ALEX RODRIGUES SILVA CAETANO
COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE
ÓLEOS ESSENCIAIS DE CINCO ESPÉCIES DE Eucalyptus
SOBRE Hemileia vastatrix E Penicillium citrinum
LAVRAS – MG
2018
ALEX RODRIGUES SILVA CAETANO
COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE CINCO ESPÉCIES DE Eucalyptus SOBRE Hemileia vastatrix E Penicillium citrinum
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agroquímica, área de concentração em Química/Bioquímica, para obtenção do título de Mestre.
Profa. Dra. Maria das Graças Cardoso Orientadora
Prof. Dr. Mário Lúcio Vilela Resende Coorientador
LAVRAS-MG 2018
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema de Geração de Ficha Catalográfica da Biblioteca Universitária da UFLA, com dados informados pelo(a) próprio(a) autor(a).
Caetano, Alex Rodrigues Silva.
Composição química e atividade antifúngica de óleos
essenciais de cinco espécies de Eucalyptus sobre Hemileia vastatrix e Penicillium citrinum / Alex Rodrigues Silva Caetano. - 2018. 68 p. : il.
Orientador(a): Maria das Graças Cardoso. .
Dissertação (mestrado acadêmico) - Universidade Federal de Lavras, 2018.
Bibliografia.
1. Produtos naturais. 2. Óleos essenciais. 3. Atividade antifúngica. I. Cardoso, Maria das Graça. . II. Título.
O conteúdo desta obra é de responsabilidade do(a) autor(a) e de seu orientador(a).
ALEX RODRIGUES SILVA CAETANO
COMPOSIÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE CINCO ESPÉCIES DE Eucalyptus SOBRE Hemileia vastatrix E Penicillium citrinum
CHEMICAL COMPOSITION AND ANTIFUNGAL ACTIVITY OF ESSENTIAL OILS OF FIVE SPECIES OF Eucalyptus ON Hemileia vastatrix AND Penicillium citrinum
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Agroquímica, área de concentração em Química/Bioquímica, para obtenção do título de Mestre.
Aprovado em 19/2/2018
Profa. Dr. Maria das Graças Cardoso Profa. Dr. Sara Maria Chalfoun de Souza Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães
Profa. Dra. Maria das Graças Cardoso Orientadora
LAVRAS-MG 2018
A Deus, pela vitória, sabedoria e inteligência concedida.
Aos meus pais, familiares e namorada, pelo amor, incentivo e por estarem sempre
apoiando-me em todos os moapoiando-mentos.
Aos meus amigos e colegas.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela oportunidade de poder fazer o curso de Pós-Graduação em Agroquímica na Universidade Federal de Lavras (UFLA) e pela sabedoria e inteligência concedida para conquistar mais essa vitória.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (Fapemig), pela bolsa concedida, tornando possível a realização deste trabalho.
À minha mãe, Joquiânia, que é o alicerce da minha vida, sempre apoiando-me, incentivando-me, concedendo amor e carinho, falando frases que encorajam e fazem com que eu alcance todos os meus objetivos. A meu pai, Marcilio, pelo apoio e incentivo.
Às minhas avós, Venorina e Neli, e familiares, pelo amor, carinho e zelo, que a cada dia me apoiam mais e mais.
À Profa. Maria das Graças Cardoso, pela oportunidade concedida por fazer parte da sua equipe, pelos ensinamentos, amizade, paciência e “os puxões de orelha”, que me fizeram crescer profissionalmente e socialmente.
À minha namorada, Ariane, pelo amor, amizade, companheirismo, apoio e incentivo. Ao Departamento de Química (DQI), por me conceder os melhores anos da minha vida. A todos os professores e funcionários do DQI/UFLA, pelos ensinamentos e amizade.
A Profa. Sara Chalfoun, Caroline, Carla e Vicentina, que abiraram as portas dos laboratórios da Epamig e tiveram muita dedicação e paciência para me ensinarem a trabalhar com microrganismo, sempre apoiando-me e incentivando-me.
Ao professor Mario Lúcio, por ter apresentado a ideia deste projeto e estar sempre à disposição para discutir ideias e trabalhos.
Ao professor Luiz Gustavo de Lima Guimarães, por aceitar o convite de participar da banca avaliadora desta dissertação.
Aos amigos do Laboratório de Óleos Essenciais: Maísa, Danúbia, Maria Luíza, Karen, Luana, Vanúzia, Rafaela Brandão, Rafaela Vieira, Jéssica, Eduarda, Túlio e Letícia. Em especial à técnica de laboratório Cleusa, pela amizade e convivência. Aos amigos do Laboratório de Análise de Qualidade de Aguardente: Allan, Richard, Franciele, Gabriel, Gustavo, Wilder, Manuel, Rafaela, Ronan e a todos os meus amigos.
RESUMO
As plantas são usadas pelos seres humanos desde a antiguidade como especiarias ou como uma forma rápida, eficaz e barata para se combater doenças e microrganismos. Os óleos essenciais são formados a partir do metabolismo secundário dos vegetais, podendo ser extraídos de todos os órgãos da planta. São misturas complexas de diversos constituintes que podem apresentar diversas atividades, dentre elas, a antifúngica. O cafeeiro Coffea sp. é um arbusto da família Rubiaceae do gênero Coffea L. A semente contida dentro do seu fruto é utilizada para fabricar o café, uma das bebidas mais consumidas em todo o mundo, influenciando diretamente na economia brasileira, visto que este país é o maior produtor de café. Dois fungos que causam prejuízos na produção desses grãos são os fungos Hemileia vastatrix e Penicillium citrinum; o primeiro é conhecido como ferrugem do cafeeiro e ataca a lavoura causando uma desfolha dos arbustos, afetando diretamente a próxima produção dos frutos, enquanto os fungos Penicillium
citrinum atacam os grãos de café durante o período de transporte e armazenamento, mudando
o aspecto visual, qualitativo e quantitativo dos grãos. Objetivou-se neste trabalho realizar a caracterização química e a atividade antifúngica in vitro e in vivo dos óleos essenciais de
Eucalyptus torelliana, Eucalyptus citriodora, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus grandis e Eucalyptus microcorys sobre os fungos Hemileia vastatrix e Penicillium citrinum. Os óleos
essenciais foram extraídos pela técnica de hidrodestilação, empregando-se o aparelho de Clevenger modificado; a caracterização química foi realizada por CG/EM e CG/DIC; a atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix foi estudada avaliando-se a concentração mínima inibitória (CMI); enquanto a atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Penicillium citrinum foi estudada avaliando-se o crescimento micelial. A atividade antifúngica in vivo foi realizada utilizando o fungo Hemileia vastatrix, sendo avaliados o efeito curativo e preventivo dos óleos essenciais. Os constituintes majoritários do óleo essencial de E. citriodora foram (citronelal, citronelol e isopulegol), de E.
torreliana (pineno, 1,8-cineol e β-pineno), de E. camaldulensis (1,8-cineol, terpineol e
pineno), de E. grandis (1,8-cineol, pineno e terpineol) e de E. microcorys (1,8-cineol, α-pineno e trans-pinocarveol). Todos os óleos essenciais apresentaram atividade antifúngica in
vitro e in vivo sobre os dois fungos em estudo, exceto o óleo essencial de E. microcorys, que
não apresentou atividade antifúngica in vivo, atuando como preventivo sobre o fungo Hemileia
vastatrix.
ABSTRACT
Plants have been used by humans since ancient times as spices or as a quick, effective and inexpensive way to combat diseases and microorganisms. Essential oils are formed by the secondary metabolism of plants and can be extracted from all the organs of the plant. They are complex mixtures of several constituents that can present several activities, including antifungal activity. The Coffea sp. coffee tree is a shrub of the Rubiaceae family of the genus Coffea L. The seed contained in its fruit is used to make coffee, one of the most widely consumed beverages in the world, directly influencing the Brazilian economy because this country is the largest producer of coffee. Two fungi that cause losses in the production of these grains are
Hemileia vastatrix and Penicillium citrinum. The former is known as the coffee tree rust, and it
attacks the crop, causing a peeling of the bushes and directly affecting the next fruit production. The Penicillium citrinum fungus attacks the coffee beans during the transportation and storage period, changing the visual, qualitative aspect and the quantitative analysis of the grains. The objective of this work was to characterize the in vitro and in vivo antifungal activity of the essential oils of Eucalyptus torelliana, Eucalyptus citriodora, Eucalyptus camaldulensis,
Eucalyptus grandis and Eucalyptus microcorys against Hemileia vastatrix and Penicillium citrinum. The essential oils were extracted by the hydrodistillation technique, using the
modified Clevenger apparatus; the chemical characterization was performed by GC/MS and GC/FID; the in vitro antifungal activity of the essential oils against Hemileia vastatrix was studied by evaluating the percentage of germination; The in vitro antifungal activity of the essential oils against Penicillium citrinum was studied by evaluating the mycelial growth. In vivo antifungal activity was performed using the Hemileia vastatrix fungus, and the curative and preventive effect of the essential oils were evaluated. The principal constituents of the essential oils of E. citriodora (citronellal, citronellol and isopulegol); E. torreliana (α-pinene, 1,8-cineol and β-pinene); E. camaldulensis (1,8-cineole, α-terpineol and α-pinene); E. grandis (1,8-cineole, α-pinene and α-terpineol) and E. microcorys (1,8-cineole, α-pinene and trans-pinocarveol) were determined. In vitro and in vivo antifungal activity against the two fungi under study was observed for all the essential oils, except the essential oil from E. microcorys, which did not present antifungal activity in vivo, but acted as a preventive agent against the fungus Hemileia vastatrix.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura química do isopreno... 16 Figura 2 Rota metabólica para formação de monoterpenos, sesquiterpenos e
diterpenos a partir do ácido mevalônico... 17 Figura 3 Rota metabólica para formação IPP a partir da via DXPS... 20 Figura 4 Rota metabólica para formação dos fenilpropanoides a partir do ácido
chiquímico... 23 Figura 5 Estrutura molecular do eugenol, limoneno, carvacrol e geraniol 25 Figura 6 Aspecto geral de uma espécie de Eucalyptus sp.... 26 Figura 7 Constituintes químicos comumente encontrados nos óleos essenciais de
Eucalyptus ssp... 27 Figura 8 Aspectos geral de um cafeeiro... 28 Figura 9 Aspecto geral da ferrugem do cafeeiro causada pelo fungo (Hemelia
vastatrix B.)... 30 Figura 10 Aspecto geral do Penicillium citrinum... 31 Figura 11 Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus
grandis... 38 Figura 12 Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus
camaldulensis... 39 Figura 13 Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus
citriodora... 40 Figura 14 Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus
microcorys... 42 Figura 15 Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus
torreliana... 43 Figura 16 Foto dos esporos de Hemileia vastatrix não germinados... 46 Figura 17
a e b
Comparação do aspecto físico dos esporos de Hemileia vastatrix antes (a) e após (b) o tratamento com óleo essencial de E. torreliana... 46
Figura 18 Atividade antifúngica do óleo essencial de Eucalyptus camaldulensis sobre Penicillium citrinum... 49 Figura 19 Atividade antifúngica do óleo essencial de Eucalyptus citriodora sobre
Penicillium citrinum... 49 Figura 20 Atividade antifúngica do óleo essencial de Eucalyptus microcorys sobre
Penicillium citrinum... 50 Figura 21 Atividade antifúngica do óleo essencial de Eucalyptus torreliana sobre
Penicillium citrinum... 50 Figura 22 Atividade antifúngica do óleo essencial de Eucalyptus grandis sobre
Penicillium citrinum... 51 Figura 23 Aspecto geral de uma folha de cafeeiro após o tratamento com controle
negativo (água), apresentando todas as pústulas esporuladas com
Hemileia vastatrix... 53 Figura 24 Aspecto geral de uma folha de cafeeiro tratada com uma solução de leite
em pó, com todas as pústulas esporuladas com Hemileia vastatrix... 54 Figura 25
a e b
Aspecto geral das folhas dos cafeeiros após os tratamentos com os óleos essenciais de E. camaldulensis (a) e E. microcorys (b) que estavam infectadas por Hemileia vastatrix. A folha à esquerda em cada imagem é referente aos tratamentos com os óleos essenciais de E. camaldulensis e
E. micrororys, respectivamente, e a folha à direita em cada imagem é
Figura 26 Aspecto geral dos tratamentos com E. grandis (a) e E. citriodora (b) sobre mudas de cafeeiro contendo as folhas infectadas com Hemileia
vastatrix. A folha à esquerda de cada imagem é referente aos tratamentos
com os óleos essenciais de E. grandis e E. citriodora, respectivamente, e a folha à direita de cada imagem é referente ao controle negativo... 55 Figura 27 Aspecto geral de uma folha de cafeeiro tratada com uma solução do
fungicida controle, com todas as pústulas sem esporos de Hemileia
vastatrix... 56 Figura 28 Aspecto geral de folhas de cafeeiro referente ao controle negativo com
todas as pústulas esporuladas com Hemileia vastatrix... 57 Figura 29 Aspecto geral dos tratamentos com E. grandis sobre as folhas de
cafeeiro, mediante a avaliação do efeito preventivo. As duas primeiras folhas à esquerda da imagem são referentes aos tratamentos com o óleo essencial de E. grandis e a folha à direita da imagem é referente ao controle negativo... 57 Figura 30
a e b
Aspecto geral das folhas de cafeeiro após os tratamentos com os óleos essenciais de E. camaldulensis (a) e E. citriodora (b) sobre folhas de cafeeiro, avaliando o efeito preventivo. A folha à esquerda de cada imagem é referente aos tratamentos com os óleos essenciais de E.
camaldulensis e E. citriodora, respectivamente, e a folha à direita de
cada imagem é referente ao controle negativo... 58 Figura 31 Aspecto geral de uma muda de cafeeiro com as folhas necrosadas após o
tratamento com E. camaldulensis mediante a avaliação do seu efeito preventivo... 58 Figura 32 Aspecto geral da folha de um cafeeiro após o tratamento com E.
microcorys, mediante o seu efeito preventivo... 59 Figura 33 Aspecto geral de uma folha de cafeeiro tratada com uma solução do
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Número de registro e coordenadas geográficas das espécies de Eucalyptus
utilizadas... 32
Tabela 2 Composição química do óleo essencial de Eucalyptus grandis... 38
Tabela 3 Composição química do óleo essencial de Eucalyptus camaldulensis... 40
Tabela 4 Composição química do óleo essencial de Eucalyptus citriodora... 41
Tabela 5 Composição química do óleo essencial de Eucalyptus microcorys... 42
Tabela 6 Composição química do óleo essencial de Eucalyptus torreliana... 43
Tabela 7 Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix... 45
Tabela 8 Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais de cinco espécies Eucalyptus sobre Penicillium citrino... 48
Tabela 9 Efeito curativo dos óleos essenciais de Eucalyptus sobre Hemileia vastatrix... 53 Tabela 10 Efeito preventivo dos óleos essenciais de Eucalyptus sobre Hemileia vastatrix. 56
LISTA DE ABREVIATURAS
CG/EM Cromatografia gasosa acoplada a um detector de espectrômetro de massas CG/DIC Cromatografia gasosa acoplada a um detector de ionização em chama CM Crescimento micelial
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 13
2 REFERENCIAL TEÓRICO... 14
2.1 Metabolismo secundário... 14
2.2 Óleos essenciais... 15
2.2.1 Biossíntese dos terpenos e fenilpropanoides, constituintes dos óleos essenciais... 16
2.2.1.1 Terpenos... 16
2.2.1.2 Fenilpropanoides... 22
2.2.2 Atividade biológica dos óleos essenciais e plantas aromáticas... 23
2.3 Espécies eucaliptos (Eucalyptus spp.)... 25
2.4 Cafeeiro (Coffea sp)... 27
2.5 Ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix B.)... 29
2.6 Penicillium citrinum... 31
3 MATERIAL E MÉTODOS... 32
3.1 Escolha das plantas para extração dos óleos essenciais... 32
3.2 Coleta do material vegetal... 32
3.3 Extração dos óleos essenciais... 33
3.4 Caracterização química dos óleos essenciais... 33
3.5 Determinação da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix... 34
3.6 Determinação da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Penicillium citrinum... 35
3.7 Determinação da atividade antifúngica in vivo dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix... 35
3.7.1 Determinação do efeito curativo dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix... 36
3.7.2 Determinação do efeito preventivo dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix... 36
3.8 Analise estatística... 37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 37
4.1 Composição química dos óleos essenciais de cinco espécies de Eucalyptus.... 37
4.2 Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix... 44
4.3 Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Penicillium citrinum... 47
4.4 Atividade antifúngica in vivo dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix 53 5 CONCLUSÃO... 62
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS... 62
1. INTRODUÇÃO
O cafeeiro Coffea ssp. é um arbusto da família Rubiaceae do gênero Coffea L., originário da Etiópia e abrange 103 espécies. Atualmente, essa cultura está presente em vários países. A semente contida em seu fruto é utilizada para fabricação do café e derivados, sendo o café uma das bebidas mais consumidas em todos os continentes. O Brasil é o maior produtor de grãos de café do mundo e essa atividade agropecuária movimenta a economia brasileira, gerando empregos diretos e indiretos.
A ferrugem, considerada a principal doença que incide sobre os cafezais em todo o mundo, foi detectada no Brasil em 1970. Desde então, seu controle tem acrescentado custos à produção e, quando não controlada, a doença reduz significativamente a qualidade, produtividade e longevidade das plantas. Outro fator que afeta os grãos de café é o ataque do fungo Penicillium citrinum, comprometendo diretamente a qualidade do grão, modificando seu aspecto visual e causando perda quantitativa e qualitativa do produto.
Para combater os microorganismos comumente encontrados na lavoura e após a colheita, são utilizados controladores químicos; porém, esses produtos possuem em sua composição substâncias que podem causar danos aos aplicadores e ao meio ambiente, além de apresentarem riscos de resíduos presentes no produto final. Dessa forma, torna-se incessante a busca por substâncias de origem natural que possuem atividade antimicrobiana e que possam ser utilizados como crontroladores químicos naturais, minimizando os danos ao meio ambiente, aos agricultores e aos consumidores.
Em contrapartida aos malefícios originados pelo uso dos controladores químicos, os óleos essenciais, por suas diversas propriedades biológicas, vêm sendo uma alternativa viável na substituição desses produtos. Eles são compostos por substâncias de origem natural formados pelo metabolismo secundário de diversas espécies de plantas, dando origem à mistura complexa de diversos compostos que possuem dentre outras atividades, a antifúngica. Essa atividade pode ser evidenciada devido à composição química rica em terpenos e fenilpropanoides ou pelo sinergismo dos constituintes presentes nos óleos essenciais.
A inocuidade dos óleos essenciais permite sua incorporação a alimentos in natura, com o intuito de aumentar suas vidas de prateleira, evitando, assim, sua degradação por fungos e bactérias.
Dentre os principais países produtores de óleos essenciais de Eucalyptus spp., o Brasil destaca-se, estando em quinto lugar, sendo as espécies Eucalyptus citriodora e Eucalyptus
citronelal e 1,8-cineol respectivamente, substâncias muito utilizadas na medicina e na indústria de cosméticos.
Objetivou-se neste trabalho caracterizar quimicamente os óleos essenciais de
Eucalyptus torelliana, Eucalyptus citriodora, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus grandis e Eucalyptus microcorys e avaliar a atividade antifúngica desses óleos essenciais sobre o fungo Hemileia vastatrix, que ataca a cultura cafeeira, e o fungo Penicillium citrinum, que causa danos
aos grãos de café durante o período de armazenamento.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Metabolismo secundário
Metabolismo é definido como um conjunto de reações que estão ocorrendo continuamente nas células, formando ou degradando componentes e fornecendo nutrientes essenciais para manter a vida celular.
O metabolismo é dividido em primário e secundário. O metabolismo primário é aquele em que há a formação de nutrientes essenciais para a vida celular, já o metabolismo secundário é definido pela síntese dos metabólitos que não são essenciais para a vida celular, mas que garantem vantagens para a sobrevivência e para a perpetuação da espécie vegetal em seu ecossistema (SIMÕES et al., 2007).
As vantagens dos metabólitos secundários são diversas, como defesa contra herbívoros e microrganismos, proteção contra a luz ultravioleta, atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes e como intercessores das interações entre as plantas (alelopatia)
(GOOBO-NETO; LOPES, 2007).
A produção de metabólitos secundários nas plantas pode ocorrer em um estágio de vida da planta ou em seu desenvolvimento e em processo de estresse causado por limitações nutricionais ou ataque microbiológico. A origem dessas substâncias ocorre a partir do metabolismo da glicose, sendo os principais intermediários o ácido chiquímico e o acetil-CoA, formando os alcaloides, os flavonoides, os taninos, as cumarinas, as quinonas, os terpenos, os fenilpropanoides, entre outros (SIMÕES et al., 2007).
2.2 Óleos essenciais
Dentre os metabólitos secundários, os constituintes de óleos essenciais vêm sendo largamente estudados. Os óleos essenciais são misturas complexas de compostos orgânicos, obtidos de plantas, tendo como componentes principais terpenos e fenilpropanoides. A composição de um óleo essencial pode variar com a mudança climática, solo, época de coleta, altitude, método de extração e os diferentes biótipos da espécie. Os métodos mais utilizados para realizar a extração dos óleos essenciais são a hidrodestilação, e a destilação por arraste a vapor d’água, podendo também serem extraídos por prensagem, que é bastante utilizado para obter óleo essencial de pericarpo de frutas cítricas (DE SOUZA et al., 2013; SANTOS et al., 2015).
Podem-se utilizar todos os órgãos da planta para se obter o óleo essencial, sendo as folhas mais utilizadas, podendo também extrair o óleo essencial das cascas, flores, rizomas e frutos (DE SOUZA et al., 2013).
Além de apresentar atividades microbiológica e antioxidante, os óleos essenciais podem proporcionar atividades antitumoral e anti-inflamatória e podem exercer diversas outras funções (ABU-DARWISH, et al. 2015).
Após o processo de extração de diversos óleos essenciais, como de eucalipto, canela, gengibre e outros, eles são destinados às indústrias alimentícias e cosméticas. Contudo, apenas uma pequena parcela dos óleos essenciais é usada na indústria farmacêutica como coadjuvante em remédios, bem como na medicina (CAVALEIRO, 2007; DE SOUZA et al., 2013).
Na indústria de alimentos, a busca por antioxidantes naturais que possam ser altamente eficazes e capazes de substituir antioxidantes e antimicrobianos sintéticos como o BHT (2,6-di-tert-butil-4-hidroxitolueno), BHA (3-tert-butil-4-hidroxianisol) e outros é cada vez maior. Os óleos essenciais são substâncias naturais, e dependendo da matéria-prima utilizada, podem apresentar vários componentes com diferentes atividades, como o limoneno, o carvacrol e o eugenol, que são substâncias bioativas que reduzem o crescimento de microrganismos e inibem a oxidação lipídica (SHARAFATI-CHALESHTORI et al., 2014).
Vários produtos à base de óleos essenciais apresentam-se com rótulos mascarados, seja pelo óleo essencial usado que não condiz com o do rótulo, seja pelas atividades que não são verídicas como expressa na embalagem do produto; sendo assim, faz-se necessário o uso de alguns testes para avaliar o potencial desses óleos essenciais (BENTAYEB et al., 2014).
2.2.1 Biossíntese dos terpenos e fenilpropanoides constituintes dos óleos essenciais
Compostos pertencentes às classes dos terpenos e fenilpropanoides são os principais constituintes dos óleos essenciais.
2.2.1.1 Terpenos
São predominantes na constituição química dos óleos essenciais e podem ser formados a partir de duas vias, representados pela via do mevalonato e pela via 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXPS). Nos óleos essenciais, são mais comuns a presença de monoterpenos e sesquiterpenos que possuem em sua composição 10 e 15 átomos de carbono, respectivamente. A unidade básica dos terpenos é o 2-metil-1,3-butadieno (isopreno) com 5 átomos de carbono (Figura 1).
Figura 1- Estrutura química do isopreno
C H2
CH2 CH3
Fonte: do autor
A união de moléculas isopreno leva à formação de monoterpenos (10 átomos de carbono), sesquiterpenos (15 átomos de carbono), diterpenos (20 átomos de carbono) e assim sucessivamente; nos óleos essenciais, predominam os monoterpenos e os sesquisterpenos. Estes são formados por duas rotas metabólicas distintas: a via do mevalonato e a via 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato (DXPS). Na primeira, o difosfato de isopentenil (IPP), unidade ativa dos terpenos, é formado a partir do ácido mevalônico, sendo conhecido como a via clássica para formação dos terpenos, de ocorrência no citosol e retículo endoplasmático. Na segunda, conhecida também como via alternativa, o IPP é formado a partir do piruvato e do gliceraldeído-3-fosfato, sendo essa de ocorrência nos plastídios (ADAM, 1998; BUCHANAN; GRUISSEM; JONES, 2000; DEWICK, 2009).
Na síntese do IPP pela via do ácido mevalônico (Figura 2), ocorre a condensação de três moléculas de acetil-CoA, reações catalisadas pelas enzimas tiolase e hidroximetilglutaril-CoA redutase, formando como produto o 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Em seguida, o HMG-CoA forma o ácido mevalônico pela ação da enzima HMG-CoA redutase. O ácido
mevalônico, então, sofre duas fosforilações sequenciais, gastando ATP e uma subsequente fosforilação/descarboxilação, seguida por uma eliminação para formar o IPP (ADAM 1998; BUCHANAN; GRUISSEM; JONES, 2000; DEWICK, 2009).
Figura 2- Rota metabólica para formação de monoterpenos, sesquiterpenos e diterpenos a partir do ácido mevalônico. CH3 C O SCoA 2 Acetil-CoA CoA SH Tiolase Acetoacetil-CoA CH3 C O CH2 C O SCoA 1) CH3 C O CH2 C O SCoA Acetoacetil-CoA Acetil-CoA CH3 C O SCoA + HMG CoA sintase CoA SH -hidroxi--metilglutaril-CoA (HMG-CoA) CH3 C OH CH2 CH2 C COOH O SCoA 2) CH3 C OH CH2 CH2 C COOH O SCoA -hidroxi--metilglutaril-CoA (HMG-CoA) ácido meváldico hemitioacetal CH3 C OH CH2 CH2 COOH C H OH SCoA NADPH NADP+ 3) 4) CH3 C OH CH2 CH2 COOH C H OH SCoA ácido meváldico hemitioacetal ácido meváldico CH3 C OH CH2 CH2 COOH C O H NADP+/CoA-SH NADPH 5) CH3 C OH CH2 CH2 COOH C O H
ácido meváldico ácido mevalônico CH3 C OH CH2 CH2 COOH CH2 OH NADP+ NADPH
C O HO CH2 C CH3 OH CH2 CH2 OP ácido mevalônico CH3 C OH CH2 CH2 COOH CH2 OH 6) ATP ADP ácido 5-fosfomevalônico ácido 5-fosfomevalônico C O HO CH2 C CH3 OH CH2 CH2 OP ácido 5-pirofosfatomevalônico ADP ATP C O HO CH2 C CH3 OH CH2 CH2 OPP 7) C O HO CH2 C CH3 OH CH2 CH2 OPP ácido 5-pirofosfatomevalônico 8) ATP ADP ácido 3-fosfo-5-pirofosfatomevalônico C O HO CH2 C CH3 OP CH2 CH2 OPP 9) Isopentenil PP (IPP) CH2 C C CH3 H H CH2 OPP CO2, Pi, H2O C O O CH2 C CH3 OP CH2 CH2 OPP H ácido 3-fosfo-5-pirofosfatomevalônico HO P O OH O ADP ATP/Biotina Enzima isomerase CH3 C CH3 CH CH2 OPP Dimetilalil PP (DMAPP) Isopentenil PP (IPP) CH2 C C CH3 H H CH2 OPP 10) CH3 C CH3 CH CH2 OPP CH3 C CH3 CH CH2 CH3 C CH3 CH CH2 DMAPP 11) DMAPP CH3 C CH3 CH CH2 + IPP CH2 C CH2 CH3 CH2 OPP CH3 C CH3 CH CH2 CH2 C C CH3 CH2 OPP H H 12)
Geranil PP (GPP) CH3 C CH3 CH CH2 CH2 C CH3 CH CH2 OPP H H CH3 C CH3 CH CH2 CH2 C C CH3 CH2 OPP 13) Óleos essenciais Sesquiterpenos Monoterpenos CH3 C CH3 CH CH2 CH2 C CH3 CH CH2 CH2 C CH3 CH CH2 OPP Farnesil PP (FPP) FPP sintase + IPP CH3 C CH3 CH CH2 CH2 C CH3 CH CH2 OPP Geranil PP (GPP) 14) Diterpenos GPP sintase + IPP Geranilgeranila PP (GGPP) CH3 C CH3 CH CH2 CH2 C CH3 CH CH2 CH2 C CH3 CH CH2 CH2 C CH3 CH CH2 OPP Fonte: Teixeira (2016)
Na rota alternativa DXPS (Figura 3), a formação do IPP ocorre pela junção do piruvato com o gliceraldeído-3-fosfato. O piruvato reage com a tiamina pirofosfato (TPP) para formar o hidroxietil-TPP, que se condensa com o gliceraldeído pela ação de uma transcetolase. O TPP é liberado, em seguida, formando um composto intermediário de cinco átomos de carbonos 1-deoxi-D-xilulose-5-5-fosfato, que se rearranja e, em seguida, sofre uma redução, formando 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato, que é transformado a IPP (ADAM 1998; BUCHANAN; GRUISSEM; JONES, 2000; DEWICK, 2009).
Figura 3- Rota metabólica para formação do IPP a partir da via DXPS. CH3 C O COOH ácido pirúvico + N S R H3C R1
ânion ilídeo de enxofre da Tiamina N S R H3C R1 C H3C O C O O H 1) N S R H3C R1 C H3C O C O O H N S R H3C R1 C H3C OH C O O 2) N S R H3C R1 C H3C OH C O O CO2 Biotina R N S H3C R1 C H3C OH Enamina 3) Gliceraldeído 3P H C O CH OH CH2 OP + Enamina N S R H3C R1 C H3C OH 4) N S R1 H3C R H3C C OH CH CH OH CH2 OP O H3C C O CH CH OH CH2 OP OH N S R1 H3C R N S R1 H3C R H3C C OH CH CH OH CH2 OP O 5)
6) ânion TPP regenerado N S R1 H3C R + 1-Desoxi-D-xilulose-5P (DXPS) H3C C CH CH OH CH2 OP OH O 1-Desoxi-D-xilulose -5P sintase H3C C O CH CH OH CH2 OP OH N S R1 H3C R 7) C O H C CH3 OH CH OH CH2 OP H3C C OH C CH O H OH CH2 OP Rearranjo pinacol-pinacolona H3C C CH CH OH CH2 OP O O H 1-Desoxi-D-xilulose-5P C O H C CH3 OH CH OH CH2 OP H3C C OH C CH O H OH CH2 OP NADPH CH2 C CH3 OH CH OH CH2 OP HO 2-C-metil-D-eritritol-4P 8) NADP+ Citidina trifosfato CH2 C OH CH3 CH OH CH2 O P O OH O P OH O O citidina HO 4-(CDP)-2-C-metil-D-eritritol 9) 2-C-metil-D-eritritol-4P CH2 C CH3 OH CH OH CH2 OP HO ATP 4-(CDP)-2-C-metil-D-eritritol CH2 C OH CH3 CH OH CH2 O P O OH O P OH O O citidina HO 2-fosfo-4-(CDP)-2-C-metil-D-eritritol CH2 C O CH3 CH OH CH2 O P O OH O P OH O O citidina P O OH HO OH 10) ADP CH2 C O CH3 CH OH CH2 O P O OH O P OH O O citidina P O OH HO OH grupo abandonador: citidina fosfato 2-fosfo-4-(CDP)-2-C-metil-D-eritritol 2-C-metil-D-eritritol-2,4-ciclofosfato 11) CH2 OH C H3C H OH CH2 C P O O OH O P O OH O
CH2 OH CH CH3 CH CH2 OPP OH -H2O CH2 OH C CH3 CH CH2 OPP CH2 OH CH CH3 CH2 CH2 OPP 12) NADPH CH2 OH CH CH3 C O CH2 OPP CH2 OH C CH3 C OH CH2 OPP Tautomerismo ceto-enólico NADP+ NADP+ NADPH O P O OH O CH2 C P O O OH OH H C H3C CH2 OH 2-C-metil-D-eritritol-2,4-ciclofosfato CH2 OH CH CH3 CH2 CH2 OPP Isopentenil PP (IPP) H H CH2 C CH3 C CH2 OPP -H2O 13) Enzima isomerase CH 3 C CH3 CH CH2 OPP Dimetilalil PP (DMAPP) Isopentenil PP (IPP) CH2 C C CH3 H H CH2 OPP 14) Fonte: Teixeira (2016). 2.2.1.2 Fenilpropanoides
Os fenilpropanoides são formados a partir do ácido chiquímico (Figura 4), que formam unidades básicas de ácido cinâmico e p-cumárico. Esses ácidos formados sofrem uma redução enzimática, produzindo propenilbenzeno e/ou alilbenzenos e, por meio de uma oxidação e redução das cadeias laterais, geram os diferentes fenilpropanoides.
Figura 4- Rota metabólica para formação de fenilpropanoides a partir do ácido chiquímico. O O H O H OH OH várias reações OH O NH2 R FAL R = H Fenilalanina R = OH Tirosina OH O R R = H Ácido Cinâmico R = OH Ácido p-cumárico
Redução Oxidação Redução Ciclização
CH2 O R (R = H, OH) (R = H, OH) CH3 R R O O (R = H, OH) (R = H, OH) R Ácido chiquímico
Fonte: SIMÕES et al., 2007.
2.2.2 Atividade biológica dos óleos essenciais e plantas aromáticas
Diversas atividades farmacológicas são atribuídas aos óleos essenciais decorrentes da sua composição diversificada, apresentando atividades anti-inflamatória, antioxidante, microbiológica, alelopática, anticarcinogênica, antiviral, atuando também no sistema digestivo e no aparelho respiratório como analgésico (CAVALEIRO, 2007).
Os radicais livres tem sido os causadores de diversas doenças, como câncer, doenças degenerativas e na aceleração do envelhecimento; com isso, aumentou-se a busca por substâncias que promovem atividade antioxidante e que estabilizam essas substâncias. As atividades antioxidantes dos óleos essenciais foram comprovadas por Rezende et al., (2017), utilizando os óleos essenciais extraídos das folhas de Mentha piperita, Cymbopogon citratus,
Rosmarinus officinalis, Peumus boldus e Foeniculum vulgare, empregando-se os métodos de
sequestro de radicais livres DPPH, ABTS e β- caroteno/ácido linoleico.
Paralelo à atividade antioxidante, a atividade antitumoral é uma das atividades farmacológicas dos óleos essenciais que vêm sendo largamente pesquisada. Estudos realizados por De Oliveira et al., (2015), utilizando o óleo essencial de Callistemon viminalis, que possui como constituintes majoritários o 1,8-cineol, α-pineno e α-terpineol, sobre melanoma, encontraram resultados positivos, reduzindo a viabilidade celular após o tratamento com esse óleo essencial em 40%.
A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais é bastante estudada e requisitada em diversas áreas, principalmente em engenharia de alimentos, uma vez que os óleos essenciais podem ser incorporados a diversos produtos alimentícios, garantindo uma maior vida de prateleira a esses produtos. Camargo et al., (2017) comprovaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Hyptis carpinifolia Benth (rosmaninho) sobre Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Salmonella Choleraesuis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Alternaria alternata, Botrytis cinerea e Fusarium oxysporum, microrganismos responsáveis por
contaminar alimentos.
Na agricultura, além da atividade antimicrobiana, a atividade alelopática dos óleos essenciais tem sido alvo de estudos, uma vez que proporcionam uma melhor produtividade nas culturas. Alvarenga et al., (2015), em estudos sobre atividade alelopática dos óleos essenciais de capim-limão (Cymbopogon citratus L.), alfavaca (Ocimum gratissimum L.) e manjericão (Ocimum basilicum L.), em cultura de alface, encontraram resultados positivos de uma maior germinação e o vigor de aquênios, após o tratamento da plantação com esses óleos essenciais.
A busca por substâncias de origem natural que contenham diversas atividades como as citadas anteriormente vem crescendo cada vez mais, pelo fato de alguns patógenos desenvolverem resistência a alguns produtos sintéticos (MSAADA et al., 2015).
Os constituintes químicos dos produtos naturais desejados são aqueles que apresentam diversas atividades, mas que não são nocivos a quem os ingere, ou prejudicial ao meio ambiente, como no caso dos produtos naturais utilizados para combater patógenos na lavoura. Citam-se alguns desses compostos, como o eugenol, o limoneno, o carvacrol e o geraniol (Figura 5), que
têm sido bastante utilizados, pois não promovem ação mutagênica em baixas concentrações e podem ser facilmente encontrados em diversos produtos de origem natural (SHARAFATI-CHALESHTORI et al., 2013).
Figura 5- Estrutura molecular do eugenol, limoneno, carvacrol e geraniol
CH3 CH3 CH3 O CH3 OH CH2 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O CH3 OH CH2 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
Eugenol Limoneno Carvacrol Geraniol
Fonte: do autor
2.3 Espécies de eucaliptos (Eucalyptus spp.)
As espécies de Eucalyptus spp. (Figura 6) são de origem australiana, mas se desenvolvem em todo o mundo. Acredita-se que as primeiras mudas de Eucalyptus sp. no Brasil foram plantadas no Rio de Janeiro, em 1824, no Jardim Botânico. Hoje, os eucalyptus são utilizados para a produção de celulose na indústria de papel e na produção de carvão que abastece as usinas siderúrgicas como fonte de energia. No entanto, ainda é baixa a utilização dessas plantas para a extração de óleo essencial, prática essa que tem aumentado nos últimos anos (SILVA; BRITO; SILVA, 2006; CASTRO et al., 2016).
Figura 6- Aspecto geral de uma espécie de Eucalyptus sp.
Fonte:https://es.wikipedia.org/wiki/Eucalyptus_dalrympleana
A extração e comercialização de óleo essencial de espécies de Eucalyptus spp., rico em monoterpenos e, em alguns casos em sesquiterpenos, têm colocado o Brasil em uma posição de destaque quanto ao volume e a quantidade de substâncias que possuem atividades biológicas presentes nesses óleos essenciais (STEFFEN; ANTONIOLLI; STEFFEN, 2010).
Os óleos essenciais de Eucalyptus spp. estão sendo muito empregados em outras culturas, proporcionando o seu desenvolvimento, atuando como indutores de resistências. Outro fator importante é seu emprego no combate às pragas e doenças que atacam algumas culturas de interesse comercial. Esse último ocorre, uma vez que a aplicação do óleo essencial resulta no estímulo das plantas em ativar o seu mecanismo de defesa, produzindo fitoalexinas e citotoxinas, além de exercerem efeito tóxico direto sobre os microorganismos e pragas (STEFFEN; ANTONIOLLI; AHMADIAN, STEFFEN 2010).
Os óleos essenciais de Eucalyptus spp., comumente utilizados como controladores microbiológicos, são ricos em 1,8-cineol (1,8-cineol), enquanto os mais usados na indústria de perfumaria são ricos em citral, citronelal e acetato de geraniol (BARBOSA; FILOMENO; TEIXEIRA 2016).
A composição química do óleo essencial de Eucalyptus spp. pode variar de acordo com a espécie. Na Figura 7, estão representados alguns constituintes químicos comumente encontrados nos óleos essenciais de Eucalyptus spp. (ESTANISLAU et al., 2001; SILVA; BRITO; SILVA, 2006).
Figura 7- Constituintes químicos comumentes encontrados nos óleos essenciais de Eucalyptus spp. O O OH OH O OH H H HO OAc 2.4 Cafeeiro (Coffea sp.)
O cafeeiro (Coffea sp.) é um arbusto da família Rubiaceae do gênero Coffea L. que abrange cerca de 103 espécies (Figura 8). A semente contida dentro do seu fruto é utilizada para a obtenção de uma das bebidas mais consumidas em todo o mundo.
piperitona citronelal citronelol linalol 1,8-cineol
E-alo ocimeno γ-terpineno acetato de geranila espatulenol α-tujeno limoneno
Figura 8- Aspecto geral de um cafeeiro
Fonte: http://mateuscoffee.blogspot.com.br/2016/03/coffea-robusta.html
A cafeicultura é uma das principais atividades econômicas brasileira, gerando empregos diretos e indiretos. O Brasil é o maior produtor e exportador de café no mundo. Dados de dezembro de 2016 mostram que os produtos à base de café representaram 9,8% das exportações brasileiras, movimentando cerca de US$ 600,74 milhões. Para 2017 a expectativa de produção foi cerca de 45,56 milhões de sacas de 60 quilos de café beneficiado, mostrando uma redução de 11,3%, quando comparado com a produção de 51,37 milhões de sacas obtidas no ciclo anterior (BRASIL, 2017; CONAB, 2017).
No Brasil, 15 estados brasileiros são responsáveis pela maior produção de café, Bahia, Ceará, Espírito Santo, Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Pará, Paraná, Pernambuco, Rio de Janeiro, Rondônia e São Paulo, em uma área total de 2,22 milhões de hectares. Essas regiões possuem climas, relevos, altitudes e longitudes diferentes que contribuem para que o Brasil possa produzir diversas espécies e qualidade de café (BRASIL, 2017).
Duas espécies são as mais cultivadas, a Coffea arábica L. que proporciona um produto mais fino e de melhor qualidade, e a Coffea canephora P. que é muito utilizada para produzir cafés solúveis e apresentam sabor único, com menor acidez e um maior teor de cafeína (BRASIL, 2017).
Os grãos de café produzidos no Brasil são exportados para diversos países fazendo com que o controle de qualidade para produção dos grãos seja cada vez mais rigoroso. A demanda por café está crescendo a cada dia, fazendo com que os produtores aumentem a área de plantio, porém, além da quantidade têm-se que melhorar também a qualidade do café (PASIN; ALMEIDA; ABREU 2009).
Um café de qualidade é determinado comercialmente pela característica física dos grãos e organolépticas da bebida. Fatores, como clima, disponibilidade hídrica, ataque de microrganismo dentre outros, podem influenciar diretamente na quantidade e qualidade do café. Buscando cada vez mais combater as adversidades que comprometem o cultivo do café, o Brasil é considerado como o maior pesquisador no melhoramento genético, biotecnologia e manejo de pragas na cultura cafeeira, desenvolvidos pelo Consórcio Pesquisa Café, uma rede com 50 instituições que realizam pesquisas para se obter um café de melhor qualidade (BRASIL, 2017).
Patógenos causadores de doenças conhecidas como a mancha-de-olho-pardo causada pelo fungo Cercospora coffeicola, a ferrugem do café causada por Hemileia vastatrix B. e a antracnose causada por Colletrotrichum spp. também influenciam diretamente no baixo rendimento da produção dos grãos de café (RODRÍGUEZ et al., 2016).
Microorganismos que incidem sobre os grãos de café comprometem o seu aspecto visual, aroma e gosto, sendo os fungos filamentosos os que causam maior dano aos grãos. Os fungos filamentosos mais frequentes que se encontram associados aos grãos de café são do gênero Aspergillus, Fusarium e Penicillium, produtores de micotoxinas, que são substâncias nocivas aos seres humanos(BATISTA et al., 2003).
2.5 Ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix B.)
A ferrugem do cafeeiro é uma doença causada pelo fungo Hemileia vastatrix, um fungo basidiomiceto, da família dos Pucciniaceae, identificado por Berkeley no Sri Lanka em 1869 (Figura 9). Essa doença causa uma desfolha no cafeeiro, comprometendo a próxima produção. Foi detectada pela primeira vez no Brasil em 1970 no sul da Bahia; passados cinco meses, a doença foi diagnosticada em todas as regiões do país, sendo considerada atualmente a principal doença prejudicial à plantação e à produção dos cafeeiros em todo o mundo (ZAMBOLIM, 2016).
Figura 9- Aspecto geral da ferrugem do cafeeiro causada pelo fungo Hemelia vastatrix (ferrugem do cafeeiro)
Fonte: Do autor
A época de desenvolvimento da ferrugem do cafeeiro inicia-se de dezembro a janeiro, tendo um crescimento exponencial nos meses de março a maio e picos em junho e julho. Após a colheita, ocorre uma diminuição da doença devido à desfolhação e às baixas temperaturas (ZAMBOLIM, 2016).
Já foram identificadas até o momento cerca de 50 raças de Hemileia vastatrix em todo o mundo, sendo no Brasil encontradas 15 raças. Os mecanismos que levam ao surgimento de novas raças não estão completamente elucidados, sendo a hipótese mais aceitável a mutação; outra hipótese é o cruzamento entre duas espécies de cafeeiro ao longo dos anos, levando a uma variedade de patógeno (VÁRZEA; MARQUES, 2005; ZAMBOLIM, 2016).
A ferrugem nas folhas do cafeeiro é fácil de ser identificada, sendo que aparecem na parte abaxial das folhas e se expandem até 20 mm de diâmetro. Durante esse processo de expansão, são formadas as uredinas nas manchas cloróticas, nas quais são produzidos urediniosporos de cor amarela-alaranjada em pó. Essa produção de uredinas ocorre principalmente no dossel onde há um maior teor de umidade e a temperatura está entre 21 – 25 °C, sendo o local apropriado para produção dos urediniosporos. Os urediniosporos formados nas plantas doentes podem se espalhar por toda a plantação, chegando a alcançar plantações de café localizadas a quilômetros da fonte (ZAMBOLIM, 2016).
Em regiões onde a temperatura está abaixo de 16 °C ou superiores a 30 °C, a doença pode ser encontrada, mas não interfere na produção. Essa doença também está relacionada com a altitude; em plantações que estão a 1200 m acima do nível do mar, não requerem a utilização de fungicidas, pois a incidência de ferrugem atinge no máximo 20% da cultura. Nessa altitude
os níveis de precipitação anual não excedem de 1300 a 1500 mm, comprometendo o desenvolvimento do fungo (ZAMBOLIM, 2016).
Em regiões produtoras de café conilon susceptível à doença e onde o clima é mais quente e úmido, os danos causados à lavoura pela ferrugem podem diminuir a produção em cerca de 30 a 50%, dependendo da resistência do genótipo (CAPUCHO et al., 2013).
2.7 Penicillium citrinum
Além dos microorganismo causadores de doenças aos cafeeiros ou patogênicos, como a ferrugem causada pelo fungo Hemileia vastatrix, outros microorganismo classificados como deterioradores incidem sobre os frutos, afetando negativamente a qualidade do produto final.
O gênero Penicillium citrinum (Figura 10) representa anamorfos (fase assexuada ou mitódica) de ascomicetos classificados na família dos Trichocomaceae, ordem Eurotiales, abrangendo 150 a 200 espécies. Essa espécie é muito encontrada em solo, matérias orgânicas em decomposição, grãos estocados, alimentos, rações, dentre outros materiais (DOMSCH et al., 1980).
Figura 10- Aspecto geral do Penicillium citrinum.
Fonte: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com.br/2015/08/penicillium-citrinum.html
As espécies de Penicillium citrinum são mais frequentes em regiões nas quais a temperatura é baixa, sendo essas pscicrotróficas, capazes de deteriorar alimentos em temperaturas de refrigeração e também caracterizados por serem xerófitas, ou seja, suportam ambientes como de clima árido (PITT; HOCKING, 1997).
O ataque de fungos do gênero Penicillium spp. em alimentos é uma das agravantes na perda de alimentos armazenados e alimentos que precisam ser transportados por um longo período de tempo, até chegar ao consumidor final. Além de causar danos ao sabor e ao aspecto
visual dos alimentos, esses fungos são produtores de micotoxinas, substâncias altamente tóxicas, que possuem como características grande estabilidade térmica. O uso de fungicidas é o principal meio para eliminação desse microrganismo em alimentos; porém, há uma crescente preocupação da aplicação desses fungicidas, uma vez que eles são aplicados após a colheita, não respeitando o tempo de carência até o alimento ser consumido e o desenvolvimento de resistência aos controladores químicos (VITORATOS et al., 2013).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Escolha das plantas para extração dos óleos essenciais
As plantas escolhidas para o desenvolvimento deste trabalho Eucalyptus torreliana,
Eucalyptus citriodora, Eucalyptus camaldulensis, Eucalyptus grandis e Eucalyptus microcorys
foram escolhidas por meio de estudos presentes na literatura e principalmente em trabalhos realizados pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Química Orgânica - Óleos Essenciais da Universidade Federal de Lavras (UFLA). A folha foi a parte da planta escolhida para ser utilizada na extração dos óleos essenciais.
3.2 Coleta do material vegetal
As folhas de cinco espécies de Eucalyptus spp. foram coletadas em dias quentes, na parte da manhã, no Viveiro do Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Lavras/MG (DEF/UFLA) e encaminhadas ao Laboratório de Química Orgânica- Óleos essenciais (DQI-UFLA), onde foram limpas, picadas e pesadas. A planiha com os determinados números de registro e coordenadas geográficas dos eucaliptos utilizados pode ser encontrada no DEF/UFLA e estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1- Número de registro e coordenadas geográficas das espécies de Eucalyptus utilizadas.
E. torreliana E. citriodora E. camaldulensis E.grandis E. microcorys
Numero de registro (4) (10150) (10533/10266) (48) (8717) Coordenadas geograficas 16°49’ 145°’38’ 23°25’ 150°20’ 17°14’ 145°59’ 17°12’ 145°35’ 28°30’ 153°19’
3.3 Extração dos óleos essenciais
Os óleos essenciais foram extraídos no Laboratório de Química Orgânica – Óleos Essenciais da Universidade Federal de Lavras. O método de extração empregado foi o de hidrodestilação, utilizando-se o aparelho de Clevenger modificado (BRASIL, 2010). Foram pesados 300 g do material vegetal fresco (folhas) e submetidos ao processo de hidrodestilação por 2 horas. Após a extração, o óleo essencial foi separado do hidrolato por centrifugação, utilizando uma centrífuga de bancada de cruzeta horizontal (Fanem Baby®I Modelo 206 BL) a 965 g por 5 minutos. Em seguida, o óleo essencial foi pipetado com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e, posteriormente, armazenado em recipiente âmbar sob refrigeração.
Paralelo à extração dos óleos essenciais, foram realizados testes para determinação do teor de umidade do material vegetal de acordo com a metodologia proposta por Pimentel et al. (2008), para posterior cálculo do rendimento dos óleos essenciais.
Para determinação do rendimento dos óleos essenciais, foram adicionados 5g do material e 80 mL de ciclo hexano em um balão volumétrico de 250 mL acoplado a um condensador com coletro volumétrico graduado (Dean Stark). O sistema foi submetido à aquecimento por 2 horas, medindo-se o volume de água ao final desse tempo. O teor de umidade foi calculado de acordo com a equação abaixo, em que R representa o rendimento do óleo essencial (base livre de umidade)
Equação 1
3.4 Caracterização química dos óleos essenciais
A caracterização química dos óleos essenciais foi realizada na Central de Análises e Prospecção Química (CAPQ) da UFLA, utilizando um cromatógrafo gasoso acoplado a um detector de espectrometria de massas (CG/EM) e um cromatógrafo gasoso acoplado a um detector de ionização em chama (CG/DIC). Os constituintes dos óleos essenciais foram identificados, utilizando-se um aparelho Shimadzu GC-17 A, com detector seletivo de massas modelo QP 5050 A, sob as seguintes condições experimentais; coluna capilar de sílica fundida (30 m x 0,25 mm) com fase ligada DBS (0,25 µm de espessura de filme); gás de arraste foi o
%𝑅 = 100 𝑥 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑜 ó𝑙𝑒𝑜
𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 − (𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑥 𝑢𝑚𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒) 5
Hélio a um fluxo de 1,18 mL min-1 a 210 °C; a temperatura iniciou-se em 60 °C, seguida de um aumento de 3 °C até 240 °C; posteriormente, a 10 °C até chegar em 300 °C, na qual permaneceu constante por 7 min; a temperatura do injetor foi de 220 °C e a do detector (ou interface) de 240 °C; foram injetados 0,1 μL de amostra, diluída em hexano a uma taxa de partição de 1:100; a energia de impacto foi de 70 eV; foi injetada também uma mistura de hidrocarbonetos (C9H20;
C10H22; ...; C24H50; C25H52; C26H54).
A quantificação dos constituintes foi realizada utilizando-se um cromatógrafo gasoso (Shimadzu CG – 17A) equipado com um detector de ionização de chamas (FID). Os parâmetros experimentais de análise foram os mesmos utilizados na identificação dos constituintes químicos por CG/EM, com temperatura do detector de 300 °C.
Os constituintes foram identificados, comparando os índices de retenção calculados, pela equação de Van Den Dool e Kratz (1963) em relação à série homóloga de alcanos (nC8- nC18) e com extrapolação para C19 e C20, com os índices de retenção da literatura de acordo com Adams (2007) e duas bibliotecas disponíveis no equipamento a NIST107 e NIST2, sendo possível comparar os espectros obtidos das amostras com os já existentes na literatura.
3.5 Determinação da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Hemileia
vastatrix
Este teste foi realizado em triplicata, avaliando-se a porcentagem de germinação dos tratamentos com os óleos essenciais em relação ao tratamento com o controle positivo utilizando-se água. O teste empregado foi o de microdiluição. Inóculos coletados no campo foram diluídos em água até atingirem uma concentração de 106 esporos por mL-1, contados em câmera de Neubauer. Volumes de 300 µL do inóculo foram transferidos para placas de Petri de 6 cm de diâmetro, contendo uma mistura de 5 mL de meio de cultura ágar/água (2%). Nas placas de Petri, foram adicionados volumes de 0,25; 0,50; 1,25; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; e 15,0 μL dos óleos essenciais, de modo a obter as concentrações finais de 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000 e 3000 μLL-1 para cada tratamento. O controle negativo foi realizado utilizando 5 mL de meio de cultura ágar/água (2%) e 300 µL de inóculo. O controle positivo foi realizado utilizando 15,0 µL do fungicida controle (Opera), dose recomendada para 5 mL de meio. As placas foram incubadas em BOD a 25 ºC, por um período de 24 horas. Para contagem dos esporos, foi padronizada a parte superior direita da placa de Petri, para realização das leituras em microscópio (PEREIRA et al., 2012 a).
3.6 Determinação da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Penicillium
citrinum
A determinação da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais sobre Penicillium
citrinum foi realizada avaliando o crescimento micelial (CM). Volumes de 0,5; 1,0; 2,5; 5,0;
10,0; 15,0; 20,0; e 30,0 μLL-1 dos óleos essenciais foram adicionados às placas de Petri de 15 cm contendo 10 mL de meio de cultura Malt Extract Ágar (MEA) à (2%), de modo a obter as concentrações finais de 50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000 e 3000 μLL-1 dos óleos essenciais para cada tratamento. Em seguida, o fungo foi repicado nessas placas e mantidos em BOD a 24 ºC. Como controle negativo, o fungo foi repicado em uma placa contendo apenas o meio de cultura Malt Extract Ágar (MEA) à (2%). A avaliação foi realizada em triplicata, avaliando o crescimento micelial dos tratamentos com óleo essencial em relação ao controle negativo, após 7 dias de incubação (VITORATOS et al., 2013).
O micoorganismo utilizado neste experimento pode ser encontrado na micoteca do Laboratório de Microbiologia da Epamig/UFLA, o qual possui como chave de identificação o código PYC 27.
3.7 Determinação da atividade antifúngica in vivo dos óleos essenciais sobre Hemileia
vastatrix
Para a realização dos testes in vivo dos óleos essenciais sobre o fungo Hemileia
vastatrix, foram utilizadas mudas de cafeeiro da variedade Mundo Novo que estavam mantidas
em uma casa de vegetação, a uma temperatura controlada de 30 °C e umidade relativa do ar de 47%. A determinação da atividade antifúngica in vivo dos óleos essenciais sobre Hemileia
vastatrix foi realizada mediante a avaliação do efeito curativo e do efeito preventivo.
As avaliações dos efeitos curativo e preventivo foram realizadas utilizando uma escala de 1 a 4, em que 1 corresponde às folhas sem esporos; 2 às folhas com pouca pústula esporulada; 3 às folhas com mais de 50% das pústulas esporuladas e 4 às folhas com 100% das pústulas esporuladas (TAMAYOU, 1988).
Não foi realizada a atividade antifúngica in vivo com o óleo essencial de E. torreliana sobre o fungo Hemileia vastatrix, devido a esse óleo essencial apresentar uma baixa atividade antifúngica em relação aos outros óleos essenciais testados e em razão do seu rendimento ser baixo, não sendo viável industrialmente.
3.7.1 Determinação do efeito curativo dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix
O efeito curativo dos óleos essenciais foi determinado borrifando os óleos essenciais de E. microcorys, E. citriodora, E. camaldulensis e E. grandis, nas conentrações de 250, 250, 500 e 1500 μLL-1, respectivamente, na parte abaxial das folhas do cafeeiro da variedade Mundo Novo contaminadas com Hemileia vastatrix. As concentrações dos óleos essenciais utilizadas foram determinadas com base na CMI encontradas nos testes in vitro. O controle negativo foi realizado, utilizando-se água e o controle positivo realizado utilizando-se o fungicida controle (Opera). Um ensaio feito com uma solução de leite em pó na concentração de 10 gL-1 também foi realizado, de modo a avaliar se esse produto utilizado na diluição dos óleos essenciais exerce atividade antifúngica sobre Hemileia vastatrix.
Após 20 dias, foram avaliadas as lesões, comparando 5 folhas colhidas ao acaso de cada tratamento com 5 folhas colhidas ao acaso do controle negativo (PEREIRA et al., 2012 b; TAMAYOU, 1988).
3.7.2 Determinação do efeito preventivo dos óleos essenciais sobre Hemileia vastatrix
O efeito preventivo dos óleos essenciais foi determinado borrifando os óleos essenciais de E. microcorys, E. citriodora, E. camaldulensis e E. grandis, nas conentrações de 250, 250, 500 e 1500 μLL-1 respectivamente, na parte abaxial das folhas sadias de mudas de cafeeiro da espécie Mundo Novo. As concentrações dos óleos essenciais utilizadas foram determinadas com base na CMI encontradas nos testes in vitro. O controle negativo foi realizado com água e o controle positivo foi realizado utilizando o fungicida controle (Opera). Um ensaio feito com uma solução de leite em pó na concentração de 10 gL-1 também foi realizado, de modo a avaliar se esse produto utilizado na diluição dos óleos essenciais exerce atividade antifúngica sobre Hemileia vastatrix.
Após 2 dias, borrifou-se uma solução de esporos de Hemileia vastatrix na concentração de 106 esporos/mL na parte abaxial das folhas do cafeeiro. Após 20 dias da inoculação de
Hemileia vastatrix, foram avaliadas as lesões comparando 5 folhas colhidas ao acaso de cada
tratamento, com 5 folhas colhidas ao acaso da testemunha (PEREIRA et al., 2012 b;
3.8 Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) com 3 repetições para a atividade in vitro dos óleos essenciais. O programa estatístico utilizado foi o SISVAR (FERREIRA, 2011). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade para cada óleo essencial, considerando 8 concentrações (50, 100, 250, 500, 1000, 1500, 2000 e 3000 μLL-1).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Composição química e rendimento dos óleos essenciais de cinco espécies de Eucalyptus.
O rendimento dos óleos essenciais de E. grandis, E. torreliana, E. camaldulensis, E.
microcorys e E. citriodora foram de 4,9; 0,45; 3,55; 2,8 e 3,96%, respectivamente, rendimento
esse alto tratando-se de óleos essenciais.
Os cromatogramas e os constituintes dos óleos essenciais das cinco espécies de
Eucalyptus estão representados nas Figuras 11 – 15 e nas Tabelas 2 - 6.
A composição química dos óleos essenciais das cinco espécies de Eucalyptus foi diferente para todas as amostras; porém, os constituintes químicos (1,8-cineol, pineno e α-terpineol) foram comuns na maioria dos óleos essenciais.
Figura 11- Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus grandis.
Fonte: do autor
Tabela 2- Composição química do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus grandis
Compostos IRcal Área (%)
1 α-Pineno 934 36.35 2 Canfeno 951 1.14 3 β-Pineno 980 0.18 4 p-Cimeno 1028 0.41 5 1,8-cineol 1033 37.43 6 α-Fenchol 1122 1.92 7 NI 1130 0.35 8 trans-Pinocarveol 1144 1.93 9 Isoborneol 1175 5.38 10 α-Terpineol 1199 8.71 11 NI 1421 0.21 12 NI 1432 0.28 13 NI 1453 3.28 14 Espatulenol 1581 0.69 15 NI 1615 1.74
Total dos constituintes químicos identificados 94,24%
De acordo com os dados descritos na Tabela 2, é possível observar que o óleo essencial de E. grandis apresentou 15 constituintes químico; porém, apenas 10 foram identificados. Os constituintes químicos majoritários foram α-pineno (36,35%), 1,8-cineol (37,43%), α-terpineol (8,71%) e isoborneol (5,38%).
Estanislau et al (2001) avaliando a caracterização química do óleo essencial de E.
grandis, identificaram 19 constituintes químicos, sendo majoritários o β-pineno (11,54%),
o-cimeno (16,66%), γ-terpineno (16,84%) e α-terpineol (8,71%), dados diferentes deste trabalho, em relação à quantidade de cada constituinte químico e ao 1,8-cineol, que não foi encontrado por esses autores.
Barbosa et al (2016) mostraram uma variação na concentração dos constituintes químicos majoritários e minoritários extraídos do óleo essencial de E. grandis. Para os autores, os constituintes químicos α-pineno, 1,8-cineol, p-cimeno e γ -terpineno são comumente encontrados nesse óleo essencial.
No óleo essencial de E. camaldulensis (Figura 12), foram identificados 7 constituintes químicos, sendo os majoritários o 1,8-cineol (41,61%), α-terpineol (19,87) e α-pineno (15,81%) (Tabela 3).
Figura 12- Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus camaldulensis.
Tabela 3- Composição química do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus
camaldulensis
Compostos IRcal Área (%)
1 α-Pineno 931 15,81 2 o-Cimeno 1025 6,84 3 Limoneno 1030 1,70 4 1,8-cineol 1032 41,61 5 γ-Terpineno 1058 6,71 6 α-Terpineol 1297 19,87 7 α-Eudesmol 1656 7,46
Total dos constituintes químicos identificados 100%
*IRcal: Indice de Retenção Calculado.
DOGAN et al (2017), analisando a composição química do óleo essencial de E.
camaldulensis, encontraram como constituintes químicos majoritários p-cimeno (42.1%),
1,8-cineol (14.1%), α-pineno (12.7%) e α-terpinol (10.7%), dados coerentes com aqueles encontrados neste trabalho; porém, em concentrações diferentes.
Estudos já realizados sobre a extração do óleo essencial de E. camaldulensis no Brasil comprovaram uma variação nos constituintes químicos majoritários e em suas concentrações; porém, o 1,8-cineol está sempre presente nesse óleo essencial e em maiores concentrações que os outros constituintes (BARBOSA; FILOMENO; TEIXEIRA 2016).
Os dados obtidos para a caracterização e quantificação do óleo essencial de E. citriodora estão apresentados na Figura 13 e descritos na Tabela 4.
Figura 13- Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus citriodora
Tabela 4- Composição química do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus citriodora
Compostos IRcal Área (%)
1 Isopulegol 1151 2,12
2 Citronelal 1154 88,83
3 Iso isopulegol 1161 4,73
4 NI 1174 0,93
5 Citronelol 1234 3,39
Total dos constituintes químicos identificados 99,07%
*NI: composto não identificado; IRcal: Indice de Retenção Calculado.
De acordo com os dados descritos na Tabela 6, é possível observar que o óleo essencial de E. citriodora apresentou 5 constituintes químicos, sendo o citronelal (88,83%) o majoritário. O alto teor de citronelal no óleo essencial de E. citriodora também foi encontrado por Estanislau et al., (2001), que encontraram 82,33% desse constituinte químico no óleo essencial em estudo, dados que corroboram com os encontrados neste trabalho.
Barbosa et al., (2016) relatam que o citronelal foi o principal constituinte químico encontrado e em altas concentrações em 9 óleos essenciais de E. citriodora extraídos de diferentes locais no Brasil. Outros constituintes químicos em menores concentrações, como citronelol, acetato de citronelila e iso pulegol também foram encontrados.
A Figura 14 e a Tabela 5 mostram respectivamente a composição química do óleo essencial de E. microcorys.
Figura 14- Cromatograma do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus microcorys
Fonte: do autor
Tabela 5- Composição química do óleo essencial extraído das folhas de Eucalyptus microcorys
Compostos IRcal Área (%)
1 α-Pineno 934 19.45 2 β-E-Ocimeno 949 0.10 3 Canfeno 951 1.02 4 p-Cimeno 1027 5.32 5 Limoneno 1031 0.58 6 1,8-cineol 1033 39.08 7 Acetato de fenchila 1122 3.16 8 trans-Pinocarveol 1144 9.86 9 Pinocarvona 1164 5.05 10 Isoborneol 1175 7.70 11 α-Terpineol 1199 8.68
Total dos constituintes químicos identificados 100%
*IRcal: Indice de Retenção Calculado.
No óleo essencial de E. microcorys, foram identificados 11 constituintes, sendo os majoritários o 1,8-cineol (39,08%), α-pinene (19,45%) e α-terpineol (9,86%).
Estanislau et al (2001) identificaram 7 constituintes químicos no óleo essencial de E.
microcorys, sendo o 1,8-cineol (86,72%), α-terpineol (3,90%) e p-cimeno (2,82%) os
