UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Mecânica
ERONILDO ALVES PINTO JUNIOR
Manufatura Aditiva Baseada em Extrusão de
Hidrogéis do Sistema Alginato / Nanocelulose
CAMPINAS
ERONILDO ALVES PINTO JUNIOR
Manufatura Aditiva Baseada em Extrusão de
Hidrogéis do Sistema Alginato / Nanocelulose
Orientador: Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila
CAMPINAS 2019
Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Engenharia Mecânica da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre em Engenharia Mecânica, na área de Materiais e Processos de Fabricação.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO(A) ALUNO ERONILDO ALVES PINTO JUNIOR E ORIENTADO PELO PROF. Dr. MARCOS AKIRA d’ÁVILA.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura
Rose Meire da Silva - CRB 8/5974
Pinto Junior, Eronildo Alves, 1990-
P658m Manufatura aditiva baseada em extrusão de hidrogéis do sistema alginato/nanocelulose / Eronildo Alves Pinto Junior. – Campinas, SP : [s.n.], 2019.
Orientador: Marcos Akira D'Ávila.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica.
1. Nanocristais de celulose. 2. Alginatos. 3. Impressão tridimensional. 4. Pseudoplasticidade. 5. Reticulação. 6. Hidrogéis. I. D'Ávila, Marcos Akira, 1972-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Mecânica. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Additive manufacturing based on alginate/nanocellulose system
hydrogels extrusion Palavras-chave em inglês: Cellulose nanocrystals Alginates Three-dimensional printing Crosslinking Hydrogels
Área de concentração: Materiais e Processos de Fabricação Titulação: Mestre em Engenharia Mecânica
Banca examinadora:
Marcos Akira D'ávila
Carlos Henrique Schuracchio Maria Helena Andrade Santana
Data de defesa: 19-02-2019
Programa de Pós-Graduação: Engenharia Mecânica
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: http://orcid.org/0000-0001-5157-4379
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA
COMISSÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA MECÂNICA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE MANUFATURA E
MATERIAIS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ACADÊMICO
Manufatura Aditiva Baseada em Extrusão de
Hidrogéis do Sistema Alginato / Nanocelulose
Autor: Eronildo Alves Pinto Junior Orientador: Marcos Akira d’Ávila
A Banca Examinadora composta pelos membros abaixo aprovou esta Dissertação:
Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila
DEMM/FEM/Universidade Estadual de Campinas
Prof. Dr. Carlos Henrique Scuracchio
DEMa/CCET/Universidade Federal de São Carlos
Prof. Dr.a Maria Helena Andrade Santana
DEMBio/FEQ/ Universidade Estadual de Campina
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedicatória
Aos meus queridos pais, por todo apoio e dedicação durante minha trajetória educacional e profissional. À minha filha, pois ela é o motivo por quem sempre busco o melhor. Aos meus amigos, por sempre estarem comigo em todos os momentos. À Mila, que entrou na minha vida trazendo muito amor, companheirismo e felicidade.
Agradecimentos
Gostaria de agradecer e expressar minha gratidão a todas as pessoas que contribuíram para a coclusão dessa dissertação:
A Deus pelo dom da vida.
Aos meus pais e irmãos, que são a base de tudo na minha vida, por todo apoio, carinho e dedicação.
A Anita Marchionatti, por todo apoio, dedicação, amor e carinho em cuidar da nossa filha.
Ao Prof. Dr. Marcos Akira d’Ávila por depositar sua confiança em meu trabalho, por suas orientações e contribuições para esta pesquisa.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Aos meus amigos e colegas de laboratório José Luis, Rosemeire, Ana Flávia, Jéssica, Nicolao, Taís, Vicente, pelas discussões e suas valiosas sugestões e críticas.
À Dra. Maria Helena Andrade Santana e Carla França, por disponibilizar o uso de o equipamento Zetasizer e o liofilizador do Laboratório de Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos.
Para Mila e Tonton, obrigado pelo carinho e apoio.
Resumo
Hidrogéis são redes de polímeros reticulados com propriedades hidrofílicas. São materiais com capacidade de armazenamento de água, devido aos grupos funcionais hidrofílicos presentes na cadeia polimérica. Juntamente com os processos de manufatura aditiva (MA) as aplicações no campo biomédico são extensas. Estes materiais são usados para obter tintas e biotintas. Estes últimos são sistemas carregados com células. O estudo das propriedades reológicas desses materiais no contexto da MA desempenha um papel importante para definir a sua aplicabilidade. Nesta pesquisa, hidrogéis nanocompósitos em suspensão aquosa, formados por alginato e celulose nanocristalina (CNCs) foram estudados para impressão 3D baseada em extrusão visando à construção de scaffolds para aplicações em Engenharia de Tecidos. Interações eletrostáticas entre os CNCs e o alginato ocorrem na suspensão aquosa. Então, é possível obter hidrogéis com propriedades adequadas para MA como uma função da composição. Assim, analisou-se o comportamento reológico deste sistema, onde foram obtidos hidrogéis fisicamente reticulados de Alginato/CNCs. Os hidrogéis foram internamente reticulados por ligações iônicas, e a cinética de reticulação foi monitorada por meio do estudo do módulo de armazenamento (G’) com o tempo. Os dados experimentais foram bem descritos quando comparados com o modelo da equação de Hill modificada, onde foi observado que o processo de reticulação interna é atrasada sob a presença de CNCs. Seguidamente, foi obtida uma tinta com prorpiedades adequadas para o processo de extrusão por meio de um procolo de obtenção e avaliação de tintas e biotintas. Um comportamento pseudoplástico descrito pelo modelo de lei das potências de Ostwald-de Waele foi obervado para altas concentrações de CNC. O teste de recuperação da viscosidade demonstrou uma recuperação rápida da estrutura, que não apresentou dependência da taxa de cisalhamento. Os testes de varredura de amplitude e frequência mostraram que a tinta com as propriedades reológicas adequadas para o processo de extrusão teve um comportamento viscoelástico do tipo sólido (solid-like). Em seguida, testes de impressão 3D foram realizados usando um sistema acionado por pistão. Composições adequadas para o processo de extrusão foram identificadas, os parâmetros de impressão foram estudados e scaffolds com diferentes números de camadas foram obtidos.
Palavras Chave: Nanocristais de celulose (CNC); Alginato; Pseudoplástico; Solid-like; Reticulação interna; Hidrogéis; Impressão 3D.
Abstract
Hydrogels are networks of crosslinked polymers with hydrophilic properties. They are materials with water storage capacity, due to the hydrophilic functional groups present in the polymer chain. Together with the additive manufacturing (AM) processes the applications in the biomedical field are extensive. These materials are used to obtain inks and bioinks. The latter are cell-loaded systems. The study of the rheological properties of these materials in the context of AM plays an important role in defining their applicability. In this research, aqueous suspension nanocomposites, formed by alginate and nanocrystalline cellulose (CNCs) were studied for extrusion-based 3D printing for the construction of scaffolds for applications in Tissue Engineering. Electrostatic interactions between CNCs and alginate occur in the aqueous suspension. Then, it is possible to obtain hydrogels having properties suitable for MA as a function of the composition. Thus, the rheological behavior of this system, where physically crosslinked Alginate / CNC hydrogels were obtained. The hydrogels were internally crosslinked by ionic bonds, and the crosslinking kinetics was monitored by studying the storage modulus (G') over time. The experimental data were well described when compared to the model of the modified Hill equation where it was observed that the internal crosslinking process is delayed under the presence of CNCs. Thereafter, an ink having properties suitable for the extrusion process was obtained by means of a process for the preparation and evaluation of inks and bioinks. A pseudoplastic behavior described by the Ostwald-de Waele power law model was observed for high concentrations of CNC. The viscosity recovery test showed a rapid recovery of the structure, which showed no shear rate dependence. The amplitude and frequency sweep tests showed that the ink with the rheological properties suitable for the extrusion process had a solid-like viscoelastic behavior. Then, 3D printing tests were performed using a piston driven system. Suitable compositions for the extrusion process were identified, the printing parameters were studied and scaffolds with different numbers of layers were obtained.
Key Word: Cellulose Nanocrystals (CNC); Alginate; Shear-thinning; Solid-like; Internal gelation; hydrogels; 3D Printing.
Lista de Ilustrações
Figura 2.1: Esquema representativo de hidrogéis de origem química e física (Aouada, 2009). ... 22 Figura 2.2: Esquema de classificação dos hidrogéis. Traduzido de (Laftah et al., 2011). ... 23 Figura 2.3: Esquema de classificação dos hidrogéis quanto ao tipo de reticulação. Adaptado de (Hamidi et al., 2008). ... 24 Figura 2.4: Estrutura química da celulose (Habibi et al., 2010). ... 26 Figura 2.5: Representação esquemática do isolamento do CNC. Adaptado de (Benavides, 2011). ... 27 Figura 2.6: Forma morfológica dos CNCs de origem bacteriana e de tunicados (Moon et al., 2016). ... 28 Figura 2.7: Estrutura polimérica do alginato (Coma, 2013). ... 29 Figura 2.8: Estrutura de reticulação iônica dos blocos G de alginato com íons de cálcio (Marriott et al., 2014). ... 30 Figura 2.9: Abordagem da engenharia tecidual mediante a utilização de scaffolds. (Dávila Sánchez, 2014). ... 33 Figura 2.10: Elementos chave da engenharia tecidual (Khang et al., 2007). ... 34 Figura 2.11: Principais requisitos dos scaffolds (Dávila Sánchez, 2014). ... 35 Figura 2.12: Abordagens de impressão 3D envolvendo o uso de hidrogéis. Traduzido de (Malda et al., 2013). ... 38 Figura 2.13: Viscosidade pela taxa de cisalhamento para fluidos Newtonianos e diferentes não-Newtonianos. Traduzido de (Jungst et al., 2015). ... 45 Figura 2.14: Curvas de viscosidade descrevendo o comportamento reológico geral de uma dispersão de 3% de nanocelulose e 3% de solução de alginato. (Gatenholm et al., 2016). ... 46 Figura 2.15: Ilustração do papel da viscosidade na Impressão 3D. A gelatina metacrilada (gelMA), forma gotículas na ponta da agulha (A), resultando na deposição de fios que se espalham na superfície (C). Quando ácido hialurônico (HA) são adicionados, os filamentos podem ser depositados a partir da ponta da agulha (B), resultando em uma construção de quatro camadas (D). As barras de escala em A-C representam 5 mm; a barra de escala em D é de 2 mm. (Schuurman et al., 2013). ... 47
Figura 2.16: Representação esquemática da origem da pseudoplasticidade e tensão de escoamento na impressão de gelatina metacrilada (gelMA)/goma de gelano. Na seringa, as cadeias de gelano (em branco) formam uma rede temporária e induzem uma viscosidade semelhante a gel (gel-like viscosity) (i). Ao dispensar através de uma agulha, a rede temporária é quebrada por cisalhamento e todas as cadeias poliméricas se alinham, reduzindo a viscosidade por ordens de magnitude (ii). Imediatamente após a remoção da tensão de cisalhamento, a rede temporária é restaurada e o filamento plotado solidifica instantaneamente (iii). (Schuurman et al., 2013). ... 49 Figura 2.17: Interpretação física da tensão de cisalhamento em SAOS (Morrison, 2001). ... 51 Figura 2.18: Esquema de como o cisalhamento oscilatório de pequena amplitude é produzido. (Morrison, 2001). ... 53
Figura 3.1: Gel de Alginato/CNC ... 59 Figura 3.2: Potencial zeta das amostras (a) 2% (m/m) de alginato, (b) 10% (m/m) de CNC e (c) mistura 2% (m/m) de alginato e 10% (m/m) de CNC. ... 62 Figura 3.3: Distribuição do tamanho de partículas do CNC em função da intensidade. ... 63 Figura 3.4: Viscosidade como função da taxa de cisalhamento (a) 0% (m/m) de alginato, (b) 1% (m/m) de alginato e (c) 2% (m/m) de alginato. ... 64 Figura 3.5: Fator de amortecimento em função da frequência angular: (a) 0% em massa de alginato, (b) 0% em massa de CNC (c) 1% em massa de alginato e (d) 2% em massa de alginato. ... 66 Figura 3.6: Esquema de formação de ligações de hidrogênio entre os grupos carboxílicos COO- do alginato e os grupos OH
presentes na superfície das hastes do CNC (Deepa et al, 2016). ... 67 Figura 3.7: Reticulação interna do alginato (Férres, 2014) ... 68 Figura 3.8: Módulo de armazenamento G' (símbolos sólidos) e módulo de perda (G'')
(símbolos abertos) como função da frequência angular (ω). ... 68
Figura 3.9: Cinética de reticulação: (a) G '(símbolos abertos), G'' (símbolos sólidos) e (b) fator de amortecimento como uma função do tempo. ... 70
Figura 4.1: Fluxograma do protocolo de avaliação e obtenção de tintas para impressão 3D por extrusão. Traduzido de (Dávila, 2018). ... 77 Figura 4.2: Sistema modular para impressão 3D de extrusão ... 78
Figura 4.3: (a) Viscosidade (ƞ) em função da taxa de cisalhamento (𝛾) para amostras contendo 2% (m/m) de alginato e variando a concentração de CNC (0 a 10% m/m), Módulo de armazenamento (𝐺′) (símbolos sólidos) e módulo de perda (𝐺′′) (símbolos abertos) em função de: (b) tensão (𝛾) e (c) frequência angular (𝜔). ... 81 Figura 4.4: Imagens de microscopia óptica mostrando a extrusão de uma mistura contendo (a) 2% de alginato puro, (b) 2% de alginato com 6% de CNC, (c) 2% de alginato com 8% de CNC e (d) 2% de alginato com 10% de CNC. A barra de escala representa 1 𝑚𝑚. ... 83 Figura 4.5: Viscosidade (𝜂) em função do tempo (𝑡) para o teste de recuperação. A taxa de cisalhamento (𝛾) aumenta de 100 para 500 𝑠 -1. ... 84 Figura 4.6: Formação do filamento variando as velocidades de extrusão e impressão. (a) Ve =
0,526 mm.min-1 e Vi = 10 mm.s-1, (b) 0,526 mm.min-1 e Vi = 20 mm.s-1, (c) 0,526 mm.min-1 e
Vi = 30 mm.s-1, (d) 1,052 mm.min-1 e Vi = 10 mm.s-1, (e) 1,052 mm.min-1 e Vi = 20 mm.s-1,
(f) 1,052 mm.min-1 e Vi = 30 mm.s-1, (g) 1,578 mm.min-1 e Vi = 10 mm.s-1, (h) 1,578
mm.min-1 e Vi = 20 mm.s-1 e (i) 1,578 mm.min-1 e Vi = 10 mm.s-1. ... 85
Figura 4.7: Largura do filamento em função da velocidade de impressão (Vi) para diferentes velocidades de extrusão (Ve). ... 86 Figura 4.8: Amostras impressas: (a) 10 camadas sem agente reticulador, (b) 30 camadas sem agente reticulador, (c) 10 camadas com agente reticulador e (d) 30 camadas com agente reticulador. ... 87 Figura 4.9: Qualidade da impressão em função do tempo de reticulação: (a) após 1 hora, (b) após 2 horas, (c) após 3 horas e (d) tan𝛿 em função do tempo. ... 88
Lista de Tabelas
Tabela 2.1: Polissacarídeos importantes, fontes e principais aplicações (Brant, 2008). ... 21
Tabela 2.2: Fontes dos íons cálcio, solubilidade e velocidade de reticulação. ... 31
Tabela 2.3: Características do hidrogel de alginato quando utilizada a técnica de transferência direta induzida por laser. Modificado de (Malda et al., 2013). ... 39
Tabela 2.4: Características de diferentes hidrogéis quando utilizada a técnica de impressão por jato de tinta. Modificado de (Malda et al., 2013). ... 40
Tabela 2.5: Principais características das três abordagens de impressão 3D à base de hidrogéis. Traduzido de (Malda et al., 2013). ... 41
Tabela 2.6: Características de diferentes hidrogéis quando utilizada a técnica de impressão por extrusão. Modificado de (Malda et al., 2013). ... 42
Tabela 2.7: Modelos Reológicos Para Comportamento de Fluxos. ... 50
Tabela 2.8: Comportamento viscoelástico Segundo valor de tan𝛿. ... 55
Tabela 3.1: Concentrações das suspensões de Alginato / CNC. ... 59
Tabela 3.2: Parâmetros de ajuste de dados experimentais usando a equação de Hill modificada (Eq. 3.1). ... 70
Tabela 3.3: Potencial zeta ... 62
Tabela 4.1: Parâmetros de ajuste do modelo de viscosidade Ostwald-de Waele. ... 81
Sumário
1 INTRODUÇÃO ... 16
1.1 Objetivos ... 182 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20
2.1 Polímeros naturais ... 20 2.2 Hidrogéis ... 212.2.1 Classificação dos Hidrogéis... 23
2.2.2 Tipos de Reticulação ... 24
2.2.3 Nanocelulose ... 26
2.2.4 Alginato ... 29
2.3 Aplicações na Engenharia Tecidual... 32
2.3.1 Scaffolds para Engenhara Tecidual ... 34
2.3.2 Biomateriais para fabricação de scaffolds ... 37
2.4 Sistemas de impressão 3D à base de hidrogéis ... 37
2.4.1 Transferência direta induzida por lazer ... 38
2.4.2 Impressão de jato de tinta ... 39
2.4.3 Impressão por extrusão ... 41
2.5 Propriedades dos hidrogéis para impressão 3D ... 43
2.5.1 Reologia ... 44
2.5.2 Viscosidade ... 46
2.5.3 Pseudoplasticidade ... 48
2.5.4 Cisalhamento oscilatório de pequena amplitude (SAOS) ... 50
3 ESTUDOS REOLÓGICOS EM SUSPENSÕES DE CELULOSE
NANOCRISTALINA E ALGINATO ... 57
3.1 Materiais e Métodos ... 57
3.1.2 Preparação das suspensões ... 58
3.1.3 Potencial zeta e tamanho de partícula... 60
3.1.4 Caracterização Reológica ... 60
3.1.5 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) ... 61
3.2 Resultados e Discussão ... 61
3.2.1 Potencial zeta e tamanho de partícula... 61
3.2.2 Caracterização de cisalhamento no estado estacionário ... 63
3.2.3 Caracterização de varredura de frequência e cinética de reticulação ... 65
3.2.4 Estrutura química ... 71
3.3 Conclusões parciais ... 72
4. IMPRESSÃO POR EXTRUSÃO DE HIDROGÉIS DE ALGINATO E
CELULOSE NANOCRISTALINA ... 74
4.1 Materiais e Métodos ... 75
4.1.1 Materiais ... 75
4.1.2 Formulação dos géis ... 75
4.1.3 Protocolo de obtenção da tinta... 76
4.1.4 Teste de formação de filamento ... 78
4.1.4 Impressão por extrusão ... 79
4.2 Resultados e Discussão ... 79
4.2.1 Protocolo de avaliação e obtenção da tinta ... 79
4.2.2 Impressão 3D baseada em extrusão ... 84
4.3 Conclusões parciais ... 89
5 CONCLUSÕES ... 90
1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, a biofabricação tem ganhado grande atenção. Neste campo de pesquisa relativamente jovem, as tecnologias de montagem automatizada ou manufatura aditiva (MA) são exploradas para gerar construções tridimensionais híbridas de biomateriais e células (Groll et al., 2016). Esta abordagem contém grandes promessas de oferecer soluções para alguns dos desafios persistentes e ainda não resolvidos da engenharia tecidual e da medicina regenerativa, como a vascularização ou a inervação. Pesquisadores de diferentes formações científicas tentam resolver alguns dos principais gargalos deste campo de pesquisa altamente interdisciplinar. Dentre os desafios, a disponibilidade de materiais adequados para a fabricação de construções hierárquicas e complexas é um dos principais desafios que limitam o desenvolvimento da biofabricação. Nesse campo de pesquisa, as biotintas (bioinks), que consistem em biomateriais e células com propriedades adequadas para manufatura aditiva ou impressão tridimensional, são especialmente interessantes e são promissoras para a obtenção de tais estruturas. A classe mais proeminente de materiais como tintas são os hidrogéis, porque eles podem fornecer características como biocompatibilidade, bioabsorção e até certa resistência mecânica, promovendo assim um microambiente viável para a fixação, crescimento e proliferação de células (Rowley et al., 1999). A capacidade de impressão é definida pelas propriedades reológicas dos materiais e deve ser ajustada ao tipo de processo de fabricação para gerar objetos tridimensionais com alta fidelidade à forma.
As principais técnicas de MA de hidrogéis são impressão a jato de tinta, transferência direta induzida por laser e impressão por extrusão (Jungst et al., 2015; Malda et al., 2013; Murphy e Atala, 2014). Em particular, a impressão baseada em extrusão se destaca, pois é o processo mais versátil, com condições de proporcionar boas condições de processamento e qualidade do produto final (Jungst et al., 2015).
Embora a impressão baseada em extrusão ofereça uma plataforma de fabricação flexível, as exigências reológicas impostas aos hidrogéis para impressão são mais específicas. A análise reológica pode ajudar a acelerar o desenvolvimento de materiais imprimíveis. Na
literatura podem ser encontradas pesquisas nas quais são apresentados técnicas de análise reológica e modelos matemáticos que ajudam a compreender melhor a capacidade de impressão de materiais (Tian et al., 2009; Bendtsen, 2017; Kelly, 2015).
Um dos sistemas de hidrogéis promissores para impressão por extrusão são os hidrogéis nanocompósitos. A utilização conjunta de partículas de dimensões nanométricas e polímeros biocompatíveis em suspensão pode resultar em materiais que associam propriedades reológicas adequadas para a MA com boas propriedades mecânicas e biocompatibilidade características dos hidrogéis. Dentre os sistemas de hidrogéis nanocompósitos para aplicações em MA destaca-se o sistema Alginato/nanocelulose.
Os nanocristais de celulose (CNCs) são partículas semelhantes a hastes em escala nanométrica obtidas a partir de materiais celulósicos, como polpa de madeira, bactérias, cânhamo, entre outros (Lin et al., 2012a; Liu et al., 2011). As vantagens dos CNCs incluem sua alta resistência mecânica, biodegradabilidade, baixa toxicidade, boa estabilidade térmica e custo relativamente baixo (Azizi Samir et al., 2005; Eichhorn, 2011). Os CNCs possuem propriedades reológicas únicas devido à sua alta taxa de proporção e densidade de grupos de hidroxilas de superfície quando comparado aos outros grupos funcionais. Em relação ao comportamento reológico, partículas coloidais no formato de hastes são mais eficientes para a obtenção de comportamento altamente pseudoplástico e comportamento viscoelástico com predominância de comportamento elástico (Mewis e Wagner, 2012). Esse tipo de comportamento, tipicamente observado em suspensões concentradas de nanocristais de celulose, é de grande interesse em aplicações na manufatura aditiva (AM).
Os hidrogéis de alginato de sódio têm sido amplamente pesquisados e utilizados em uma ampla gama de aplicações, desde agentes espessantes em alimentos até agentes de imobilização e scaffolds para engenharia tecidual (Lee e Mooney, 2012; Sun e Tan, 2013). O alginato é um polissacarídeo aniônico que pode ser extraído de macroalgas ou culturas bacterianas. É um copolímero de (1-4) ligado a β-D-manuronato (M) e resíduos de α-L-guluronato (G) (Gacesa, 1988; Percival, 1979). A biocompatibilidade inata do alginato o torna favorável para uso em muitas aplicações biomédicas. Suas propriedades de reticulação
permitem a encapsulação de células, fármacos, fatores de crescimento para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo infecções, úlceras e cicatrização de feridas (Smidsrod et
al., 1990; Szekalska et al., 2016). O alginato tem sido extensivamente estudado para a
cicatrização de feridas sob a forma de biocurativos, uma vez que filmes finos são facilmente obtidos através do controle de suas propriedades de reticulação (Pereira et al., 2013).
Diante deste cenário os processos de manufatura aditiva apresentam um grande potencial para desenvolver estruturas tridimensionais, então, a engenharia tecidual pode ser estudada de forma mais profunda aplicando os processos que atualmente podem ser desenvolvidos com equipamentos de baixo custo, com isso, esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de protocolos apropriados para avaliar e obter tintas com uma capacidade ótima de impressão. Assim, associar as propriedades reológicas envolvidas em cada estágio do processo permitirá obter formulações de tinta ótimas para impressão 3D baseada em extrusão, onde o método de reticulação interna pôde ser aplicado durante a impressão para obter hidrogéis, não sendo necessária a etapa de reticulação após a impressão.
1.1 Objetivos
O objetivo desse trabalho foi estudar a reologia de hidrogéis nanocompósitos do sistema Alginato/Nanocelulose visando a manufatura aditiva por extrusão desse sistema para a obtenção de estruturas com potencial em aplicações na engenharia tecidual.
As seguintes etapas foram realizadas para alcançar o objetivo desse trabalho:
Estudo do comportamento reológico de soluções aquosas de alginato de sódio e suspensões de Alginato/CNC em diferentes concentrações, buscando avaliar as interações entre CNC e cadeias de alginato e sua influência no comportamento reológico;
Obtenção de hidrogéis com comportamento reológico apropriado para o processo de impressão baseado em extrusão 3D;
Estudo dos parâmetros de impressão e fazer correlações com os estudos reológicos;
Estudo da reticulação interna do Alginato/CNC e reticulação de estruturas impressas
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Polímeros naturais
Polímeros naturais são produzidos e extraídos da natureza. Exemplos incluem borracha natural, amido, colágeno, seda, celulose, gelatina, goma de gelana e alginato. A vantagem destes polímeros é que a maioria são biocompatíveis e biodegradáveis porque são derivados de materiais naturais. No entanto, estes polímeros usualmente têm propriedades mecânicas baixas e podem apresentar variações de lote devido à sua origem natural (Kelly, 2015).
Uma das principais classes dos polímeros naturais são os polissacarídeos. Esses são formados por carboidratos de alta massa molar e complexos coloidais que quando se hidrolisam formam monossacarídeos de 5 ou 6 átomos de carbono. Os polissacarídeos são produzidos com uma combinação única de propriedades funcionais e características favoráveis ambientalmente. Tanto na forma original ou modificados, possuem boas propriedades mecânicas, ainda que menores quando comparados com os polímeros sintéticos e são utilizados em aplicações como fibras, filmes, adesivos, plásticos processáveis fundidos, espessantes, modificadores reológicos, hidrogéis, carreadores de drogas, emulsificantes, entre outras aplicações. Grande parte dos polissacarídeos é biodegradável e não tóxicos, justificando a grande aplicabilidade na área biomédica (Kelly, 2015). A Tabela 2.1 apresenta uma lista de alguns polissacarídeos utilizados em diferentes aplicações.
Tabela 2.1: Polissacarídeos importantes, fontes e principais aplicações (Brant, 2008).
Polissacarídeo Fonte Principal Principais Aplicações Referência
Ágar Algas-marinhas Biotecnologia (suporte
para cultura de bactérias) (De Ruiter & Rudolph, 1997)
Goma xantana Soro de leite microrganismos
Indústria de alimentos (Nitschke et al., 2001)
Celulose de derivados Plantas
Indústria de papel, têxtil, fármacos, aditivos de plantas, medicina regenerativa, biomateriais (D’almeida, 1998) (Paavola et al., 1998) (Mahli et al., 2005) Amido e derivados Milho, fécula de
mandioca
Indústria de alimentos, fármacos, aprestos têxteis
(Queji et al., 2006) (Liporacci et al., 2005) Alginato de sódio Algas (Gelidium
cartilagineum, Gracilaria confervoides
Cosméticos, fármacos,
biomateriais (De Ruiter & Rudolph, 1997)
Dextrana Processo fermentativo (Leuconostoc mesenteroídes)
Indústria do açúcar (Honorato et al., 2005)
Carragena Algas-marinhas (Kappaphycus cutonni
Indústria de aditivos para alimentos, fármacos,
cosméticos
(Gomez et al., 2007)
Hialurona (n-ácido hialurônico)
Cartilagens Fármacos, cosméticos, biomateriais (Li et al., 2007) (Yun et al., 2004) Quitina e quitina modificada Exoesqueleto dos crustáceos Tratamento de efluentes, Biomateriais (Kumar, 2000) (Khor, 2002) Quitosana Destilação da quitina,
paredes celulares de fungos
Liberação controlada de
fármacos, biomateriais (Kumar, 2000)
2.2 Hidrogéis
Hidrogéis são constituídos de redes de polímeros reticulados com propriedades hidrofílicas. São constituídos por materiais com capacidade de armazenamento de água de
mais de 90%, devido em parte aos grupos funcionais hidrofílicos presentes na cadeia polimérica. Esses grupos atraem o dipolo negativo nas moléculas de água, que são então confinadas pela reticulação das redes poliméricas (Peppas e Khare, 1993). As redes de polímeros que atuam nesses sistemas podem ser cadeias naturais ou sintéticas, e podem ser reticuladas por ligações covalentes ou iônicas. As propriedades dos hidrogéis podem variar dependendo da seleção do monômero, das condições de síntese, do grau de intumescimento, da densidade de reticulação ou das mudanças nos estímulos, incluindo temperatura, pH e concentração de sal (Horkay et al., 2001; Kamata et al., 2014; Eliyahu-Gross e Bitton, 2013 e Anseth et al., 1996).
Os hidrogéis podem ser diferenciados de acordo com o método de formação e manutenção de sua estrutura polimérica. Deste modo, temos os géis formados por estruturas que se mantêm como resultado de interações a nível intermolecular como ligações iônicas secundárias, ligações de hidrogênio entre outras, esses são chamados de géis reversíveis ou físicos. Por outro lado, temos os géis formados por estruturas químicas resultantes de ligações covalentes, que são chamados de géis permanentes ou químicos (Ratner et al., 2004). O esquema de preparação dos géis físicos e químicos é mostrado na Figura 2.1. Uma descrição mais extensa dos tipos de reticulação está apresentada na seção 2.2.2.
2.2.1 Classificação dos Hidrogéis
Hidrogéis são classificados com base em diferentes pontos de vista. De um ponto de vista morfológico eles são classificados em partículas, pó, esféricos, fibras, membranas e emulsões. Do ponto de vista dos recursos materiais, os hidrogéis também podem ser divididos em macromoléculas naturais, polímeros semissintéticos e polímeros sintéticos. Do ponto de vista do método de preparação, eles são classificados como polimerização por enxerto, polimerização de reticulação, formação de redes de polímero solúvel em água e reticulação por radiação. Além disso, os hidrogéis podem ser classificados de acordo com a constituição da origem, o tipo de interligação e a resposta ambiental (Singh et al., 2008). Os hidrogéis que possuem resposta ambiental são chamados de "hidrogéis inteligentes" e são classificados de acordo com sua sensibilidade à temperatura, eletricidade, luz, campo sonoro, campos magnéticos e pH. A classificação dos hidrogéis é ilustrada na Figura 2.2.
2.2.2 Tipos de Reticulação
Uma das formas de classificação dos hidrogéis é em relação ao seu tipo de reticulação. A reticulação é o processo pelo qual as cadeias de polímero são fisicamente ou quimicamente ligadas sem polimerização. Esta ligação restringe qualquer movimento das cadeias e cria uma estrutura de rede polimérica com propriedades viscoelásticas (Kelly, 2015). O tipo e o grau de reticulação influenciam muitas das propriedades da rede, como propriedades de intumescimento, módulo de elasticidade e transporte de moléculas (Kuo e Ma, 2001).
A Figura 2.3 apresenta os métodos de reticulação química e física (Hamidi et al., 2008).
Figura 2.3: Esquema de classificação dos hidrogéis quanto ao tipo de reticulação. Adaptado de (Hamidi et al., 2008).
A reticulação física é um processo reversível que ocorre por emaranhamento da cadeia polimérica, cristalização, ligação iônica ou de hidrogênio dentro da estrutura do polímero. É afetada pela temperatura do ambiente em que se encontram os hidrogéis e é geralmente formada pelo resfriamento do gel (Kelly, 2015). Os hidrogéis fisicamente reticulados são a classe de hidrogel mais proeminente usada nos processos de impressão 3D devido a boa capacidade de impressão (Malda et al., 2013).
A reticulação química ocorre devido à ligação covalente entre as cadeias poliméricas. A reticulação covalente ocorre por meio de uma ligação direta ou pelo uso de um agente de reticulação. Esse processo é irreversível e cria hidrogéis que não podem ser reformulados depois de ligados. Os agentes de reticulação utilizados no processo de reticulação química são moléculas bifuncionais, isto é, possuem dois grupos reativos dentro da sua estrutura. Isto permite a ligação covalente com dois polímeros diferentes ou com um polímero e um agente de reticulação. Os agentes podem ser homobifuncionais, onde os grupos reativos são os mesmos, ou heterobifuncionais, onde os grupos reativos são diferentes, permitindo a reticulação com dois grupos funcionais diferentes (Kelly, 2015).
Uma desvantagem significativa dos hidrogéis reticulados fisicamente são suas baixas propriedades mecânicas; por exemplo, na impressão 3D, podem aumentar os problemas de estabilidade de uma construção impressa e estar associados a dificuldades no manuseio e seu desempenho geral. Portanto, tem-se dado cada vez mais atenção aos hidrogéis que são unidos por interações físicas fracas (reversíveis) que permitem uma boa capacidade de impressão, mas que podem ainda ser estabilizadas por reticulação química após o processamento (Malda
2.2.3 Nanocelulose
A celulose é o material orgânico renovável mais abundante produzido na biosfera, com uma produção anual estimada em mais de 7,5x1010 toneladas (Hess et al., 1995). É um policarboidrato composto de uma série de unidades de celobiose, cada uma das quais é formada por duas subunidades anidroglucose com rotação de 180◦ uma da outra (Figura 2.4). A celulose é amplamente distribuída em plantas altas, em vários animais marinhos (por exemplo, tunicados) e, em menor grau, em algas, fungos, bactérias, invertebrados e até em amebas (protozoários), por exemplo, Dictyostelium discoideum. Em geral, a celulose é uma substância fibrosa, resistente, insolúvel em água, que desempenha um papel essencial na manutenção da estrutura das paredes celulares das plantas. Foi descoberta e isolada pela primeira vez por Anselme Payen em 1838 (Payen, 1838) e desde então, vários aspectos físicos e químicos da celulose foram extensivamente estudados. De fato, descobertas estão sendo feitas constantemente com relação à sua biossíntese, montagem e características estruturais que inspiraram uma série de esforços de pesquisa entre um grande número de disciplinas. Várias revisões já foram publicadas relatando o estado do conhecimento deste fascinante polímero (Kim et al., 2006; Charreau et al., 2013; Dufresne, 2013).
Figura 2.4: Estrutura química da celulose (Habibi et al., 2010).
Os nanocristais de celulose (CNCs) são nanopartículas cristalinas obtidas de celulose, que são altamente relevantes para o desenvolvimento de novos materiais de base biológica com propriedades aprimoradas. Na década de 1950, Ranby relatou, pela primeira vez, imagens de microscopia eletrônica de cristais isolados de madeira através de hidrólise por ácido sulfúrico (Ranby, 1949 e Ranby, 1951). Os CNCs possuem potencial em aplicações
como reforço em nanocompósitos, dada sua densidade relativamente baixa (1,6 g/ml), alta resistência mecânica (10 GPa) (Azizi Samir et al., 2005) e alto módulo de elasticidade (143
GPa) (Šturcová et al., 2005). Eles são relevantes para a preparação de dispositivos
biomédicos, implantes e têxteis, uma vez que são biocompatíveis e com baixa toxicidade. Além disso, os CNCs estão amplamente disponíveis em todo o mundo e um potencial subproduto da futura indústria de biocombustíveis celulósicos (Azizi e Samir et al., 2005; de Souza Lima e Borsali, 2004).
Com fórmula química (C6H10O5)x(C6H9O4SO4Na)y os CNCs são isolados usando ácidos
inorgânicos, principalmente os ácidos clorídrico e sulfúrico. Quando o HCl é usado, os CNCs suspensos facilmente se aglomeram devido à ligação de hidrogênio entre os cristalitos que formam aglomerados da ordem de micrometros. Quando a hidrólise é realizada com H2SO4 os
grupos sulfato carregados negativamente são introduzidos na superfície dos cristalitos, o que impede a aglomeração, produzindo uma suspensão estável de partículas cristalinas nanométricas (Figura 2.5).
Figura 2.5: Representação esquemática do isolamento do CNC. Adaptado de (Benavides, 2011).
As nanopartículas de celulose provenientes de madeira têm 3-20 nm de largura e 100-200 nm de comprimento, enquanto os de Valonia, uma planta marinha, são relatados como sendo 20 nm de largura e 1000-2000 nm de comprimento. Da mesma forma, do algodão se extrai CNCs de 5-10 nm de largura e 100-300 nm de comprimento, e tunicado, um animal do mar, se obtem medidas de 10-20 nm de largura e 500-2000 nm de comprimento (Angles e Dufresne, 2001). A razão de aspecto, que é definida como a razão entre o comprimento e a largura (C/L), abrange um amplo intervalo e pode variar entre 10 e 30 para algodão e 70 para o tunicado.
A morfologia da seção transversal dos CNCs também depende da origem das fibras de celulose. A morfologia na seção transversal e também ao longo do eixo do cristal pode ser atribuída à ação dos complexos terminais durante a biossíntese da celulose, que depende da fonte do nanocristal. CNCs de origem bacteriana (Hanley et al., 1997) e tunicado (Elazzouzi-Hafraoui et al., 2007) foram relatados como tendo formatos semelhantes a fitas com torções com passos de meio helicoidal de 600-800 nm (Micrasterias denticulata) e 1,2-1,6 µm, respectivamente, (Figura 2.6).
Figura 2.6: Forma morfológica dos CNCs de origem bacteriana e de tunicados (Moon et
al., 2016).
Uma importante aplicação do CNC é como modificador reológico. A reologia dos CNCs em vários meios de suspensão e misturas de polímeros tem sido amplamente estudada (Ching et al., 2016; de Souza Lima e Borsali, 2004). A diminuição na viscosidade com taxa de cisalhamento crescente, causada pela adição do CNC, é semelhante a outras nanopartículas inorgânicas com altas razões de aspecto (Chen et al., 2009) A redução da viscosidade a
maiores taxas de cisalhamento para as suspensões de CNC é o resultado do alinhamento das fibras de CNC na direção do cisalhamento, reduzindo assim grandemente os seus volumes de interação. Diversas variáveis têm mostrado influenciar no comportamento pseudoplástico: interação do solvente e CNC, sistema polimérico, temperatura e morfologia do CNC, distribuição de tamanho, carga superficial, química e concentração.
2.2.4 Alginato
O alginato é um polissacarídeo natural derivado de algas marrons (Augst et al., 2006). A cadeia do copolímero linear é composta por blocos consecutivos de (1–4) α-guluronato ligado (blocos G) e β-D-manuronato (blocos M) seguidos por segmentos de blocos MG alternados (Coma, 2013). A Figura 2.7 mostra a composição dos blocos G e M.
Figura 2.7: Estrutura polimérica do alginato (Coma, 2013).
Os hidrogéis de alginato possuem propriedades de materiais específicos de acordo com a fonte ou tipo de alga de que é derivado. Isso pode ser atribuído à razão entre os blocos G e M presentes na cadeia principal molécula polimérica, que varia de fonte para fonte. Por exemplo, fontes com alto índice ou alto conteúdo de bloco G, como Laminaria hyperborea, são conhecidas como fontes de alta viscosidade e formam hidrogéis fortes. Fontes de média viscosidade, como Macrocystis pyrifera, formam hidrogéis de média resistência devido à
proporção média de blocos G:M, enquanto fontes de baixa viscosidade como Ascophyllum
rodosum formam os hidrogéis mais fracos devido ao alto conteúdo de blocos M dentro da
estrutura do polímero (Mchugh, 1987).
Quanto ao mecanismo de reticulação do alginato, onde o alginato passa por uma transição sol-gel, é de natureza iônica. Os blocos G da cadeia polimérica de alginato sofrem uma formação do que é descrita como uma estrutura de “caixa de ovos” na presença de cátions divalentes (Ca2+, Ba2+ e Sr2+) (Grant et al., 1973). Os cátions divalentes formam ligações intermoleculares com dois grupos carboxilato desprotonados e dois grupos hidroxila dos blocos G de alginato, mostrados na Figura 2.8. A reticulação lateral dessas caixas de ovos resulta na formação de hidrogel.
Figura 2.8: Estrutura de reticulação iônica dos blocos G de alginato com íons de cálcio (Marriott et al., 2014).
Como mencionado anteriormente, a proporção de blocos G para M na estrutura de alginato desempenha um papel crucial nas propriedades dos materiais do hidrogel resultante, uma vez que os blocos G têm uma grande afinidade por cátions divalentes enquanto os blocos M formam interações fracas com cátions divalentes e não participam de reticulação (Lee e Mooney, 2012). Assim, quanto maior a quantidade de blocos G presentes na estrutura, maior o número de ligações cruzadas é formada, e mais resistente será o hidrogel resultante. O
cálcio é o cátion bivalente mais comumente usado para induzir a reticulação de alginato, já que os blocos G têm uma alta afinidade para formar fortes ligações com esse íon e é o mais biocompatível (Fang et al., 2007). Os cátions divalentes adicionais usados incluem magnésio, bário e estrôncio, formando as ligações mais fracas as mais fortes, respectivamente (Sun e Tan, 2013).
A taxa na qual esta reticulação ocorre pode ser adaptada através da variação das concentrações dos constituintes e/ou da adição de agentes de retardamento (Lee e Mooney, 2012). Foi demonstrado que um aumento na concentração de cálcio resulta em um aumento na taxa de reticulação, com o aumento dos íons de cálcio disponíveis, as ligações cruzadas com blocos G do alginato se formam rapidamente. A adição de um retardamento, como Na2HPO4, pode interromper o processo de reticulação, diminuindo assim a taxa em que
ocorre. A fonte de cálcio também desempenha um papel na taxa de reticulação, com fontes altamente solúveis, como CaCl2 liberando íons rapidamente para o meio, favorecem a
reticulação imediata. Fontes intermediárias, como o CaSO4, fornecem íons ao longo do tempo
para reticulação gradual e fontes com baixa solubilidade, como CaCO3, fornecem íons durante
um longo período de tempo, resultando em uma reticulação lenta, também chamada de reticulação interna (Cho et al., 2009). A Tabela 2.2 mostra as diferentes fontes dos íons cálcio, sua solubilidade e velocidade de reticulação.
Tabela 2.2: Fontes dos íons cálcio, solubilidade e velocidade de reticulação.
Fonte de Cálcio Solubilidade Reticulação
CaCl2 Alta Imediata
CaSO4 Média Lenta
CaCO3 Baixa Muito lenta
Quando se trata da impressão baseada em extrusão o alginato é um forte candidato para impressão devido às suas propriedades inatas do material. Um exemplo é um scaffold de alginato impresso para encapsular as células endoteliais é descrito por (Khalil e Sun, 2009). As propriedades reológicas do alginato permitem um comportamento pseudoplástico, ou seja, uma redução na viscosidade sob maior cisalhamento (Wang et al., 1994). Esta caraterística é
favorável para impressão por extrusão, pois um material menos viscoso requer menos tensão e pressão para ser extrudado através de um bocal. Assim, as células encapsuladas dentro do alginato são submetidas a menores tensões.
2.3 Aplicações na Engenharia Tecidual
A substituição de partes do corpo vem sendo estudada por muitos anos, tendo início quando dentes perdidos foram substituídos por dentes artificiais gravados dos ossos de bois (Ring, 1995). Os substitutos artificiais, na maioria das vezes, não são tão úteis e duradouros quanto os tecidos originais, e o transplante de órgãos reais é severamente limitado pela escassez de doadores e por ser um procedimento muito invasivo (Thorne, 1998). Mesmo quando tais órgãos estão disponíveis, a transmissão de doenças e a rejeição do receptor são os fatores limitantes (Mcdevitt, 2006). A engenharia tecidual emergiu do uso de biomateriais que substituem pequenas áreas de tecidos danificados por matrizes tridimensionais que podem atuar como transportadores de células, bem como provedores de sinais para regeneração.
A engenharia tecidual é um importante tópico emergente na engenharia biomédica, e mostra-se como uma promessa para o desenvolvimento de novas alternativas para a regeneração de tecidos, novos implantes e próteses (Vacanti e Langer, 1999). Um dos principais métodos por trás da engenharia tecidual envolve o crescimento in vitro de células. Mas as células não têm a capacidade de crescer em orientações 3D favorecidas e, assim, definir a forma anatômica do tecido. Em vez disso, eles migram aleatoriamente para formar uma camada bidimensional (2D) de células. No entanto, os tecidos 3D são necessários e isto é conseguido semeando as células em matrizes porosas, conhecidas como scaffolds, às quais as células se ligam e colonizam (Langer e Vacanti, 1993). O scaffold, portanto, é um componente muito importante para a engenharia tecidual. Na Figura 2.9 é apresentada a abordagem da engenharia tecidual mediante o cultivo de células em scaffolds tridimensionais.
Figura 2.9: Abordagem da engenharia tecidual mediante a utilização de scaffolds. (Dávila Sánchez, 2014).
A construção de tecidos para uso médico já é usada de forma significativa nos hospitais. Estas aplicações inovadoras envolvem pele artificial (Cooper et al., 1991), fígado (Cima et
al., 1991a,b), pâncreas, intestinos, nervos (Evans et al., 1999), cartilagem (Ashiku et al.,
1997), ligamento ósseo (Kim et al., 1995) e tendão (Caoa et al., 1995). A primeira aplicação comercial é um produto de pele bioartificial para tratamento de queimados que foi introduzido em 1990 (Miller e Peshwa, 1996). Outras aplicações que chegaram ao mercado incluem reparo de cartilagem, isolamento de células progenitoras hematopoiéticas e terapia imunomoduladora para câncer (Miller e Peshwa, 1996).
Vários requisitos foram identificados como cruciais para a produção de scaffolds para engenharia tecidual (Hutmacher, 2001): (1) o scaffold deve possuir poros interconectados de escala apropriada para favorecer a integração e vascularização do tecido, (2) ser feito de material com biodegradabilidade controlada ou bioreabsorvilidade de modo que o tecido eventualmente substitua o scaffold, (3) tenha propriedades químicas superficiais apropriadas para favorecer a fixação, diferenciação e proliferação celular, (4) possuir propriedades mecânicas adequadas para combinar com o local de implantação e manuseio pretendido, (5) não induzir nenhuma resposta adversa e, (6) ser facilmente fabricado em uma variedade de formas e tamanhos. Tendo em mente estes requisitos, a regeneração tecidual se resume em:
células, biomateriais (scaffolds) e mecanismos de sinalização. Na Figura 2.10 são mostrados os elementos chave da engenharia tecidual.
Figura 2.10: Elementos chave da engenharia tecidual (Khang et al., 2007).
2.3.1 Scaffolds para Engenhara Tecidual
Para obter um bom desempenho na regeneração tecidual, os scaffolds necessitam de algumas características básicas como biocompatibilidade, biodegradabilidade, bioatividade, bioreabsorção, compatibilidade mecânica, poros interconectados e natureza não tóxica dos produtos de degradação efetuada pelo organismo. Na Figura 2.11 são mostrados os requisitos dos scaffolds para engenharia tecidual.
Figura 2.11: Principais requisitos dos scaffolds (Dávila Sánchez, 2014).
O primeiro critério de qualquer scaffold para engenharia tecidual é que ele deve ser biocompatível; as células devem aderir, funcionar normalmente e migrar para a superfície e, eventualmente, através do scaffold e começar a proliferar antes de depositar nova matriz. Após a implantação, o scaffold ou construção de engenharia tecidual deve desencadear uma reação imune desprezível, a fim de evitar que ele cause uma resposta inflamatória tão grave que pode reduzir a cicatrização ou causar a rejeição pelo organismo.
O objetivo da engenharia tecidual é permitir que as próprias células do corpo, com o tempo, acabem substituindo o scaffold implantado. Scaffolds e construções, não se destinam como implantes permanentes. O scaffold deve, portanto, ser biodegradável, de modo a permitir que as células produzam sua própria matriz extracelular (Babensee et al., 1998). Os subprodutos dessa degradação também devem ser não tóxicos e capazes de sair do corpo sem interferência com outros órgãos. De modo a permitir que a degradação ocorra em conjunto com a formação de tecido, é necessária uma resposta inflamatória combinada com infusão controlada de células, tais como macrófagos. Agora que as estratégias da engenharia tecidual estão entrando na prática clínica mais rotineiramente, o campo da imunologia desempenha um papel de crescente destaque na área de pesquisa (Brown et al., 2009 e Lyons et al., 2010).
A arquitetura dos scaffolds usados para engenharia tecidual é de importância crítica. Os
scaffolds devem ter uma estrutura de poros interconectados e alta porosidade para garantir a
penetração celular e a difusão adequada de nutrientes para as células dentro da construção e para a matriz extracelular formada por essas células e também a difusão de produtos residuais para fora do scaffold. A questão da degradação do núcleo, decorrente da falta de vascularização e remoção de resíduos do centro de construções de engenharia tecidual, é uma grande preocupação (Phelps e Garcia, 2009; Ko et al., 2007).
Quanto às propriedades mecânicas, idealmente, o scaffold deve ser consistentes com o local anatômico no qual ele deve ser implantado e, de uma perspectiva prática, deve ser resistente o suficiente para permitir o manuseio cirúrgico durante a implantação. Embora isso seja importante em todos os tecidos, ele oferece alguns desafios para aplicações cardiovasculares e ortopédicas, especificamente. Produzir scaffold com propriedades mecânicas adequadas é um dos grandes desafios na tentativa de projetar osso ou cartilagem. Para esses tecidos, o scaffold implantado deve ter integridade mecânica suficiente para atuar desde o momento da implantação até a conclusão do processo de remodelação (Hutmacher, 2006). Outro desafio é que as taxas de cura variam com a idade; por exemplo, em indivíduos jovens, as fraturas normalmente curam até o ponto de suportar em cerca de seis semanas, com integridade mecânica completa não retornando até aproximadamente um ano após a fratura, mas nos idosos a taxa de reparo diminui. Isso também deve ser levado em conta ao projetar
scaffold para aplicações ortopédicas.
Para que um determinado scaffold ou construção de engenharia de tecidos se torne clinicamente e comercialmente viável, deve ser rentável e deve ser possível aumentar a escala de fabricar um de cada vez em um laboratório de pesquisa para produção de pequenos lotes (Lee e Niederer, 2010). Além disso, é necessário levar em consideração todos os requisitos citados anteriormente. Requisitos biológicos e de engenharia devem estar equilibrados para que a atividade celular seja promovida e assim ocorra a regeneração tecidual. O critério final para os scaffolds na engenharia tecidual é aquele em que todos os critérios listados acima são dependentes: a escolha do biomaterial a partir do qual o scaffold deve ser fabricado.
2.3.2 Biomateriais para fabricação de scaffolds
Tipicamente, três grupos individuais de biomateriais, cerâmicas, polímeros sintéticos e polímeros naturais, são usados na fabricação de scaffolds para engenharia tecidual. Cada um desses grupos de biomateriais individuais tem vantagens específicas e, desnecessário dizer, desvantagens, de modo que o uso de scaffolds compósitos compostos por diferentes fases está se tornando cada vez mais comum. Embora não seja geralmente usado para a regeneração de tecidos moles, tem havido um uso generalizado de estruturas cerâmicas, tais como hidroxiapatita (HA) e fosfato tricálcio (TCP), para aplicações de regeneração óssea. Os
scaffolds cerâmicos são tipicamente caracterizados por alta rigidez mecânica (módulo de
Young), elasticidade muito baixa e uma superfície dura e quebradiça.
A terceira abordagem comumente usada é o uso de materiais biológicos como biomateriais de scaffolds. Materiais biológicos como colágeno, vários proteoglicanos, substratos à base de alginato e quitosana têm sido usados na produção de suportes para engenharia tecidual. Ao contrário dos scaffolds baseados em polímeros sintéticos, os polímeros naturais são biologicamente ativos e tipicamente promovem excelente adesão e crescimento celular. Além disso, eles também são biodegradáveis e permitem que as células hospedeiras, ao longo do tempo, produzam sua própria matriz extracelular e substituam a estrutura degradada. No entanto, a fabricação de scaffolds a partir de materiais biológicos com estruturas homogêneas e reprodutíveis apresenta um desafio. Além disso, os scaffolds geralmente têm propriedades mecânicas que não atendem certas aplicações, o que limita seu uso em, por exemplo, aplicações ortopédicas de suporte de carga.
2.4 Sistemas de impressão 3D à base de hidrogéis
A impressão tridimensional (3D) é uma técnica de manufatura aditiva que implementa a produção de estruturas camada por camada (Wong e Hernandez, 2012). Primeiro, um modelo
CAD 3D é criado com a estrutura desejada, salvo como um arquivo .stl e dividido em código G, ou na linguagem de computador que o software de impressão 3D lê. O arquivo de código G determina o caminho no qual a extrusora deve seguir para depositar o material de uma maneira que resulte na estrutura desejada (Sears et al., 2016). A vantagem dessa técnica é que ela reduz o tempo de produção e permite a fabricação de projetos complexos ou pequenos lotes de produtos específicos de maneira econômica quando comparada com outras técnicas de produção (Yan e Gu, 1996).
Resumidamente, os sistemas de impressão 3D à base de hidrogéis podem ser divididos em métodos baseados em transferência direta induzida por laser, impressão à jato de tinta (tanto térmica quanto piezoelétrica) e impressão por extrusão (Figura 2.12). Cada técnica exige requisitos muito específicos para as características dos materiais de impressão baseadas em hidrogel, no que diz respeito à sua reologia e taxa de pós-cura, a fim de alcançar a fabricação confiável de construções 3D (Malda et al., 2013).
Figura 2.12: Abordagens de impressão 3D envolvendo o uso de hidrogéis. Traduzido de (Malda et al., 2013).
2.4.1 Transferência direta induzida por lazer
A tecnologia de transferência direta induzida por laser refere-se ao uso de uma lâmina de doador coberta com uma camada de absorção de energia de laser e uma camada de
hidrogel. Os pulsos de laser focalizados causam a evaporação local da camada absorvente que, por sua vez, gera uma alta pressão de gás, impulsionando o composto de hidrogel em direção à lâmina coletora (Figura 2.4). Esta tecnologia permite a deposição precisa de materiais de alta densidade (Hribar et al., 2014). Uma vantagem dessa técnica, é que não necessita o uso de agulha, portanto, não é afetada por problemas de entupimento. Foi usado com sucesso hidrogéis com uma ampla gama de viscosidades (1–300 mPa.s-1). No entanto, a alta resolução desse processo complica a distribuição uniforme das camadas de gotas ejetadas, requerendo assim, uma rápida cinética de reticulação para alcançar alta fidelidade à forma da construção, resultando assim em uma vazão relativamente baixa (Malda et al., 2013).
O hidrogel mais utilizado na técnica de transferência direta induzida por laser é o alginato, a Tabela 2.3 demonstra algumas características desse hidrogel quando utilizada essa técnica.
Tabela 2.3: Características do hidrogel de alginato quando utilizada a técnica de transferência direta induzida por laser. Modificado de (Malda et al., 2013).
Hidrogel Concentração do Polímero Método de Reticulação Qualidade de Impressão Citocompatibilidade Referência Alginato 2% Iônica
Intermediária Intermediária, dia 10 (Koch, et al., 2012)
2%
Reforçada com solução
de fibras eletrofiadas Alta, dia 7 (Catros et al., 2011)
1% Alta Alta, dia 1 (Guillotin et al., 2010)
2% / 8% Baixa / Intermediária Não estudada (Yan et al., 2012)
2.4.2 Impressão de jato de tinta
Normalmente, a impressão a jato de tinta no campo da impressão 3D é definida como a distribuição por um pequeno orifício e o posicionamento preciso de volumes muito pequenos (1-100 picolitros) de hidrogel em um substrato (Calvert, 2007). Para a impressão a jato de
tinta à base de hidrogéis, térmica e piezoelétrica são as duas abordagens mais adotadas. Para impressão térmica a jato de tinta, pequenos volumes do fluido de impressão são vaporizados por um microaquecedor para gerar o pulso que expele as gotas do cabeçote de impressão (Derby, 2008). Já na impressão a jato de tinta piezoelétrico, não é usado aquecimento, mas um pulso mecânico direto é aplicado ao fluido na agulha por um atuador piezelétrico, que causa uma onda de choque que força o escoamento do hidrogel através da agulha (Malda et al., 2013).
A impressão a jato de tinta foi aplicada com sucesso na impressão de hidrogéis permitindo a geração de estruturas tridimensionais bem definidas, embora pequenas (Arai et
al., 2011). Uma das principais restrições da tecnologia de jato de tinta é talvez o baixo limite
superior da viscosidade do hidrogel (Tabela 2.4), que é da ordem de 0,1 Pa.s (Calvert, 2001), complicando a deposição demateriais com viscosidades mais altas. Como pequenas gotículas desse hidrogel são depositadas em um substrato com alta velocidade, a baixa viscosidade facilitará o espalhamento da gotícula na superfície após a impressão. Além disso, a maioria dos pesquisadores nesta área tem usado impressoras a jato de tintas comercialmente disponíveis, que são projetadas para dispensar hidrogéis de baixa viscosidade, não contendo partículas medindo mais de 1 µm, com uma alta resolução. Em resumo, como consequência do pequeno tamanho das gotículas e da reticulação dependente da difusão das impressoras a jato de tinta, resulta num desafio traduzir esta tecnologia para tamanhos maiores (Malda et al., 2013).
Alguns hidrogéis e suas características são mostradas na Tabela 2.4, quando utilizada a técnica de impressão pro jato de tinta.
Tabela 2.4: Características de diferentes hidrogéis quando utilizada a técnica de impressão por jato de tinta. Modificado de (Malda et al., 2013).
Hidrogel Concentração do Polímero Método de Reticulação Qualidade de Impressão Citocompatibilidade Referência Alginato 2% 0,8% Iônica Intermediária Não reportada Alta, dia 0 (Boland et al., 2006) (Arai et al., 2011)
Colágeno I
Colágeno I 0,1% Térmica Baixa Células migratórias (Jakab et al., 2008) Fibrogênio/
Colágeno I 0,15%/1% Enzimática
Reforçada com solução
de fibras eletrofiadas 82%, dia 7 (Xu et al., 2012) Poli
(etilenoglicol) Dimetacrilado
10%/20% Radiação UV Intermediária 89%, dia 1 (Cui et al., 2012)
2.4.3 Impressão por extrusão
Uma abordagem alternativa para o projeto e fabricação de construções de hidrogel por impressão 3D é baseada em sistemas extrusão. Para este método, os hidrogéis são geralmente inseridos em seringas plásticas descartáveis e dispensados, pneumaticamente, com pistão ou parafusos, em uma plataforma de construção. Em vez de gotículas individuais, a impressão por extrusão produz um filamento de hidrogel. Para manter a forma das construções após a impressão, hidrogéis com viscosidades mais altas são frequentemente usados. A resolução que pode ser obtida com a extrusão é da ordem de 200 µm, o que é consideravelmente maior em comparação com os sistemas baseados em jato de tinta ou laser. No entanto, a velocidade de fabricação usando a impressão por extrusão é significativamente maior (Tabela 2.5).
A Tabela 2.5 demonstra a comparação das principais características das três abordagens de impressão 3D à base de hidrogéis.
Tabela 2.5: Principais características das três abordagens de impressão 3D à base de hidrogéis. Traduzido de (Malda et al., 2013).
Transferência direta por indução a laser
Impressão de jato de tinta
Impressão por extrusão
Resolução ++ + +/-
Velocidade de fabricação
- +/- ++
Velocidade de reticulação ++ ++ +/- ++: Muito boa +: Boa +/-: Intermediária -: Baixa
A deposição controlada por pistões geralmente fornece um controle mais direto sobre o escoamento do hidrogel a partir da agulha, devido ao atraso do volume de gás comprimido nos sistemas pneumáticos. Sistemas à base de parafusos podem conferir maior controle espacial e são benéficos para a dispensação de hidrogéis com maiores viscosidades. (Campos
et al., 2012 e Maher et al., 2009).
Alguns hidrogéis e suas características são mostrados na Tabela 2.6, quando utilizada a técnica de impressão por extrusão.
Tabela 2.6: Características de diferentes hidrogéis quando utilizada a técnica de impressão por extrusão. Modificado de (Malda et al., 2013).
Hidrogel Concentração do Polímero Método de Reticulação Qualidade de Impressão Citocompatibilidade Referência Agarose 1,5% 5% Térmica Alta Baixa 95%, dia 21 95%, dia 7 (Campos et al., 2012) (Fedorovich, et al., 2008) Alginato 2%/10% Iônica Intermediária 89%, dia 2 (Fedorovich, et al., 2011) (Fedorovich, et al., 2008) Alginato/ Fibrina 6,3% Iônica Enzimática Térmica
Baixa Não estudada (Landers et al., 2002)
Alginato/ Gelatina
5%/7,5% Iônica Química
Intermediária 95%, dia 0 (Yan et al., 2005)
Colágeno I 0,3% Térmica Intermediária 86%, dia 1
(Smith et al., 2004) (Smith et al., 2007) (Jakab et al., 2008) Gelatina 0,1%/7%/20% Térmica Química Intermediária Alta 95%, mês 1 (Lee et al., 2010) (Wang et al., 2006)
Gelatina Metacrilada
20% Térmica
Foto
Baixa 73% (Schuurman et al., 2013)
Ácido hialurônico
0,3%/1,2% Foto Baixa Proliferação, dia 7 (Skardal et al., 2010)
Metilcelulose 4% Térmica Baixa Não reportadada (Fedorovich, et al., 2008)
2.5 Propriedades dos hidrogéis para impressão 3D
A adequação de um hidrogel para um processo específico de impressão 3D depende principalmente de suas propriedades físico-químicas sob as condições dadas pelo instrumento de impressão específico. O desenvolvimento de sistemas de hidrogéis que atendem todos os requisitos para a impressão 3D, isto é, hidrogéis que são adequados para fabricar estruturas tridimensionais, da mais simples até as mais complexas, continua a ser um desafio. Os principais parâmetros físico-químicos que determinam a capacidade de impressão de um hidrogel são as suas propriedades reológicas como, viscosidade, pseudoplasticidade, os módulos de armazenamento (G') e de perda (G") e mecanismos de reticulação. No entanto, os parâmetros de processamento específicos, tais como as dimensões da agulha (tamanho, diâmetro), irão consequentemente determinar a tensão de cisalhamento a que os hidrogéis são expostos, assim como o tempo máximo necessário para a fabricação de uma construção de dimensão relevante. Finalmente, uma vez que os hidrogéis tenham sido impressos, a construção impressa tem de possuir, desenvolver ou ser dotada de fidelidade à forma e estabilidade mecânica suficiente, por exemplo por reticulação (pós-processamento) como resultado da reticulação.
Estes parâmetros estão interligados e são importantes para as diferentes tecnologias de impressão 3D, no entanto, os números absolutos podem ser consideravelmente diferentes dadas à natureza do processo de deposição. Por exemplo, a impressão a jato de tinta é geralmente limitada a viscosidades máximas baixas, enquanto que com a impressão por extrusão maiores viscosidades podem ser processadas. Por conseguinte, a impressão a jato de tinta requer reticulação rápida para permitir a fabricação de uma estrutura 3D mecanicamente