UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
PAULO CARVALHO DE PAULA
MORINGA OLEIFERA LAM.: UMA FONTE VEGETAL DE PROTEÍNAS HIPOGLICEMIANTES E HIPOLIPEMIANTES
FORTALEZA 2017
PAULO CARVALHO DE PAULA
MORINGA OLEIFERA LAM.: UMA FONTE VEGETAL DE PROTEÍNAS
HIPOGLICEMIANTES E HIPOLIPEMIANTES
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Orientadora: Profa. Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa
Co-orientadora: Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos
FORTALEZA 2017
PAULO CARVALHO DE PAULA
MORINGA OLEIFERA LAM.: UMA FONTE VEGETAL DE PROTEÍNAS
HIPOGLICEMIANTES E HIPOLIPEMIANTES
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica da Universidade Federal do Ceará, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Área de concentração: Bioquímica Vegetal.
Aprovada em / / .
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________ Profa. Dra. Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_______________________________________________ Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos (Co-orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
__________________________________________________ Profa. Dra. Norma Maria Barros Benevides
Universidade Federal do Ceará (UFC)
___________________________________________________ Profa. Dra. Adriana Rolim Campos Barros
Universidade de Fortaleza (UNIFOR)
__________________________________________________ Dra. Carla Freire Celedônio Fernandes
Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)
__________________________________________________ Prof. Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por todas as graças a mim concedidas.
À minha mãe, Maria do Socorro, pessoa que mais amo nesse mundo, a quem devo tudo que sou e que tenho.
À professora Ilka Maria Vasconcelos, mulher que tanto admiro por sua competência, profissionalismo, zelo pela ciência, bondade e caráter. Mulher guerreira, pesquisadora exemplar, de admirável inteligência, que eu considero a maior responsável por essa minha conquista. Meu sincero e eterno agradecimento.
À minha tia, Jacinta Carvalho, minha tia-mãe, a quem eu tanto amo, e à sua filha, Jamilly Carvalho, minha prima-irmã, que mora dentro do meu coração.
À minha amada, Rochele Batista, por seu amor, sua torcida, incentivo e permanência ao meu lado nos momentos alegres e também difíceis.
À minha orientadora, professora Daniele de Oliveira Bezerra de Sousa, pelos ensinamentos, correções e auxílio nesse momento tão importante para mim.
Aos membros da banca examinadora, Dra. Norma Maria Barros Benevides, Dra. Adriana Rolim Campos Barros, Dra. Carla Freire Caledônio Fernandes e Dr. Ariclécio Cunha de Oliveira, por terem aceitado participar da avaliação do meu trabalho, em meio a tantos compromissos acadêmicos e particulares.
Ao professor José Tadeu Abreu de Oliveira, pelos valiosos ensinamentos, pelas maravilhosas aulas e por ter permitido acesso ao seu laboratório para realização de experimentos; aos seus estudantes, em especial Thiago Fernandes e Pedro Filho.
À professora Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho, por ter aberto as portas de seu laboratório para execução de procedimentos experimentais.
À aluna Bella Giselly, por suas contribuições experimentais para composição desse trabalho.
Aos meus colegas de trabalho do Laboratório de Proteínas Tóxicas (LabTox): Mariana Reis, Tarcymara Garcia, Nadine Monteiro, Ana Paula, Halisson Araújo, Yara de Castro e Mayara Melo. Um agradecimento especial a Lucas Dias e Helen Costa, pela grande auxílio nos experimentos e aos doutorandos Tiago
Deiveson e João Xavier, dois grandes amigos que encontrei nesse período de
À professora e nutricionista Ana Paula Moreira, por sua compreensão em determinados momentos, por sua torcida , incentivo, compromisso, auxílio e por tudo que fez em meu benefício.
À Clarissa Rocha, pela torcida, dicas e conselhos.
A todos os professores e servidores técnico-administrativos que fazem parte do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da UFC.
AGRADECIMENTOS
Os trabalhos experimentais que compõem esta tese foram realizados com o apoio dos seguintes Programas/Instituições:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ - através das atividades de capacitação no
ensino e pesquisa em Bioquímica realizadas em parceira com o Laboratório de
Toxinas Vegetais-LABTOX, sob a coordenação da Profa. Dra. Ilka Maria Vasconcelos, Laboratório de Bioprospecção de Recursos Regionais -
BIOPROSPEC, sob a coordenação da Profa. Dra. Ana de Fátima Fontenele Urano Carvalho e com o Laboratório de Proteínas Vegetais de Defesa, sob a coordenação do Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira.
UNIVERSIDADE DE FORTALEZA ( UNIFOR) - através de atividades experimentais
executadas no Laboratório de Análise Proteômica do Núcleo de Biologia Experimental (NUBEX), sob coordenação da Profa. Dra. Ana Cristina de Oliveira Monteiro-Moreira.
COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE ENSINO SUPERIOR (CAPES) – Através da concessão de bolsa de pós-graduação ao autor
deste trabalho.
DEMAIS INSTITUIÇÕES DE FOMENTO E APOIO À PESQUISA COMO: CNPq e
FUNCAP, que contribuiram para a melhoria nas condições experimentais e na formação de recursos humanos dentro do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da UFC.
“Dê-me, Senhor, agudeza para entender, capacidade para reter, método e faculdade para aprender, sutileza para interpretar, graça e abundância para falar, acerto ao começar, direção ao progredir e perfeição ao concluir.”
RESUMO
O diabetes mellitus é caracterizado por hiperglicemia e complicações vasculares, responsáveis por elevada morbimortalidade. Projeções mundiais do aumento no número de diabéticos já foram divulgadas. Isso justifica a busca de compostos vegetais hipoglicemiantes, para formulação de fármacos para o tratamento do diabetes. Nesse contexto, proteínas vegetais são incluídas no arsenal de moléculas com potencial hipoglicêmico. O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de proteínas hipoglicemiantes do tegumento de sementes e das folhas de Moringa
oleifera, uma planta nativa da Índia. Dessa espécie, uma fração proteica do
tegumento de sementes (Mo-TEG) e uma proteína das folhas (Mo-S3) foram obtidas, ambas com efeito hipoglicemiante. Mo-TEG apresentou rendimento proteico de 40%, correspondendo a um teor de 0,66 mg de proteína/g de farinha do tegumento. Tal fração mostrou reação cruzada com o anticorpo anti-insulina humana. Em camundongos com diabetes induzido por aloxano, Mo-TEG mostrou efeito hipoglicemiante em curto prazo, após administração intraperitoneal ou oral, com efeito mais pronunciado pela primeira via (72,3% vs 39,6%, após 5 h da administração). Ainda pela via intraperitoneal, Mo-TEG melhorou a tolerância à glucose administrada oralmente, gerando redução glicêmica e melhora do perfil lipídico sérico quando administrada por 10 dias em camundongos diabéticos. Com relação à proteína das folhas de M. oleifera, Mo-S3 foi purificada por cromatografias em DEAE-Celulose e Sephacryl S-200, com índice de purificação de 891,53 vezes e rendimento proteico de 1,04%. Mo-S3 possui massa molecular de 8,6 kDa, revelada por espectrometria de massas sob condições nativas. Além de apresentar epítopos antigênicos do tipo insulina, Mo-S3 exerceu efeito hipoglicemiante após administração intraperitoneal, em dose única ou doses repetidas. Contrariamente a
Mo-TEG, Mo-S3 não mostrou efeito hipoglicemiante por via oral. Mo-TEG e Mo-S3
exerceram efeito hipolipemiante em camundongos diabéticos. Os resultados obtidos demonstram que proteínas estão incluídas no arsenal de moléculas hipoglicemiantes presentes em M.oleifera, o que possibilita sua inserção na pesquisa voltada à produção de drogas para o tratamento do diabetes.
Palavras-chave: Moringa oleifera. Proteínas vegetais hipoglicemiantes. Diabetes
ABSTRACT
Diabetes mellitus is characterized by chronic hyperglycemia associated with vascular complications, which cause high morbidity and mortality rates. World projections of the increase in the diabetic number have already been done. This reinforces the search for hypoglycemic plant compounds in the perspective of their use on drug formulation for diabetes treatment. In this context, plant proteins have been included in the arsenal of molecules with hypoglycemic potential. The aim of the present work was to obtain hypoglycemic proteins from the seed coat and leaves of Moringa oleifera, a plant native to India. From this species, a protein fraction from the seed coat (Mo-TEG) and a protein from the leaves (Mo-S3) were obtained, both with hypoglycemic effect. Mo-TEG showed a protein yield of 40%, corresponding to 0.66 mg protein/g of seed coat flour. Mo-LPI was able to cross-react with human
anti-insulin antibodies. In alloxan-induced diabetic mice, Mo-TEG showed a short-term hypoglycemic effect after intraperitoneal or oral administration, with a higher effect through the first route (72.3% vs 39.6% 5 h after the administration). Also by the intraperitoneal route, Mo-TEG improved the tolerance to orally administered glucose, exhibiting hypoglycemic effect and improvement of the serum lipid profile when administered along 10 days to alloxan-induced diabetic mice. Regarding to protein from M. oleifera leaves, Mo-S3 was purified by DEAE-Cellulose and Sephacryl S-200 chromatography, with a 891.53-fold purification and 1.04% yield. Mo-S3 is a 8.6 kDa protein as revealed by mass spectrometry under native conditions. In addition to the presence of insulin epitopes, Mo-S3 showed hypoglycemic effect after intraperitoneal administration, in a single dose or repeated doses. Conversely, no significant hypoglycemic effect was observed in diabetic mice when Mo-S3 was orally administered. Moreover, Mo-TEG and Mo-S3 showed hypolipidemic effect in diabetic mice. Altogether, these data demonstrate that proteins belong to the set of hypoglycemic molecules of M.oleifera, which allow their insertion in biomedical research in order to produce drugs to treat diabetes.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Pessoas com diabetes ao redor do mundo e por região entre
2015 e 2040 ... 22
Figura 2 - Sintomas clássicos de diabetes ... 26
Figura 3 - Evolução dos eventos fisiopatológicos até o estabelecimento de diabetes tipo 2 ... 29
Figura 4 - Disfunção endotelial como evento promotor da aterosclerose ... 31
Figura 5 - Modificações epigenéticas induzidas pelo diabetes e consequente indução e manutenção de disfunção endotelial e inflamação vascular... 33
Figura 6 - Espécies de plantas que apresentam compostos secundários com atividade hipoglicemiante e potencial antidiabético... 37
Figura 7 - Plantas com proteínas hipoglicemiantes do tipo insulina ... 39
Figura 8 - Moringa oleifera Lam ... 44
Figura 9 - Fluxograma de obtenção de Mo-TEG ... 52
Figura 10 - Sequência de procedimentos executados durante o período de adaptação dos animais... 56
Figura 11 - Perfil eletroforético em PAGE-SDS de Mo-TEG submetida ao tratamento com pepsina ... 62
Figura 12 - Perfil eletroforético em PAGE-SDS de Mo-TEG submetida ao tratamento com tripsin ... 63
Figura 13 - Detecção de proteínas do tipo insulina em Mo-TEG ... 65
Figura 14 - Precipitação de proteínas presentes em Mo-TEG induzida por zinco ... 66
Figura 15 - Efeito da administração intraperitoneal de Mo-TEG, em dose única, na glicemia de animais diabéticos ... 69
Figura 16 - Efeito da administração intraperitoneal de Mo-TEG, em dose única, na glicemia de animais diabético ... 72
Figura 17 - Curva glicêmica referente ao teste oral de tolerância à glucose em animais diabéticos submetidos à administração intraperitoneal de Mo-TEG ... 74
Figura 18 - Área sob a curva (ASC) referente à curva glicêmica do teste oral de tolerância à glucose em animais diabéticos submetidos à administração intraperitoneal de Mo-TEG ... 75 Figura 19 - Efeito da administração intraperitoneal diária, ao longo de 10
dias, de Mo-TEG ... 77 Figura 20 - Efeito da administração intraperitoneal diária de Mo-TEG, por
10 dias, nos níveis séricos de colesterol total ... 79 Figura 21 - Efeito da administração intraperitoneal diária de Mo-TEG, por
10 dias, nos níveis séricos da fração lipoproteica HDL ... 80 Figura 22 - Efeito da administração intraperitoneal diária de Mo-TEG, por
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Critérios para diagnóstico de pré-diabetes e de diabetes, segundo American Diabetes Association (2017) ... 24 Tabela 2 - Teor de proteínas e rendimento proteico ao longo das etapas de
obtenção de Mo-TEG ... 61 Tabela 3 - Ocorrências comportamentais durante o período de adaptação
dos camundongos ... 68 Tabela 4 - Percentual de aumento ou redução glicêmica promovido
pela administração intraperitoneal de Mo-TEG em camundongos diabéticos ... 70 Tabela 5 - Percentual de aumento ou redução glicêmica promovido
pela administração por via intrasgástrica de Mo-TEG ... 73 Tabela 6 - Glicemia dos camundongos submetidos ao teste de doses
repetidas nos dias 6 e 9 do experimento, após administração de insulina ... 78
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AGE Produtos finais de glicosilação avançada
ASC Área sob a curva
BCIP 5- bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato
bFGF Fator de crescimento fibroblástico básico
BSA Albu ina sérica bovina
DM Diabetes mellitus
DM 1 Diabetes mellitus tipo 1 DM 2 Diabetes mellitus tipo 2
EGF Fator de crescimento epidermal
eNOS Óxido nítrico sintase endotelial EROS Espécies reativas de oxigênio
GAD65 Isoforma 65 da descarboxilase do ácido glutâmico HbA1c Hemoglobina glicada do tipo A1c
HDL Lipoproteína de alta densidade
IA-2 Isoforma 2 datirosina fosfatase associada à insulinoma IGF-1 Isoforma 1 do fator de crescimento do tipo insulina
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
LDL Lipoproteína de baixa densidade
MCP-1 Isoforma 1 da proteína quimioatrativa de monócitos NBT Azul de nitro tetrazólio
NF-kB Fator nuclear de transcrição kappa-B
PAI-1 Inibidor do tipo 1 do ativador do plasminogênio PDGF Fator de crescimentoderivado de plaquetas
PVDF Fluoreto de polivinilideno
SDS Dodecil-sulfato de sódio
SIRT-1 Sirtuína 1
TGF Fator de crescimento transformante TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TOTG Teste oral de tolerância à glucose
UH Unidades de hemaglutinação
VCAM-1 Isoforma 1 da molécula de adesão celular vascular ZnT8 Isoforma 8 dotransportador de zinco
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 18
2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 21
2.1 Diabetes mellitus: uma doença epidêmica ... 21
2.2 A busca de fontes naturais para o tratamento do diabetes ... 32
2.2.1 Gallega officinalis ... 34 2.2.2 Abelmoschus moschatus ... 34 2.2.3 Annona squamosa ... 35 2.2.4 Pinus pinaster ... 35 2.2.5 Salacia oblonga ... 35 2.2.6 Croton cajucara ... 35 2.2.7 Achyrocline satureioides ... 36
2.2.8 Outras espécies de plantas com propriedades hipoglicemiantes 36 2.3 Proteínas vegetais hipoglicemiantes: um potencial pouco especulado ... 38 2.3.1 Canavalia ensiformis ... 40 2.3.2 Vigna unguiculata ... 40 2.3.3 Bauhinia variegata ... 40 2.3.4 Momordica charantia ... 41 2.3.5 Momordica cymbalaria ... 41 2.3.6 Costus igneus ... 42 2.3.7 Urtica pilulifera ... 42
2.4 Moringa oleifera: seu potencial antidiabético e sua inserção na pesquisa prospectiva de proteínas hipoglicemiantes ... 43
3 CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 47 4 OBJETIVOS ... 48 4.1 Geral ... 48 4.2 Específicos ... 48 5 MATERIAIS ... 49 5.1 Material vegetal ... 49 5.2 Animais experimentais ... 49 5.3 Reagentes químicos ... 49
6 MÉTODOS ... 51
6.1 Obtenção de proteínas a partir do tegumento de sementes de M. oleifera ... 51
6.2 Quantificação de proteínas ... 51
6.3 Caracterização bioquímica de Mo-TEG ... 53
6.3.1 Avaliação da digestibilidade in vitro ... 53
6.3.2 Avaliação da atividade hemaglutinante ... 53
6.3.3 Ensaio de dot blot ... 54
6.3.4 Avaliação da precipitação por zinco ... 54
6.4 Ensaios in vivo para prospecção do efeito hipoglicemiante de Mo-TEG ... 55
6.4.1 Adaptação dos animais ... 55
6.4.2 Indução de diabetes experimental ... 55
6.4.3 Prospecção de ação hipoglicemiante - teste de dose única ... 57
6.4.4 Teste oral de tolerância à glucose ... 57
6.4.5 Prospecção de ação hipoglicemiante – teste de doses repetidas 58 6.4.6 Prospecção de ação hipolipemiante ... 58
6.5 Toxicidade aguda ... 59
6.6 Análise estatística ... 59
7 RESULTADOS ... 60
7.1 Obtenção de proteínas a partir do tegumento de sementes de M. oleifera ... 60
7.2 Caracterização bioquímica de Mo-TEG ... 60
7.3 Ensaios in vivo para prospecção de efeito hipoglicemiante de Mo-TEG ... 67
7.4 Toxicidade aguda ... 76
8 DISCUSSÃO ... 82
9 ARTICLE ... 89
9.1 Introduction ... 89
9.2 Materials and Methods ... 90
9.2.1 Plant material ... 90
9.2.2 Animals ... 90 9.2.3 Purification of the hypoglycemic protein from M. oleifera leaves 91
.
9.2.4 Protein determination ……… 91
9.2.5 Electrophoretic profile ………... 91
9.2.6 Dot blot assay ………. 92
9.2.7 Mass spectrometry analysis ……… 92
9.2.8 Hemagglutinating activity ……… 92
9.2.9 Hemolytic activity ………... 93
9.2.10 Induction of experimental diabetes ……….. 93
9.2.11 Single dose test in alloxan-induced diabetic mice ……….. 94
9.2.12 Repeated dose test in alloxan-induced diabetic mice ………. 94
9.2.13 Statistical analysis ……… 95
9.3 Results ………. 95
9.3.1 Purification of Mo-S3 ……… 95
9.3.2 Effect of Mo-S3 on fasting blood glucose in alloxan-induced diabetic mice ……….. 102
9.3.3 Effect of Mo-S3 on signs of chronic hyperglycemia ……… 102
9.3.4 Effect of Mo-S3 on serum lipids levels ……… 108
9.4 Discussion ……….. 110
10 CONCLUSÕES ... 114
1 INTRODUÇÃO
O diabetes mellitus (DM) e suas complicações crônicas representam uma causa importante de morbimortalidade no mundo atual. Avançando em proporções epidêmicas, tal enfermidade exigirá do sistema de saúde um rigoroso planejamento no que se refere às políticas públicas de atendimento e de vigilância de novos casos, além de um programa intensivo quanto à disponibilização de verbas financeiras para tal empreendimento (INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION, 2015; AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).
A morbidade ocasionada pelo DM se deve à hiperglicemia crônica, evento que caracteriza essa patologia. O aumento dos níveis glicêmicos é devido à redução total ou parcial da secreção de insulina pelo pâncreas e/ou à diminuição na ação desse hormônio. Cegueira adquirida, doença renal crônica, neuropatia e doença aterosclerótica são algumas das complicações associadas ao estado hiperglicêmico crônico do diabetes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).
Para minimizar ou evitar a ocorrência de complicações crônicas, ou mesmo com o intuito de atrasar o aparecimento de tais condições clínicas, faz-se necessário uma boa adesão do paciente aos tratamentos farmacológico e dietoterápico, além da adoção de um estilo de vida onde o sedentarismo, tabagismo e alcoolismo crônico devem ser excluídos (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2016). Atualmente, diversos análogos de insulina, produzidos por meio da tecnologia do DNA recombinante, são utilizados para o tratamento do diabetes mellitus tipo 1 (DM1). A adesão à administração subcutânea diária desses análogos é imprescindível para a manutenção do controle glicêmico. Existem também diversas classes de hipoglicemiantes orais, disponibilizados para o tratamento do diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).
Nesse contexto de tratamento para a manutenção de um bom controle glicêmico, alternativas complementares têm sido adotadas por diversas culturas, baseando-se, principalmente, na utilização de plantas. Folhas, sementes e raízes são utilizadas para consumo direto ou elaboração de chás e produtos naturais que, quando consumidos, promovem redução gicêmica. Isso tem sido abordado e justificado em estudos etnofarmacológicos, que comprovaram a eficácia de tais produtos como agentes hipoglicemiantes, creditando-se tal efeito especialmente aos metabólitos secundários (COMAN; RUGINA; SOCACIU, 2012).
Apesar dos compostos derivados do metabolismo secundário vegetal terem o maior crédito com relação ao potencial hipoglicemiante, outros metabólitos incluem-se no arsenal de moléculas promotoras de redução glicêmica, presentes em diversas espécies de plantas. Apesar da menor divulgação na literatura científica, em comparação com compostos de outra natureza química, as proteínas hipoglicemiantes têm ganhado destaque na prospecção de compostos vegetais no contexto da biotecnologia médica Algumas proteínas vegetais hipoglicemiantes apresentam, inclusive, características bioquímicas similares às da insulina de mamíferos, levantando a hipótese de que moléculas do tipo insulina tem sido conservadas ao longo da evolução biológica (PAULA et al., 2016).
Uma espécie vegetal que se destaca na prospecção de compostos hipoglicemiantes é a Moringa oleifera Lam. Nativa do nordeste da índia, essa espécie é utilizada como insumo alimentar habitual nessa região e na África, sendo, também, usada como alternativa complementar para o tratamento de diversas doenças, incluindo o DM (GOYAL et al., 2007). Recentemente, nosso grupo de pesquisa relatou a presença de compostos hipoglicemiantes de natureza proteica em folhas e tegumento de sementes M. oleifera, o que insere essa espécie no conjunto de plantas das quais se tem obtido proteínas hipoglicemiantes (PAULA et
al., 2016; PAULA et al., 2017). Nesse sentido, a pesquisa científica a ser relatada na
presente tese é referente a resultados relativos a uma fração proteica obtida do tegumento de sementes e à purificação de uma proteína hipoglicemiante de folhas de M. oleifera. Para isso, o trabalho foi guiado pelas seguintes perguntas de partida:
- Além dos efeitos hipoglicemiantes, proteínas do tegumento de sementes
e de folhas de M. oleifera teriam outras propriedades capazes de contribuir para minimização dos efeitos deletérios associados ao DM? - A proteína hipoglicemiante purificada de folhas teria características
bioquímicas similares às da insulina de mamíferos?
Assim, a proposta deste trabalho é verificar o potencial hipoglicemiante de proteínas obtidas do tegumento de sementes e de folhas de M. oleifera, de forma a contribuir para a elucidação de suas propriedades e possibilidades de aplicação como agentes terapêuticos no tratamento do diabetes. Visando maior clareza na abordagem do estudo realizado, a tese foi estruturada da seguinte forma:
- Capítulo 1 – Referencial Teórico – Diabetes mellitus e compostos hipoglicemiantes de plantas;
- Capítulo 2 – Proteínas do tegumento de sementes de M. oleifera como potenciais agentes hipoglicemiantes e hipolipemiantes;
- Capítulo 3 – Purificação e caracterização uma proteína hipoglicemiante de folhas de M. oleifera.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Diabetes mellitus: uma doença epidêmica
Um fator de risco cardiovascular bem descrito na literatura; uma importante causa de cegueira adquirida, de amputações de membros inferiores e de considerável morbidade; traços epidêmicos na contabilização e nas projeções de novos casos. Essas são algumas das características de uma patologia que impulsiona a pesquisa científica à busca de maior entendimento fisiopatológico: o diabetes mellitus (DM) (INTERNATIONAL DIABETES FEDERATION, 2015)
Por definição, o DM consiste em um grupo de condições clínicas que possuem, em comum, a presença de hiperglicemia, resultante de defeitos na secreção e/ou ação da insulina. Autoimunidade deflagrada contra as células β pancreáticas secretoras de insulina é o evento promovedor do diabetes mellitus tipo 1 (DM1), que se caracteriza por deficiência absoluta de insulina e, portanto, requerendo tratamento com insulina exógena (AMIEL et al., 2015). O outro tipo clínico de diabetes, mais conhecido e frequente, o diabetes mellitus tipo 2 (DM2), envolve uma interação de eventos (lesão primária das células β e resistência à insulina) que regem a deficiência relativa de insulina, ocasionado uma condição hiperglicêmica de caráter mais assintomático e, dessa forma, mais devastadora (KAHN; COOPER; PRATO, 2014).
O avanço do DM ocorre em proporções alarmantes e, efetivamente, uma epidemia de DM está em curso (Figura 1). Isso se deve ao crescimento e envelhecimento populacional, à maior urbanização, ao aumento da prevalência de obesidade e sedentarismo e de outros fatores. Estima-se que, atualmente, o número de diabéticos no mundo fique em torno de 387 milhões, com projeções de 471 milhões em 2035. No Brasil, em 2014, foi estimado que existia cerca de 11,9 milhões de indivíduos diabéticos, na faixa etária de 20 a 79 anos, com estimativas para 19,2 milhões em 2035 (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2016).
Figura 1 – Pessoas com diabetes ao redor do mundo e por região entre 2015 e 2040
O DM é uma importante causa de mortalidade. Estimativas mundiais no início do século 21 atribuíram cerca de 5,2% dos óbitos ao DM, o que categoriza tal doença como a quinta principal causa de morte. Na maioria dos países desenvolvidos, essa doença representa entre a quarta e a oitava causa de óbito. Dados brasileiros de 2011 indicaram as seguintes taxas de mortalidade por DM (número de indivíduos por 100 mil habitantes) para a população geral, homens e mulheres, respectivamente: 33,7; 27,2; 32,9 (ROGLIC et al., 2005); BRASIL, 2014).
Além do impacto na vida dos indivíduos acometidos e dos familiares, o DM é uma doença onerosa para tais indivíduos e ao sistema de saúde. Os gastos diretos com DM variam entre 2,5 e 15% do orçamento anual da saúde de um país. No Brasil, o custo anual referente ao cuidado do paciente diabético é de aproximadamente 40,3 milhões, sendo 91% em função de internações hospitalares. Limitações no desempenho profissional por conta de complicações e consequente perda de produtividade também contribuem para o ônus de gastos desse custo social (SOCIEDADE BRASILEIRA DE DIABETES, 2016).
Segundo diretrizes atuais, o DM pode ser diagnosticado baseando-se em critérios de glicemia plasmática, incluindo a glicemia de jejum e/ou a glicemia plasmática mensurada 2 h após um teste oral de tolerância à glucose (TOTG) (Tabela 1). A mensuração de hemoglobina glicada (HbA1C) é igualmente apropriada para tal diagnóstico, embora exista uma imperfeita correlação entre HbA1C e glicemia média em certos indivíduos (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017). No caso da glicemia de jejum, o teste deve ser feito após ausência de ingestão calórica de no mínimo 8 h. O TOTG é performado por meio da ingestão de uma carga de glucose contendo o equivalente a 75 g de glucose anidra dissolvida em água. Glicemia de jejum, TOTG e HbA1C também podem diagnosticar indivíduos com pré-diabetes e numerosos estudos confirmaram que, comparado com os pontos de corte das medidas de glicemia de jejum e de HbA1C, o TOTG diagnostica mais pessoas com diabetes (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 2017).
Tabela 1 – Critérios para diagnóstico de pré-diabetes e de diabetes, segundo American Diabetes Association (2017)
Parâmetros Laboratoriais Diagnóstico Pré-dibetes Diabetes Glicemia de jejum 100-125 mg/dLa ≥ 126,0 mg/dL Glicemia após 2 h do TOTG 140-199 mg/dLb ≥ 200,0 mg/dL HbA1C 5,7-6,4% ≥ 6,5% Screening glicêmico na presença de sintomas clássicos de hiperglicemia _______ ≥ 200,0 mg/dL a
glicemia de jejum prejudicada b
A sintomatologia do estado hiperglicêmico inclui poliúria (aumento no volume e frequencia de micção), polidipsia (aumento da sede), polifagia (aumento da fome), visão turva, aparecimento de feridas com difícil cicatrização e perda de peso, esse último principalmente no que se refere ao DM1 (Figura 2). No caso do DM1, tais sintomas tornam-se mais intensos até a procura por auxílio médico e, portanto, até o período de diagnóstico, não raramente resultando em internamentos hospitalares por conta de cetoacidose diabética (ATKINSON, 2012). Já para o DM2, ocorre uma evolução clínica mais assintomática, uma vez que os níveis glicêmicos em comparação ao DM1 são menores e, portanto, é frequente, no período de diagnóstico, a ocorrência concomitante de complicações (OZOUGWU, 2013).
A fisiopatologia do DM1 manifesta-se através de eventos autoimunes, direcionados contra as células β pancreáticas. A quebra dessa tolerância imunológica é gerada por meio de interações entre componentes genéticos e ambientais, esses últimos podendo incluir estresse, dieta hipercalórica e hiperproteica, ingestão de leite de vaca no período anterior aos 6 meses de idade, nascimento pré-termo e infecções. Esse tipo clínico de diabetes acomete, usualmente, a faixa etária de crianças e adolescentes, o que justifica a utilização do termo "diabetes juvenil" para descrever o DM1 (WALLBERG; COOKE, 2013).
O levante imunológico contra as células β pancreáticas inclui componentes celulares e humorais que, em conjunto, promovem necrose celular. O componente celular é composto pelo ataque promovido por macrófagos, linfócitos T e células matadoras naturais, os quais interagem na promoção dessa necrose. A atividade desse componente celular resulta em um processo inflamatório localizado nas ilhotas pancreáticas, denominado insulite, no qual está envolvida a secreção de citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina-1 (IL-1). Achados histológicos dessa condição são caracterizada por uma infiltração de macrófagos nas ilhotas pancreáticas (WALLBERG; COOKE, 2013).
Figura 2 – Sintomas clássicos de diabetes
O componente humoral é constituído pela presença de autoanticorpos direcionados contra componentes antigênicos das células β pancreáticas. Títulos desses autoanticorpos podem ser detectados ainda na fase pré-diabética e podem constituir-se como potenciais marcadores de lesão dessas células. Alguns exemplos desses autoanticorpos são aqueles direcionados contra os seguintes componentes presentes nas células β pancreáticas: ácido glutâmico descarboxilase isoforma 65 (GAD65), tirosina fosfatase associada à insulinoma isoforma 2 (IA-2), transportador de zinco isoforma 8 (ZnT8) e insulina. O risco do desenvolvimento clínico da doença, com hiperglicemia evidente, cresce com o aumento do número de autoanticorpos (KAWASAKI, 2014).
O tempo necessário para se estabelecer uma taxa de necrose suficiente para o aparecimento dos sintomas no DM1 é muito variável, dependendo dos fatores ambientais a que se expõe o indivíduo geneticamente predisposto. A perda de 80% da massa de células β pancreáticas é o limiar para o estabelecimento de hiperglicemia. Assim, perdas celulares inferiores a 80% ainda permitem a manutenção de normoglicemia pelas células β pancreáticas residuais ainda não lesionadas, salientando-se que, o indivíduo, mesmo normoglicêmico, se encontra em um estágio clínico de pré-diabetes tipo 1 (AKIRAV; KUSHNER; HEROLD, 2008).
O fluxo patológico dos eventos moleculares que direcionam o curso clínico do DM2 inclui dois fatores-chave: defeitos primários na secreção de insulina e resistência à insulina. Experimentalmente, tem-se verificado que a lesão primária de células β pancreáticas é o principal fator envolvido na predisposição genética ao DM2. Defeitos primários na função secretória de células β pancreáticas já foram identificados em indivíduos normoglicêmicos, mas com história familiar de DM2 (FONSECA; JOHN-KALARICKAL, 2009; ALSAHLI; GERICH, 2010).
Defeitos primários na função secretória das células β pancreáticas não são os únicos protagonizadores da evolução clínica para o DM2; a resistência à insulina também apresenta um papel importante dessa evolução, de forma que ela pode intensificar a lesão dessas células. Inicialmente, indivíduos com resistência à insulina mantém-se normoglicêmicos através de uma hipersecreção insulínica compensatória, o que sobrepuja a própria resistência à ação desse hormônio. Em indivíduos com histórico familiar de DM2, já foram identificados defeitos primários em algum aspecto da função secretória de células β pancreáticas, mesmo nesse estágio de hipersecreção (ALSAHLI; GERICH, 2010).
O que explica o papel da resistência à insulina na intensificação da lesão de células β pancreáticas é o cenário bioquímico no qual ela se insere: um estado inflamatório de baixa intensidade, porém crônico, caracterizado pela liberação de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1 (Figura 3). A própria hiperinsulinemia compensatória é também um fator lesivo adicional às células β pancreáticas. Dessa forma, a progressiva lesão dessas células acaba por promover hiperglicemia que define o DM2 clinicamente instalado. A obesidade é uma condição que é associada a esse estado inflamatório de baixa intensidade e, por isso, o DM2 é muito frequente em indivíduos obesos (MCARDLE et al., 2013).
A hiperglicemia prolongada é o fator-chave da geração de complicações de cunho vascular. Tais complicações podem ser agrupadas em complicações micro e macrovasculares: as primeiras, correspondendo a comorbidades como retinopatia, nefropatia e neuropatia diabética e, as segundas, agrupando o leque de desfechos com plano de fundo aterosclerótico, como infarto agudo do miocárdio, doença arterial periférica e acidente vascular encefálico. Uma vez que a hiperglicemia é o elemento mediador de tais complicações, o tratamento do diabetes visa prioritariamente à manutenção de níveis glicêmicos normais, na maior faixa temporal possível (FORBES; COOPER, 2013).
São muitos os mecanismos pelos quais a hiperglicemia causa danos em órgãos-alvo, como olhos e rins. Embora diferentes, um fato comum rege o mecanismo de lesão dessas vias: o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) induzido pela hiperglicemia. Das vias de lesão celular que são ativadas, podem ser citadas: (1) o aumento da atividade da via dos polióis; (2) formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs); (3) ativação da proteína quinase C (PKC) e (4) aumento na atividade da via das hexosaminas (BROWNLEE, 2005).
Figura 3 – Evolução dos eventos até o estabelecimento de DM2 clínico
O diabetes é responsável por grande número de óbitos em virtude de eventos cardiovasculares, como o infarto agudo do miocárdio. Existem, portanto, vias de sinalização induzidas pela hiperglicemia não controlada que sustentam o plano de fundo aterosclerótico responsável por tais eventos (SIRACUSE; CHAIKOF, 2012). Estresse oxidativo e vias de sinalização envolvendo quinases e fatores de transcrição interagem na promoção de dano vascular, por intermédio de um processo lesivo e progressivo denominado disfunção endotelial (AVOGARO et al., 2011). As vias de lesão celular descritas anteriormente também têm relação com a deflagração do processo inflamatório aterosclerótico (REIS et al., 2008).
A disfunção endotelial é caracterizada por modificações estruturais e funcionais de artérias, resultando em redução da luz arterial e, portanto, do fluxo sanguíneo (Figura 4). Tal processo envolve uma série de eventos celulares e inflamatórios que, pouco a pouco, obstruem o vaso: redução da produção de óxido nítrico endotelial; aumento na produção de moléculas de adesão como a molécula de adesão célula vascular (VCAM-1) e de proteína quimioatrativa de monócitos (MCP-1); diapedese de monócitos para a camada subendotelial e posterior ativação a macrófagos; produção de citocinas pró-inflamatórias pelos macrófagos e consequente sustentação do processo inflamatório; produção de fatores de crescimento pelo endotélio e por macrófagos que induzem a migração de células musculares lisas da camada média para a camada subendotelial (ALTABAS, 2015).
A hiperglicemia persistente ativa um mecanismo denominado memória hiperglicêmica vascular, com mudanças epigenéticas que mantém a lesão vascular mesmo após momentos de posterior normalização glicêmica. A modulação de eventos epigenéticos como acetilação e metilação pelo ambiente hiperglicêmico promove dano vascular por ativar estresse oxidativo e vias inflamatórias (EL-OSTA et al., 2008).
Figura 4 – Disfunção endotelial como evento promotor da aterosclerose
O estado diabético promove “down-regulation” do gene da desacetilase SIRT-1, resultando em aumento da acetilação do promotor do gene para a proteína adaptadora p66Shc. Ocorre concomitante hipometilação desse promotor induzida também pelo estado hiperglicêmico. Tais mudanças epigenéticas causam aumento mitocondrial de espécies reativas de oxigênio que, por sua vez, resulta em redução da atividade de óxido nítrico endotelial e, consequentemente, redução na produção de óxido nítrico, fator-chave na disfunção endotelial. O aumento de EROs também ativa a via do fator nuclear kappa B (NF-kB), o qual induz a produção de moléculas de adesão e de citocinas pró-inflamatórias, sustentando, assim, a inflamação vascular (Figura 5) (PANENI et al., 2013).
2.2 A busca de fontes naturais para o tratamento do diabetes
Muitas culturas têm utilizado formas alternativas para o tratamento do DM e essa abordagem é baseada principalmente na utilização de plantas que exibem propriedades hipoglicemiantes (PATIENCE; ESTELLA; PHILIP, 2014). Estudos etnofarmacológicos têm sustentado a utilização de tais plantas na medicina tradicional para o tratamento do DM, por meio da identificação dos compostos hipoglicemiantes presentes nas espécies utilizadas e do uso de modelos animais de diabetes (COMAN; RUGINǍ; SOCACIU, 2012).
Hoje se conhece um vasto arsenal de moléculas isoladas de vegetais que são capazes de promover, de alguma forma, a redução dos níveis glicêmicos, apresentando, assim, potencial biotecnológico para utilização como agente hipoglicemiante. De fato, a existência de alguns fármacos hipoglicemiantes utilizados atualmente para o tratamento do DM2 apresenta uma relação com a utilização de plantas, como ervas, para tratar o diabetes e com a atividade investigativa de elucidação dos compostos vegetais que realizavam tal efeito. Tendo em vista que diversos fármacos utilizados na terapêutica do diabetes apresentam mecanismos verificados em compostos vegetais de ação hipoglicemiante, percebe-se a estreita relação entre a prospecção de tais moléculas e o desenvolvimento de novos fármacos (LAMBA et al., 2000; QASEEM et al., 2012).
Figura 5 – Modificações epigenéticas induzidas pelo DM e consequente indução e manutenção de disfunção endotelial e inflamação vascular
Os efeitos hipoglicemiantes de extratos de tecidos de plantas são creditados, principalmente, a substâncias derivadas do metabolismo secundário vegetal (metabólitos secundários), que constituem moléculas com grande diversidade e complexidade estrutural, produzidas em pequena escala e apresentando distribuição mais restrita no reino vegetal. Enquanto as moléculas do metabolismo primário desempenham funções essenciais no vegetal, tal como fornecimento de energia e matéria-prima para biossíntese e crescimento, os metabólitos secundários estão relacionados a funções adaptativas, como as relacionadas aos mecanismos de defesa química (DORNAS et al., 2009; GERSHENZON, 2004; NEGRI, 2005).
Em sua maioria, os compostos hipoglicemiantes de plantas pertencem à classe dos alcalóides e dos flavonoides (PATIENCE; ESTELLA; PHILIP, 2014). Componentes hipoglicemiantes naturais derivados de plantas também incluem moléculas da classe das cumarinas, glicosídeos cianogênicos, iridóides, fenolpropanóides, estilbenos, terpenóides, substâncias sulfúricas e xantonas (NEGRI, 2005).
A seguir, serão exemplificadas espécies de plantas e seus compostos hipoglicemiantes.
2.2.1 Galega officinalis
A G. officinalis é uma leguminosa da subfamília faboidae, extensivamente utilizada com propósitos ornamentais e de adubagem. É uma espécie nativa da Europa, Rússia e Irã, onde se desenvolve em solos úmidos. Seu composto ativo hipoglicemiante é a galegina, um derivado de guanidina. Historicamente, a metiformina, um hipoglicemiante oral largamente utilizado no tratamento do DM2, foi desenvolvida por meio de estudos realizados com a galegina (LUKA; OMONIWA, 2012). Uma fração livre de alcaloide, obtida do extrato de G. officinalis previne estresse oxidativo em ratos com diabetes (LUPAK et al., 2015).
2.2.2 Abelmoschus moschatus
A. moschatus é uma planta da Ásia e da América do Sul, da família
flavonoides. Estudos in vivo mostraram que a miricetina melhorou a sensibilidade à insulina em ratos (LIU et al., 2007).
2.2.3 Annona squamosa
A. squamos (ateira) pertence à família Annonaceae, cujo fruto é chamado
de fruta-pinha, pinha ou fruta-do-conde. Seu composto hipoglicemiante, a quercetina-3-O-glicosídeo, isolada de suas folhas, exerceu efeitos hipoglicemiantes em modelos animais (PANDA; KAR, 2008).
2.2.4 Pinus pinaster
Popularmente conhecido como pinheiro-bravo, P. pinaster é uma espécie originária de regiões da Europa e Mediterrâneo. Seu tronco é coberto por uma casca espessa, da qual são obtidos, proantocianidinas, catequina e epicatequina, com propriedades hipoglicemiantes e antioxidantes. Extratos aquosos da casca do tronco exerceram efeitos hipoglicemiantes em ratos diabéticos e em humanos com DM2. As proantocianidinas de P. pinaster, que são oligômeros de catequinas e epicatequinas, possuem atividade inibitória de α-glicosidase, similar ao hipoglicemiante oral acarbose (BEDEKAR; SHAH; KOFFAS, 2010; SCHÄFER; HOGGER, 2007).
2.2.5 Salacia oblonga
Planta arbustiva nativa da índia, a S. oblonga é largamente utilizada na medicina tradicional para tratar o DM. Seu composto bioativo hipoglicemiante é a mangiferina, da classe das xantonas. Estudos mostraram que a mangiferina aumentou a expressão de transportadores de glucose e sua translocação até as membranas celulares em culturas de células musculares e adiposas, estimulando, assim, a captação desse monossacarídeo por tais células (GIRÓN et al., 2009).
2.2.6 Croton cajucara
A euforbiácea C. cajucara é uma espécie da região amazônica, utilizada para o tratamento de diversas doenças. A casca de seu tronco apresenta um
composto hipoglicemiante da classe dos diterpenos, a trans-desidrocrotonina, que mostrou potencial antidiabético em camundongos (SILVA et al., 2001).
2.2.7 Achyrocline satureioides
A. satureioides, popularmente conhecida como macela, macela-do-campo, macelinha ou macela de travesseiro, é uma erva da flora brasileira. Da família Asteraceae, tem formação arbustiva e é utilizada na medicina tradicional. O aquirofurano, um dibenzofurano prenilatado obtido dessa planta, promoveu significantes reduções glicêmicas em modelos animais (CARNEY et al., 2002).
2.2.8 Outras espécies de plantas com propriedades hipoglicemiantes
Muitas outras espécies vegetais foram listadas na literatura como apresentando potencial antidiabético. Extratos das folhas de Averrhoa bilimbi e de
Biophytum sensitivum exerceram efeito hipoglicemiante pronunciado em ratos e
coelhos diabéticos, respectivamente (PURI, 2001; PUSHPARAJ; TAN; TAN, 2001). Extratos ricos em antocianinas obtidos de blueberries foram eficientes na promoção de redução glicêmica em camundongos diabéticos, apresentando um efeito secretagogo de insulina em culturas de células β pancreáticas de roedores (GRACE et al., 2009; JAYAPRAKASAM et al., 2005). A Figura 6 mostra algumas das plantas aqui descritas.
Figura 6 – Espécies de plantas que apresentam compostos secundários com atividade hipoglicemiante e potencial antidiabético
Fonte: www.plantamed.com.br
A - Gallega officinalis; B - Abelmoschus moschatus; C - Annona squamosa; D - Pinus pinaster;
2.3 Proteínas vegetais hipoglicemiantes: um potencial pouco especulado
Embora se tenha dado muito crédito aos metabólitos secundários no protagonismo da ação hipoglicemiante verificada pela ingestão de extratos vegetais, pouco se tem discutido sobre observações e dados da literatura que relacionam ainda mais as plantas ao contexto biotecnológico de utilização no campo da diabetologia: dados que mostram a existência de proteínas do tipo insulina em vegetais (XAVIER-FILHO et al., 2003).
Em 1923, logo após a descoberta da insulina em extratos etanólicos de pâncreas de cães (descoberta da qual Collip participou como um dos desenvolvedores do método de extração de insulina a partir de pâncreas de cães), autores reportaram a presença de materiais do tipo insulina em folhas de feijão verde, alface, cebola verde e folhas de trigo, cujos extratos promoveram reduções glicêmicas significantes em coelhos normais e em cães pancreatectomizados, após administração subcutânea (BANTING et al., 1922; COLLIP, 1923).
Nos anos 70, um grupo indiano reportou a presença de insulina em plantas, patenteando o processo de obtenção de tal material, que se baseava em extração etanólica-acídica de frutos e sementes da cucurbitácea Momordica
charantia (KHANNA et al., 1976). O produto obtido, que foi denominado
polipeptídeo-p, mostrou atividade hipoglicemiante em gerbos da espécie Meriones
hurrinae, em macacos langures da espécie Presbytis entellus e em humanos com
diabetes. Apesar de tais efeitos insulinomiméticos in vivo, o polipeptídeo-p apresentou certas propriedades bioquímicas que diferiram das propriedades presentes na insulina bovina, como massa molecular de cerca de 11 kDa, presença do aminoácido metionina e ausência de imunoreatividade contra anticorpos anti-insulina bovina (KHANNA et al.,1981). A partir de então, dava-se início a um novo período de prospecções acerca de compostos do tipo insulina em vegetais.
A seguir, serão descritas espécies de plantas das quais foram obtidas proteínas hipoglicemiantes e/ou com características similares às da insulina de mamíferos (Figura 7).
Figura 7 – Plantas com proteínas hipoglicemiantes do tipo insulina
Fonte: www.plantamed.com.br
A – Canavalia ensiformis; B – Vigna unguiculata; C – Bauhinia variegata; D – Momordica charantia; E
2.3.1 Canavalia ensiformis
Em 1999, foi reportada a presença de uma proteína do tipo insulina no tegumento de sementes de C. ensiformis, popularmente conhecida como Jack bean (OLIVEIRA et al., 1999). Quatro ensaios permitiram sugerir que a proteína em questão era do tipo insulina: (1) a proteína apresentou mobilidade eletroforética em tricina-PAGE-SDS similar à da insulina bovina; (2) reagiu com anticorpo antisulina em ensaio de Western blotting; (3) promoveu redução glicêmica significante em camundongos com diabetes aloxânico, após injeção intravenosa e (4) apresentou duas cadeias, idênticas em termos de sequência amino-terminal às cadeias α e β da insulina bovina. Esse trabalho foi o primeiro a mostrar a presença de uma proteína do tipo insulina especificamente no tegumento de uma semente.
2.3.2 Vigna unguiculata
Quatro anos após a publicação da presença de uma proteína do tipo insulina no tegumento de sementes de C. ensiformis, foi reportada a presença do mesmo tipo de molécula no tegumento de sementes de V. unguiculata, também uma leguminosa (VENÂNCIO et al., 2003). A presença de epítopos antigênicos do tipo insulina também foi observada nos frutos sem sementes, mas não no embrião. Considerando a expressão de insulina vegetal nos frutos inteiros em função do tempo após a polinização, os autores verificaram um aumento na concentração até o 16º dia após o evento e uma redução acentuada em 20 dias após a polinização (fase de abertura do fruto). A partir dessa observação, foi hipotetizado que uma maior concentração da proteína do tipo insulina nas fases mais iniciais do desenvolvimento e, portanto, no período em que o fruto se encontrava mais metabolicamente ativo, poderia ser um indício do papel dessa molécula nesse órgão vegetal.
2.3.3 Bauhinia variegata
A fabacea B. variegata é largamente utilizada na medicina tradicional para o tratamento do DM. É popularmente conhecida como pata-de-vaca, originária da Índia e China e muito cultivada no sudeste do Brasil (DUARTE et al., 2007). Além de
promover o controle glicêmico, o chá das folhas dessa espécie é utilizado também para outras propostas medicinais (POKHREL; ADHIKARI; BARAL, 2002; RAJKAPOOR et al., 2006).
Uma proteína, com massa molecular similar à da insulina bovina foi purificada a partir de extrato de folhas dessa planta (AZEVEDO et al., 2006). A proteína, além de ter apresentado reação com anticorpo anti-insulina humana, promoveu também redução significativa da glicemia em camundongos com diabetes quimicamente induzido por aloxano. Análises microscópicas mostraram que essa proteína está localizada nos cloroplastos das células parenquimatosas.
2.3.4 Momordica charantia
Yinchok-Anun et al. (2006) obtiveram uma fração proteica dos frutos de
M. charantia que promoveu o aumento da captação de glucose por miócitos C2C12 e
adipócitos 3T3-L1 e a redução significativa dos níveis glicêmicos de ratos com diabetes quimicamente induzido por estreptozotocina, após administração subcutânea.
Também de M. charantia, uma única fração peptídica semipurificada, denominada MC2-1, promoveu redução glicêmica significativa em camundongos com diabetes quimicamente induzido por aloxano, após administração por via oral. Essa fração continha como principais peptídeos aqueles com massas moleculares entre 1,3 e 6,0 kDa. Posteriormente, um peptídeo hipoglicemiante, denominado MC2-1-5, com massa molecular de aproximadamente 3,4 kDa, determinada por MALDI-TOF-MS, foi purificado a partir de MC2-1 (YUAN; GU; TANG, 2008). MC2-1-5 promoveu importante redução glicêmica em camundongos com diabetes quimicamente induzido por aloxano, após administração por via oral.
2.3.5 Momordica cymbalaria
A cucurbitácea M. cymbalaria representa outra espécie do gênero Momordica, utilizada em algumas culturas como erva medicinal para o tratamento do diabetes (RAO et al., 1999). Uma proteína hipoglicemiante, que foi denominda M.Cy protein, com massa molecular de 17 kDa, foi purificada a partir de um extrato hipoglicemiante de frutos dessa planta e apresentou ponto isoelétrico de 5,0,
próximo ao da insulina, que é de 5,4 (RAJASEKHAR et al., 2010). Além disso, M.Cy protein promoveu redução glicêmica somente quando administrada por via parenteral e não por via oral.
2.3.6 Costus igneus
Uma proteína isolada das folhas de C. igneus (família Zingiberaceae) apresentou reatividade com anticorpo anti-insulina. A massa molecular da proteína do tipo insulina purificada, determinada por MALDI-TOFF, foi de 5,7 kDa. Além disso, a proteína purificada de C. igneus promoveu atividade hipoglicemiante em camundongos normais e naqueles com diabetes quimicamente induzido por estreptozotocina, quando administrada por via oral ou intraperitoneal, e induziu captação de glucose por cultura de células RIN5f responsivas à insulina. Contudo, um conjunto de propriedades biofísicas indicou que essa proteína é estruturalmente diferente da insulina recombinante humana (JOSHI et al., 2013). Posteriormente, ensaio de imunoblot revelou aumento nos substratos de receptor de insulina (IRS-1) e na translocação de transportadores de glucose dependentes de insulina (GLUT-4) em direção à membrana de células musculares em cultura, sugerindo que essa proteína elicita vias de sinalização insulinomiméticas (HARDIKAR et al., 2016).
2.3.7 Urtica pilulifera
Lectinas de plantas são exemplos de proteínas vegetais que já tiveram efeitos antidiabéticos documentados. Em ratos diabetizados por estreptozotocina, uma dose de 100 mg/Kg de lectina isolada de semente de U. pilulifera, administrada por via intraperitoneal, reduziu a glicemia ao longo de 4 semanas de tratamento, com injeções diárias da proteína. Por outro lado, nos ratos diabéticos não tratados, foi verificada uma elevação da glicemia ao longo das 4 semanas de estudo (KAVALALI et al., 2003).
Não se sabe ao certo qual o papel das proteínas do tipo insulina no vegetal. Outros dados experimentais reforçam a efetiva existência de antígenos do tipo insulina e de vias de sinalização relacionadas à insulina em vegetais e seu possível papel na promoção da germinação e desenvolvimento da semente e na fotossíntese em folhas. É possível que insulina em vegetais tenha um papel
anabólico, de desenvolvimento, analogamente ao estímulo anabólico exercido pela insulina em humanos (PAULA et al., 2016).
2.4 Moringa oleifera: seu potencial antidiabético e sua inserção na pesquisa prospectiva de proteínas hipoglicemiantes
Nesse contexto de discussão de plantas com potencial antidiabético, a espécie M. oleifera apresenta um destaque no que diz respeito à presença de uma diversidade de moléculas hipoglicemiantes: desde metabólitos secundários até proteínas. Conhecida como a “árvore da vida”, várias partes dessa espécie têm sido utilizadas no tratamento complementar do diabetes por muitas culturas (PAULA et al., 2016).
M. oleifera é uma espécie nativa da Índia, popularmente chamada de
moringa, acácia-branca, árvore-rabanete-de-cavalo, cedro, moringueiro e quiabo de quina. Da família Moringaceae, possui folhas compostas e cresce principalmente em áreas semi-áridas tropicais e subtropicais (Figura 8). A M. oleifera apresenta de pequeno a médio porte, com crescimento rápido, sendo capaz de suportar longos períodos de estiagem e de sobreviver em solos pobres e adaptando-se a uma ampla faixa de solos, com melhor desenvolvimento em solos neutros ou levemente ácidos (GOPALAKRISHNAN; DORIYA; KUMAR, 2016).
M. oleifera tem importante valor nutricional, de forma que todas as suas
partes são ricas em tocoferóis, carotenóides, ácido ascórbico e compostos fenólicos, além de cálcio e potássio. Essa espécie apresenta elevado conteúdo de proteínas de boa qualidade e de óleos. Folhas e sementes são os seus órgãos com maior conteúdo de proteínas. Folhas in natura apresentam teor proteico em torno de 6,4-6,7%. A proteína é o composto encontrado em maior quantidade nas sementes, com um teor médio de 40% (GALLÃO; DAMASCENO; BRITO, 2006; FERREIRA et al., 2008; MOURA et al., 2009).
Figura 8 – Moringa oleifera Lam.
Fonte: http://moringamaisvida.com.br/
Muitas propriedades farmacológicas são atribuídas à M. oleifera: ações anti-inflamatória, hepatoprotetora, antimicrobiana, protetora contra estresse oxidativo, hipolipidêmica e antidiabética. Tais propriedades embasam a utilização da
M. oleifera na medicina popular para o tratamento de diversas patologias, muitas
delas associadas ao diabetes (GOYAL et al., 2007).
Vários compostos bioativos estão presentes nas folhas de M. oleifera, incluindo vitaminas, carotenoides, polifenóis, ácidos fenólicos, flavonoides, alcaloides, glucosinolatos, isotiocianatos, taninos, saponinas, oxalatos e fitatos. Como já descrito anteriormente, algumas dessas classes de compostos, presentes em outras espécies vegetais, apresentam propriedades hipoglicemiantes e, assim, parte do potencial que a M. oleifera possui, com relação ao uso no tratamento complementar do diabetes, deve-se à presença de tais compostos, em especial alcaloides, polifenóis, isotiocianatos e ácidos fenólicos (LEONE et al., 2015).
São muitos os estudos que discriminam a M. oleifera no que se refere a propriedades hipoglicemiantes. Extratos aquosos de suas folhas foram efetivos em reduzir os níveis glicêmicos de ratos diabéticos durante o TOTG. As doses administradas promoveram reduções significativas após 3 h da administração intragástrica de solução de glucose, tanto em animais subdiabéticos, como nos moderadamente diabéticos. O extrato das folhas também promoveu reduções significativas na glicemia de jejum e na glicemia pós-prandial de ratos severamente diabéticos, porém com tratamento crônico (JAISWAL et al., 2009).
Isotiocianatos presentes nos frutos da M. oleifera mostraram importante potencial antidiabético. A incubação de linhagens celulares de células β pancreáticas com 100 ppm de N-benzil tiocarbamatos, N-benzil carbamatos, benzil nitrilas e benzil éster, isolados de extratos dos frutos, resultou na liberação de 15-33 ng insulina/mg proteína, enquanto que a incubação dessas células com 4 mM de glucose (o principal indutor de secreção de insulina em sistemas vivos) promoveu a liberação de 4-6 ng insulina/mg proteína (FRANCIS et al., 2004).
Extratos metanólicos dos frutos de M. oleifera sem sementes reduziram a progressão do diabetes em ratos com diabetes induzido por estreptozotocina, havendo reduções significativas nos níveis de glucose sérica e concomitantes aumentos nos níveis insulinêmicos. Desses extratos, foram isolados os fitoquímicos quercetina e kampferol (GUPTA et al., 2012). Extrato aquoso de folhas de M. oleifera protegeram ratos normais e diabéticos contra o dano oxidativo induzido pelo estado
diabético (JAISWAL et al., 2013). Ainda, extratos das folhas de M. oleifera foram capazes de reverter de forma considerável danos histopatológicos nas ilhotas pancreáticas de ratos com diabetes quimicamente induzido (YASSA; TOHAMY, 2014).
Mais recentemente, nosso grupo de pesquisa verificou que proteínas também estão incluídas no arsenal bioquímico hipoglicemiante presente nos órgãos de M. oleifera. Um protocolo de obtenção de proteínas do tipo insulina a partir de tecidos vegetais, baseado em extração etanólica-acídica e subsequente precipitação das proteínas com acetona, foi utilizado no tegumento das sementes. A fração proteica obtida, nomeada Mo-SC (M. oleifera seed coat), após administração intraperitoneal e oral em camundongos com diabetes quimicamente induzido, promoveu significante redução glicêmica em 5 h após o tratamento e melhorou a tolerância à glucose administrada por via oral além de ter causado redução glicêmica ao longo de dez dias de tratamento intraperitoneal. Além disso, por meio de dot blot utilizando anticorpo anti-insulina humana, Mo-SC mostrou epítopos antigênicos do tipo insulina (PAULA et al., 2016).
Adicionalmente, nosso grupo de pesquisa verificou em um isolado proteico obtido de folhas de M. oleifera, nomeado Mo-LPI (M. oleifera leaf protein
isolate), efeito hipoglicemiante e antioxidante em camundongos diabéticos induzidos
por aloxano. Administração intraperitoneal em dose única, na dose de 500 mg/kg, reduziu a glicemia em 66,4% após 5 h e em 56,2% no sétimo dia ao longo de sete dias de tratamento intraperitoneal diário, não tendo relação com efeito secretagogo de insulina. Assim como observado para Mo-SC, Mo-LPI apresentou também reação com anticorpo anti-insulina (PAULA et al., 2017).
Assim, M. oleifera constitui uma espécie vegetal com importante potencial para a prospecção de novos fármacos hipoglicemiantes.
3 CONSIDERAÇÕES GERAIS
Proteínas vegetais hipoglicemiantes representam uma importante classe de moléculas que requerem estudos mais pormenorizados. Presentes em diferentes espécies e diversos tecidos vegetais, a existência de tais moléculas evidencia a importância da conservação evolutiva de vias metabólicas associadas ao metabolismo da glucose e, mais propriamente, ao papel de proteínas com funções similares à insulina (CHAN; STEINER, 2000). A relevância dessa conservação durante a evolução pode ser inferida pela presença de tais proteínas no tegumento de sementes de algumas plantas, o que pode estar associado a mecanismos de transporte de glucose que auxiliam na germinação (PAULA et al., 2016). É o caso de proteínas do tipo insulina encontradas no tegumento de sementes de C. ensiformis (OLIVEIRA et al., 1999) e V. unguiculata (VENÂNCIO et
al., 2003). De fato, insulina humana acelera a germinação de sementes vegetais
(OLIVEIRA et al., 2004).
O presente capítulo trata da obtenção de uma fração proteica obtida do tegumento de sementes de M. oleifera, denomida Mo-TEG. Aqui serão discutidos os métodos empregados para sua obtenção, os resultados acerca de sua caracterização bioquímica e a abordagem experimental que permitiu avaliar seu potencial hipoglicemiante. Além de apresentar indícios da presença de proteínas do tipo insulina, Mo-TEG mostrou ter um significativo efeito hipoglicemiante em um modelo animal (camundongos) com diabetes quimicamente induzido por aloxano. Tais efeitos foram verificados por administrações em dose única, em doses repetidas e por meio da análise da tolerância oral à glucose. Soma-se a esse potencial hipoglicemiante, a propriedade que Mo-TEG apresentou em modificar níveis séricos de lipídeos em camundongos, inferindo um efeito de atenuação do risco de aparecimento de complicações cardiovasculares associadas à hiperglicemia crônica. Estes resultados sugerem o significativo potencial de utilização de Mo-TEG na pesquisa biomédica voltada para a prospecção e formulação de fármacos a serem empregados no tratamento do diabetes.
4 OBJETIVOS
4.1 Geral
Caracterizar bioquimicamente uma fração proteica obtida do tegumento de sementes de M. oleifera, denominada Mo-TEG (Mo: M. oleifera, TEG: tegumento das sementes), e avaliar seus efeitos sobre parâmetros séricos em camundongos com diabetes quimicamente induzido por aloxano.
4.2 Específicos
Caracterizar Mo-TEG através da determinação do perfil eletroforético, da digestibilidade in vitro por proteases gastrointestinais, do potencial de atividade hemaglutinante, da presença de epítopos antigênicos do tipo insulina e do potencial para precipitação por zinco;
Prospectar a atividade hipoglicemiante de Mo-TEG a curto e longo prazo através de ensaios biológicos in vivo usando camundongos com diabetes quimicamente induzido por aloxano;
Verificar a influência da administração crônica de Mo-TEG nos níveis séricos de lipídeos de camundongos com diabetes quimicamente induzido por aloxano;
