CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): LARIANE TEODORO OLIVEIRA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): REGINA HELENA PIRES ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): CARLOS HENRIQUE GOMES MARTINS COLABORADOR(ES):
1. RESUMO
Bactérias e fungos formam complexas estruturas associadas à superfícies, denominadas biofilmes. Tais comunidades microbianas comportam-se de forma diferente no que se refere à taxa de crescimento e à capacidade de resistir aos tratamentos antimicrobianos, além de mudança morfológica e fisiológica da célula microbiana, induzidas por condições ambientais onde incluem-se pH, temperatura, oxigenação e presença de nutrientes. Contudo, formação de biofilmes em microambientes nosocomiais tais como circuito hídrico de Serviços de hemodiálise, são pobremente relatados na literatura. Assim, este estudo propõe avaliar a formação de biofilme por fungos do gênero Aspergillus, espécie A. niger frente à biocidas de uso rotineiro em Serviços de Hemodiálise. Serão utilizadas cepas provenientes de circuito hídrico de um Serviço de Hemodiálise hospitalar para indução de formação de biofilme em microplacas (96 poços), sendo que a metodologia de redução de XTT {sódio 3´-[1-(fenilaminocarbonil]- 3,4-tetrazolium]-bis (4-metoxi-6-nitro) ácido benzeno sulfônico hidratado}, determinará a viabilidade celular dos biofilmes. A fotodocumentação por microscopia eletrônica de varredura evidenciará a morfologia e a topografia dos biofilmes. Espera-se que o estudo alerte para a necessidade de inclusão de biofilmes nas padronizações de águas utilizadas em Serviços de diálise pelos órgãos regulatórios, pois estas são focadas apenas na forma livre (planctônica) de crescimento dos organismos.
2. INTRODUÇÃO
A insuficiência renal crônica (IRC), é definida como alterações na taxa de filtração glomerular e/ou presença de lesão parenquimatosa presentes há pelo menos três meses (BASTOS et al., 2010). Quando diagnosticada a IRC, deve ser instituído um tratamento dialítico o mais precoce possível, sendo o mais utilizado a hemodiálise. Neste procedimento, o acesso ao sangue é obtido unindo-se uma veia e uma artéria superficial do braço (cateter venoso central ou fístula artério-venosa). A máquina de hemodiálise filtra o sangue num meio extracorpóreo substituindo em parte o funcionamento renal.
Ao entrar na máquina de hemodiálise de proporção, a água já tratada é misturada a uma solução eletrolítica de modo estequiométrico separado da solução tampão, necessária para a formação do dialisato. Geralmente, a água potável recebida da rede pública de abastecimento é tratada por osmose reversa, no intuito de minimizar a exposição do paciente à endotoxinas e fragmentos microbianos, os quais são capazes de serem transferidos da água para o paciente (LAUDE-SHARP et al., 1990; LONNEMANN et al., 1992; LONNEMANN, 2000; HANDELMAN et al., 2009).
No entanto, a ausência de qualquer substância antimicrobiana na água tratada torna-a susceptível à contaminação microbiana, o que tem sido relatado na literatura (CARMICHAEL et al., 2001; GOMILA et al., 2005; BORGES et al., 2007; VARO et al., 2007; MONTANARI et al., 2009; AL-NASERI et al., 2013). A RDC N° 11, de 13 de março de 2014 estabelece ausência em 100 mL como valores permitidos de coliformes totais e 100 UFC (unidade formadoras de colônias)/mL para bactérias heterotróficas. Entretanto, contaminações são frequentes.
Simultaneamente, as infecções micóticas têm aumentado nas últimas décadas. Em alguns estudos internacionais (ARVANITIDOU et al., 2000; WARRIS et al., 2001; ANAISSIE et al., 2002) as fontes ambientais têm sido associadas à epidemiologia destas infecções. No Brasil, diversos gêneros fúngicos têm sido relatado em sistemas hídricos de hemodiálise (VARO et al., 2007;PIRES-GONCALVES et al., 2008; PIRES et al., 2011) e algumas destas contaminações têm sido atribuídas à presença de biofilmes (HOENICH et al., 2006; PIRES et al., 2011).
No intuito de preservar a integridade do sistema, a desinfecção do sistema hídrico bem como das máquinas de diálise é padronizada para alguns biocidas aprovados na legislação, embora seu uso para biofilmes microbianos ainda não esteja padronizado à nível nacional ou internacional.
3. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de formação de biofilme por fungos da espécie A. niger frente à biocidas de uso regular em Serviços de Hemodiálise. A topografia dos biofilmesde A. nigerfoi demonstrada pela visualização em microscopia eletrônica de varredura.
4. METODOLOGIA
Todos as cepas de A. niger (10) utilizadas no estudo estavam estocadas à -80 ºC e fazem parte do acervo de coleções de culturas da Universidade de Franca, sendo previamente isoladas a partir de cinco pontos do circuito hídrico de um Serviço de hemodiálise hospitalar. As cepas foram identificadas pela metodologia convencional (LARONE, 1995; LACAZ et al., 1998) cultivando-se os mesmos em ágar batata para observação das microestruturas.A cepa A. nigerATCC 10864 foi usada como cepa-controle. Os biofilmes foram formados em placas de microtitulação (96 poços) e, a viabilidade, estimada pelo ensaio de redução do XTT a 492nm (RAMAGE et al., 2001). Os biofilmes formados em placas de 24 poços sobre discos de
cloreto de polivinila (PVC), lavados em tampão fosfato, fixados em paraformolaldeído, desidratados em banho de etanol (15-100%) e secos em dissecador foram visualizados em microscopia eletrônica de varredura (REED, 1996).
5. RESULTADOS PRELIMINARES
Todas as 10 cepas de A. nigertestadas foram capazes de formar biofilme em placas de 96 poços, conforme mostra a Figura 1. Não houve diferença significativa (P>0,05) na capacidade de formação de biofilme entre os isolados ambientais e a cepa A. niger ATCC 10864. A microscopia eletrônica de varredura mostrou biofilmes com emaranhado de hifas basal e estruturas conidiais em evidência. Observação em maior aumento evidenciou espessa matriz de substâncias exopoliméricas envolvendo os fialoconídios (Figura 2).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 ATCC 10864 01 02 04 05 06 07 08 09 10 D e n si d a d e ó p ti c a ( 4 9 2 n m )
Figura 1. Valores de densidade óptica obtidos com o ensaio de XTT para os isolados de A. niger. Comparativamente à cepa padrão A. niger ATCC 10864 (coluna em preto), os isolados ambientais não apresentaram diferença significativa (P>0,05) na formação de biofilme, conforme mostrou a análise de variância (ANOVA) seguida de pós correção com o teste de Bonferroni. As barras denotam o desvio padrão obtido na realização de três experimentos em dias diferentes.
C B
6.FONTES CONSULTADAS
AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, MINISTÉRIO DA SAÚDE. RDC nº 11. Brasilia, DF: Diario Oficial da União 2014.
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