KAREN CRISTINA GUEDES SILVA
CAMPINAS 2016
PRODUÇÃO DE MICROGÉIS SIMBIÓTICOS DE GELATINA-ALGINATO E SIMULAÇÃO DA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM CONDIÇÕES
KAREN CRISTINA GUEDES SILVA
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em ENGENHARIA DE ALIMENTOS.
Orientador: Ana Carla Kawazoe Sato
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA KAREN CRISTINA GUEDES SILVA E ORIENTADA PELA PROFESSORA DRA. ANA CARLA KAWAZOE SATO
CAMPINAS 2016
PRODUÇÃO DE MICROGÉIS SIMBIÓTICOS DE GELATINA-ALGINATO E SIMULAÇÃO DA LIBERAÇÃO CONTROLADA EM CONDIÇÕES
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Ana Carla Kawazoe Sato
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP Orientadora
Profa. Dra. Fabiana Perrechil Bonsanto Departamento de Ciências Exatas e da Terra
Setor de Engenharia Química – UNIFESP Membro Titular
Profa. Dra. Flavia Maria Netto
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP Membro Titular
Profa. Dra. Carmen Silvia Favaro Trindade
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – USP Membro Suplente
Dra. Renata Valeriano Tonon
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa Membro Suplente
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Jayme e Sônia, por ser a base de tudo que sou, pelos ensinamentos e por me apoiarem em todos as decisões.
Ao meu irmão Lucas, pela amizade e companheirismo.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por me guiar, proteger, encorajar-me em todas as minhas decisões, mostrando-me a direção e por ser meu suporte nos momentos de dificuldade e superação.
À profa, Dra. Ana Carla Kawazoe Sato, pelo exemplo, oportunidade, ensinamentos, paciência, por todo incentivo e confiança, seu apoio foi fundamental para meu desenvolvimento profissional e concretização deste trabalho.
Aos meus pais Jayme e Sônia pelo incentivo, força e exemplo, por entenderem minhas ausências e pelo amor incondicional. Por vocês me inspiro a ser cada dia melhor!
Ao meu irmão Lucas, pela amizade, apoio e por estar sempre presente em minha vida vibrando a cada conquista. É bom saber que posso contar com você...
Aos colegas e amigos de Campinas, pela jornada que cumprimos juntos ao longo do mestrado, foram momentos de dificuldade, superação e alegrias, que ficarão guardados na memória. Sem a presença de vocês essa trajetória teria se tornado mais difícil...
As minhas amigas e companheiras de Lavras, por sempre estarem presentes, por me incentivarem e pela torcida, vocês são como irmãs!
Aos funcionários, técnicos de laboratório, ao Departamento de Ciência de Alimentos e Laboratório de Bioaromas, por cederem o espaço e equipamentos durante parte da pesquisa.
Ao grupo de Reologia, por me receberem, pelas experiências trocadas e pela convivência diária.
À todos do Laboratório de Engenharia de Processos, principalmente ao Mariano, pelos conhecimentos transmitidos e pela disponibilidade.
Aos alunos de iniciação científica Gabriel e Eliza, pela disposição, pelos momentos de tentativas, erros e aprendizado, obrigada pela parceria, foi muito importante contar com o apoio de vocês. Agradeço especialmente à Eliza pelo suporte quando não estive presente, sua ajuda foi muito importante!
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos do mestrado. Muito obrigada a todos!
RESUMO
Muitos efeitos benéficos à saúde são atribuídos ao consumo de alimentos funcionais, como probióticos e prebióticos. No entanto, para que os probióticos exerçam suas funções, devem resistir às condições de processamento, armazenamento e ao trato digestivo, visto que esses são sensíveis à temperatura, acidez ou até mesmo oxigênio. Neste contexto, a produção de microcápsulas visa oferecer proteção e possibilitar a liberação controlada deste ativo no sítio de ação desejado. Este estudo objetivou a produção de microgéis de alginato e gelatina por gelificação iônica para proteção de probióticos (Lactobacillus acidophilus), assim como a avaliação da influência da adição de frutoligossacarídeos (FOS) na matriz de encapsulação. No estudo preliminar, foram analisadas características reológicas e morfológicas das formulações de alginato e gelatina com adição de FOS em concentrações variadas, a fim de otimizar a interação entre proteína, oligo e polissacarídeos, possibilitando a formação de sistemas com características reológicas desejáveis para utilização como modificadores de textura ou sistemas de encapsulação. A partir desses ensaios foi estabelecida a concentração de 3% de FOS, juntamente com alginato (1% m/v) e gelatina (1,5% m/v) para produção dos sistemas de encapsulação. Probiótico livre, microgéis probióticos e simbióticos foram adicionados em iogurte e avaliados quanto à viabilidade ao armazenamento (4°C), ao longo de 28 dias. A associação de probióticos e prebióticos promoveu maior sobrevivência dos Lactobacillus acidophilus ao longo do período de armazenamento. No ensaio in vitro das condições gastrointestinais, os microgéis de alginato e gelatina (AG) e alginato, gelatina e FOS 3% (F3) foram resistentes às condições gástricas, permanecendo íntegras e desintegraram-se em meio intestinal, liberando o material encapsulado no sitio de ação. A contagem dos probióticos livres apresentou maior redução ao longo da passagem pelo trato gástrico simulado. A avaliação das características morfológicas e físico-químicas mostrou que os microgéis foram eficientes para proteção dos microrganismos, garantindo a sobrevivência e viabilidade dos probióticos durante o processo de microencapsulação, resistência aos fluidos digestivos por simulação in vitro e estabilidade ao armazenamento em condições controladas.
ABSTRACT
Many beneficial effects are attributed to the consumption of functional foods like prebiotics and probiotics. However, for probiotics exert their functions, they need to resist the conditions of processing, storage and gastric conditions during passage through the stomach tract, since they are sensitive to temperature, acidity and/or oxygen. In this context, the production of microcapsules aims to provide protection and enable the controlled release of these compounds at the desired site of action. This study aimed to produce alginate and gelatin microcapsules by ionic gelation for probiotic protection (Lactobacillus acidophilus), as well as evaluating the influence of addition of fructooligosaccharides (FOS) in the biopolymeric system. In the preliminary study, rheological and morphological characteristics were analyzed for alginate-gelatin formulations with addition of FOS in varying concentrations, to optimize the interaction between the protein, oligo and polysaccharides, for production of systems with desirable rheological characteristics for use as texture modifiers or encapsulating systems. From these assays, the following concentrations were established: alginate (1% w/v), gelatin (1.5% w/v) and FOS (3% w/v) for the production of encapsulating systems. Free probiotic, probiotic and symbiotic microcapsules were added to yogurt and evaluated regarding their viability to storage (4°C) over 28 days. The combination of probiotics and prebiotics resulted in higher survival of Lactobacillus acidophilus during the storage period. In vitro assay of gastrointestinal conditions showed that gelatin microcapsules (AG) and alginate-gelatin-FOS 3% (F3) were resistant to gastric conditions. These microcapsules disintegrated in the intestinal conditions, releasing the encapsulated material in the desired site of action. Free probiotics showed lower viability along the passage through the simulated gastric tract. Morphological and physico-chemical characteristics showed that microgels were efficient in protecting the microorganisms, ensuring their survival and viability along the microencapsulation process, in vitro digestion simulation and stability along storage.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura molecular de diferentes tipos de frutooligossacarídeos encontrados em plantas. Fonte: Bankeblia (2013). ... 25 Figura 2: Principais modelos de micropartículas: (A) matriz, (B) microcápsula simples, (C) simples irregular, (D) duas paredes, (E) vários núcleos, (F) grupamento de microcápsulas. Adaptado: Gibbs et al. (1999)... 27 Figura 3: Produção de microgéis por atomização/extrusão seguido de gelificação iônica. Fonte: Perrechil, Sato e Cunha (2011). ... 31 Figura 4: Estrutura do alginato. Fonte: Burei et al. (2008). ... 32 Figura 5: Estrutura da gelatina responsável pela formação de tripla hélice. Fonte: Burei et al. (2008). ... 34 Figura 6: Esquema das interações entre o alginato e gelatina. Fonte: Li et al. (2011). ... 35 Figura 7: Tensão de ruptura dos géis formados por difusão salina (A) sem sonicação, (B) com sonicação. Deformação de ruptura dos géis formados por difusão salina (C) sem sonicação, (D) com sonicação. Módulo de elasticidade dos géis formados por difusão salina (E) sem sonicação, (F) com sonicação. ( ) 2 dias ( ) 5 dias ( ) 9 dias. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p<0.05). Letras minúsculas mostram diferenças entre as formulações com mesma concentração de biopolímero ao longo do tempo. Letras maiúsculas mostram as diferenças entre as formulações aos 9 dias em relação ao mesmo tratamento (com ou sem sonicação). ... 43 Figura 8: Géis F4 (a) e F5 (a) 5 dias de gelificação. ... 44 Figura 9: Microestrutura dos géis obtidos por difusão salina em membrana aos 9 dias de gelificaçã das formulações apresentadas na Tabela 1 (A) A, (B) AFos1, (C) AFos3, (D) AFos5. (E) G, (F) GFos1, (G) GFos3, (H) GFos5. Géis obtidos por difusão salina em membrana ao 9 dias, (I) F0, (J) F1, (K) F3, (L) F5. Aumento de 500. ... 47 Figura 10: Microestrutura do gel F3s obtido por difusão salina em membrana aos 9 dias de gelificação submetido ao processo de sonicação. 1% Alginato, 1,5% gelatina e 3% FOS. Aumento de 1000х. ... 49 Figura 11: Curva de escoamento para as soluções puras... 59 Figura 12: Curva de escoamento para as soluções de alginato (1% m/v), gelatina (1,5% m/v) e FOS (1-5% m/v). ... 60 Figura 13: (a) Curva de escoamento das soluções de gelatina (1,5% m/v) e FOS (1-5% m/v), (b) Curva de escoamento para as soluções de alginato (1% m/v) e FOS (1-5% m/v). ... 62 Figura 14: (a) Respostas de materiais em relação à varredura de frequência. Fonte: (TA-INSTRUMENTS), (b) Ensaio oscilatório da formulação F3. ... 64 Figura 15: (a) G` para as formulações de alginato e gelatina adicionadas de FOS, (b) G`` para as formulações de alginato e gelatina adicionadas de FOS. ... 65 Figura 16: (a) Tan delta das formulações de alginato, gelatina e FOS (1 a 5%). ... 65 Figura 17: (a) Módulo de armazenamento - G’, (b) Módulo de dissipação - G’’ para as soluções de gelatina adicionadas de FOS. ... 67 Figura 18: Potencial ζ do alginato e gelatina ... 68
Figura 19: Distribuição de tamanho de partículas dos microgéis com diferentes concentrações de FOS. ... 70 Figura 20: Tamanho da partícula formada por atomização seguida de gelificação iônica durante exposição à solução de CaCl2. ... 72
Figura 21: Microscopia eletrônica de varredura dos microgéis compostos por alginato, gelatina e 3% de FOS. Aumento de 1500х. ... 75 Figura 22: Viabilidade dos L. acidophilus microencapsulados e L. acidophilus livres adicionados em iogurte, mantidos sob refrigeração (4°C) ao longo de 28 dias. Letras minúsculas mostram diferenças entre a mesma formulação ao longo dos 28 dias analisados. Letras maiúsculas representam as diferenças entre as formulações: alginato 1%, gelatina 1,5% e probiótico (AG); alginato 1%, gelatina 1,5%, FOS 3% e probiótico (AGF) e probiótico livre (PL), avaliadas ao mesmo dia. ... 87 Figura 23: Microscopia ótica do iogurte (Streptococcus thermophilus e L. bulgaricus) com adição de probióticos livres (L. acidophilus)... 89 Figura 24: Microestrutura das matrizes probióticas: (a) AG, (b) AGF. Aumento de 2000x. .. 90 Figura 25: Viabilidade dos L. acidophilus à simulação in vitro por um período de 4 horas. ... 91 Figura 26: Microscopia ótica dos microgéis e dos probióticos livres ao longo da simulação in vitro. ... 94
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Formulações e tratamentos avaliados ... 39
Tabela 2: Tratamentos avaliados ... 54
Tabela 3: Parâmetros de ajuste do modelo Herschel-Bulkley para as soluções puras ... 59
Tabela 4: Viscosidade aparente das soluções biopoliméricas a uma taxa de deformação de 100s-1 e parâmetros de ajuste do modelo Herschel-Bulkley... 61
Tabela 5: pH das soluções biopoliméricas ... 68
Tabela 6: Potencial Zeta das soluções de alginato, gelatina e FOS ... 69
Tabela 7: Distribuição de tamanho dos microgéis ... 71
Tabela 8: Potencial Zeta dos microgéis de alginato, gelatina e FOS ... 73
Tabela 9: Formulações produzidas para viabilidade à estocagem e simulação in vitro ... 82
Tabela 10: Preparo das soluções estoque para simulação dos fluidos gástricos simulados (FGS) e fluidos intestinais simulados (FIS). Os volumes estão calculados para um volume final de 100 mL para cada fluido simulado. A adição de enzimas, sais biliares, solução de Ca+2 e demais componentes, resultam na concentração eletrolítica ao final da mistura dos fluidos simulado e alimento. ... 85
Tabela 11: pH do iogurte com adição dos microgéis AG, AGF e PL avaliados durante 28 dias de armazenamento a 4°C. ... 87 Tabela 12: Eficiência do processo de encapsulação em relação à viabilidade dos probióticos 90
Sumário ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO ... 15 INTRODUÇÃO GERAL ... 17 OBJETIVOS ... 18 OBJETIVO GERAL ... 18 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 18
CAPÍTULO 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20
1.1. ALIMENTOS FUNCIONAIS ... 20 1.2. PROBIÓTICOS ... 20 1.2.1. Lactobacillus acidophilus ... 21 1.3. PREBIÓTICOS ... 23 1.3.1. Frutooligossacarídeos ... 23 1.4. SIMBIÓTICOS ... 25 1.5. MICROENCAPSULAÇÃO ... 26 1.5.1. Técnicas de microencapsulação ... 27
1.5.2. Microencapsulação por atomização ... 28
1.5.3. Produção de microgéis por gelificação iônica ... 29
1.7. MATERIAIS UTILIZADOS NO PREPARO DE MICROGÉIS ... 31
1.7.1. Alginato ... 32
1.7.2. Gelatina ... 34
Produção de macrogéis de gelatina e alginato: avaliação das propriedades mecânicas e estruturais ... 36
CAPÍTULO 2. PRODUÇÃO DE MACROGÉIS DE GELATINA E ALGINATO: AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES MECÂNICAS E ESTRUTURAIS ... 37
2.1. INTRODUÇÃO ... 37
2.1. MATERIAL E MÉTODOS ... 38
2.1.1. Materiais ... 38
2.1.2. Métodos ... 38
2.1.2.1. Preparo das soluções biopoliméricas ... 38
2.1.2.2. Preparo dos macrogéis por difusão salina... 39
2.1.2.3. Preparo dos géis a baixas temperaturas ... 39
2.1.2.4. Propriedades mecânicas ... 40
2.1.2.5. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 40
2.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 41
2.2.1. Propriedades mecânicas ... 41
2.2.2. Microscopia eletrônica de varredura ... 46
2.3. CONCLUSÕES ... 50
CAPÍTULO 3. DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE SOLUÇÕES BIOPOLIMÉRICAS E MICROGÉIS DE ALGINATO E GELATINA ... 52
3.1. Introdução ... 52
3.1. MATERIAL E MÉTODOS ... 53
3.1.1. Materiais ... 53
3.1.2. Métodos ... 54
3.1.2.1. Preparo das soluções biopoliméricas ... 54
3.1.2.2. Preparo dos microgéis ... 55
3.1.3. Análises das soluções biopoliméricas ... 55
3.1.3.1. Ensaios reológicos ... 55
3.1.3.2. Potencial ζ ... 56
3.1.3.3. Avaliação do pH das soluções ... 56
3.1.4. Avaliação dos microgéis ... 57
3.1.4.1. Distribuição de tamanho das partículas ... 57
3.1.4.2. Potencial ζ ... 57
3.1.4.3. Microscopia eletrônica de varredura ... 57
3.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 58
3.2.1. Caracterização das soluções biopoliméricas ... 58
3.2.1.1. Curvas de escoamento ... 58
3.2.1.2. Ensaio oscilatório ... 63
3.2.1.3. Carga superficial e pH das soluções biopoliméricas... 68
3.2.2. Caracterização dos microgéis ... 69
3.2.2.1 Tamanho de partícula ... 69
3.2.2.2 Carga superficial e pH ... 72
3.2.2.3. Morfologia dos microgéis ... 74
3.3. CONCLUSÕES ... 76
CAPÍTULO 4. VIABILIDADE DOS L. ACIDOPHILUS LIVRES E ENCAPSULADOS ADICIONADOS EM IOGURTE DURANTE ARMAZENAMENTO SOB REFRIGERAÇÃO E DURANTE A SIMULAÇÃO IN VITRO DAS CONDIÇÕES GASTRO-INTESTINAIS ... 78
4.1.1. Materiais ... 81
4.1.2. Métodos ... 81
4.1.2.1. Ativação da cultura microbiana ... 81
4.1.2.2. Preparo das soluções biopoliméricas ... 81
4.1.2.3. Preparo dos microgéis ... 82
4.1.2.4. Quantificação de L. acidophilus ... 82
4.1.2.5. Eficiência de encapsulação ... 82
4.1.2.6. Produção do iogurte para adição de probiótico livre e dos microgéis ... 83
4.1.2.7. Determinação da viabilidade a estocagem de L. acidophilus encapsulados adiocionados em iogurte ... 83
4.1.2.8. Microscopia ótica ... 84
4.1.2.9. Digestão in vitro ... 84
4.1.2.10. Análises estatísticas ... 86
4.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 86
4.2.1. Eficiência de encapsulação e viabilidade a estocagem ... 86
4.2.2. Simulação da digestão in vitro ... 90
4.3. CONCLUSÕES ... 95
Discussão geral ... 96
Conclusões gerais ... 98
ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
Este estudo foi organizado em Capítulos que estão descritos a seguir:
Introdução geral: Na introdução estão descritas a justificativa do trabalho com seus objetivos gerais e específicos.
Capítulo 1. Revisão bibliográfica: Neste Capítulo, foram abordados os principais fundamentos teóricos que abrangem este estudo. A importância dos alimentos funcionais como os probióticos, prebióticos, bem como sua associação, conhecida por simbióticos. Diferentes técnicas de microencapsulação e materiais biopoliméricos foram apresentados, com atenção especial para o processo de gelificação iônica. Referente aos materiais biopoliméricos utilizados nos processos de microencapsulação, a utilização do alginato, gelatina e frutoligossacarídeos (FOS) foi explorada para produção de matrizes biopoliméricas para potencial aplicação em sistemas de encapsulação ou modificadores de textura.
CAPÍTULO 2. Produção de macrogéis para avaliação das propriedades mecânicas e estruturais: Neste capítulo estão descritas as etapas de desenvolvimento dos macrogéis obtidos por gelificação iônica utilizando membranas de diálise. A adição de FOS em concentrações variando de 1 a 5% (m/v) ao sistema biopolimérico composto por alginato e gelatina, assim como a influência do processo de sonicação das soluções produzidas foram avaliadas em relação às propriedades mecânicas e microestrutura dos macrogéis. A partir dos resultados obtidos foi possível definir a condição para a formação de uma rede mais coesa e matrizes com menores tamanhos de poros.
CAPÍTULO 3. Desenvolvimento e caracterização das soluções biopoliméricas e microgéis: As soluções biopoliméricas utilizadas para produção dos macrogéis obtidos no capítulo 2 foram caracterizadas em relação às curvas de escoamento, a fim de avaliar a influência do processo de atomização na produção de microgéis obtidos por gelificação iônica externa. Ensaios oscilatórios foram conduzidos para caracterização das propriedades viscoelásticas dos sistemas de encapsulação. Após a caracterização das soluções biopoliméricas, os microgéis foram produzidos e avaliados em relação à distribuição de
tamanho de partículas, potencial Zeta, microscopia eletrônica de varredura e microscopia ótica.
CAPÍTULO 4. Viabilidade dos L. acidophilus livres e encapsulados adicionados em iogurte ao armazenamento sob refrigeração e durante a simulação in vitro das condições gastro-intestinais: Após a caracterização e otimização dos microgéis e soluções biopoliméricas, microgéis com adição de L. acidophilus foram produzidos para avaliação da viabilidade dos microrganismos à estocagem em iogurte ao longo de 28 dias, sendo os resultados comparados à viabilidade de L. acidophilus livres adicionados em iogurte. Neste capítulo, realizou-se também a simulação in vitro da digestibilidade dos microgéis contendo probióticos, a fim de determinar a viabilidade dos microgéis probióticos obtidos em relação perfil de liberação do ativo ao longo do trato gastrointestinal e sua aplicabilidade em iogurte.
INTRODUÇÃO GERAL
A microencapsulação é uma técnica que permite proteger compostos de interesse utilizando diferentes tipos de materiais poliméricos, convertendo-os em produtos de maior conveniência, aplicabilidade, além de possibilitar sua liberação controlada e melhorar a biodisponibilidade dos ativos (BANSODE et al., 2010; COOK et al., 2012).
Muitos estudos têm sido desenvolvidos com a finalidade de investigar a utilização de diferentes técnicas de microencapsulação para proteção de microrganismos probióticos (BRINQUES e AYUB, 2011; COOK et al., 2014; GARCÍA-CEJA et al., 2015), uma vez que estes apresentam sensibilidade às condições que são submetidos durante o processamento, armazenamento, entre outros (AVILA-REYES et al., 2014; PHOEM, CHANTHACHUM e VORAVUTHIKUNCHAI, 2015). A administração oral dos probióticos pode resultar na perda de viabilidade, que está associada à passagem pelo estômago, devido à alta acidez e também presença de sais biliares durante a passagem pelo trato intestinal (COOK et al., 2012).
A microencapsulação de probióticos em polímeros biodegradáveis possui muitas vantagens para indústria de alimentos, principalmente em se tratando de polímeros naturais como alginato e gelatina. Estes biopolímeros possuem propriedade de formar géis capazes de proteger materiais sensíveis, como bactérias probióticas, sem afetar sua atividade; não apresentam toxicidade e formam géis reversíveis, capazes de se degradarem sob determinadas condições, sendo muito empregados pela indústria farmacêutica (KAILASAPATHY, 2002; COOK et al., 2012).
Os prebióticos são componentes alimentares que apresentam a potencialidade de atuarem como substrato para proliferação dos probióticos. Quando associado a estes, os alimentos recebem o nome de simbióticos, sendo responsáveis pelo aumento no volume fecal, redução no tempo de trânsito intestinal, entre outros benefícios. Além disso, os prebióticos podem atuar como substrato para produção de metabólitos essenciais como ácidos graxos de cadeia curta, que agem auxiliando a nutrição das células do cólon (LOSADA e OLLEROS, 2002; SAAD, 2006). Sendo assim, a microencapsulação de probióticos em simbiose com prebióticos pode conferir maior resistência aos microgéis e melhora na viabilidade dos microrganismos.
Embora muitos trabalhos venham sendo desenvolvidos no segmento de alimentos funcionais voltando-se para microencapsulação de probióticos, a utilização comercial das
microcápsulas esbarra em questões básicas como rendimento, características físico-químicas dos materiais de cobertura, produção em grande escala, entre outros. A tecnologia de encapsulação por atomização seguida de gelificação iônica, pode se apresentar como uma alternativa interessante, visto que seu processamento exclui o uso de altas temperaturas, o que pode reduzir a viabilidade dos microorganismos, pode ser produzida em grande escala e apresenta baixo custo de produção. Outra vantagem está associada à possibilidade de aplicação dos microgéis em produtos que apresentam alta atividade de água (CHAN, LEE e HENG, 2002; LI et al., 2009).
O segmento de microencapsulação apresenta grande potencialidade na indústria de alimentos, portanto, estudos que visam melhoria de processos, cinética de liberação, testes de simulação in vitro das condições gastrointestinais e viabilidade dos compostos ativos, podem contribuir para melhoria do setor e possibilitar sua aplicação em escala industrial em alimentos com propriedades diversificadas.
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Esse trabalho teve como objetivo avaliar a influência da adição de prebióticos em simbiose com probióticos na produção de microcápsulas de Alginato e Gelatina, assim como a influência da técnica de encapsulação na sobrevivência e viabilidade dos microrganismos probióticos encapsulados com adição de prebióticos (simbióticos) e isoladamente.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliação da matriz de encapsulação (sistema biopolimérico) e da adição do prebiótico na estrutura desta matriz;
Estudo da encapsulação dos microrganismos probióticos pela técnica de atomização seguida de gelificação iônica.
Estudo da viabilidade dos microrganismos probióticos aos fluidos gástricos e intestinais por simulação in vitro e cinética de liberação do ativo ao longo da passagem pelo organismo.
Avaliação da estabilidade dos probióticos microencapsulados adicionados em iogurte durante o armazenamento.ao longo de 28 dias
CAPÍTULO 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. ALIMENTOS FUNCIONAIS
O consumo de alimentos funcionais vem se intensificando nos últimos anos, por apresentarem propriedades benéficas à saúde, como melhorar funções fisiológicas, aumentando o valor nutricional dos alimentos, auxiliando o equilíbrio e atividade da microbiota intestinal, bem estar, saúde e também por reduzirem o risco de algumas doenças (SAARELA et al., 2002; SAAD, 2006). Neste contexto, se torna importante o desenvolvimento de novas tecnologias na indústria de alimentos que auxiliem a obtenção destes resultados.
A fim de atender esta demanda, a indústria de alimentos busca desenvolver pesquisas em inovação que possibilitem o desenvolvimento de alimentos saudáveis, nutritivos e funcionais. Probióticos e prebióticos são exemplos de ingredientes funcionais que vem sendo empregados em diversos alimentos. Muitos estudos vem sendo desenvolvidos a partir da associação destes ingredientes funcionais para aplicação em alimentos. Os produtos que associam probióticos e prebióticos são conhecidos como simbióticos, uma vez que os prebióticos apresentam a potencialidade de melhorar a sobrevivência e colonização de bactérias probióticas, por atuarem como fonte de substrato prontamente disponível para fermentação (DESAI, POWELL e SHAH, 2004).
1.2. PROBIÓTICOS
Probióticos são microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro (FAO/WHO, 2002). Para que os probióticos proporcionem benefícios à saúde, a quantidade recomendada em produtos alimentares é de no mínimo 106 UFC/g, ou que sejam consumidos em quantidades suficientes a fim de se obter uma dose diária de 108 UFC (CHÁVARRI et al., 2010).
Muitos estudos apontam que a capacidade de sobrevivência de bactérias probióticas durante os processos de produção, período de armazenamento, e trânsito no trato gastrointestinal é baixa, devido às condições ácidas as quais são expostas, presença de sais biliares, temperatura, entre outras condições (KAILASAPATHY, 2002; MENEZES et al., 2013).
A fim de conferir maior resistência destes microrganismos ao longo dos processos de produção, armazenamento e garantir sua atuação no intestino, a técnica de microencapsulação vem sendo utilizada com o objetivo de promover a sobrevivência dos probióticos, proporcionando um revestimento adequado, de modo que atinjam o sítio de ação em quantidades adequadas (LI et al., 2009; SHAMEKHI et al., 2013).
Bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus, Bifidobacterium e em menor escala, Enterococcus faecium, são mais frequentemente empregadas como suplementos probióticos para alimentos (SAAD, 2006). Os gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium são encontrados naturalmente em humanos, na parte terminal do intestino delgado e cólon, respectivamente (PADILHA, 2013).
O consumo de alimentos com probióticos auxilia na recomposição da microbiota natural, reforçando os mecanismos de defesa e inibindo o desenvolvimento de microrganismos patógenos. Os probióticos possuem a capacidade de recompor a microbiota intestinal por se aderirem ao intestino e colonizá-lo, conferindo benefícios como aumento da resistência às bactérias patógenas, auxílio na prevenção contra infecções, estímulo à multiplicação de bactérias benéficas, redução dos efeitos de intolerância à lactose e reforço dos mecanismos de defesa naturais do hospedeiro (HOLZAPFEL e SCHILLINGER, 2002; SAAD, 2006).
1.2.1. Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus spp. pertencem ao grupo das bactérias gram-positivas, são classificadas como bactérias anaeróbias facultativas ou anaeróbias e não produzem esporos. Cerca de 56 espécies do gênero Lactobacillus foram listadas segundo Gomes e Malcata (1999), entre as espécies mais indicadas para dietas alimentares, se encontram os Lactobacillus acidophilus.
Os microorganismos pertencentes ao gênero Lactobacillus podem ser divididos em três subgêneros, com base na temperatura ótima de crescimento e metabolismo (homofermentativos estritos, heterofermentativos facultativos, heterofermentativos estritos). Os Lactobacillus acidophilus são classificados como anaeróbios e homofermentativos estritos, por produzirem ácido lático como resultado da fermentação de carboidratos, proteínas, vitaminas do complexo B, ácidos graxos livres e minerais (ANJUM et al., 2014).
A produção de ácido lático contribui para redução do pH do meio onde atuam, resultando em um ambiente desfavorável aos microorganismos patogênicos. Os Lactobacillus acidophilus produzem também um antimicrobiano natural, conhecido como bacteriocinas, que auxilia na manutenção da flora bacteriana saudável (ANJUM et al., 2014). Se desenvolvem em pH ótimo entre 5,5 a 6,0 podendo resistir a pH inferiores a 4,0. Sua temperatura ótima de atuação se encontra entre 35 a 40°C. Apresentam largura de 0,6 a 0,9 μm e comprimento de 1,5 a 6,0 μm e são intolerantes à presença de sais (GOMES e MALCATA, 1999; PADILHA, 2013; ANJUM et al., 2014).
A adição de Lactobacillus acidophilus em alimentos está associada a benefícios à saúde, como diminuição do colesterol no sangue, diminuição do risco de mutagenicidade e carcinogenicidade, constipação, diarreia, intolerância à lactose, entre outros (HOLZAPFEL e SCHILLINGER, 2002).
Por conferirem benefícios à saúde, os probióticos têm sido empregados na produção de alimentos funcionais. No entanto, a perda considerável de viabilidade durante condições de processamento ou armazenamento, como variações de temperatura e pH, ou até mesmo durante a passagem pelo trato gastrointestinal, pela exposição à acidez gástrica e sais biliares, podem provocar redução na viabilidade, fazendo com que os probióticos não alcancem o cólon em quantidades suficientes para atribuir os benefícios a eles associados (PADILHA, 2013).
A microencapsulação oferece aos probióticos maior proteção, se tornando uma potencial solução para melhorar a viabilidade destes microrganismos quando submetidos a condições de estresse (DING e SHAH, 2009).
Diferentes aplicações dos probióticos em alimentos têm sido estudadas, seja na forma livre ou encapsulada, como sua adição em queijos (ONG, HENRIKSSON e SHAH, 2007) e iogurtes (RIBEIRO et al., 2014). Garcia e Ceja et al. (2015) estudaram a adição de microcápsulas probióticas de alginato e quitosana em diferentes matrizes alimentícias, como leite, néctar de pêssego e geleia de amoras, mostrado que matrizes de alginato e quitosana proporcionaram melhor proteção dos probióticos sob armazenamento em temperaturas de refrigeração.
1.3. PREBIÓTICOS
Os prebióticos são componentes alimentares não digeríveis que afetam beneficamente o hospedeiro pois possuem a capacidade de estimular seletivamente a proliferação ou atividade de populações de bactérias desejáveis no cólon e de inibir a multiplicação de patógenos. São componentes com maior poder de atividade no intestino grosso, podendo também atuar sobre a microbiota do intestino delgado (SAAD, 2006).
Entre os ingredientes alimentares, carboidratos não digeríveis (oligo e polissacarídeos), alguns peptídeos e proteínas, além de certos lipídeos estão dentro do conceito de prebióticos, que atuam estimulando seletivamente determinados grupos de bactérias benéficas residentes no cólon, como as bifidobactérias, lactobacilos e eubactérias (GIBSON e ROBERFROID, 1995; HOLZAPFEL e SCHILLINGER, 2002).
As fibras solúveis são componentes alimentares essenciais, pois atuam como substrato para proliferação de Lactobacillus e Bifidobacterium, sendo responsáveis juntamente com os probióticos, pelo aumento no volume fecal e redução no tempo de trânsito intestinal. Além disso, as fibras atuam como substrato para produção de metabólitos essenciais como ácidos graxos de cadeia curta, que agem auxiliando a nutrição das células do cólon (LOSADA e OLLEROS, 2002).
Grande parte dos estudos que avaliam os efeitos dos prebióticos, utilizam frutooligossacarídeos (FOS) e inulina, que são amplamente utilizados na idústria de alimentos (SHIN et al., 2000; IVANOVSKA et al., 2012; PHOEM, CHANTHACHUM e VORAVUTHIKUNCHAI, 2015). Inulina e FOS pertencem à classe de carboidratos denominados frutanos, sendo suas principais fontes a chicória (Cichorium intybus) e a alcachofra de Jerusalém (Helianthus tuberosus) (SAAD, 2006).
1.3.1. Frutooligossacarídeos
FOS são oligossacarídeos não digeríveis, constituídos de uma molécula de sacarose adicionada de outras moléculas de frutose. São carboidratos com baixo grau de polimerização em comparação com outros frutanos e, consequentemente, tem um baixo peso molecular (BENKEBLIA, 2013).
Termo genérico empregado para descrever todos os oligo ou polissacarídeos, os frutanos referem-se aos carboidratos nos quais uma ou mais ligações frutosil-frutose
predominam dentre as ligações glicosídicas. Dentre os frutanos do tipo inulina, são encontrados a inulina e os frutooligossacarídeos. Ambos possuem estruturas químicas e propriedades nutricionais semelhantes devido a sua estrutura básica composta por ligações β(2→1) de unidades frutosil, algumas vezes terminadas em uma unidade glicosil, como pode ser observado pela Figura 1. Oligofrutose e FOS são termos sinônimos utilizados para denominar frutanos do tipo inulina com grau de polimerização inferior a 10 (CARABIN e FLAMM, 1999).
FOS podem ser encontrados em diferentes frutas, cereais e vegetais, como chicória, alcachofra, aspargos, alho, cebola, beterraba e aveia (PASSOS e PARK, 2003). Quando consumidos, passam pelo trato gastrointestinal sem serem absorvidos, sendo expostos à ação dos microorganismos dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, habitantes naturais do intestino, que possuem enzimas capazes de metabolizar os FOS preferencialmente a outras fontes de carboidratos, produzindo ácidos graxos de cadeia curta e ácido lático, o que reduz o pH do cólon e inibe o desenvolvimento de microorganismos patogênicos, além de favorecer o desenvolvimento da flora bifidogênica (LOSADA e OLLEROS, 2002; SAAD, 2006). A fermentação dos prebióticos auxilia a motilidade intestinal, reduzindo o impacto da microbiota prejudicial associada à produção de componentes tóxicos (LOSADA e OLLEROS, 2002).
Diversos estudos buscam comprovar as ações benéficas do consumo de FOS, como redução de prisão de ventre e melhora na absorção de nutrientes sem alteração de parâmetros fisiológicos (LOSADA e OLLEROS, 2002). Estudos em laboratório, indicam que a suplementação com FOS promove aumento da acidificação do ceco, melhora a taxa de absorção de cálcio, magnésio e ferro, além de aumentar os níveis de zinco hepático e de magnésio femorais (WANG et al., 2010).
De acordo com a ANVISA (2003) as alegações de propriedades funcionais em alimentos podem ser atribuídas desde que a porção do produto pronto para consumo forneça as quantidades mínimas necessárias para conferirem benefícios e eles atribuídos. Para o caso dos FOS, se o alimento for sólido deve conter no mínimo 3 g por porção ou 1,5 g se o alimento for líquido. Além disso, o uso do ingrediente não deve ultrapassar 30 g na recomendação diária do produto pronto para consumo.
Figura 1: Estrutura molecular de diferentes tipos de frutooligossacarídeos encontrados em plantas. Fonte: Bankeblia (2013).
1.4. SIMBIÓTICOS
Alimentos simbióticos são obtidos da combinação apropriada de microorganismos probióticos com os compostos prebióticos (GIBSON e ROBERFROID, 1995; REID et al., 2003). O termo simbiótico sugere uma relação de sinergia a partir do uso combinado, onde os compostos prebióticos são responsáveis por favorecer o desenvolvimento dos probióticos (GONZALEZ, ADHIKARI e SANCHO-MADRIZ, 2011).
Os simbióticos vêm sendo estudados pela capacidade de conferir benefícios à saúde. Além dos benefícios que seus contituintes apresentam isoladamente, a interação entre eles pode melhorar a viabilidade e atividade dos probióticos, uma vez que os prebióticos atuam como substrato, favorecendo a seleção e o desenvolvimento destes microorganismos no hospedeiro (HOLZAPFEL e SCHILLINGER, 2002; REID et al., 2003; SAAD, 2006). Os avanços nestes estudos têm possibilitado um aumento significativo na utilização dos simbióticos em alimentos. Muitos estudos investigam a utilização dos prebióticos como material encapsulante, apresentando resultados promissores no aumento da viabilidade dos
probióticos e resistência às condições gastro-intestinais (CHÁVARRI et al., 2010; OKURO et al., 2013)
Saad (2006) sugere que a seleção de probióticos e prebióticos a serem adicionados em alimentos ou em sistemas de encapsulação, deve ser realizada de modo a garantir a sinergia. Microcápsulas simbióticas de amido resistente e Lactobacillus acidophilus em matriz de alginato e quitosana, foram produzidas por de Araújo Etchepare et al. (2016). Os autores mostraram que esta associação melhorou a sobrevivência dos probióticos ao armazenamento e durante a simulação gastro-intestinal. Avila-Reyes et al. (2014) desenvolveram microcápsulas para proteção de L. rhamnosus, avaliando a ação do amido de arroz e inulina na viabilidade dos microrganismos, mostrando que os dois prebióticos atuaram em sinergia com os probióticos, melhorando a viabilidade.
1.5. MICROENCAPSULAÇÃO
A microencapsulação pode ser definida como um processo no qual pequenas partículas ou gotas são revestidas ou incorporadas em uma matriz, que pode ou não ser homogênea. Esta técnica proporciona uma barreira física para o material aprisionado, que pode ser referido como núcleo, fase interna ou recheio, sendo a estrutura de proteção denominada de membrana, material de parede ou revestimento (GHARSALLAOUI et al., 2007).
O material de parede ou membrana atua reduzindo a permeabilidade e exposição do ativo com a finalidade de proteção, reduzindo a perda ou inativação de material encapsulado durante a exposição às condições adversas no processamento, armazenamento ou durante o consumo. Visto que a ação dos probióticos se dá no intestino, os sistemas matriciais para veiculação destes compostos devem ser resistentes à passagem pelo estômago e, consequentemente, a condições de elevada acidez (LI et al., 2009).
As propriedades físico-químicas e composição do material de parede definem o grau de proteção dos compostos encapsulados, assim como a permeabilidade da matriz de encapsulação. O material de parede pode ser composto de uma ou mais camadas e a fase interna de um ou vários ingredientes (GHARSALLAOUI et al., 2007).
Em relação à classificação, as micropartículas podem ser divididas em dois grupos de acordo com o núcleo: aquelas em que o núcleo se encontra na região central, circundado continuamente pelo material de parede, sendo este o chamado sistema reservatório (Figura 2
B, C, D), e aquelas onde o núcleo se encontra disperso na matriz, como sistema matricial, onde uma pequena parte do material encapsulado se encontra na superfície, também chamado de microesferas (Figura 2 A) (OLIVEIRA, 2011).
Figura 2: Principais modelos de micropartículas: (A) matriz, (B) microcápsula simples, (C) simples irregular, (D) duas paredes, (E) vários núcleos, (F) grupamento de microcápsulas. Adaptado: Gibbs et al. (1999).
A utilização da microencapsulação em alimentos proporciona vantagens como proteção de compostos sensíveis, a fim de evitar degradações pela luz, oxigênio, umidade, acidez e ingredientes reativos, evitar a perda nutricional, incorporar mecanismos de liberação controlada, mascarar ou preservar flavors e aromas e prevenir aglomeração (SHAHIDI e HAN, 1993).
1.5.1. Técnicas de microencapsulação
O processo de microencapsulação pode ser realizado mediante várias técnicas, que devem levar em consideração fatores como a aplicação que será dada à microcápsula, o tamanho desejado das partículas, o mecanismo de liberação, além de propriedades biológicas e físico-químicas, tanto do recheio quanto do agente encapsulante (GHARSALLAOUI et al., 2007; COOK et al., 2012).
A técnica de microencapsulação depende das propriedades físicas e químicas dos materiais utilizados. Existem vários métodos físicos e químicos utilizados para a produção de microcápsulas, sendo estes divididos em três categorias: métodos físicos, químicos e físico-químicos (JAMEKHORSHID, SADRAMELI e FARID, 2014).
Nos métodos físicos, a parede da microcápsula é mecanicamente aplicada em torno do núcleo de microcápsula, dentre os métodos físicos incluem a pulverização em banho térmico, evaporação de solvente, liofilização, secagem por spray dryer ou spray chilling, entre outros. Inclusão molecular, emulsão e polimerização interfacial são exemplos de métodos químicos. Já entre os métodos físico-químicos destacam-se a coacervação e separação de fases, gelificação iônica e emulsificação/evaporação do solvente (ZHANG et al., 2013; JAMEKHORSHID, SADRAMELI e FARID, 2014)
Diversas técnicas de encapsulação de probióticos são encontradas na literatura, entre as mais utilizadas estão à técnica de spray drying, spray chilling, as quais passam por processo de atomização; leito fluidizado, coacervação/separação de fases e método eletrostático (ANAL e SINGH, 2007).
Dentre as diferentes técnicas que podem ser empregadas para encapsulação de compostos de significância biológica, tais como enzimas, microrganismos, células vegetais ou animais, a gelificação externa se apresenta como uma alternativa interessante, trata-se de um processo simples, que possibilita a formação de hidrogéis pela difusão do agente de reticulação através das gotas formadas por atomização/extrusão, sem a utilização de agentes emulsificantes e emprego de altas temperaturas (ZHANG et al., 2007; PUGUAN, YU e KIM, 2014). Assim, a utilização de biopolímeros não tóxicos, comestíveis e biodegradáveis como alginato, goma jataí, carragena, gelana e xantana, possibilita a produção de hidrogéis carreadores de probióticos para inserção em diferentes sistemas alimentares por esta técnica (ZHANG et al., 2007).
1.5.2. Microencapsulação por atomização
A microencapsulação por atomização tem como característica a produção de grande quantidade de material, o que a torna economicamente viável e possibilita a produção em grande escala. É um processo que permite certa maleabilidade técnica para melhorar a estabilidade das culturas probióticas e materiais de parede e permite ajustes nas condições de processamento, como regulagem da altura entre o bico atomizador e a solução de reticulação e vazão em que a solução biopolimérica é bombeada (MENEZES et al., 2013).
A atomização pode ser empregada para produção de microcápsulas secas utilizando spray drying ou para produção de microgéis pelo processo de gelificação iônica, que passam por processos subsequentes de secagem ou gelificação, respectivamente.
Diferentes processos utilizados para produção de micropartículas vem sendo investigados. Anal e Singh (2007) relatam que diversos autores apontam o método de secagem por spray drying como bem sucedido ao ser aplicado a diferentes espécies de Lactobacillus e Bifidobacterium. No entanto, bactérias probióticas são sensíveis à temperatura a qual são submetidas durante a secagem, pois as membranas celulares e proteínas das bactérias podem sofrer danos, o que pode levar a perda da atividade probiótica depois de algumas semanas de armazenamento. Outra desvantagem está relacionada à inserção das microcápsulas secas em sistemas alimentares com maior atividade de água, podendo levar ao entumecimento e ruptura das cápsulas com consequente liberação do ativo.
O processo de atomização seguido por gelificação iônica, pode se apresentar como uma técnica interessante para produção de microgéis contendo probióticos e/ou simbióticos. Microgéis preparados por atomização apresentam menor tamanho de partícula quando comparadas às partículas obtidas por extrusão, que também são obtidas por gelificação iônica externa. No entanto as partículas produzidas por esta técnica possuem diâmetro dependente do diâmetro da seringa utilizada para o gotejamento, sendo os dois processos realizados a temperatura ambiente (PATIL et al., 2010).
1.5.3. Produção de microgéis por gelificação iônica
Géis de hidrocolóides podem ser obtidos a partir de diferentes mecanismos, como gelificação iônica, gelificação a quente ou a frio. A gelificação envolve a reticulação de grupos carboxílicos da cadeia polimérica do hidrocolóide, formando zonas de junção que são base para estrutura tridimensional dos géis. Parâmetros como temperatura, presença de íons e a própria estrutura do hidrocolóide podem interferir na formação das zonas de junção (BUREY et al., 2008).
O processo de gelificação iônica pode ser realizado por duas técnicas: gelificação interna ou gelificação externa, também conhecida por difusão.
O processo de gelificação interna envolve dispersão de uma fase aquosa contendo agente de reticulação em sua forma inativa e biopolímero. A gelificação interna da solução biopolimérica ocorre com a ionização do agente de reticulação, mediante a redução no pH do meio ou adição de um ácido orgânico que, ao penetrar pela fase aquosa, reage com o agente de reticulação resultando na gelificação (COOK et al., 2012; HU, AZADI e ARDEKANI, 2015)
Microgéis produzidos pelo processo de gelificação externa, podem ser formados a partir da atomização ou extrusão da solução contendo o biopolímero e o ativo em solução salina, onde as gotas permanecem sob agitação por um determinado período de tempo. Como resultado, ocorre a formação de microgéis, pois a difusão dos cátions divalentes presentes na solução salina através da superfície da gota, promovem a formação de ligações cruzadas nas partículas (BUREY et al., 2008; ELLIS e JACQUIER, 2009).
A gelificação externa é um método simples, não necessita a utilização de solventes orgânicos e apresenta um grande potencial para a aplicação nas áreas farmacêuticas, biomédicas e alimentícia (PATIL et al., 2010).
O processo de gelificação interna proporciona maior controle na entrega do agente reticulante, resultando na formação de uma matriz mais homogênea. Alternativamente, a gelificação externa se destaca como o método de reticulação mais relevante para o alginato do ponto de vista biotecnológico e industrial, pela facilidade de obtenção (LI et al., 2015). De acordo com Puguan, Yu e Kim (2014), microgéis de alginato produzidos por gelificação externa apresentam um gradiente de concentração devido ao processo de difusão, que se inicia na superfície da cápsula e causa resistência aos íons de Ca+2 subsequentes, resultando na formação de uma estrutura não homogênea, com a superfície mais concentrada. Estas estruturas possibilitam maior controle da transferência de massa, protegendo os compostos ativos (PUGUAN, YU e KIM, 2014).
Matrizes hidrofílicas produzidas por interações eletrostáticas têm apresentado resistência a ação de enzimas da parte superior ao trato gastrintestinal, boas propriedades de barreira, resistência mecânica e coesão, mostrando-se um bom veículo para fármacos e compostos bioativos, o que possibilita a produção de hidrogéis carreadores de probióticos para inserção em alimentos líquidos, ou sistemas alimentares com maior atividade de água (MATALANIS, JONES e MCCLEMENTS, 2011; LI et al., 2015).
O processo de atomização seguido de gelificação externa para produção de microgéis (Figura 3) oferece estabilidade, resistência das matrizes e possibilita a incorporação destes em diversos produtos, como produtos com alta atividade de água, podendo também ser utilizados como modificadores de textura de produtos alimentícios, levando a produtos com textura diferenciada (BUREY et al., 2008; ELLIS e JACQUIER, 2009).
Figura 3: Produção de microgéis por atomização/extrusão seguido de gelificação iônica. Fonte: Perrechil, Sato e Cunha (2011).
1.7. MATERIAIS UTILIZADOS NO PREPARO DE MICROGÉIS
Diversos polímeros são utilizados em processos de microencapsulação. A produção de microgéis a partir de biopolímeros possui diversas aplicações na indústria de alimentos, por serem produzidos a partir de fontes naturais e por se degradarem mediante estímulos biológicos, como ação de enzimas, proteínas, hidrólise ou mudanças no pH, originando produtos biocompatíveis e não tóxicos (ZHANG et al., 2007; ALBINI, 2012).
A indústria de alimentos vem utilizando diversos polímeros naturais provenientes de algas, fontes microbianas, animais e vegetais em processos de microencapsulação. Estes polímeros incluem proteínas como colágeno, albumina, gelatina, proteínas do soro e caseinatos; polissacarídeos como alginato, carragena, quitosana e pectina; poliésteres; ácidos ribonucleicos (RNA) e desoxirribonucleicos (DNA), que são empregados mediante diversas técnicas de microencapsulação (ANAL e SINGH, 2007; ALBINI, 2012).
A escolha dos materiais utilizados na produção de microcápsulas é dependente das características do composto bioativo, das características físico-químicas do produto a ser enriquecido, condições de produção, armazenamento, além da forma como o composto será liberado (PERRECHIL, 2012).
Alguns exemplos de aplicação de polímeros para microencapsulação por gelificação de compostos ativos incluem a utilização de alginato e quitosana para produção de microcápsulas de prebióticos e probióticos (CHÁVARRI et al., 2010; DE ARAÚJO ETCHEPARE et al., 2016), gelatina e goma arábica para encapsulação de ácido ascórbico
(COMUNIAN et al., 2013) produção de microcápsulas de alginato contendo óleo essencial de eucalipto (CHANG e DOBASHI, 2003), entre outras. A utilização destes polímeros tem sido explorada devido suas propriedades gelificantes.
1.7.1. Alginato
O alginato é um polissacarídeo natural, presente na parede celular de algas marinhas pardas que apresenta benefícios por ser aceito como um aditivo alimentar e não ser tóxico para as células a serem imobilizadas (LI et al., 2009). É um polímero de alta massa molar formado por monômeros de ácido β-D-Maurônico e ácido α-L-Gulurônico, ligados de forma linear por ligações glicosídicas α(1,4) (Figura 4) (MENEZES et al., 2013).
Figura 4: Estrutura do alginato. Fonte: Burei et al. (2008).
O alginato vem sendo utilizado pela indústria farmacêutica em estudos de encapsulação de medicamentos e células vivas no combate a tumores (BHUJBAL, DE VOS e NICLOU, 2014), na produção de hidrogéis para liberação controlada de fármacos em mucosas (MOEBUS, SIEPMANN e BODMEIER, 2009), como modificador de textura, devido sua alta viscosidade e propriedades gelificantes (JIMÉNEZ-ESCRIG e SÁNCHEZ-MUNIZ, 2000) entre outras aplicações.
Géis de alginato podem ser obtidos através da interação entre cátions divalentes como cálcio, bário e estrôncio, através da interação entre estes e os resíduos de ácido gulurônico do alginato. A temperatura, concentração de íons e de alginato (variando entre 1-2 m/m%) são fatores que influenciam a cinética de gelificação do alginato (BUREY et al., 2008).
O alginato também vem sendo aplicado a sistemas de microencapsulação em combinação com outros compostos. Cook et al. (2012) reportaram a eficiência de diferentes métodos de encapsulação de probióticos para entrega controlada, destacando o processo de extrusão, emulsão e secagem por spray, no entanto, os atores destacaram a importância de estudos que visam aumentar o sobrevivência dos probióticos e aprofundar em pesquisas de entrega controlada, visto que a maioria dos estudos não apresentam informações sobre a natureza de liberação do ativo e poucos experimentos apresentaram resultados realizando testes in vivo de forma a permitir avanços nos estudos da área.
O processo de atomização seguido de gelificação iônica para produção de microgéis de alginato possibilita a formação de partículas de tamanho variável, sendo dependente da viscosidade da solução de alginato, do diâmetro do orifício o qual a solução é injetada, velocidade, assim como a distância entre o bico atomizador por onde passa a solução de alginato e a solução gelificante (ANAL e SINGH, 2007).
Phoem, Chanthachum e Voravuthikunchai (2015) estudaram os processos de extrusão e emulsificação para proteção de Bifidobacterium durante armazenamento, à exposição a altas temperaturas e aos fluidos gástricos e entéricos em matrizes contendo prebióticos. Os autores mostraram que a viabilidade dos probióticos microencapsulados pela técnica de extrusão foi maior que a viabilidade das microcápsulas probióticas obtidas por emulsão quando submetidas à condições adversas, no entanto, o diâmetro das partículas formadas por extrusão foi maior que o diâmetro das partículas obtidas por emulsão, o que pode ter proporcionado uma barreira a mais, dificultando a difusão e consequente desintegração dos microgéis.
Outros estudos para encapsulação de Lactobacillus e Bifidobacterium em alginato em combinação com outros compostos vem sendo desenvolvidos, como alginato e óleo de palma (DING e SHAH, 2009), alginato e gelana, alginato e κ-carragena/goma alfarroba (TOTOSAUS, ARIZA-ORTEGA e PÉREZ-CHABELA, 2013). Menezes et al. (2013) abordam que estudos sobre o sistema cálcio-alginato para encapsulação de microrganismos têm apresentado resultados positivos, melhorando a resistência a diferentes condições as quais os microorganismos são expostos durante as etapas de processamento ao serem adicionados em alimentos e durante a ingestão.
1.7.2. Gelatina
Obtida pela hidrólise parcial do colágeno, proteína encontrada nos tecidos conjuntivo e epitelial, a gelatina é muito utilizada devido às suas propriedades gelificantes termo reversíveis, além de possuir excelente capacidade de formar membranas, ser biocompatível e não apresentar toxicidade (LI et al., 2009). Por este motivo a gelatina tem sido aplicada como material para encapsulação, por apresentar eficácia na melhoria do desempenho de materiais poliméricos (DONG, WANG e DU, 2006; MENEZES et al., 2013; COOK et al., 2014).
Cerca de 14% da fração de gelatina corresponde à umidade, 84% de proteína e 2% de cinzas. A fração proteica é composta por aminoácidos como glicina, prolina e hidroxiprolina em maior abundância, que se unem por ligações peptídicas, formando sequências que se repetem aos longo da cadeia polimérica (Figura 5), que são a base para reticulação e formação de redes tridimensionais características de gelatina e proteínas da família do colágeno (BUREY et al., 2008).
Figura 5: Estrutura da gelatina responsável pela formação de tripla hélice. Fonte: Burei et al. (2008).
Por apresentar caráter anfótero, a gelatina pode atuar em cooperação com polissacarídeos aniônicos como alginato (LI et al., 2009), especialmente em valores abaixo do seu ponto isoelético, quando apresenta carga positiva. A associação de alginato e gelatina para formação de matrizes poliméricas se deve às interações iônicas e ligações de hidrogênio, formadas pelos grupos carboxílicos e hidroxila presentes na estrutura de cada polímero, como
pode ser observado através da Figura 6 (LI et al., 2011). A formação de matrizes compostas de alginato e gelatina tem sido reportada pela capacidade de proteger compostos sensíveis e promover a entrega controlada (DONG, WANG e DU, 2006), assim como sua utilização como modificadores de textura em alimentos (VORON'KO, DERKACH e IZMAILOVA, 2002).
A concentração de gelatina utilizada em produtos alimentícios a fim de promover a gelificação, pode variar de 1-5 m/m% e a formação do gel pode ser afetada pela concentração de gelatina utilizada, taxa de resfriamento e pH do meio (BUREY et al., 2008).
Título do artigo:
Produção de macrogéis de gelatina e alginato: avaliação das propriedades mecânicas e estruturais
Autores: Karen Cristina Guedes Silva; Ana Carla Kawazoe Sato
CAPÍTULO 2. PRODUÇÃO DE MACROGÉIS DE GELATINA E ALGINATO: AVALIAÇÃO DAS PROPRIEDADES MECÂNICAS E ESTRUTURAIS
2.1. INTRODUÇÃO
Associado ao interesse das indústrias de alimentos por produzirem sistemas gelificados comestíveis com diferentes texturas, misturas de biopolímeros tem sido largamente estudadas para produção de géis, por apresentarem características atrativas de textura e propriedades visco-elásticas (HAGHIGHI et al., 2011).
O alginato é um polissacarídeo natural, presente na parede celular de algas marinhas pardas. É um polímero formado por monômeros de ácido β-D-Manurônico e ácido α-L-Gulurônico que em presença de cátions divalentes, pode formar hidrogéis (LI et al., 2009; HU, AZADI e ARDEKANI, 2015). Devido às suas excelentes propriedades de biocompatibilidade, vem sendo empregado na indústria de alimentos e indústria farmacêutica para entrega controlada de fármacos, sendo que sua associação com a gelatina pode aumentar o desempenho deste polímero em relação à entrega controlada e proteção do ativo, por atuar como um reforço para matriz biopolimérica (DONG, WANG e DU, 2006).
Além disso, a introdução de prebióticos juntamente com outros polímeros e proteínas para o desenvolvimento de sistemas de encapsulação vem sendo estudada por diversos autores, podendo resultar em interações promissoras que permitam a proteção de probióticos e diversos compostos de interesse (SABIKHI et al., 2010; KRASAEKOOPT e WATCHARAPOKA, 2014; PHOEM, CHANTHACHUM e VORAVUTHIKUNCHAI, 2015).
Muitos aditivos são utilizados com o propósito de promover modificações nas características reológicas dos sistemas onde são adicionados. Neste sentido, a utilização de aditivos com propriedades funcionais, além de modificar as características reológicas, pode contribuir para o aspecto nutricional dos alimentos. Portanto, a utilização de oligossacarídeos se torna conveniente, por possibilitar modificações de textura e proporcionar efeitos funcionais requeridos pela indústria de alimentos (WITCZAK, WITCZAK e ZIOBRO, 2014). Oligossacarídeos são fibras dietéticas que contribuem na textura e reologia dos sistemas onde são adicionados, sem comprometer o sabor e palatabilidade. Proporcionam benefícios, como aumento da absorção de nutrientes, resistência a microorganismos
patogênicos, além de atuar na redução de riscos de doenças cardiovasculares, obesidade e diabetes (KLEMMER et al., 2011).
Diante do exposto, o estudo da influência da adição de FOS em diferentes concentrações, nas propriedades mecânicas e reológicas de sistemas biopoliméricos compostos de alginato e gelatina, com uso potencial como sistemas de encapsulação ou modificadores de textura foi realizado, de modo a caracterizar as diferentes formulações para potencial aplicação.
2.1. MATERIAL E MÉTODOS
2.1.1. Materiais
Para o preparo das soluções biopoliméricas foram utilizados gelatina suína Tipo A, Bloom 280 (Gelco, Pedreira – SP, Brasil) e alginato de sódio (Danisco, Landerneau - França) e como prebiótico, foi incorporado à matriz de encapsulação frutooligossacarídeo (FOS) Nutraflora P95 (Corn Products, Jundiaí – SP, Brasil). Foram utilizadas membranas de diálise (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3500, Pierce, Rockford, IL, USA) para a formação dos macrogéis imersos em solução de CaCl2 dihidratado (Dinâmica - Química contemporânea
Ltda. CAS 10035-04-8). Os demais materiais utilizados foram de grau analítico.
2.1.2. Métodos
2.1.2.1. Preparo das soluções biopoliméricas
Solução contendo 1,5 % (m/v) de gelatina foi preparada pela adição do pó em água deionizada a temperatura ambiente. Posteriormente, a solução foi aquecida a 45°C, em agitador magnético por 15 minutos. Resfriou-se a solução a 25°C antes da adição de 1% de alginato (m/v) e diferentes concentrações de FOS variando de 1% a 5% (m/v). As soluções, apresentadas na Tabela 1, foram mantidas sob agitação constante até a homogeneização completa, por cerca de 2 horas.
As formulações F0s, F3s, F4s e F5s foram produzidas com uma etapa adicional de tratamento de ultra som (Unique, USC 1450 - SP) após o preparo das soluções, com frequência ultra-sônica 25 kHz e potência de 150W, por um período de 10 minutos.
2.1.2.2. Preparo dos macrogéis por difusão salina
As soluções biopoliméricas foram transferidas para membranas de diálise (SnakeSkin Dialysis Tubing, 3500, Pierce, Rockford, IL, USA) onde permaneceram em contato com solução de cloreto de cálcio 150 mM a temperatura ambiente, para formação do gel através da difusão de íons Ca+2. Foram avaliadas 10 formulações com alginato, gelatina e FOS, além das misturas de cada biopolímero, separadamente, com o FOS (Tabela 1), onde foram avaliadas as concentrações de prebióticos adicionados à matriz biopolimérica e a influência do processo de sonicação na formação dos macrogéis.
Tabela 1: Formulações e tratamentos avaliados
Formulação FOS (% m/v) Gelatina (% m/v) Alginato (% m/v) Sonicação
F0 0 1,5 1,0 - F0s 0 1,5 1,0 Sim F1 1 1,5 1,0 - F2 2 1,5 1,0 - F3 3 1,5 1,0 - F3s 3 1,5 1,0 Sim F4 4 1,5 1,0 - F4s 4 1,5 1,0 Sim F5 5 1,5 1,0 - F5s 5 1,5 1,0 Sim A 0 0 1,0 - AFos1 1 0 1,0 - AFos3 3 0 1,0 - AFos5 5 0 1,0 - G 0 1,5 0 - GFos1 1 1,5 0 - GFos3 3 1,5 0 - GFos5 5 1,5 0 -
O sub índice s indica que as amostras foram submetidas ao processo de sonicação
2.1.2.3. Preparo dos géis a baixas temperaturas
Os géis sem adição de alginato, foram preparados pela adição de gelatina em água, como descrito na seção 2.1.2.1. As soluções foram aquecidas a 45°C, posteriormente resfriadas a 25°C antes da adição de FOS nas concentrações de 0, 1, 3 e 5 % m/v. Para formação dos géis, as soluções foram transferidas para placas de petri e armazenadas em Incubadora BOD (Marconi - MA 415 UR) a 4°C por 24 horas.
2.1.2.4. Propriedades mecânicas
Propriedades mecânicas (tensão de ruptura, deformação de ruptura e módulo de elasticidade) foram avaliadas após 2, 5 e 9 dias de contato com solução de CaCl2, a fim de
verificar o tempo da gelificação do alginato.
Os macrogéis foram retirados da membrana e cortados perpendicularmente, com altura igual ao diâmetro medido em cada intervalo de tempo avaliado (2, 5 e 9 dias) sendo submetidos a medidas de compressão uniaxial em Texturômetro universal TA-XT Plus Texture Analyzer (Stable Micro Systems, UK) utilizando geometria acrílica de 45mm de diâmetro. As propriedade mecânicas foram obtidas por compressão dos géis a 80% da altura original a 25°C, com velocidade de compressão de 1mm/s. Tensão de Hencky (σt),
deformação de Hencky (Ɛt) e módulo de elasticidade (E), foram calculados de acordo com as
respectivas equações (1) a (3), os dados de ruptura ( ) e equivalem ao ponto do primeiro pico observado.
(1) ( ) (2) (3)
onde, é a força no tempo t, e área inicial e altura inicial da amostra respectivamente, e a altura no tempo t. As propriedades mecânicas obtidas no ponto de ruptura estão associadas ao ponto máximo da curva de tensão deformação, enquanto o módulo de elasticidade equivale ao coeficiente angular na zona de deformação reversível.
2.1.2.5. Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras foram preparadas para microscopia, de acordo com a metodologia descrita por Vilela, Cavallieri e Cunha (2011), com algumas modificações.
Amostras dos macrogéis com aproximadamente (5mm x 5mm x 10mm) foram fixadas por 24 horas em tampão glutaraldeído (2,5%) e cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7.2) com a finalidade de minimizar modificações estruturais durante os tratamentos de secagem posteriores. As amostras de macrogéis fixadas foram fraturadas em nitrogênio líquido, e
