...26
3.1 Área de estudo e desenho experimental...26
3.2 Biometria e extração de tecidos...27
3.3 Análises químicas de compostos orgânicos e inorgânicos...27
3.3.1Determinação de compostos orgânicos...27
3.3.2 Análise de metais por espectrofotometria de absorção atômica...29
3.3.3 Análise do mercúrio total pelo método de geração de vapor frio acoplado a sistema de espectrometria de absorção atômica...29
3.4 Extração de RNA total e RNA mensageiro...30
3.6 Clonagem e Sequenciamento...32
3.7 PCR quantitativo em tempo real...33
3.8 Análises estatísticas...34
4 RESULTADOS... ...36
4.1 Parâmetros químicos e físicos da água ...36
4.2 Biometria dos peixes...36
4.3 Determinação de compostos orgânicos no sedimento dos locais de exposição...37
4.3.1 Hidrocarbonetos alifáticos...37
4.3.2 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)...38
4.3.3 Alquilbenzeno Lineares (LABs)....39
4.3.4 Pesticidas Organoclorados...39
4.3.5 Esteróis...40
4.4 Determinação de compostos orgânicos no fígado dos animais....41
4.5 Metais...42
4.6 Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) ...43
4.7 Análise dos níveis de transcrição dos genes de interesse ...56
5. DISCUSSÃO...61
5.1 Parâmetros químicos e físicos da água...61
5.2 Parâmetros biológicos...61
5.3 Níveis de contaminantes...62
5.3.1 Hidrocarbonetos alifático...62
5.3.2 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)....63
5.3.3 Alquilbenzeno lineares (LAB).....63
5.3.4 Pesticidas Organoclorados (HCB).....64
5.3.5 Esteróis...65
5.3.6 Análise de metais...65
1 INTRODUÇÃO
1.1 Contaminação Ambiental
Nas últimas décadas o nível de substâncias químicas nos ecossistemas aquáticos vem aumentado de forma alarmante como resultado das atividades humanas sobre o meio ambiente. Esta situação é particularmente notada nas áreas com elevadas densidades populacionais, onde os cursos d’água são modificados, recebendo esgotos industriais e domésticos, além de sedimentos, lixo, e subprodutos oriundos do uso intensivo dos recursos naturais pela agropecuária, silvicultura e mineração (MORENO & CALLISTO, 2005; ARIAS et al., 2007).
O aumento populacional geograficamente desproporcional, que se concentra no litoral e em torno dos cursos hídricos, leva a alta demanda por água e consequentemente seu mau uso ao qual representam sérios e crescentes problemas que ameaçam o desenvolvimento sustentável e a proteção do ambiente (FITZHUGH e RICHTER, 2004).
A poluição aquática provém da adição de substâncias que alteram as características físicas e químicas do corpo d’água, e desta maneira prejudicando a utilização das suas águas para usos benéficos. Existem três formas de poluição a física, química e biológica. A poluição física altera as características físicas da água que decorre do lançamento de água aquecida nos rios usada no processo de refrigeração de refinarias, siderúrgicas e usinas termoelétricas ou também pode ocorrer através da poluição por resíduos pela presença de sólidos suspensos provenientes de esgotos industriais e domésticos e da erosão de solos. Entre os poluentes químicos temos aqueles que são biodegradáveis pela ação de bactérias e os persistentes que predominam no ambiente por muito tempo, como por exemplo, o DDT e o mercúrio. E por fim, a poluição biológica que é causada pela presença de organismos patogênicos que provocam infecções intestinais (PEREIRA, 2004).
Na tentativa de reverter este quadro, alguns países como o Brasil decidiram implementar novas tecnologias e elaborar normas mais rigorosas para o controle e monitoramento da qualidade da água. O Brasil possue uma das maiores reservas hídricas do mundo, concentrando cerca de 25% da água doce superficial disponível no planeta, no entanto uma parcela significativa desta não possui potabilidade (MAGALHÃES & CAMPOS, 2006)
Os aspectos de saúde e meio ambiente teve um maior avanço no Brasil a partir do século XX onde em 1934 foi elaborado o primeiro instrumento de controle do uso de recursos hídricos no país com a elaboração do Código das Águas, estabelecendo como prioritários o abastecimento público e preservação da qualidade da água em todo o território nacional que foi posteriormente estabelecida na Constituição Federal de 1988 (SOARES, BERNARDES, CORDEIRO NETTO, 2002). Hoje nos favorecemos da Resolução CONAMA No.357/2005 complementada pelas resoluções CONAMA Nº 410/2009 e 430/2011, estabelecem as condições e padrões de lançamento de efluentes dependendo da classificação das águas, constituindo que os efluentes de qualquer fonte poluidora somente poderão ser lançados diretamente nos corpos receptores após o devido tratamento e desde que obedeçam às condições, padrões e exigências dispostos na resolução e em outras normas aplicáveis.
No entanto, a elaboração de leis e normas ambientais, não garante o cumprimento da lei e o emprego de recursos financeiros em tecnologias eficientes que quantifiquem e remediem a contaminação da água em casos de poluição química (MAGALHÃES & CAMPOS, 2006).
Estas circunstâncias têm contribuído para a redução da qualidade ambiental, bem como para o comprometimento da saúde dos seres vivos que habitam esses ecossistemas; aumentando a probabilidade dos riscos de contaminação nos cursos d’água, um ônus imposto pelos padrões de conforto e bem-estar da vida moderna. Deste modo, os ecossistemas aquáticos urbanos vêm perdendo suas características naturais e sua diversidade biológica (MORENO & CALLISTO, 2005; ARIAS et al., 2007).
1.2 Contaminantes
O ambiente aquático é continuamente carregado de contaminantes, produtos químicos de origem orgânica e/ou inorgânica provindos das comunidades urbanas, agrícolas e industriais. Há décadas vários desses poluentes vem sendo descartados continuamente no ambiente acarretando problemas aos organismos que habitam esses locais (PEREIRA, 2004). Dentre estes contaminantes temos os metais, bifenilas policloradas (PCBs), pesticidas organoclorados, hidrocarbonetos alifáticos (HAs), hidrocarbonetos policíclicos
aromáticos (HPAs), alquilbenzeno lineares (LABs), esteróis fecais, medicamentos, entre outros.
Os metais estão entre os contaminantes mais perigosos, sendo que alguns como o zinco (Zn), cobre (Cu) e o ferro (Fe) são micronutrientes essenciais para o desenvolvimento dos organismos aquáticos, requeridos em pequenas quantidades. Outros, mesmo em pequenas quantidades, são tóxicos, como o chumbo (Pb) e cádmio (Cd), mas de maneira geral, todos são tóxicos dependendo da concentração (BENDATI, 1997).
Um contaminante largamente utilizado da década de 20 por suas características físico-químicas (alta constante dielétrica e elevada estabilidade térmica) são as bifenilas policloradas (PCBs). Estes compostos são da classe dos organoclorados por possuírem cloro anidro em sua estrutura. Os PCBs foram utilizados principalmente em produtos como transformadores e capacitores, fluídos de transferência de calor e como aditivos na formulação de plastificantes, tintas, adesivos e pesticidas. Embora a utilização dos PCBs tenham sido banidos em vários países e também no Brasil, ainda é permitido que equipamentos já instalados continuem em funcionamento até sua substituição integral (PENTEADO & VAZ, 2001) .
O pesticidas organoclorados são poluentes hidrofóbicos persistentes que por esta característica acabam sendo bioacumulados nos tecidos dos organismos e consequentemente biomagnificado pelo consumo de alimentos contaminados. Mesmo sendo proibido em vários países o HCB é liberado no meio ambiente como um subproduto de vários processos industriais e o DDT ainda é usado no controle de vetores, programas destinados a malária, febre amarela, e leishmaniose. Apesar de vários anos de proibição e restrição, estes poluentes ainda persistem no ambiente, constituem um perigo a saúde dos organismos aquáticos e aos que se alimentam destes (MIRANDA et al., 2008).
Um dos principais poluentes dos corpos d’água são os hidrocarbonetos alifáticos e policíclicos aromáticos (HPAs). A poluição por hidrocarboneto é de grande preocupação para a conservação dos recursos naturais, que em muitos casos sustenta as economias regionais por serem os principais componentes de petróleo bruto. Sua presença e concentrações elevadas freqüentemente criam preocupação ambiental em relação aos efeitos ecotoxicológicos. São substâncias muitas vezes hidrofóbicas e facilmente acumuladas nos organismos através das cadeias alimentares (COMMENDATORE et al., 2012).
Alquilbenzeno lineares são amplamente utilizados como base para agentes de limpeza atuando como detergente e, portanto, são lançados no sistema de esgoto sanitário e industrial em todo o mundo. É
potencialmente prejudicial aos organismos vivos por causa da capacidade perturbar membranas e proteínas levando a desnaturação (ASOK & JISHA, 2012).
Além dos contaminantes químicos temos o esteróis que são biomarcadores de poluição fecal. Os esteróis fecais são aqueles derivados do colesterol, produzidos ainda no trato intestinal de animais superiores, considerado uma “impressão digital” possibilitando determinar a fonte da contaminação. O esterol mais abundante nas fezes é o coprostanol detectado na maioria das águas de superfície e sedimentos contaminada com esgoto. Sob condições anóxicas sedimentares, coprostanol irá persistir proporcionando sua detecção enquanto outras análises sobre estas condições não possibilitam sua detecção, como é o caso dos coliformes fecais (REEVES & PATTON, 2005).
A toxicidade destes poluentes pode causar a sérios problemas ambientais, particularmente, esses poluentes são suspeitos de causar hepatotoxicidade, supressão imunológica, neurotoxicidade, distúrbios da tireóide, toxicidade reprodutiva e carcinogenicidade. Afetando o desenvolvimento dos animais bem como a sobrevivência de uma comunidade inteira (MIRANDA et al., 2008).
1.3 Biomarcadores
As metodologias tradicionais de classificação de águas, baseadas em características físicas, químicas e bacteriológicas, não são suficientes para identificar e quantificar as substâncias químicas na água (KNIE & LOPES 2004). E o monitoramento ambiental por meio de análises químicas diretas de água e sedimento é limitado pela disponibilidade e sensibilidade dos métodos e por uma incapacidade para prever a toxicidade de misturas complexas (BOLOGNESI et al., 2004). Então o conhecimento da toxicidade de agentes químicos em diferentes organismos aquáticos possibilita a observação direta da saúde dos mesmos e a detecção de efeitos nocivos sobre o ambiente aquático (SÄMY et al., 2010).
Uma nova área da ciência surgiu para melhor avaliar esses efeitos causados pelas substâncias químicas e pelos agentes físicos liberados no ambiente sobre os organismos vivos denominada de Ecotoxicologia. Esta relaciona os efeitos adversos causados pelas substâncias químicas e pelos agentes físicos liberadas no ambiente sobre os organismos vivos,
analisando os efeitos adversos causados nos diferentes níveis de organização biológica, incluindo os caminhos da transferência desses agentes e sua interação com o ambiente (FENT, 2004; KNIE & LOPES 2004).
O biomonitoramento, através do uso de bioensaios determina o efeito dos poluentes, utilizando testes em sistemas biológicos a fatores estressantes, fornecendo promissoras ferramentas para a identificação de poluentes capazes de causar danos à saúde humana e ao ambiente (GALLOWAY et al., 2004; KNIE & LOPES 2004). Estes ensaios podem ser avaliados através da medida de parâmetros biológicos denominados indicadores biológicos ou biomarcadores. Biomarcadores são as alterações biológicas adaptativas a estressores, como a exposição e o efeito tóxico de poluentes presentes no ambiente, que expressam alterações ao nível molecular, celular, fisiológico e até comportamental (WALKER et al., 1996). Esses biomarcadores podem ser usados na avaliação ambiental, monitorando tanto a presença, como o potencial tóxico dos contaminantes muito antes do aparecimento de seus efeitos irreversíveis (AMORIM, 2003).
Amorim (2003) define como características essenciais para selecionar e validar um biomarcador. Este deve refletir a interação do sistema biológico com a substância química; ter conhecida e apropriada sensibilidade e especificidade para a interação; ser reprodutível qualitativamente e quantitativamente; estar contido em um meio biológico acessível de análise; sua medição analítica tem que apresentar exatidão e precisão adequadas; devem ser claramente estabelecidos os valores normais deste biomarcador em populações não expostas ao agente químico de interesse.
O primeiro desafio na investigação de um biomarcador adequado para um melhor diagnóstico possível vai depender do contaminante a ser estudado e o organismo modelo. Dentre os principais organismos aquáticos utilizados como organismos sentinela, estão os peixes, moluscos e anfíbios (COTELLE & FÉRARD, 1999). Dentre estes, o uso de determinadas espécies de peixes é recomendado pela sua boa resistência em condições adversas, como pH extremo, baixos níveis de oxigênio dissolvido, variações de temperatura, presença de metais pesados, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), entre outros (POPMA & MASSER, 1999; NOGUEIRA et al., 2011; FRENZILLI et al., 2009).
Como exemplo tem a Tilápia (Oreochromis niloticus), o qual é um organismo qualificado para avaliações de biomonitoramento ambiental devido a sua resistência em águas de má qualidade, com
baixas temperaturas, alta concentração de amônia, baixo oxigênio dissolvido e uma faixa de pH entre 5 e 10 (POPMA & MASSER, 1999).
Para o estabelecimento de metodologias eficazes que evidenciem situações de risco ambiental, é de fundamental importância o uso integrado de análises da qualidade de água, com metodologias tradicionais de avaliação das alterações biológicos em animais, juntamente com respostas moleculares e/ou bioquímicas frente a ambientes contaminados (ARIAS et al., 2007).
1.4 Biomarcadores moleculares
A exposição de um organismo a poluentes pode desencadear uma cascata de respostas biológicas, cada uma das quais tem o potencial de servir como um biomarcador. Alterações biológicas visíveis a nível de comunidade, população ou ecossistema são precedidas por mudanças anteriores a níveis moleculares, antecipando assim as alterações nos níveis mais elevados de organização biológica. Sendo que, uma vez que os efeitos adversos em níveis hierárquicos superiores (população ou comunidade) são detectados, danos significativos podem já ter ocorrido. Portanto, a identifição precoce prevê aumento do risco dos efeitos adversos após a exposição a substâncias químicas ambientais, dando importância a utilização de biomarcadores moleculares (NOGUEIRA, 2009).
O uso de técnicas da biologia molecular aplicada à ecotoxicologia e monitoramento ambiental fornece informações em um nível de organização biológica diferente das demais técnicas e permite uma melhor compreensão dos mecanismos de ação dos contaminantes nos organismos vivos (BRULLE et al., 2008; KOSKINEN et al., 2004).
As alterações nos perfis de transcrição gênica fornecem informações sobre a interação dos estressores ambientais ao genoma, servindo como ferramenta poderosa para diagnosticar a existência de um estresse ambiental e para analisar as respostas biológicas que este provoca em uma determinada população (BRULLE et al., 2008; KOSKINEN et al., 2004).
Uma técnica molecular bastante utilizada em estudos toxicológicos é a Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) que pemite identificar de forma global os genes diferencialmente transcritos, induzidos ou reprimidos, entre duas situações distintas. Sendo assim, pode ser usada para entender os efeitos biológicos e prever os
mecanismos de ação de uma substância química em escala transcricional do genoma como um todo, quando comparada a uma situação controle (BRULLE et al., 2008; QU et al., 2011).
Por isto, esta técnica foi considerada adequada para estudar o efeito dos contaminantes da Bacia do Cubatão, possibilitando fornecer informações inéditas sobre o efeito combinado dos poluentes presentes num sistema biológico de forma global, possibilitando verificar os locais mais afetados, os quais podem ser inferidos pelos genes cuja transcrição sofre alterações nos animais expostos.
1.5 Local de estudo
A Bacia Hidrográfica do Rio Cubatão é o complexo hídrico mais importante da Baía da Babitonga. Localizada na região nordeste do estado de Santa Catarina, compreende uma área de 40,96 Km2 inserida em sua maior parte no município de Joinville e uma menor porção no município de Garuva. Os rios Quiriri, da Prata, e o do Braço são os principais afluentes do Rio Cubatão (OLIVEIRA et al., 2009).
O Rio Cubatão é o principal curso d’água e manancial da região e serve como fonte de captação de água para abastecimento da cidade de Joinville. Apesar da grande importância para a população, somente no seu terço superior a qualidade da água do rio é considerada boa, nos demais cursos, estas são utilizadas para a irrigação, agropecuária, bem como corpo receptor de efluentes domésticos e industriais (OLIVEIRA et al., 2009; ZONOTELLI et al., 2009).
A degradação da qualidade da água por problemas de poluição no Rio Cubatão fica mais explícita na sub-bacia do Rio do Braço, comprometida pelos afluentes do Distrito Industrial de Joinville (OLIVEIRA et al., 2009). Esta região vem sofrendo com contaminações principalmente de metais como cádmio, chumbo, cobre, cromo, e níquel além de baixas concentrações de oxigênio dissolvido observados em um estudo da UNIVILLE (2004).
De modo geral esta bacia vem sofrendo degradação por ação antrópica decorrente de atividades socioeconômicas, as quais exercem impactos diretos na vegetação, no solo e na qualidade das águas nos vários afluentes que a compõem. As atividades com maior impacto sobre os recursos hídricos locais são as indústrias farmacêuticas, metal-mecânica, plásticos, têxtil e, principalmente, as indústrias de galvanoplastia, além de esgotos domésticos, oficinas mecânicas e
lavação de postos de gasolina. A crescente urbanização e industrialização levam ao constante aumento do volume dos efluentes industriais e resíduos sólidos, assim como o uso de agrotóxicos nas lavouras de arroz, a drenagem insuficiente de água pluvial, a ineficiência na coleta e tratamento de esgoto que muitas vezes é lançado nos cursos d’água sem o tratamento adequado (ALVES, 2003; ZONOTELLI et al., 2009).
1.6 Caracterização da espécie
Nome científico: Oreochromis niloticus Reino: Animalia
Phylum: Chordata Classe: Actinopterygii Ordem: Perciformes Família: Cichlidae
O peixe Oreochromis niloticus é conhecido popularmente no Brasil como Tilápia, possui o hábito alimentar fitoplanctófago e onívoro, podendo atingir um comprimento de 60 cm e peso médio de 4,3kg. É um animal de hábitos diurnos e ocorre em uma grande variedade de habitats de água doce como rios, lagos, canais, esgotos e canais de irrigação. A espécie é nativa da África, tendo sido introduzida no nordeste brasileiro em 1971 (BOSCOLO et. al., 2001; CANABARRO & TOLEDO, 2010; OLIVEIRA, 2010).
Devido a sua resistência em águas de má qualidade, com baixas temperaturas, alta concentrações de amônia, baixo oxigênio dissolvido e uma faixa de pH entre 5 e 10, a Tilápia constitui-se em um organismo qualificado para avaliações de biomonitoramento ambiental (POPMA & MASSER, 1999).
2. OBJETIVO GERAL
Identificar genes diferencialmente transcritos e verificar alterações na resposta da transcrição gênica em Tilápia do Nilo (Oreachromis niloticus) expostas in situ em regiões contaminadas da Bacia do Rio Cubatão no distrito industrial de Joinville, SC.
2.1 Objetivos Específicos
- Clonar e identificar genes diferencialmente transcritos em fígado de Tilápia do Nilo (Oreachromis niloticus) expostas em locais contaminados da Bacia do Rio Cubatão do Norte;
- Classificar os genes identificados a partir de sua função biológica, para uma melhor caracterização do perfil de transcrição gênica;
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Área de estudo e desenho experimental
Para a realização deste estudo, Tilápias do Nilo adultas (Oreochromis niloticus) foram fornecidas pela estação de piscicultura da Fundação Municipal de Desenvolvimento Rural 25 de Julho (Joinville/SC). Os animais foram previamente aclimatados e mantidos em grupos de dez em gaiolas de 1,2x1x1 metro (comprimento, largura, altura) no mesmo local por aproximadamente três semanas, com o intuito de reduzir o estresse provocado pelo confinamento.
Os locais de estudo foram três áreas do Complexo Hídrico da Bacia Hidrográfica do Rio Cubatão em Joinville, Santa Catarina, e como local referência foi utilizada a Estação de Piscicultura referida (26°12'13"S-48°55'12"W), (sua localização esta indicada como REF na Figura 1), onde os animais também foram mantidos em gaiolas. O local denominado S1 (26°11'51"S-48°47'57"W) se encontra no Rio Cubatão antes do encontro do Rio do Braço, S2 (26°12'24"S-48°47'44"W) se localiza no Rio do Braço e S3 (26°11'54"S- 48°46'38"W) no Rio Cubatão após o encontro com o Rio do Braço (Figura 1), que sofre grande influência de atividades industriais.
Figura 1. Representação da região da bacia do Rio Cubatão, indicando os locais
Para o bem estar dos animais, os mesmos foram transportados a cada local de exposição em sacos plásticos oxigenados em água do próprio açude da estação com temperatura aproximada de 20 a 22 ºC. Foram utilizados somente machos pesando entre de 110 a 313 g e medindo 17 a 25 cm.
O experimento foi realizado no mês de outubro de 2009, quando foram colocadas duas gaiolas em cada local, para serem coletadas após dois e sete dias de exposição. Durante o período de exposição os animais não foram alimentados. Os procedimentos realizados foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFSC (CEUA PP00039).
3.2 Biometria e extração de tecidos
Após período de exposição, em média 6 a 8 (obs:Alguns foram predados) peixes foram coletados e transportados em sacos plásticos com água e oxigenados, levados à Fundação e acondicionados em tanques de 2000 L de água até a dissecção. Primeiramente os animais foram pesados e medidos. Então eles foram mortos por meio de secção transversal da medula espinhal e retirado amostras fígado para as análises bioquímicas, moleculares e químicas, e amostras de músculo somente para a análise química.
As análises bioquímicas foram realizadas pelo Laboratório de Defesas Celulares, UFSC; a análise de química orgânica pelo Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo - USP; a análise de metais foi realizado pelo Departamento de Química da FURG e a análise molecular que é objeto do presente trabalho.
Na água de todos os locais foram medidos o pH, os níveis de oxigênio dissolvido e a temperatura, utilizando-se um kit portátil de análise de água de campo. Amostras de sedimentos e água do rio foram coletados em recipientes apropriados para análise dos compostos orgânicos e metais traços.
3.3 Análises químicas de compostos orgânicos e inorgânicos
As amostras de sedimento foram secas durante 72 horas em liofilizador (Thermo Savant – ModulyoD). Em seguida, as amostras foram maceradas e homogeneizadas em almofariz com pistilo e armazenadas em frascos de vidro previamente limpos com solvente. Uma alíquota de 20 gramas de sedimento e 0,25 gramas do fígado de peixe foram extraídas em sistema Soxhlet para análise dos bifenilas policlorados (PCBs), pesticidas organoclorados, hidrocarbonetos alifáticos (HAs), aromáticos (HPAs) e alquilbenzeno lineares (LABs) com n-hexano/diclorometano 50 % (v/v) segundo método descrito pela UNEP (1992), Matos (2002) e MacLeod et al. (1986) com algumas modificações. Antes da extração foram adicionados os padrões surrogate PCB-103, PCB-198, naftaleno-d8, acenafteno-d10, fenantreno-d10, criseno-d12, perileno-d12, dodecil alquilbenzeno (1C12LAB), hexadeceno e eicoseno em todas as amostras, brancos e materiais de referência certificados (SRM).
O extrato do sedimento foi dividido em duas alíquotas para serem submetidas à cromatografia por adsorção em coluna. Uma parte foi eluída para análise de organoclorados e a outra fração para análise de hidrocarbonetos alifáticos (HAs), LABs, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). As amostras foram injetadas no cromatógrafo líquido de alto desempenho (HPLC) da Perkin Elmer equipado com duas colunas de exclusão (permeação em gel). A fase móvel utilizada foi o diclorometano (UNEP, 1992; MATOS, 2002; MACLEOD et al., 1986).
Uma alíquota do extrato final foi injetada no cromatógrafo a gás (6890 da Agilent Technologies) equipado com detector de captura de elétrons (GC-ECD) para análise de pesticidas organoclorados e com detector de ionização de chama (GC-FID) 6890 para análise de HAs. Os demais grupos de compostos (HPAs, PCBs e LABs) foram analisados no cromatógrafo a gás equipado com espectrômetro de massas (GC/MS) 6890/5973N também da empresa citada. A aquisição dos dados foi feita em SIM (single ion monitoring).
Os esteroides foram extraídos de 20 g de sedimento também por Soxhlet por 8 horas contendo etanol e α-colestano como padrão surrogate segundo procedimento de Kawakami e Montone (2002). A identificação e quantificação foram feitas em GC-MS, sendo que a aquisição foi feita em SCAN.
As identificações dos pesticidas, HAs, HPAs, PCBs, LABs e esteróides foram feitas por comparação dos tempos de retenção com padrões de referência da Accustandard e Supelco dos EUA, Fluka da
Suíça e Sigma-Aldrich da Alemanha. A quantificação foi entre os surrogates e os compostos de interesse, baseada nas curvas analíticas montadas com pelo menos cinco concentrações diferentes de cada grupo de compostos. Os compostos analisados no GC/MS também foram identificados através do íon de quantificação (m/z) e seus respectivos íons de confirmação.
3.3.2 Análise de metais por espectrofotometria de absorção atômica.
As amostras biológicas de músculo foram tratadas com ácido nítrico concentrado para a total decomposição da amostra e solubilização de todos os metais, segundo descrito no Reference Methods for Marine Pollution Studies - UNEP (1984a).
O procedimento foi realizado com a digestão em chapa aquecedora. As amostras biológicas liofilizada foram agitadas por aproximadamente 2 minutos para homogeinização. Após 2 minutos foi pesado aproximadamente 0,1 a 0,5 g do tecido liofilizado nas bombas de Teflon®. Adicionado 5 mL de HNO3 concentrado, a temperatura ambiente por pelo menos 1 hora. Os tubos de polipropileno foram fechados e colocados sobre a chapa quente a 100 °C por 3 horas. Com as amostras já resfriadas a temperatura ambiente, estas amostras que estavam em tubos de polipropileno foram abertas cuidadosamente no interior de uma capela e transferidas dos frascos de digestão para tubos de polipropilenos graduados. Então os frascos foram lavados com água Milli-Q, três vezes, adicionando esta água aos tubos graduados e diluído até a marca de 25 mL com água Milli-Q e agitado. A análise e leituras das amostras se procederam conforme as normas de operações do aparelho de espectrofotômetria de absorção atômica. Os resultados foram expressos em µg.g-1.
3.3.3 Análise do mercúrio total pelo método de geração de vapor frio acoplado ao sistema de espectrometria de absorção atômica
O método é aplicável a amostras biológicas com concentrações de mercúrio total com cerca de 0,05 µg.g-1. Foi empregada uma digestão forte para decompor a amostra e oxidar e converter todas as formas de mercúrio orgânico em mercúrio inorgânico. O método descrito é uma
adaptação do Reference Methods for Marine Pollution Studies No. 8 - UNEP (1984b), apresentado de forma detalhada em Ustra (2001).
O procedimento iniciou com 0,2 a 2 g de amostra seca em um tubo de Teflon® com tampa. Foi adicionado 5 mL de ácido nítrico concentrado e deixado em repouso por uma hora na temperatura ambiente. Aquecido em placa por 3 horas a 90 oC. Com as amostras já resfriadas, estas foram transferidas para um balão volumétrico e adicionado 20 mL de água Milli-Q e 1 mL de solução de K2Cr2O7 (concentração final 2% v/v). Diluído com água Milli-Q até a marca do balão e esperado sedimentar. A análise e leituras das amostras se procederam conforme as normas de operações do aparelho de espectrofotômetria de absorção atômica. Os resultados foram expressos em µg.g-1.
3.4 Extração de RNA total e RNA mensageiro
A extração de RNA total foi realizada a partir de 200 mg de cada amostra de fígado, previamente armazenada em RNAlater® (Invitrogen) a -20 ˚C através do método que utiliza o reagente TRIZOL® (Invitrogen) seguindo as especificações do fabricante. A pureza, concentração e integridade do RNA total foram analisadas por espectrofotometria utilizando o aparelho Nanodrop ND-1000 UV-Vis (Nanodrop Technologies), a 260, 280 e 320 nm e através do perfil eletroforético em gel de agarose (Fig.2).
Figura 2. Eletroforese de RNA. Verificação da integridade do material (foi
utilizado pool de amostras). Observam-se duas bandas que representam o RNA ribossomal 18S e 28S.
Para a obtenção do RNA mensageiro (RNAm) foi preparado um pool de 8 amostras de peixes do local referência e um pool de 8 amostras do local S2, (tempo de exposição, dois dias) usando o kit PolyA mRNA (Ambion), de acordo com as instruções do fabricante. Este método utiliza o fato do RNAm ter em sua estrutura uma calda POLI AAA, ou seja, de nucleotídeos de adenina, podendo assim isolar os RNAs mensageiros a partir de uma mistura complexa de vários outros tipos de RNAs.
Escolheu-se o período de dois dias de exposição pelo fato dos biomarcadores moleculares serem rapidamente ativados e reprimidos quando os organismos são expostos a contaminantes. E somente foi utilizado amostras do local S2 para ser avaliado juntamente com o local REF, pois em estudos anteriores o local S2 apresentou-se mais poluído, além do fato de que, a técnica de SSH só permite avaliar dois grupos por análise.
3.5 Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH)
Na Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH) foi utilizado o kit PCR Select cDNA Subtraction Kit (Clontech) que é um método baseado em reações de PCR. A técnica inicia-se a partir de 1 µg de cada uma das amostras de mRNA (referência e exposto) que são convertidas a cDNA. Os cDNAs expressos diferencialmente (alvo) estão presentes no cDNA tester e ausentes no cDNA driver. Os cDNAs são primeiro digeridos com uma enzima de restrição produzindo extremidades não coesivas. Os fragmentos de cDNA tester são então divididos em duas amostras (1 e 2) e ligados a dois adaptadores diferentes (adaptador 1 e 2), resultando em duas populações de tester, (1) e (2). São realizadas duas hibridizações na técnica de SSH. Primeiro, um excesso do driver é adicionado a cada amostra do tester. As amostras são então desnaturadas e colocadas para anelar. Nesta primeira hibridização ocorre vários tipos de ligação entre as fitas de cDNA, fita senso e anti-senso com adaptador, sem adaptador e fitas simples com e sem adaptador.
Na segunda hibridização, as duas amostras oriundas da primeira hibridização são misturadas. Apenas o restante dos cDNAs fita simples com adaptadores e subtraídos está apto a reassociar e formar híbridos que possuem sequências diferentes de adaptadores em sua extremidade 5’. Uma extremidade é proveniente da amostra 1 e a outra da amostra 2.
As duas sequências permitem a amplificação preferencial da fração normalizada e subtraída usando PCR e um par de “primers” (iniciadores), P1 e P2, os quais correspondem à parte externa do adaptador 1 e 2, respectivamente.
Para realizar esta amplificação seletiva, uma reação de extensão é realizada para preencher as extremidades desencontradas (coesivas) das moléculas para o anelamento do “primer” antes da iniciação do procedimento de PCR. Em todos os ciclos da reação de PCR, a amplificação exponencial pode ocorrer em moléculas híbridas que possuem sequências diferentes de adaptadores em sua extremidade 5’. Somente as moléculas que têm seqüências de adaptadores diferentes nas suas extremidades as quais permitem que eles sejam exponencialmente amplificados por meio da reação de PCR (ANEXO 1). Ou seja, as sequências não hibridizadas, representam os genes que foram transcritos na amostra exposta, mas não foram na referência, ou inversamente, assim possibilitando obter transcritos diferencialmente expressos entre as amostras.
3.6 Clonagem e Sequenciamento
As amostras obtidas pela utilização da técnica de SSH foram ligadas nos vetores pGEM-T Easy® (Promega) pela enzima T4 DNA ligase, em seguida foi realizada a transformação das células competentes E.coli DH5-α, através de choque térmico.
As bactérias competentes foram cultivadas em placas de petri contendo meio de cultura sólido (Agar 35 g/l, LB Agar –Sigma; ampicilina, 100 mM; IPTG, 0,5 mM e X-Gal, 50mM) e deixadas a 37 ºC por 18 h para crescimento de colônias. Após o período de cultivo as colônias visualmente da cor branca foram selecionadas e passadas para um meio de cultura líquido 20 g/l (LB Broth - Sigma) com ampicilina (100 mM), durante 18h a 37 ºC em agitação constante. Destas amostras foi extraído e purificado o DNA utilizando o kit Qiagen Miniprep (Qiagen).
O sequenciamento das amostras de subtração foi realizado no equipamento ABI3300® (Applied Biosystems), para determinação das sequências gênicas expressas durante o experimento. Elas foram obtidas através de uma reação de PCR com a incorporação do corante fluorescente BigDye Terminator v3.1® (Applied Biosystems) utilizando
os iniciadores M13F ou M13R que alinham a uma região localizada próxima ao inserto no vetor pGEM-T® Easy (Promega).
Os genes homólogos foram identificados no banco de dado disponível (GeneBank), através do software BLAST (www.ncbi.nih.gov/blast) e escolhido os genes de interesse para validação por PCR quantitativo em tempo real.
3.7 PCR quantitativo em tempo real
A partir das sequências dos genes de interesse identificados através da SSH (Tabela 1), foram desenhados iniciadores específicos para cada sequência pelo programa FastPCR e padronizados para validação por PCR quantitativo em tempo real. Para este também foi obtido o RNA total pelo método do reagente TRIZOL® (Invitrogen) e o cDNA pelo kit Omniscrit RT da Qiagen (de acordo com as instruções do fabricante), para as amostras de cada local e tempo de exposição. Para a determinação da pureza e concentração do RNA total foi utilizado o espectrofotômetro NanodropND-1000 UV-Vis (Nanodrop technologies), a 260, 280 e 320 nm.
Tabela 1. Iniciadores das seguências selecionadas para validação por PCR quantitativo em tempo real.
GENE SIGLA PRIMER 5’ – 3’
Apolipoproteína AI APPR TGTCGGTCACAGGAGCAACGGAA ACTCAGGCGAAGGAGGGTGC Tetraspanina 3 TTN AGCGTGTGTGCTGCCAGTCTGAGTA ACAAATAGCAACGCCCAGAGCCGT Alfa-cetoácido desidrogenase de cadeia ramificada E1 AKD TCCCGCACATCTTTGAGCCCTTCT TTTCCTGGCTGCTCTCCACTGTCT Ciclina-G1 CG1 CACCAACTCTTAATTTGTGGACACCG CAAACTACACAGGGAAACTGGCAC Ceruloplasmina CRP ACAGCATGGGTCAGTTCGAGGTGGT TCCCAGGTTCGGTTTGGAGCGTAGT
Componente complemento c3 CC3 GGACAAGGTTTCTCACACACGACCAG TTCCAGCTTCCCTCTGTGGATGGT
Alfa-2-macroglobulina A2M TGGCATGAAGGGAGGAGTGAGTGA GCAGGTACAGGTTATCGAGCTGGC
Coriogenina L CNN TGGGATCATGCGCTGTTGTCGGAGA
ATCACAGGAGAACCACCCACAGGCT
Ácido graxo sintase FAS GAGTAGTTAGTATGCAGAAACACGGCTGG AGG
TTTCCACATGCAGACACCAGTAGACAGGC
Retinol desidrogenase 3 RDY ATGACAGCCTCCGCCTCAACAT TGCCCATAGTCGTCCTTCACTTCC
Citocromo p450 2j6 P450 CCTGGGATTCCCGAGATGTGCCAAT CCCACTCATTCTTGTCAAGCAGCACGG
Fator complemento properdina PPN ACCTGACCGAGAGACGAGTGTGCT ACGAGGAGGGTAAAGGTTGTAGCCGGT Aclimatação a temperatura quente WTA TGCAGGTCTTGAGATGGATGCTGT CAGCGAAACTCTTATTGGAGAACTCGGC
Fibrinogênio beta FBG AGGGAGACCTTCGCTGGAAATAGA CAACTGGAGCAGGAGTAGGGC
Proteína Ribossomal 18s S18 TACCACATCCAAAGAAGGCA TCGATCCCGAGATCCAACTA
Foi utilizado o método de quantificação por detecção não específica com SYBR® Green, fluoróforo fluorescente que se liga à fita-dupla de DNA, emitindo fluorescência. Cada amostra foi analisada em duplicata com o seguinte protocolo: 95 °C por 5 min e 35 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s. Gerada a curva de melting, que ao emitir apenas um pico de fluorescência para cada amostra, foi confirmada a amplificação de um único produto de PCR. Foram considerados válidas as reações iguais ou próximas dos valores de 100% para a eficiência da reação e 1,0 para o valor de R2, este indica que a reação se mantém com eficiência semelhante em cada concentração de cDNA da curva. Ao final o software (Rotor Gene 6000) obtemos o valor do número de ciclos de limiar o Ct (Ciclo Threshold), o qual é o número de ciclos a que a amostra atravessa o limiar.
Dentre os normalizadores avaliados, que foram a actina, tubulina e G6PDH (Glicose-6-fosfato desidrogenase) somente o ribossomo 18S foi selecionado por não apresentar variação na transcrição dos animais mantidos no local de referência e os locais avaliados, após dois e sete dias de exposição.
3.8 Análises estatísticas
O cálculo da transcrição dos genes foi realizado utilizando o software REST 2009 da QIAGEN® através dos dados de Ct de cada gene e os gráficos confeccionados pelo programa estatístico GraphPad. Prism versão 5.01. O programa REST aplica um modelo matemático de randomização, ou seja, atribuição de um modo aleatório a assegurar uma distribuição igual para cada grupo do estudo, adequado a comparação da expressão para cada amostra.
A análise dos parâmetros químicos e físicos da água e concentração de metais foi realizada primeiramente a análise de distribuição normal e após a análise de variância (ANOVA) de uma via,
seguida do teste post hoc de Duncan, quando necessário. Para os dados biométricos foi utilizado o Teste não paramétrico Kruskal-Walis seguido do teste complementar de Dunns. Foram considerados resultados estatisticamente significativos quando p < 0,05. Os valores representam a média ± erro padrão.
4 RESULTADOS
4.1 Parâmetros químicos e físicos da água
Os parâmetros químicos e físicos de qualidade da água dos diferentes locais experimentais foram analisados após dois e sete dias de exposição. Os valores de temperatura, pH e O2 dissolvido estão apresentados na Tabela 2. Nenhuma diferença significativa na temperatura, pH e O2 dissolvido foi observada entre os locais de exposição em relação ao local utilizado como referência.
Tabela 2. Valores médios de temperatura, pH e O2 dissolvido da água em cada local de estudo após dois e sete dias de exposição das tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) nos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC.
Pontos Temperatura (°C) pH O 2 dissolvido (mg/l)
REF 21,6 ± 2,4 6,6 ± 0,2 7,1 ± 2,2
S1 20,7 ± 1,7 6,0 ± 0,4 7,6 ±1
S2 20,7 ± 1,5 6,5 ± 0,3 5,8 ±1,2
S3 21,7 ± 1,1 5,4 ± 0,8 7,3 ± 1,1
REF indica o local de referência em que os animais foram mantidos (Fundação Municipal de Extensão Rural 25 de Julho, Joinville, SC) e, S1, S2 e S3, os locais de exposição dos animais nos rios Cubatão e do Braço. Os dados representam a média ± erro padrão. Foi utilizado o teste ANOVA de uma via seguido por teste post hoc de Dunnet para comparação dos dados entre os locais (p<0,05).
4.2 Biometria dos peixes
A biometria dos peixes mantidos por dois e sete dias de exposição nos locais experimentais podem ser visualizados na Tabela 3. O número de animais por grupo não foi o mesmo, pois no dia das coletas verificamos que houve predação desses animais. Apesar deste fator, não observamos nenhuma diferença significativa no comprimento e peso dos peixes dos grupos de exposição S1, S2 e S3 em relação ao local de Referência.
Tabela 3. Peso e comprimento médio de Oreochromis niloticus expostos durante dois e sete dias nos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC.
Grupo Número por grupo Peso (g) Comprimento (cm) Dois dias REF 10 184,2 ± 71,3 20,40 ± 3,4 S1 7 146,1 ± 44,8 19,14 ± 1,7 S2 10 205,2 ± 47,9 22,50 ± 1,6 S3 10 163,7 ± 48,65 20,20 ± 1,7 Sete dias REF 10 203,5 ± 65,9 21,50 ± 2,0 S1 10 173,6 ± 57,1 20,20 ± 1,9 S2 7 151,4 ± 17,9 19,86 ± 1,2 S3 6 147,9 ± 48,2 19,00 ± 1,8
REF indica o local de referência em que os animais foram mantidos (Fundação Municipal de Extensão Rural 25 de Julho, Joinville, SC) e, S1, S2 e S3, os locais de exposição dos animais nos rios Cubatão e do Braço. Os dados representam a média ± erro padrão. Foi utilizado o teste não-paramétrico Kruskal-Walis seguido do teste complementar de Dunns (p < 0,05).
4.3 Determinação de compostos orgânicos no sedimento dos locais de exposição.
4.3.1 Hidrocarbonetos alifáticos
Os Hidrocarbonetos alifáticos podem ser de origem antrópica ou natural. Um dos parâmetros para avaliar a presença de fontes biogênicas é através da análise da razão pristano/fitano, com valores que variam entre 3 e 5 (STEINHAUER & BOEHM, 1992). Essa razão apresentou um intervalo de 1,10 a 203 µg.g-1 nas amostras de sedimento analisadas (ANEXO 2), e somente as estações S2 e S3 indicaram uma introdução antrópica na região.
A concentração de hidrocarbonetos alifáticos totais encontrados nas amostras de sedimento de Joinville variou de 2,40 a 203 µg.g-1 peso
seco. A concentração mais alta foi encontrada na amostra da estação (Figura 3).
Figura 3. Níveis de hidrocarbonetos alifáticos totais quantificados em amostras
de sedimento coletadas na área referência e nos locais de estudo nos rios Cubatão e do Braço (Joinville, SC).
4.3.2 Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs)
Os maiores níveis de HPAs totais no sedimento foram observados no local S2, seguido pela amostra S3 (Figura 4). As concentrações de HPAs apresentaram uma variação de 11,6 a 1179 ng.g-1 (ANEXO Em relação aos HPAs com perileno também foram encontradas as maiores concentrações nas amostras de sedimento dos locais
(Figura 4). HPAs com perileno significa que a amostra é derivada de fontes diferentes da combustão de material orgânico, atribuídas a fontes naturais (VENKATESAN, 1988).
REF S1 S2 S3
seco. A concentração mais alta foi encontrada na amostra da estação S2
m amostras na área referência e nos locais de estudo nos rios
Os maiores níveis de HPAs totais no sedimento foram observados As concentrações de ANEXO 3). encontradas as locais S2 e S3 HPAs com perileno significa que a amostra é derivada de atribuídas a fontes
Figura 4. Níveis de Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (com e
perileno) em amostras de sedimentos.
4.3.3 Alquilbenzeno Lineares (LABs)
Os níveis de LABs totais quantificados nas amostras dos sedimentos do local S2 foi 655 ng.g-1 e do local S3 foi
amostra do local S1 apresentou valores abaixo do limite de detecção e local referência apresentou níveis de 6,84 ng.g-1.
4.3.4 Pesticidas Organoclorados
Concentrações consideravelmente baixas de DDTs totais 2,25 ng.g-1) foram encontradas nas amostras do local
sendo que no local S2 foi observada a maior concentração, presença de resíduos deste produto (Tabela 4). Entretanto informações a respeito da sua utilização nessa região
Possivelmente estas concentrações de DDT podem estar relacionadas a sua persistência no ambiente, bem como, sua utilização ilegal em agrotóxicos.
REF S1 S2
os aromáticos (com e sem
nas amostras dos do local S3 foi 19,2 ng.g-1. A abaixo do limite de detecção e o
de DDTs totais (0,15 a local REF, S2 e S3, a maior concentração, indicando a . Entretanto, não há informações a respeito da sua utilização nessa região recentemente. Possivelmente estas concentrações de DDT podem estar relacionadas a sua persistência no ambiente, bem como, sua utilização ilegal em
Tabela 4. Concentração de pesticidas organoclorados em amostras de sedimentos dos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC.
REF S1 S2 S3
Pesticidas Organoclorados (ng.g-1)
p,p'-DDE 0,5 0,15 0,68 0,22
p,p'-DDT 1,22 <0,37 0,68 0,64
DDTs totais 2,07 0,15 2,25 1,02
REF indica o local de referência em que os animais foram mantidos (Fundação Municipal de Extensão Rural 25 de Julho, Joinville, SC) e, S1, S2 e S3, os locais de exposição dos animais nos rios Cubatão e do Braço.
4.3.5 Esteróis
A presença de esterol na água é um indicador de poluição fecal que é fonte de descarga dos efluentes domésticos. Coprostanol é um esterol fecal gerado através da ação microbiana sobre o colesterol. Segundo Gonzalez-Oreja e Saiz-Salinas (1998) níveis de coprostanol acima de 0,5 µg.g-1 indicam altos níveis de contaminação por esgoto sanitário no ambiente. Com exceção do local S1, todos os locais amostrados apresentaram concentração de coprostanol acima ou muito próximo desse limite de 0,5 µg.g-1 (Tabela 5).
Tabela 5. Concentração de esteróis em amostras de sedimentos dos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC.
REF S1 S2 S3 Esteróis (µg.g-1) Coprostanol 0,46 0,15 9,12 1,38 Epicoprostanol 0,23 0,04 0,50 0,19 Coprostanona 0,45 0,19 6,57 1,84 Colestanona 0,09 0,16 0,25 0,57 Colestanol 1,62 0,79 2,10 1,68 Esteróis totais 19,1 10,5 32,3 14,3 Relações Coprostanol/(coprostanol+colestanol) 0,22 0,16 0,81 0,45 coprostanona/(coprostanona+colestanona) 0,83 0,55 0,96 0,76
REF indica o local de referência em que os animais foram mantidos (Fundação Municipal de Extensão Rural 25 de Julho, Joinville, SC) e, S1, S2 e S3, os locais de exposição dos animais nos rios Cubatão e do Braço.
A amostra do local S2 apresentou a maior razão de coprostanol/ (coprostanol + colestanol) de 0,81, seguido do local S3, com valores de 0,45, sendo que razões entre 0,70 a 1,0 indicam um local contaminado por esgoto (GRIMALT et al., 1990).
4.4 Determinação de compostos orgânicos no fígado dos animais As concentrações de contaminantes orgânicos no fígado dos animais mantidos nos diferentes locais de estudo podem ser visualizadas na Tabela 6. Os níveis de PCBs, organoclorados e esteróis apresentaram-se abaixo do limite de detecção do método (dados não mostrados). Os níveis de HPAs totais apresentaram uma variação de 74,3 a 348 ng.g-1 (peso úmido). As maiores concentrações foram detectadas no fígado dos animais mantidos no local S2 seguido de S1, S3 e referência. Todas as amostras dos peixes apresentaram níveis significativos de LABs no fígado. Quando os dados são normalizados por grama de lipídios, os maiores valores observados foram nas amostras do local S2, mas quando os dados são normalizados por grama de tecido, os maiores níveis foram observados nos peixes do local referência, indicando a presença de algum tipo de contaminação por detergentes nesta região.
Tabela 6. Concentrações de contaminantes orgânicos em amostras de fígado de Tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas por sete dias nos Rios Cubatão e do Braço, Joinville, SC.
REF S1 S2 S3
HPAs Totais ng.g-1 de tecido 74,3 348 309 172 ΣHPAs Totais µg.g-1 lipídios 563 4581 7720 2257 LABs Totais ng.g-1 de tecido 326 203 195 260 ΣLABs Totais µg.g-1 lipídios 2.47 3.43 4.89 2.67 Alifáticos Totais µg.g-1 11.2 139 2.35 19.2 Alcanos Totais µg.g-1 5.35 5.24 2.35 3.95 REF indica o local de referência dos animais na Fundação Municipal de Extensão Rural 25 de Julho, Joinville, SC e S1, S2, S3 os locais de exposição dos animais nos Rios Cubatão e do Braço.
As maiores concentrações de hidrocarbonetos alifáticos totais foram observadas no fígado dos peixes mantidos no local S1. Os peixes do local REF também apresentaram os maiores níveis de alcanos totais. 4.5 Metais
A concentração dos metais no músculo dos animais pode ser visualizada na Tabela 7. A determinação de metais foi realizada pelo Departamento de Química da FURG utilizando amostras coletadas após sete dias de exposição. Somente o manganês quantificado no músculo dos peixes mantidos nos locais S1 e S3, e o zinco nos peixes dos locais S1, S2 e S3 apresentaram diferenças estatísticas em relação ao controle. Tabela 7. Concentração de metais (µg.g-1) no músculo de Oreochromis niloticus, mantidas por sete dias nos rios do Braço e Cubatão, Joinville, SC. REF S1 S2 S3 Metais Mn 1,40 ± 0,47 9,02 ± 0,68*** 1,68 ± 1,18 4,18 ± 2,50* Cr 0,19 ± 0,03 0,23 ± 0,15 0,14 ± 0,03 0,26 ± 0,26 Cd < ldmc < ldm < ldm < ldm Ni 0,62 ± 0,33 0,22 ± 0,05 0,56 ± 0,33 0,51 ± 0,44 Pb 0,10 ± 0,02 0,10 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,11 ± 0,02 Cu 1,67 ± 0,55 2,58 ± 0,60 2,02 ± 0,90 2,16 ± 0,56 As 0,08 ± 0,05 0,10 ± 0,06 0,05 ± 0,00 0,23 ± 0,19 Hg 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,02 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 Fe 29,68 ± 1,75 29,22 ± 3,36 25,77 ± 2,63 25,45 ± 3,28 Zn 16,52 ± 4,34 8,03 ± 1,40** 9,75 ± 3,00** 8,98 ± 2,32** REF indica o local de referência dos animais (Fundação Municipal de Extensão Rural 25 de Julho, Joinville, SC), e S1, S2, S3 os locais de exposição dos animais nos Rios Cubatão e do Braço. c < limite de detecção do método. Os dados representam a média ± erro padrão. ANOVA de uma via seguido por teste post hoc de Duncan (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001)
