FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PRÉ-TRATAMENTOS
DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
CONSIDERANDO ALTAS CARGAS DE SÓLIDOS
Campinas 2015
LUIZA HELENA DA SILVA MARTINS
AVALIAÇÃO DE DIFERENTES PRÉ-TRATAMENTOS DO BAGAÇO
DE CANA-DE-AÇÚCAR CONSIDERANDO ALTAS CARGAS DE
SÓLIDOS
Tese de Doutorado apresentada á Faculdade de Engenharia Química, da Universidade Estadual de Campinas, como requisito para obtenção do título de Doutora em Engenharia Química.
Orientadora: Profa. Dra. Aline Carvalho da Costa
Campinas 2015
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA LUIZA HELENA DA SILVA MARTINS E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ALINE CARVALHO DA COSTA
da Área de Engenharia e Arquitetura Elizangela Aparecida dos Santos Souza - CRB 8/8098
Martins, Luiza Helena da Silva, 1984-
M366a Avaliação de diferentes pré-tratamentos do bagaço de cana de açúcar considerando altas cargas de sólidos / Luiza Helena da Silva Martins. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Aline Carvalho da Costa.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
1. Bagaço de cana. 2. Pré-tratamento. 3. Hidrólise enzimática. 4. Fermentação. I. Costa, Aline Carvalho da,1970-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of different pretreatments of sugarcane bagasse
considering high solid loads
Palavras-chave em inglês:
Sugarcane bagasse Pretreatment
Enzymatic Hydrolisis Fermentation
Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Químicos Titulação: Doutora em Engenharia Química
Banca examinadora:
Vera Lúcia Reis de Gouveia Laura Plazas Tovar
Elenise Bannwart de Moraes Torres George Jackson de Moraes Rocha
Data de defesa: 23-06-2015
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Química
____________________________________________
Dra. Aline Carvalho da Costa
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
____________________________________________
Dra. Vera Lúcia Reis de Gouveia
CTBE - Lab. Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
_____________________________________________
Dra. Laura Plazas Tovar
UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas
_____________________________________________
Dra. Elenise Bannwart de Moraes Torres
CTBE - Lab. Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
_____________________________________________
Dr. George Jackson de Moraes Rocha
CTBE - Lab. Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol
vii
RESUMO
A indústria sucroalcooleira é uma atividade de grande importância para o Brasil, e tem o bagaço de cana como o principal subproduto, o qual pode ser utilizado para a produção de etanol de 2ª geração. Nesse contexto, são cada vez maiores os estudos relacionados com as tecnologias de pré-tratamento, etapa fundamental para a eficiente produção deste tipo de combustível. Entretanto, o custo de reagentes e gastos com tratamento de águas residuais ainda é um obstáculo para este tipo de tecnologia. Assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar 3 tipos de pré-tratamentos do bagaço de cana: H2SO4 diluído, Peróxido de
hidrogênio alcalino (PHA) e hipoclorito-hidrogênio peróxido (Ox-B), com a utilização de elevadas cargas de sólidos, tanto na etapa de pré-tratamento quanto na de hidrólise enzimática, visando a redução do uso de reagente e do consumo de água. Para todos os tratamentos foram realizados planejamentos experimentais de 3 níveis (3²). O material pré-tratado com H2SO4 diluído, PHA e Ox-B foi submetido a hidrólise enzimática com 10%
(m/v) de sólidos, com carga enzimática de 15 FPU/g e 25 CBU/g de bagaço. Para a melhor condição do pré-tratamento realizado com PHA foi estudada a substituição do uso do NaOH por KOH e Mg(OH)2 para ajuste do pH em 11,5. Um estudo do aumento da carga de
sólidos na hidrólise enzimática também foi realizado (batelada simples e alimentada) para os materiais pré-tratados com os três reagentes estudados, sendo os hidrolisados submetidos a fermentação com S. cerevisiae. As maiores conversões obtidas na hidrólise enzimática para carga de sólidos de 10% (m/v) foram: 60,80% para o H2SO4, 76,00% para o PHA,
66,9% para o Ox-B. O aumento da carga de sólidos na hidrólise enzimática teve efeito negativo na conversão. O material pré-tratado com PHA foi o que mostrou melhores resultados tanto para a hidrólise enzimática como para a fermentação, que atingiu rendimento máximo de 84,48% de etanol a 34ºC a 20% (m/v) de sólidos no pré-tratamento e 10% (m/v) de sólidos na hidrólise enzimática.
Palavras-chave: Pré-tratamento, Hidrólise enzimática, altas cargas de sólidos, bagaço, fermentação
ix
ABSTRACT
The sugar industry is a very important activity for Brazil, and has the sugarcane bagasse as the main co-product, which can be used for the 2nd generation ethanol production. In this context, there are increasing studies related to pretreatment technologies, essential step for efficient production of this type of fuel. However, the cost of reagents and treatment costs of waste waters are still an obstacle for this type of technology. Thus, this study aimed to evaluate three types of pretreatments of sugarcane bagasse: diluted H2SO4 , alkaline
hydrogen peroxide (APH) and hypochlorite-hydrogen peroxide (Ox-B), using high solid loadings, both in the pretreatment and the enzymatic hydrolysis step in order to reduce reagent usage and consumption of water. For all pre-treatments were carried out experimental design of three levels (3²). The pretreated material with dilute H2SO4, APH
and Ox-B was subjected to enzymatic hydrolysis with 10% (w/v) solids, with enzyme load of 15 FPU/g and 25 CBU/g of substrate. To the best condition pretreatment was performed with PHA studied substitution of KOH for the NaOH and Mg(OH)2 for pH adjustment to
11.5. A study of increased solids loading in the enzymatic hydrolysis was also performed (simple and fed batch) for pretreated material with the three reagents studied, and the hydrolysates subjected to fermentation with S. cerevisiae. The highest conversions obtained in the enzymatic hydrolysis to solids loading of 10% (w/v) were 60.80% for the H2SO4 76.00% for the APH, 66.9% for Ox-B. The increased of solids loading on enzymatic hydrolysis had a negative effect on conversion. The pre-treated material showed that the PHA was the best results for both the enzymatic hydrolysis and also for fermentation, reaching a maximum yield of 84.48% ethanol at 34 ° C with 20% (w/v) solids in the pre-treatment and 10% (w/v) solids in the enzymatic hydrolysis.
Keywords: Pre-treatment, enzymatic hydrolysis, high solids loadings, bagasse, fermentation
xi SUMÁRIO RESUMO ... vii ABSTRACT ... ix SUMÁRIO ... xi AGRADECIMENTOS ... XIX ÍNDICE DE FIGURAS ... xxi
ÍNDICE DE TABELAS ... xxv
ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES ... xxix
ÍNDICE DE EQUAÇÕES ... xxxi
CAPÍTULO 1 ... 1 INTRODUÇÃO ... 1 1. Objetivos ... 5 1.1 Objetivo geral ... 5 1.2 Objetivos específicos ... 5 1.3 Organização do trabalho ... 7 1.4 Produção bibliográfica ... 8
1.4.1 Trabalhos publicados em anais de congressos ... 8
1.4.2 Artigo aceito para publicação ... 9
CAPÍTULO 2 ... 10
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 10
2.1 Cana-de-açúcar ... 10
2.1.1 Bagaço de cana ... 11
2.1.2 Componentes do bagaço de cana ... 12
2.1.2.1 Celulose ... 12
2.1.2.2 Hemiceluloses ... 13
2.1.2.3 Lignina ... 14
2.1.2.4 Extrativos ... 14
2.3 A produção do etanol de segunda geração (E2G) ... 15
2.3.1 Conceito de biorrefinaria ... 16
2.3.2 Pré-tratamento ... 18
2.3.2.3 Pré-tratamento Químico ... 20
2.3.2.3.1 Pré-tratamento ácido ... 20
2.3.2.3.3 Pré-tratamento hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio (Ox-B) ... 23
2.3.2.3.4 Peróxido de hidrogênio alcalino (PHA) ... 26
2.4 Formação de inibidores ... 27
2.5 Hidrólise enzimática ... 29
2.5.1 Enzimas celulases ... 31
2.5.2 Interação enzima-sustrato ... 34
2.6 O uso de altas cargas de sólidos nas etapas de pré-tratamento e hidrolise da biomassa ... 35
2.6.1 Pré-tratamento em condições de elevadas cargas de sólidos ... 36
xii
CAPÍTULO 3 ... 41
PREPARO DA BIOMASSA E ATIVIDADE DAS ENZIMAS ... 41
3.1 Introdução ... 41
3.2 Metodologia experimental ... 41
3.2.2 Enzimas ... 41
3.2.3 Determinação da atividade enzimática ... 41
3.2.4 Análise da composição química do bagaço de cana ... 42
3.3 Resultados e discussão ... 42
3.3.1 Análise da composição química do bagaço de cana bruto... 42
3.3.2 Determinação da atividade das enzimas ... 43
3.3.2.1 Determinação da atividade enzimática da celulase ... 43
3.3.2.2 Determinação da atividade enzimática da β-glicosidase ... 46
CAPÍTULO 4 ... 49
ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DO BAGAÇO E DO LICOR APÓS PRÉ-TRATAMENTOS COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO, PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO E SOLUÇÃO HIPOCLORITO DE SÓDIO/PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (Ox-B) ... 49
4.1 Introdução ... 49
4.2 Metodologia experimental ... 49
4.2.2 Pré-tratamento com PHA... 51
4.2.3 Pré-tratamento com Ox-B ... 52
4.2.3.1 Preparo da solução de OX-B ... 52
4.2.3.2 Pré-tratamento utilizando o OX-B ... 52
4.2.4 Cálculo do fator de severidade ... 53
4.2.5 Composição da fração sólida ... 53
4.2.6 Composição da fração líquida ... 53
4.3 Resultados e discussão ... 54
4.3.1 Composição físico-química da fração sólida dos materiais pré-tratados ... 54
4.3.2 Solubilização dos componentes na etapa de pré-tratamento ... 63
4.3.3 Composição físico-química da fração líquida dos materiais pré-tratados ... 70
4.3.3.2 Carboidratos (monômeros e oligômeros) no licor de pré-tratamento... 70
4.3.3.2 Carboidratos, ácido acético e produtos de degradação no licor de pré-tratamento ... 76
4.3.3.3 Lignina recuperada no licor de pré-tratamento... 82
CAPÍTULO 5 ... 86
ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DAS CONDIÇÕES DE PRÉ-TRATAMENTO COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO, PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO E SOLUÇÃO HIPOCLORITO DE SÓDIO/PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (Ox-B) NA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA ... 86
5.1 Introdução ... 86
5.2.1 Hidrólise enzimática ... 87
5.3 Resultados e discussão ... 87
5.3.1 Hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4 diluído ... 87
xiii
5.3.3 Perfis de hidrólise para a hidrólise do pré-tratamento catalisado com H2SO4 .. 93
5.3.4 hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com PHA ... 95
5.3.5 Análise estatística da hidrolise enzimática do bagaço pré-tratado com PHA .... 98
5.3.7 hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com Ox-B ... 103
5.3.8 Análise estatística da hidrolise enzimática do bagaço pré-tratado com Ox-B alcalino ... 106
5.4 Conclusões ... 111
CAPÍTULO 6 ... 113
ESTUDOS DA ESTRUTURA FÍSICA DO BAGAÇO SUBMETIDO AOS PRÉ-TRATAMENTOS COM ÁCIDO SULFÚRICO DILUÍDO, PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO E SOLUÇÃO HIPOCLORITO DE SÓDIO/PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (Ox-B) ... 113
6.1 Introdução ... 113
6.2 Metodologia experimental ... 113
6.2.1 Determinação do índice de cristalinidade (CrI) ... 114
6.2.2 Microscopia Eletrônica por Varredura (MEV) ... 115
6.2.3 Análise de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ... 115
6.2.4 Capacidade de retenção de água (CRA) ... 116
6.3 Resultados e discussão ... 116
6.3.1 Índice de cristalinidade (CrI) para o bagaço pré-tratado com H2SO4, PHA e Ox-B. ... 116
6.3.2 Microscopia Eletrônica por Varredura (MEV) das biomassas crua e pré-tratadas ... 118
6.3.2 Capacidade de retenção de água (CRA) ... 119
6.3.2.1 Capacidade de retenção de água (CRA) das amostras pré-tratadas com H2SO4 ... 119
6.3.2.2 Capacidade de retenção de água (CRA) para o PHA ... 121
6.3.2.3 Capacidade de retenção de água (CRA) para o Ox-B ... 123
6.3.3 Análise de FTIR para as biomassas pré-tratadas ... 125
6.4 Conclusões ... 128
CAPÍTULO 7 ... 130
ESTUDOS ADICIONAIS REALIZADOS NO BAGAÇO DE CANA SUBMETIDO AOS TRÊS DIFERENTES TIPOS DE PRÉ-TRATAMENTOS ... 130
7.1 Introdução ... 130
7.2 Materiais e métodos ... 131
7.2.1 Deslignificação do bagaço pré-tratado com H2SO4 diluído ... 131
7.2.2 Pré-tratamento com PHA utilizando bases alternativas ... 131
7.2.3 Composição da fração sólida ... 132
7.2.4 Composição da fração líquida ... 132
7.2.5 Cinética de deslignificação para PHA e Ox-B... 132
7.2.6 Hidrólise enzimática ... 132
7.3 Resultados e discussão ... 133 7.3.1 Composição do bagaço pré-tratado com H2SO4 e deslignificado com 1% de
xiv
NaOH ... 133
7.3.2 Hidrólise enzimática da biomassa deslignificada ... 137
7.3.4 Substituição da base NaOH por bases alternativas ... 142
7.3.5 Composição da fração sólida e da fração líquida da biomassa pré-tratada com PHA utilizando bases alternativas. ... 142
7.3.6 Hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com PHA utilizando bases alternativas ... 145
7.3.7 Obtenção de dados cinéticos para a deslignificação ... 148
7.4 Conclusões ... 159
CAPÍTULO 8 ... 160
ESTUDO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DOS PRÉ-TRATAMENTOS ESTUDADOS ... 160
8.1 Introdução ... 160
8.2 Metodologia experimental ... 160
8.2.1 Hidrólise enzimática em batelada simples... 160
8.2.2 Hidrólise enzimática em batelada alimentada ... 161
8.2.3 Estudo da variação da carga enzimática da β-glicosidase ... 161
8.2.4 Análise de Tukey ... 161
8.3 Resultados e discussão ... 161
8.3.1 Hidrólise enzimática em batelada simples e batelada alimentada ... 161
8.3.1.1 Perfil de açúcares ... 161
8.3.1.2 Conversão e rendimento global ... 165
8.3.2 Estudo da variação da carga enzimática da β-glicosidase ... 168
8.4 Conclusões ... 172
CAPÍTULO 9 ... 173
FERMENTAÇÃO DAS HEXOSES DOS HIDROLISADOS OBTIDOS DOS PRÉ-TRATAMENTOS ESTUDADOS PARA PRODUÇÃO DE E2G ... 173
9.1 Introdução ... 173
9.2 Metodologia experimental ... 173
9.2.1 Microorganismo ... 173
9.2.2 Meio de ativação do microrganismo ... 173
9.2.3 Meio semi-sólido para ativação da levedura ... 174
9.2.4 Meio de crescimento do microrganismo ... 174
9.2.5 Esterilização dos hidrolisados ... 175
9.2.6 Fermentação... 175
9.2.7 Determinação de concentração de células totais ... 176
9.3 Resultados e discussão ... 177
9.4 Conclusão ... 182
CONCLUSÕES FINAIS ... 184
SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS ... 186
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 187
APÊNDICES ... 208
APÊNDICE I ... 208
xv APÊNDICE III ... 213 APÊNDICE IV ... 215 APÊNDICE V ... 216 APÊNDICE VI ... 218 APÊNDICE VII ... 219 APÊNDICE VIII ... 225
xvii
Dedico este trabalho à minha mãe Marli Helena da Silva.
xix
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a DEUS por estar aqui e a Nossa Senhora de Nazaré pelas graças alcançadas.
À minha, mãe Marli Helena da Silva, pela ótima criação, pelo incentivo e pelo exemplo em todos os momentos de minha vida;
À professora, Dra. Aline Carvalho pela orientação e a oportunidade de realizar esse trabalho;
Ao professor Dr Rubens Maciel Filho por permitir o meu acesso em seus laboratórios;
À pesquisadora, Dra. Sarita Rabelo e ao Professor Dr. Rafael Ramos de Andrade pela amizade e por acompanharem o trabalho, de maneira muito gentil e pela colaboração valiosa;
Aos meus familiares, em especial meus irmãos Adelson, Júlia e Ednilza e minhas primas Victória, Magda, meus primos Raphael e Rangel e à tia Raquel.
Ao Tomáš Procházka, miluji te forever. Obrigada por fazer parte da minha.
Aos amigos Renan Chisté, Débora Kono, Johnatt Rocha, Rosi Costa, Wendy Francês, Érika Marques, Corina Sepeda, Kelly Lendini Troni, e Moisés Alves.
A todos os amigos que fazem e fizeram parte da equipe do Laboratório de Engenharia de Processos Fermentativos e Enzimáticos (LEPFE), em especial João Moreira Neto, Daniele Machado, Paula Hoyos e André Cesário.
Aos amigos do BIOEN, em especial a Andrea Komesu e o Bruno Colling Klein. Ao LOPCA, em especial à Patrícia Fazzio, Nívea de Lima e Christiano.
À UNICAMP pela oportunidade de realização do Curso e por ceder o ambiente para a realização deste trabalho.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa;
Ao CTBE, pelo fornecimento da matéria-prima, para realização deste trabalho. A todos os professores, que ao longo de minha vida estudantil me deram base para que eu chegasse até aqui.
xxi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Composição geral da cana-de-açúcar, adaptado de Mutton (2008). ... 11
Figura 2.2. Esquema do conceito de refinaria. Fonte: (Modenbach e Nokes, 2013) ... 18
Figura 2.3. Esquema da especulação de como ocorre a geração de espécies reativas de oxigênio do hipoclorito de sódio (NaClO) e peróxido de hidrogênio (H2O2) (Lee, 2005) .. 25
Figura 2.4. Produtos e inibidores potenciais formados a partir de celulose, hemicelulose e lignina durante o pré-tratamento da biomassa lignocelulósica fonte: Modenbach e Nokes (2012). ... 29
Figura 2.5. Esquema mecanicista da hidrólise enzimática da celulose por celulases de Trichoderma. Fonte: Zhang et al. (2006)... 33
Figura 3.1 . Gráfico da concentração da enzima em cada diluição em função da massa de glicose liberada por 1,0 mL da enzima diluída em condições reacionais pré-determinadas.44 Figura 3.2. Gráfico da concentração da enzima em cada diluição em função da massa de glicose liberada por 1,0 mL da enzima. ... 47
Figura 4.1. Pré-tratamento catalisado com H2SO4 considerando altas cargas de sólidos. .. 50
Figura 4.2. Resfriamento das amostras catalisadas com H2SO4 após a reação de pré-tratamento. ... 50
Figura 4.3. Pré-tratamento com PHA. ... 51
Figura 4.4. Etapa de lavagem da biomassa pré-tratada em água corrente. ... 51
Figura 4.5. Componentes da biomassa após submetida a diferentes pré-tratamentos. ... 62
Figura 5.1. Relação da conversão em glicose em relação ao tempo de residência de pré-tratamento H2SO4. ... 90
Figura 5.2. Superfície de resposta para a concentração de glicose em mg/g bagaço bruto liberada após hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada com H2SO4. ... 93
Figura 5.3. Perfil de hidrólise dos açúcares liberados durante a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4. ... 94
Figura 5.4. Conversão da celulose em função da temperatura utilizada no bagaço pré-tratado com PHA. ... 98
Figura 5.5. Superfície de resposta para a concentração de mg glicose/g bagaço bruto liberada após hidrólise enzimática da biomassa pré-tratada com PHA. ... 100
xxii
Figura 5.6. Perfil de hidrólise dos açúcares liberados durante a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com PHA. ... 102 Figura 5.7. Conversão da celulose em função da temperatura utilizada no bagaço pré-tratado com Ox-B. ... 106 Figura 5.8. Superfície de resposta para a concentração de mg de glicose/g de bagaço bruto da biomassa pré-tratada com Ox-B. ... 108 Figura 5.9. (a)-(i) Perfil de hidrólise dos açúcares liberados durante a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com Ox-B... 110 Figura 6.1. Difratograma do bagaço de cana bruto e pré-tratada com H2SO4 diluído, Ox-B
e PHA. ... 117 Figura 6.2. MEV (A) Bagaço bruto (B) Bagaço pré-tratado H2SO4 (C) Bagaço
pré-tratadoOx-B (D) Bagaço pré-tratado com PHA. ... 118 Figura 6.3. CRA para o planejamento do pré-tratamento com 1% (m/v) de H2SO4 a 121 ºC.
Ensaios 1, 2 e 3: 20% de sólidos; Ensaios 4, 5 e 6: 30% de sólidos; Ensaios 7, 8 e 9: 40% de sólidos. Ensaios 1, 4 e 7: 30 min de pré-tratamento; Ensaios 2, 5 e 8: 90 min de : 40% de sólidos. Ensaios 1, 4 e 7: 30 minutos de tratamento; Ensaios 2, 5 e 8: 90 min de pré-tratamento; Ensaios 3, 6 e 9: 150 min de pré-tratamento. ... 120 Figura 6.4. Correlação entre a conversão em glicose liberada após hidrólise enzimática e o CRA para as amostras tratadas com H2SO4. ... 121
Figura 6.5. CRA para o planejamento do pré-tratamento 7% (v/v) de PHA por 1h. Ensaios 1, 2 e 3: 20% de sólidos; Ensaios 4, 5 e 6: 25% de sólidos; Ensaios 7, 8 e 9: 30% de sólidos. Ensaios 1, 4 e 7: 50ºC; Ensaios 2, 5 e 8: 70ºC; Ensaios 3, 6 e 9: 90ºC. ... 121 Figura 6.6. Correlação entre a conversão em glicose liberada após hidrólise enzimática e o CRA para as amostras tratadas com PHA. ... 122 Figura 6.7. CRA para o planejamento do pré-tratamento com 5% (m/m) de Ox-B por 2h. Ensaios 1, 2 e 3: 20% de sólidos; Ensaios 4, 5 e 6: 25% de sólidos; Ensaios 7, 8 e 9: 30% de sólidos. Ensaios 1, 4 e 7: 25ºC; Ensaios 2, 5 e 8: 57.5ºC; Ensaios 3, 6 e 9: 90ºC. ... 124 Figura 6.8. Correlação entre a conversão em glicose liberada após hidrólise enzimática e o CRA para as amostras tratadas com Ox-B... 124 Figura 6.9. CRA considerando todos os pré-tratamentos em função da conversão em (%). ... 125
xxiii
Figura 6.10. Espectro FTIR do bagaço de cana bruto, e do bagaço pré-tratado com H2SO4
diluído. ... 126 Figura 6.11. Espectro FTIR do bagaço de cana bruto, e do bagaço pré-tratado com PHA. ... 127 Figura 6.12. Espectro FTIR do bagaço de cana bruto, e do bagaço pré-tratado com Ox-B. ... 128 Figura 7.1. Solubilização dos componentes após a etapa de deslignificação (1% (m/v) de NaOH por 1 h a 100ºC) do bagaço pré-tratado com H2SO4 (20% (m/v) de sólidos,
temperatura de 120ºC e tempo de 150 min) considerando o aumento na carga de sólidos para 10%, 20% e 30%, respectivamente... 135 Figura 7.2. Perfil de glicose para o bagaço pré-tratado com H2SO4 e deslignificado com
NaOH após 72 h de reação. ... 140 Figura 7.3. Perfil de glicose liberada nos ensaios para o bagaço pré-tratado com H2SO4;
para o bagaço deslignificado com NaOH e para o bagaço bruto. ... 141 Figura 7.4. Inibidores gerados nos licores de pré-tratamento para as bases estudadas (1) NaOH (2) KOH e (3) Mg(OH)2. ... 144
Figura 7.5. Conversão e rendimento global dos ensaios de hidrólise enzimática dos ensaios do pré-tratamento com H2O2 utilizando bases alternativas. ... 145
Figura 7.6. Perfil de glicose (a), xilose (b) celobiose (c) e arabinose (d) na hidrólise enzimática dos materiais pré-tratados com PHA variando o tipo de basa utilizada. ... 147 Figura 7.7. Porcentagem de massa solubilizada após o pré-tratamento e hidrólise enzimática. ... 148 Figura 7.8. Perfil de celulose (a); de hemiceluloses (b) e lignina (c) no decorrer do tempo de pré-tratamento em g/100g de bagaço bruto. ... 150 Figura 7.9. Conversão da Lignina total em função do tempo. ... 151 Figura 7.10. Gráficos de logaritmo natural da lignina Klason versus tempo para o NaOH (a) KOH (b) e Mg(OH)2 (c). ... 154
Figura 7.11. Perfil de celulose(a); de hemicelulose (b) e lignina (c) no decorrer do tempo de pré-tratamento em g/100g de bagaço bruto. ... 156 Figura 7.12. Conversão da Lignina total em função do tempo. ... 157 Figura 7.13. Gráficos de logaritmo natural da lignina Klason versus tempo para 25ºC (a)
xxiv
57,5ºC (b) e 90ºC (c). ... 158 Figura 8.1. Perfil de glicose (a) H2SO4 diluído (b) PHA e (c) Ox-B nas concentrações de
10, 15 e 20% (m/v) de sólidos. ... 163 Figura 8.2. Perfil de celobiose (a) H2SO4 diluído (b) PHA e (c) Ox-B nas concentrações de
10, 15 e 20% (m/v) de sólidos. ... 165 Figura 8.3. Perfil de glicose (a) H2SO4 diluído (b) PHA e (c) Ox-B na concentração de 10%
(m/v) de sólidos e em diferentes variações de cargas enzimáticas de β-glicosidase. ... 171 Figura 9.1. (a) Perfil da produção de etanol (b) Consumo de glicose obtido após a fermentação do hidrolisado enzimático de diferentes tipos de pré-tratamentos a 34 ºC. ... 181 Figura 9.2. Perfil de fermentação obtido para o pré-tratamento com PHA utilizando NaOH a 34 ºC. ... 182
xxv
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 2.1. Condições ótimas de rendimentos de açúcar de pré-tratamentos que utilizaram várias concentrações de sólidos segundo várias literaturas. ... 37 Tabela 3.1. Composição Química do bagaço de cana. ... 43 Tabela 3.2. Concentração das soluções diluídas da enzima celulase. ... 44 Tabela 3.3. Valores das absorbâncias e massa de glicose liberada em cada diluição da enzima celulase. ... 45 Tabela 3.4. Concentração das soluções diluídas da enzima celulase. ... 46 Tabela 3.5. Valores das absorbâncias e massas de glicose liberadas por cada diluição da enzima β-glicosidase. ... 47 Tabela 4.1. Composição química das amostras de bagaço pré-tratadas com 1% (m/v) H2SO4 a 121ºC. ... 55
Tabela 4.2. Composição química das amostras de bagaço pré-tratadas com PHA. ... 57 Tabela 4.3. Composição química das amostras de bagaço pré-tratadas com Ox-B. ... 59 Tabela 4.4. Solubilização da celulose nos pré-tratamentos com H2SO4, PHA e Ox-B.
Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de composição da fração sólida estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 64 Tabela 4.5. Solubilização das hemiceluloses nos pré-tratamentos com H2SO4, PHA e Ox-B.
Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de composição da fração sólida estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 66 Tabela 4.6. Solubilização da lignina total nos pré-tratamentos com H2SO4, PHA e Ox-B.
Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de composição da fração sólida estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 67 Tabela 4.7. Concentração dos carboidratos presente no licor de pré-tratamento H2SO4
diluído. Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de composição da fração sólida estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 71 Tabela 4.8. Concentração dos carboidratos presente no licor de pré-tratamento PHA. Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de composição da fração sólida estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 74 Tabela 4.9. Concentração dos carboidratos presente no licor de pré-tratamento Ox-B.
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Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de composição da fração sólida estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 75 Tabela 4.10. Concentração de carboidratos, ácido acético e inibidores no licor de pré-tratamento H2SO4. Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de
composição estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 77 Tabela 4.11. Concentração de carboidratos, ácido acético e inibidores no licor de pré-tratamento com PHA. Melhores condições de pré-pré-tratamento definidas pela análise de composição estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 78 Tabela 4.12. Concentração de carboidratos, ácido acético e inibidores no licor de pré-tratamento Ox-B. Melhores condições de pré-pré-tratamento definidas pela análise de composição estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 79 Tabela 4.13. Lignina recuperada no pré-tratamento com Ox-B e PHA. Melhores condições de pré-tratamento definidas pela análise de composição estão marcadas em negrito para cada pré-tratamento. ... 82 Tabela 5.1. Planejamento 32 e resultados dos rendimentos para o bagaço pré-tratado com H2SO4. Os resultados de conversão, rendimento global e concentração de glicose
correspondem a 72 h de hidrólise. ... 88 Tabela 5.2. Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis do pré-tratamento com H2SO4. Efeitos significativos a 90% de confiança marcados em negrito. ... 91
Tabela 5.3. Análise da variância (ANOVA) para a concentração de glicose (mg/g bagaço bruto) liberada após a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4. ... 92
Tabela 5.4. Planejamento 32 e resultados dos rendimentos para o bagaço pré-tratado com PHA. Os resultados de conversão, rendimento global e concentração de glicose correspondem a 72 h de hidrólise. ... 95 Tabela 5.5. Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis do pré-tratamento com PHA. Efeitos significativos a 90% de confiança marcados em negrito. ... 99 Tabela 5.6. Análise da variância (ANOVA) para a concentração de glicose (mg/g bagaço bruto) liberada após a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com PHA. ... 99 Tabela 5.7. Planejamento 32 e resultados dos rendimentos para o bagaço pré-tratado com Ox-B. Os resultados de conversão, rendimento global e concentração de glicose correspondem a 72 h de hidrólise. ... 104
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Tabela 5.8. Análise dos efeitos principais e de interação das variáveis do pré-tratamento com Ox-B. Efeitos significativos a 90% de confiança marcados em negrito. ... 107 Tabela 5.9. Análise da variância (ANOVA) para a concentração de glicose (mg/g bagaço bruto) liberada após a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com Ox-B. ... 107 Tabela 7.1. Composição química da fração sólida do bagaço pré-tratado com H2SO4 (20%
(m/v) de sólidos, temperatura de 120ºC e tempo de 150min) deslignificado com 1% (m/v) de NaOH por 1h a 100ºC, em g/100g de bagaço bruto. ... 133 Tabela 7.2. Composição química da fração líquida do bagaço pré-tratado com H2SO4 (20%
(m/v) de sólidos, temperatura de120ºC e tempo de 150min) deslignificado com 1% (m/v) de NaOH por 1h a 100ºC,em g/100g de bagaço bruto. ... 134 Tabela 7.3. Rendimentos obtidos para a hidrólise enzimática do bagaço pré-tratado com H2SO4 submetido a deslignificação com NaOH. ... 138
Tabela 7.4. Comparação entre a conversão da celulose (%) e o teor de lignina remanescente (%) nos três ensaios. ... 140 Tabela 7.5. Composiçãodo bagaço de cana de açúcar após o pré-tratamento com bases alternativas ao NaOH em g/100g de bagaço bruto. ... 143 Tabela 7.6. Composição do licor do bagaço de cana após o pré-tratamento com bases alternativas em g/100g de bagaço bruto. ... 143 Tabela 7.7. Concentração de base utilizada para se elevar o pH da solução de H2O2 a 7%
(m/v) até 11,5. ... 155 Tabela 8.1. Conversao da celulose para os ensaios em batelada simples e em batelada alimentada. ... 166 Tabela 8.2. Conversão da glicose em % para os estudos da variação da carga enzimática de β-glicosidase. ... 169 Tabela 8.3. Concentração da celobiose em g/L para os estudos da variação da carga enzimática de β-glicosidase. ... 170 Tabela 9.1. Concentração dos açúcares, furfural e hidroximetilfurfural do meio fermentativo para o processo em batelada. ... 176 Tabela 9.2. Rendimento de etanol. ... 178 Tabela 9.3. Rendimento em relação ao bagaço pré-tratado. ... 180 Tabela 9.4. Rendimento de etanol em relação ao bagaço bruto. ... 180
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ÍNDICE DE ABREVIAÇÕES
OX-B: Hipoclorito-peróxido de hidrogênio PHA = peróxido de hidrogênio alcalino MEV: Microscopia eletrônica por varredura GP: Grau de polimerização
CRA: Capacidade de retenção de água CrI: Índice de cristalinidade
FTIR: Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier EROs: Espécies reativas de Oxigênio
E2G: Etanol de segunda geração
SFS: Sacarificação e fermentação simultâneos FSS: Fermentação e sacarificação separados GP= grau de polimerização
CHB= celobiohidrolases EG = endoglucanases
xxxi ÍNDICE DE EQUAÇÕES Equação 3.1 ... 45 Equação 3.2 ... 48 Equação 4.1 ... 53 Equação 4.2 ... 53 Equação 5.1 ... 92 Equação 5.2 ... 100 Equação 5.3 ... 108 Equação 6.1 ... 114 Equação 6.2 ... 116 Equação 7.1 ... 150 Equação 7.2 ... 152 Equação 7.3 ... 153 Equação 9.1 ... 177 Equação 9.2 ... 177
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CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
Atualmente, devido ao inevitável esgotamento e impacto ambiental negativo dos combustíveis fósseis, houve uma maior preocupação em se obter fontes alternativas de energia; assim, o foco na conversão de materiais lignocelulósicos tem ganhado bastante atenção nos últimos tempos (Yang, Bin e Wyman, Charles E., 2008).
Desde o século 20 a energia sempre foi fornecida por combustíveis fósseis, tais como: petróleo, carvão e gás natural. O uso destes combustíveis resulta no aumento líquido dos níveis de CO2 na atmosfera. As questões ambientais, como o aumento da temperatura
causam uma ameaça devido ao efeito estufa e ao fato de que os combustíveis fósseis são recursos não-renováveis. Deste modo, tem aumentado o interesse na produção de combustíveis de fontes renováveis, como a biomassa (Sendelius, 2005).
A cana de açúcar é considerada a principal matéria-prima para produção de etanol combustível, tendo produção concentrada no Brasil (40%), Índia (22%) e China (8%). Um terço da cana é recuperado como resíduo de fibras (bagaço de cana), seguido da recuperação da sacarose (Sun, J. et al., 2004; Da Cruz et al., 2012). O bagaço de cana é bastante útil para uma fábrica de processamento de lignocelulose porque é um subproduto agrícola abundante e um substrato promissor para a produção de etanol (Goldemberg, 2008; Mendes et al., 2015). Bem como a palha da cana, que além de ter grande potencial para geração de calor, eletricidade, também pode ser utilizada para a produção de etanol celulósico (Santos et al., 2012).
O bagaço de cana é uma biomassa lignocelulósica que é composta por uma estrutura complexa, onde se encontram principalmente três frações denominadas celulose, hemiceluloses e lignina. A organização da interação entre esses polímeros da parede celular (que dão força e resistência aos ataques físicos, químicos e biológicos) constitui uma barreira ao acesso das enzimas celulolíticas e pode ser parcialmente despolimerizada na etapa de pré-tratamento, que é a que ocorre anteriormente à sacarificação (Hendriks e Zeeman, 2009; Silva et al., 2011). O uso do bagaço de cana pode permitir a expansão da produção de etanol sem que haja a redução global da produção de açúcar (Da Cruz et al.,
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2012). Deve-se considerar também que o bagaço de cana também pode ser utilizado para a cogeração de energia através da queima desta biomass, muitas usinas são autossuficientes no consumo de energia e o excedente gerado pode ser comercializado com as distribuidoras de energia (Dantas Filho et al., 2008).
Devido à importância do bagaço de cana como um subproduto industrial, há um grande interesse no desenvolvimento de métodos químicos para a sua transformação em combustíveis e produtos químicos que oferecem vantagens estratégicas econômicas e ambientais (Adsul et al., 2004; Peng et al., 2009) Esta biomassa apresenta aproximadamente 40-45% de celulose, 30-35% de hemiceluloses e 20-30% de lignina (Sun, J. X. et al., 2004; Peng et al., 2009); esta última não é facilmente separada e rapidamente solubilizada devido à sua recalcitrância natural (Peng et al., 2009).
O pré-tratamento é um processo tipicamente empregado para diminuir a recalcitrância da biomassa lignocelulósica e aumentar a sua conversão em biocombustíveis, pela hidrólise enzimática e posterior fermentação (Jung et al., 2010; Mendes et al., 2015). O principal objetivo do pré-tratamento é permitir que a celulose fique disponível ao ataque enzimático e minimizar a perda dos açúcares e a formação de inibidores. O pré-tratamento deve agir de forma a modificar ou remover parcialmente a lignina e/ou hemiceluloses, aumentando a área superficial ou diminuindo o tamanho da partícula. Uma grande quantidade de pré-tratamentos foi estudada e cada uma tem suas vantagens e desvantagens, isto se torna benéfico para adaptar o pré-tratamento com a fonte de biomassa e seu uso final desejado (Modenbach e Nokes, 2012).
O pré-tratamento empregado também determina a acessibilidade das enzimas à celulose e tem um efeito significativo na porção dos componentes-chave da enzima necessário na etapa de hidrólise subsequente (Yang, Bin e Wyman, Charles E, 2008). A acessibilidade da enzima foi definida como um fator limitante na conversão enzimática da celulose presente na biomassa à glicose (Ishizawa et al., 2007).
Os pré-tratamentos químicos com ácidos são considerados efetivos e econômicos, pois estes pré-tratamentos podem facilmente hidrolisar as hemiceluloses e produzir uma fração líquida rica em xilose, com pequenas quantidades de derivados de lignina. Assim, tratamentos com ácidos são bons métodos para a recuperação das hemiceluloses e têm sido usados com sucesso para pré-tratar o bagaço de cana (Pandey et al., 2000; Lavarack et al.,
3 2002; Fogel et al., 2005; Rezende et al., 2011).
Embora as maiores pesquisas sobre pré-tratamento estejam focadas nas condições ácidas a altas temperaturas (maiores que 150ºC), os pré-tratamentos alcalinos a baixas temperaturas têm mostrado ser bastante efetivos (Chang et al., 2001; Cheng et al., 2010; Sills e Gossett, 2011). A utilização do peróxido de hidrogênio em pH alcalino tem sido aplicada em um grande número de matérias-primas lignocelulósicas (Gould, 1984; Rabelo et al., 2008). Soluções de peróxido de hidrogênio alcalino deslignificam parcialmente os materiais lignocelulósicos, deixando um resíduo celulósico que é altamente suscetível à digestão enzimática pelas celulases (Gould, 1984).
O Ox-B corresponde a um complexo estável entre as formas de hipoclorito e H2O2
(Day, 2005). O oxigênio singlete (oxigênio altamente oxidante), superóxido e radicais hidroxila são produzidos durante a reação entre o H2O2 e o hipoclorito. O superóxido e os
radicais hidroxila podem oxidar e degradar a lignina e carboidratos gerando espécies reativas de oxigênio (Gierer, 2000). Estas soluções de Ox-B foram testadas como agentes de pré-tratamento de biomassa e foram obtidos altos rendimentos de açúcares durante a hidrólise enzimática (Lee et al., 2009).
A produção de etanol já é um processo historicamente bem conhecido, e a principio ele é conduzido pela fermentação dos açúcares em etanol utilizando cepas de leveduras. Entretanto, a biomassa é formada por polímeros de açúcares, ordenados em uma matriz denominada lignocelulose, que não pode ser fermentada. Para produzir etanol, este material deve ser submetido à degradação se tornando mono e dímeros de açucares para que a levedura consiga ter acesso aos componentes. Esta degradação pode ser realizada pela hidrólise da biomassa utilizando enzimas, e o processo é chamado de hidrólise enzimática (Sendelius, 2005).
A hidrólise enzimática conduzida por enzimas celulases é a mais promissora abordagem para a obtenção de altos rendimentos de açúcares. As celulases quebram a celulose em moléculas de celobiose, que serão convertidas em glicose pela ação da β-glicosidase (Hinman et al., 1992; Lynd et al., 1996). A hidrólise enzimática leva a rendimentos de monossacarídeos mais altos do que a hidrólise ácida porque as enzimas catalisam apenas a hidrólise da celulose ou hemiceluloses durante a reação e não há degradação dos açúcares (Parisi, 1989). As enzimas são compostos naturalmente
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biodegradáveis e, portanto, ambientalmente amigáveis (Rabelo et al., 2008).
No processo de conversão de lignoceluloses, o uso de elevadas cargas de sólidos (≥10%, m/m) tem trazido inúmeras vantagens, tais como: aumento da concentração de açúcares e etanol, diminuição do uso de água e de reagentes, e,consequentemente, a diminuição de custos operacionais, além de tornar o processo ambientalmente amigável. O termo “carga de sólidos” pode ser definido como a quantidade de material seco que entra no processo dividido pelo total de massa de material seco mais a água adicionada neste material (Modenbach e Nokes, 2012).
O presente trabalho utilizou como base os trabalhos de Rezende et al. (2011) que realizaram o pré-tratamento com 1% (m/v) de H2SO4, os estudos de Rabelo et al. (2014)
onde a concentração necessária de peróxido eficiente para o pré-tratamento da biomassa foi de aproximadamente 7% (v/v), e de (Lee, 2005) que trabalhou com 5% de Ox–B (combinação de hipoclorito de sódio com peróxido de hidrogênio alcalino). No presente trabalho o objetivo foi manter todas estas concentrações e aumentar a carga de sólidos do bagaço, de forma a minimizar o uso dos reagentes e consequentemente reduzir os custos na produção.
Para o pré-tratamento com PHA foi avaliada a substituição da base utilizada para elevar o pH da solução, testando-se a substituição de NaOH por KOH que embora não tenha tanta diferença de custo quando comparada ao NaOH, tem a vantagem que o potássio é um composto que pode ajudar no enriquecimento do meio para o processo de fermentação Além disso, o uso e a descarga do sódio são problemáticos, pois acarretam em impactos ambientais negativos, como a salinização do solo e poluição da água (Zheng et al., 2014; Liu et al., 2015). O KOH poderia ser uma solução para este problema. O licor negro derivado do tratamento KOH tem nutriente potássio que tem valor potencial para o melhoramento do solo (Ong et al., 2010; Liu et al., 2015). E a substituição por Mg(OH)2
por se tratar de uma base menos custosa comparada com as demais.
Foi realizado um estudo comparativo entre todos os pré-tratamentos estudados, enfatizando a questão de eficiência e custos dos mesmos. Embora o presente trabalho tenha abordado pré-tratamentos realizados por outros autores, destaca-se que praticamente não foram encontrados trabalhos na literatura avaliando os pré-tratamentos estudados com alta carga de sólidos seguidos de hidrólise enzimática em altas cargas de sólidos e finalmente a
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etapa de fermentação, de forma a determinar o desempenho do processo de forma integrada. A contribuição do presente trabalho, assim, é comparar os pré-tratamentos avaliando todas as etapas do processo para determinar a produção de etanol por quantidade e bagaço e os aspectos técnicos de cada processo.
1. Objetivos
1.1 Objetivo geral
O objetivo geral do presente trabalho foi comparar diferentes pré-tratamentos para a produção do etanol de segunda geração, avaliar a influência destes na composição da biomassa e em relação à conversão e rendimento global na hidrólise em alta carga de sólidos, assim como o rendimento em etanol. Além disso, a presente tese teve como meta avaliar a possível diminuição de custos no processo, neste quesito o processo em altas cargas de sólidos foi um dos meios mais propícios por se utilizar menor conteúdo de água e menores concentrações de reagentes na etapa de pré-tratamento se for considerada a concentração de reagente por litro de solução (menos reagentes por massa de sólido).
1.2 Objetivos específicos
A seguir serão mostrados resumidamente todos os objetivos específicos desta tese.
1. Estudo do pré-tratamento com H2SO4 considerando elevadas cargas de sólidos.
Neste estudo foi avaliado o pré-tratamento utilizando altas cargas de sólidos através de um planejamento de experimentos 32 onde as variáveis estudadas foram o tempo e a carga de sólidos a variável resposta foi a produção de glicose. Foi escolhido o melhor ensaio, que foi submetido ao processo de deslignificação com 1% de NaOH variando também a carga de sólidos. Todo este material foi caracterizado e submetido à hidrólise enzimática.
2. Estudo do tratamento com PHA a altas cargas de sólidos na etapa de pré-tratamento. Nesta etapa o estudo com PHA foi avaliado em altas concentrações
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de sólidos durante a etapa de pré-tratamento. Foi avaliada também a substituição do NaOH por bases alternativas, visando encontrar uma forma de substituição desde reagente por aqueles mais baratos. Neste estudo foi utilizado um planejamento de experimentos 32 onde as variáveis estudadas foram a temperatura e a carga de sólidos e a variável resposta foi a produção de glicose, neste estudo também foi realizada a análise composicional na biomassa pré-tratada e a hidrólise enzimática.
3. Estudar o pré-tratamento Ox-B considerando elevadas cargas de sólidos. Este pré-tratamento foi avaliado também utilizando-se o mesmo planejamento já citado nos itens 1 e 2. Porém as variáveis estudadas foram concentração de sólidos e a temperatura de reação e a variável resposta foi a produção de glicose. O material também foi caracterizado, hidrolisado e analisado como os demais.
4. Estudar a estrutura física do bagaço submetido a três diferentes pré-tratamentos. Neste estudo foram determinadas análises de capacidade de retenção de água, índice de cristalinidade, microscopia eletrônica por varredura (MEV) e análise de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) com o objetivo de avaliar de forma mais detalhada as transformações ocorridas na biomassa submetida aos três diferentes pré-tratamentos e a influência desta estrutura para as reações de hidrólise enzimática.
5. Otimizar a carga de β-glicosidase e aumento da carga de sólidos na hidrólise. Nesta etapa foi estudada a otimização da carga enzimática de β-glicosidase para cada ponto considerado como ótimo em todos os pré-tratamentos obtidos. Após este resultado, foi realizado o estudo da hidrólise enzimática variando a carga de sólidos, este estudo foi realizado em reator e foi feito em batelada e batelada alimentada. O perfil de hidrólise foi medido em todos os ensaios.
6. Realizar o processo fermentativo dos hidrolisados dos pré-tratamentos mais eficazes. Foi realizada a fermentação para os hidrolisados enzimáticos obtidos após os pré-tratamentos com melhores resultados de conversão de glicose a fim de
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compará-los entre si, além de avaliar a influência de inibidores (furfural, hidroximetilfurfural e ácido acético) no rendimento final da produção de etanol.
1.3 Organização do trabalho
O presente trabalho foi organizado da seguinte forma: o Capítulo 1 apresenta a introdução do trabalho, os objetivos geral e específico, bem como a produção bibliográfica obtida no decorrer desta pesquisa. No Capítulo 2 tem-se a revisão da literatura com todo o embasamento teórico utilizado para a realização deste estudo. O Capítulo 3 apresenta a parte experimental e resultados do preparo da biomassa utilizada e da determinação das atividades das enzimas utilizadas no trabalho. O Capítulo 4 apresenta o estudo da composição do bagaço e do licor após pré-tratamentos com ácido sulfúrico diluído, peróxido de hidrogênio alcalino e solução hipoclorito de sódio/peróxido de hidrogênio (Ox-B), onde foram feitas comparações entre as composições da fração sólida e líquida das biomassas modificadas após os pré-tratamentos. No Capítulo 5 foi realizada também comparações entre as biomassas pré-tratadas levando em consideração a produção de glicose na etapa de hidrólise enzimática realizada a 10% (m/v) de sólidos, onde foram estudados planejamentos experimentais de três níveis 3² e como resposta a glicose produzida em g/L e em g de glicose por g de bagaço bruto. No Capítulo 6 os estudos foram voltados para as modificações estruturais das biomassas submetidas aos pré-tratamentos mencionados, para observar as transformações na biomassa após a etapa de pré-tratamento e a influência da estrutura modificada para as reações de hidrólise enzimática. O Capítulo 7 visou estudar as melhores condições das biomassas pré-tratadas de forma a avaliar o uso e a eficiência da deslignificação para a biomassa pré-tratada com H2SO2, a utilização de
bases alternativas para a substituição do NaOH no pré-tratamento com PHA. Foram realizados também estudos cinéticos na deslignificação destes materiais. O Capítulo 8 foi destinado ao estudo da hidrólise enzimática dos pré-tratamentos conduzidos com H2SO4,
PHA e Ox-B, com a finalidade de aumentar a carga de sólidos durante esta etapa, avaliando a batelada simples e alimentada e comparando a eficiência do processo, além da influência do tipo de pré-tratamento no que se refere a acessibilidade da enzima. Foi estudada também a variação na carga enzimática da β-glicosidase com o intuito de encontrar uma região
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ótima de enzima para uma maior produção dos açúcares fermentescíveis. No Capítulo 9 foram descritas as fermentações dos hidrólisados ricos em açúcares fermentescíveis das melhores condições dos ensaios obtidos no Capítulo 9 utilizando a levedura Saccharomyces cerevisiae. As fermentações foram feitas somente para os pré-tratamentos com H2SO4, PHA
e Ox-B, comparando a produção de etanol para cada tratamento realizado.
1.4 Produção bibliográfica
1.4.1 Trabalhos publicados em anais de congressos
MARTINS, L. H. S.; COSTA, A. C. Evaluation of alkaline hydrogen peroxide pretreatment of sugarcane bagasse at high solids concentrations.2013. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). In: 35th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals, Portland, EUA, 2013.
MARTINS, L. H. S.; COSTA, A. C.; RABELO, S. C. Evaluation of acid pretreatment employing high concentrations of sugarcane bagasse. 34th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals (April 30 - May 3, 2012) in New Orleans.
MARTINS, L. H. S.; COSTA, A. C.Evaluation of the Pretreatment of Sugarcane Bagasse with N-Methylmorpholine-N-Oxide to Enhance Enzymatic Hydrolysis. XVIII Simpósio Nacional de Bioprocessos (SINAFERM) 2011.
9 1.4.2 Artigo aceito para publicação
MARTINS, L.H.S., RABELO, S.C., COSTA, A.C., Effects of the pretreatment
method on high solids enzymatic hydrolysis and ethanol fermentation of the
cellulosic fraction of sugarcane bagasse, Bioresource Technology (2015), doi:
http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2015.05.024
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CAPÍTULO 2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cana-de-açúcar
A cana-de-açúcar tem nome o científico de Saccharum officinarum e pertence à família botânica Poaceae, sendo uma gramínea da classe Liliopsida e da ordem Ciperales, representada por plantas que apresentam flores pequenas, praticamente destituídas de perianto e protegidas por brácteas secas, reunidas em típicas inflorescências (Aranha e Yahn, 1987). É considerada originária do Sudeste Asiático, na grande região da Nova Guiné e Indonésia (Heinz, 2013).
Fisicamente a cana é constituída por quatro frações: as fibras, os sólidos solúveis e não solúveis e a água (Mutton, 2008). A fibra é basicamente composta por frações orgânicas sólidas, não solúveis em água, originalmente encontradas na haste da cana, e é caracterizada por ser morfologicamente heterogênea. A fração sólida não solúvel, ou a fração que não pode ser dissolvida na água, é constituída principalmente por substâncias inorgânicas (minerais, solo e outros materiais) e isto sofre bastante influência das condições de processamento agrícola e do tipo de colheita. Já a fração solúvel é composta pela sacarose, assim como outros componentes em menor quantidade, tais como ceras (Triana et al., 1990)
A Figura 2.1 apresenta um esquema dos compostos que constituem a cana-de-açúcar.
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Figura 2.1 Composição geral da cana-de-açúcar, adaptado de Mutton (2008).
A estrutura da planta de cana apresenta o córtex, que é composto de fibras bastante lignificadas, caracterizando a espessura da parede celular e ocomprimento dando rigidez para as fibras, conferindo proteção contra danos mecânicos externos, servindo também de suporte à planta. Internamente o talo é constituído por um tecido parenquimatoso (medula de caráter não fibroso), o qual possui como principal função o armazenamento do suco adocicado produzido pela planta. Imerso dentro deste tecido encontram-se as hastes fibrovasculares, compostas de fibras curtas e vasos que atuam na sustentação e condução dos alimentos e outros produtos ao longo da planta (Paturau, 1989; Rabelo, 2010).
2.1.1 Bagaço de cana
O bagaço de cana é um subproduto resultante da extração do caldo da cana-de-açúcar em usinas ou destilarias na produção de álcool etílico e cana-de-açúcar. Pode ser considerado atualmente como o principal subproduto agrícola brasileiro, devido à expansão na produção de álcool. A maior parte do bagaço produzido é utilizada na própria usina para a geração de vapor para o suprimento de energia de seu parque industrial. O bagaço de cana bruto resultante do processo de moagem apresenta aproximadamente umidade de 50% b.u. e
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densidade aparente de 120 kg/m³ (Da Silva e Dos Santos Morais, 2008).
Nos últimos anos, tem havido uma tendência crescente para a utilização eficiente de subprodutos agrícolas, incluindo o bagaço de cana. Vários processos e produtos têm sido relatados que utilizam bagaço de cana como matéria-prima, que incluem a geração de eletricidade, produtos à base de fermentação etc. O bagaço também pode ser utilizado para a produção de biocombustíveis, como o bioetanol (Pandey et al., 2000).
2.1.2 Componentes do bagaço de cana
2.1.2.1 Celulose
A celulose é o componente mais abundante da biomassa lignocelulósica, é a substância responsável pela formação da estrutura do esqueleto da planta. As cadeias de celulose se agregam e formam fibrilas apresentando ligações de hidrogênio entre os grupos hidroxila das intra e intercadeias, o que resulta na cristalinidade da celulose. Quando duas unidades adjacentes formam uma ligação glicosídica, onde ocorre a eliminação da molécula de água nos grupos hidroxílicos 1 e 4, esta estrutura é denominada celobiose, que é um dissacarídeo e a unidade conformacional mínima da celulose. A glicose representa a unidade fundamental das cadeias deste homopolímero (Fengel e Wegener, 1989; Hu et al., 2015).
A parte cristalina da celulose pode ser expressa em porcentagem pelo índice de cristalinidade ou CrI e vai depender da origem e processo de obtenção da celulose. Alguns autores têm sugerido que a parte amorfa é mais suscetível ao processo de hidrólise enzimática quando comparada com a forma cristalina (Fan et al., 1980). Embora 2/3 da celulose esteja na sua forma cristalina (Chum, 1985), as microfibrilas possuem também áreas amorfas, nas quais várias cadeias perdem suas formas de ordem paralela, adquirindo uma orientação mais desorganizada. As moléculas da cadeia passam sucessivamente através de zonas cristalinas e amorfas.
Quanto maior é o teor de celulose cristalina, mais difícil é o ataque das enzimas celulolíticas na etapa de hidrólise enzimática deste polímero. As regiões amorfas são aquelas que estão mais acessíveis a estas enzimas e, assim, elas são mais facilmente
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hidrolisadas; quando se trata das áreas cristalinas a eficiência do contato da enzima é reduzida (Chang e Holtzapple, 2000). Assim, deve haver alguma estratégia para melhorar a digestibilidade da celulose reduzindo este grau de cristalinidade.
2.1.2.2 Hemiceluloses
As hemiceluloses são a segunda classe de componentes da parede celular das plantas da biomassa lignocelulósica, são polímeros heterogêneos compostos por diferentes pentoses, hexoses e ácidos orgânicos. As hemiceluloses da madeira contêm principalmente xilanas. As hemiceluloses estão intimamente ligadas com a celulose por ligações de hidrogênio e associadas à lignina por ligações covalentes (principalmente pela ligação α-benzil éter). Essas ligações restringem a liberação das hemiceluloses das paredes celulares das plantas (Li et al., 2015).
O grau médio de polimerização (GP) de hemiceluloses é cerca de 80-200. As hemiceluloses estão intimamente associadas com as fibrilas de celulose e agem como um envoltório em torno das fibrilas de celulose, que dão rigidez ao tecido da planta. Geralmente, em espécies de madeira dura, a maioria das hemiceluloses são O-acetil-4-O-metilglucurona-β-D-xilanas. Em resinosas, a maioria das hemiceluloses são galactoglucomananas acetiladas, enquanto que as arabinoxilanas são as principais hemiceluloses das gramíneas. Dependendo das fontes botânicas e variações estruturais de hemiceluloses, a classificação das hemiceluloses tem sido revisada recentemente por vários autores (Deutschmann e Dekker, 2012; Peng e She, 2014).
Segundo Paturau (1989), no bagaço de cana as hemiceluloses estão dispostas na proporção de 24 a 27%, e, após a hidrólise, esta será decomposta em xilose, arabinose, ácido urônico e furfural, e o principal açúcar encontrado no bagaço de cana é a xilose (Fengel e Wegener, 1989).
Em anos recentes ocorreu um grande interesse pelas hemiceluloses como heteropolímeros para aplicações químicas e farmacêuticas; por exemplo, o seu uso para a produção de biopolímeros catiônicos, hidrogéis, entre outros (Ebringerrova, 2006).
14 2.1.2.3 Lignina
O termo lignina refere-se ao nome em latim lignum (madeira). É um dos principais componentes dos tecidos de gimnospermas e angiospermas, ocorre em vegetais e tecidos vasculares. O papel mais importante da lignina é no transporte de água, nutrientes e metabólitos, além de ser responsável pela resistência mecânica da planta, protegendo também os tecidos contra o ataque de micro-organismos (Fengel e Wegener, 1989).
A lignina está covalentemente ligada à celulose e outros polissacarídeos da parede celular. Essa estrutura empacota as microfibrilas de polissacarídeos, protegendo-os contra a atividade hidrolítica de enzimas e outros fatores externos, além de estabilizar o complexo lignocelulose (Leonowicz et al., 1999).
A lignina é um composto formado por fenilpropanóides depositados durante a maturação da parede celular. Este composto faz ligações cruzadas com os polissacarídeos da parede auxiliando no seu empacotamento (Buchanan et al., 2000)
A lignina é a terceira macromolécula vegetal mais abundante, encontrada na parede celular. Trata-se de um heteropolímero amorfo formado por três diferentes unidades de fenilpropanos, que são: álcool p-cumarílico, álcool coferílico e álcool sinapílico, mantidos unidos por outro tipo de ligação. Além de todos os papéis importantes que a lignina apresenta esta também dá à planta apoio estrutural e protege quanto ao estresse oxidativo. A lignina não é solúvel em água e é opticamente inativa, o que faz com que a sua degradação seja difícil (Fengel e Wegener, 1989).
2.1.2.4 Extrativos
Os extrativos correspondem a compostos intermediários do metabolismo do vegetal; estes componentes são aqueles que podem proporcionar a reserva energética, além de proteção ao vegetal contra o ataque de fatores externos (como micróbios e insetos), porém têm um efeito inibitório nos processos de conversão de biomassa (Fengel e Wegener, 1989). Os extrativos são constituídos por uma grande variedade de compostos orgânicos e podem ser extraídos com solventes orgânicos ou aquosos (Fengel e Wegener, 1989; Cunha, 1999). Os extrativos podem incluir ceras, gorduras, resinas, taninos, gomas, açúcares, amidos e pigmentos (Sluiter et al., 2005).
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2.3 A produção do etanol de segunda geração (E2G)
O E2G é produzido a partir de material lignocelulósico (MLC) proveniente da biomassa. Nas últimas décadas, diversas fontes lignocelulósicas têm sido estudadas para a produção de E2G, como exemplo temos: a palha de milho, de trigo e de arroz, os resíduos de cana-de-açúcar, bagaço de sorgo sacarino e gramíneas, resíduos florestais. No Brasil, pelo fato de ser a matéria-prima predominante na produção de E1G, a cana-de-açúcar tem sido o foco dos principais estudos para a produção de E2G (Milanez et al., 2015).
Sabe-se que os principais componentes dos materiais lignocelulósicos são a celulose, as hemiceluloses e a lignina. Devido à forte cristalinidade da estrutura da celulose e da presença do complexo existente entre estes três componentes, alguns pré-tratamentos devem ser realizados anteriormente à etapa de hidrólise enzimática para formação dos açúcares e a subsequente etapa de fermentação para a produção do etanol. Embora sejam realizadas diversas pesquisas no que se referem a estes obstáculos em escala industrial, as principais etapas que limitam o processo são: o pré-tratamento, o alto custo das enzimas para a hidrólise enzimática e a falta de um micro-organismo adequado para a fermentação (Wang e Zhu, 2009), uma vez que o micro-organismo mais utilizado tem capacidade apenas para fermentar as hexoses, sendo limitado para as pentoses. Estes seriam os principais obstáculos técnicos para a produção do etanol celulósico. Além disso, há os inconvenientes no que se refere aos altos custos de equipamentos adequados para este tipo processo.
Segundo Milanez et al. (2015) o processo de difusão das tecnologias de produção para o E2G ainda não começou propriamente. Algumas empresas já desenvolvem as tecnologias para a produção do E2G. Ainda que sejam conhecidas as tecnologias das etapas físicas, químicas e biológicas para a produção deste produto, estas devem sofrer alterações e evoluções com o decorrer do processo de escalonamento industrial. Ainda há um longo processo de aprendizagem a ser percorrido, onde os ricos e incertezas para a difusão destas tecnologias sejam devidamente superados.
16 2.3.1 Conceito de biorrefinaria
O conceito de biorrefinaria se refere ao processo integrado de conversão da biomassa para a produção de combustível, energia e produtos químicos a partir da biomassa. Este conceito é análogo às atuais refinarias de petróleo, que produzem múltiplos combustíveis e produtos a partir do petróleo. A biorrefinaria industrial tem sido identificada como uma rota promissora para a criação de uma nova indústria de base biológica. Pela produção de muitos produtos, a biorrefinaria pode levar vantagens no que se refere aos componentes da biomassa e seus intermediários, maximizando o valor agregado dos derivados desta matéria-prima (Kamm et al.; Koutinas et al., 2005; Lichtenthaler, 2006).
Embora semelhantes às refinarias de petróleo, as biorrefinarias apresentam algumas diferenças importantes. A primeira é que elas podem utilizar uma variedade de matérias-primas. Conseqüentemente, elas exigem o desenvolvimento de uma maior gama de tecnologias de processamento e sistemas de biorrefinaria para lidar com as diferenças de composição na matéria-prima. Em segundo lugar, a matéria-prima de biomassa é mais volumosa (tem uma densidade de energia mais baixa) do que os combustíveis fósseis. No Brasil, o conceito de biorrefinaria ainda é recente, embora tenha uma grande importância socioeconômica, pois há o aproveitamento bem mais eficiente da biomassa, trazendo um grande número de questões conceituais e de cenários técnicos e econômicos para serem definidos. Essas questões envolvem em geral a compreensão do potencial que a biomassa tem para o país, já que o Brasil é um grande produtor de matérias-primas. Por ser um país continental, o Brasil, com elevada diversidade de solos, climas e biomassas, deveria ter as pesquisas regionalizadas em relação as suas espécies potenciais (Vaz Júnior, 2011).
As biorrefinarias estão incluídas na agenda de pesquisa e desenvolvimento da maioria dos países desenvolvidos e aqueles que estão em desenvolvimento, como, por exemplo, o Brasil, o que leva à mobilização dos órgãos públicos e privados e grandes quantias de recursos tentando viabilizar o aproveitamento e a otimização das matérias-primas de forma a agregar valor na cadeia produtiva e até reduzir impactos ambientais (Vaz Júnior, 2011).
Um modelo desejado de biorrefinaria seria aquele onde durante o processamento houvesse uma total exploração da biomassa. Uma série de produtos deveria ser ditada pelo
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mercado e selecionada para extrair o maior valor agregado possível das lignoceluloses utilizadas (Modenbach e Nokes, 2012).
Hoje a tecnologia da biorrefinaria está relacionada com dois itens importantes, que são: 1. A utilização de toda a planta ou complexo da biomassa e 2. A integração do processo moderno e tradicional para a utilização biológica das matérias-primas. Esta tecnologia está baseada por uma economia utilizada principalmente pela combinação de diferentes métodos e processos (físicos, químicos e biológicos). E é necessário, ainda, que estas tecnologias básicas da biorrefinaria sejam desenvolvidas. Por esta razão é necessário que haja a cooperação interdisciplinar e a união de várias áreas de pesquisa e desenvolvimento para que se possam melhorar estas tecnologias (Kamm et al.).
A Figura 2.2 apresenta um esquema do conceito de biorefinaria, onde há primeiramente a entrada da lignocelulose no processo de conversão, depois este material é submetido aos processos de pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação. A destilação produz combustíveis líquido para transporte, assim como outros produtos de valor. O sólido residual pode ser queimado para produzir energia, que pode ser um ciclo de retorno no processo de conversão, ou enviado para fora da grade para uso comercial ou residencial (Modenbach e Nokes, 2013).
