UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS – UNICAMP
FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA – FEQ
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO
Desenvolvimento de Processos Químicos – ACDPQ
BIOFIXAÇÃO DE DIÓXIDO DE CARBONO POR MICROALGAS ACUMULADORAS DE MATERIAIS GRAXOS
Autor: Érika Cristina Francisco
Orientador: Profª. Drª. Telma Teixeira Franco, PhD.
Co-orientador: Profo. Dr. Eduardo Jacob-Lopes
Dissertação de mestrado apresentada a Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
Campinas – São Paulo Março 2010
ii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP
F847b
Francisco, Erika Cristina
Biofixação de dióxido de carbono por microalgas acumuladoras de materiais graxos / Erika Cristina Francisco. --Campinas, SP: [s.n.], 2010.
Orientadores: Telma Teixeira Franco, Eduardo Jacob Lopes.
Dissertação de Mestrado - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.
1. Microalga. 2. Biodiesel. 3. Lipídeos - Biotecnologia. 4. Ácidos graxos. 5. Dioxido de carbono. I. Franco, Telma Teixeira. II. Lopes, Eduardo Jacob. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. IV. Título.
Título em Inglês: Biofixation of carbon dioxide by microalgae accumulate of lipids
Palavras-chave em Inglês: Microalgae, Biodiesel, Lipids -
Biotechnology, Fatty Acids, Carbon dioxide Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Químicos Titulação: Mestre em Engenharia Química
Banca examinadora: Maria Isabel Queiroz, Ranufo Monte Alegre Data da defesa: 22/03/2010
iv Teste exemplar corresponde à versão final da dissertação de mestrado em Engenharia
v Dedico...
vi AGRADECIMENTOS
À orientação, amizade e oportunidades oferecidas pela professora Dra. Telma Teixeira Franco.
Aos meus pais Eunice S. Francisco e Venicio Francisco pela dedicação incondicional, educação e amor. Aos meus familiares pelo apoio, principalmente à minha tia Idineis, que aonde quer que esteja esta me protegendo.
Ao Eduardo Jacob Lopes pela co-orientação, dedicação, auxílio, confiança e exemplo de pesquisador.
A professora Maria Isabel, da Fundação Universidade Federal do Rio Grande, pelas culturas de Aphanothece microscopica Nagëli.
Aos meus amigos Mariana, Tiago, Monica, Camila, Gabi, Ademir, Anderson, Rony e Rafael, Paulinha, Giro, Renato, Chris, Vanessa, Foca, Samuca, entre outros, pela força e cumplicidade.
Aos integrantes e ex-integrantes do LEBBPOR, pela convivência e auxílio; e a Debora pela colaboração, pelo trabalho e pela amizade.
Aos amigos da FEQ, Nathalia, Camilo, Talita, Mariana, Juliana, Michele, Bianca, Vinicius e Jaiver, entre outros que me perdoem pelo esquecimento.
A Petrobrás pelo auxílio na pesquisa e na colaboração para apresentação de trabalho no Congresso Achema.
Aos órgãos de formento e pesquisa CAPES, FAPESP e CNPq.
Ao criador por toda a trajetória e experiências proporcionadas para a minha evolução.
vii Todo efeito tem uma causa. Todo efeito inteligente tem uma causa inteligente. O poder da causa inteligente está na razão da grandeza do efeito. Allan Kardec
viii SUMÁRIO CAPÍTULO 1 ... 1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ... 1 1 Introdução ... 2 2 Objetivos ... 3 CAPÍTULO 2 ... 4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 4
1 Aquecimento global e biocombustíveis ... 5
2 Microalgas ... 7
3 Microalgas como fonte de bioprodutos ... 11
4 Microalgas como fonte de lipídeos ... 15
5 Sistemas para o cultivo de microalgas ... 18
6 Biodiesel ... 22
7 Parâmetros de Qualidade do Biodiesel ... 25
CAPÍTULO 3 ... 30
Metodologia ... 30
1 Cultivo e origem das espécies ... 31
2 Fotobiorreator ... 32
3 Produção de biomassa e biofixação de CO2 ... 33
4 Análise da matéria graxa produzida ... 34
5 Parâmetros para a determinação da qualidade do biodiesel ... 36
6 Análise estatística ... 38
CAPÍTULO 4 ... 39
RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 39
1 Produção de biomassa e seqüestro de CO2 ... 40
2 Caracterização qualitativa e quantitativa das frações lipídicas... 45
ix
CAPÍTULO 5 ... 60
CONCLUSÕES E TRABALHOS FUTUROS ... 60
1 Conclusões ... 61
2 Trabalhos Futuros ... 62
CAPÍTULO 6 ... 63
x ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Parâmetros cinéticos...42 Tabela 2: Frações saturadas, monoinsaturadas e poliinsaturadas...52 Tabela 3: Parâmetros para análise da qualidade do biodiesel...54
xi ÍNDICE DE QUADROS
Quadro 1: Usos comerciais da biomassa microalgal...12 e 13 Quadro 2: Porcentagem lipídica em microalgas...16 Quadro 3: Principais ácidos graxos contidos em algumas oleaginosas...23
xii ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: reação de transesterificação...24
Figura 2: Diagrama experimental...33
Figura 3: Dinâmica do crescimento celular e pH para as diferentes espécies estudadas...41
Figura 4: Cromatograma da Aphanothece microscopica Nagëli...48
Figura 5: Cromatograma da Chlorella vulgaris...49
Figura 6: Cromatograma da Dunaliella tertiolecta...49
Figura 7: Cromatograma da Phaeodactylum tricornutum...50
Figura 8: Cromatograma da Phormidium sp...50
Figura 9: Cromatograma da Scenedesmus obliquus...51
Figura 10: Composição dos ácidos graxos contidos na espécie Chlorella vulgaris...52
xiii NOMENCLATURA
FFA - free fatty acid TAG - triacilgliceróis DAG - diacilgliceróis MAG - monoacilgliceróis FAME - fatty acid methyl acid CN - cetane number
EC - ester content SV – saponification value IV – iodine value
LCSF – long-chain saturated factor CFPP – cold filter plugging point
Px – produtividade volumétrica da biomassa PL – produtividade volumétrica do óleo pHMax – valor máximo do pH obtido no cultivo
rmáx – taxa máxima de remoção de dióxido de carbono rCO2 – capacidade de obsorção de CO2
k1/k2 – razão entre as taxas constantes de absorção e dissorção de CO2 TDH – hydraulic detention time (h)
FA – fatty acid
SFA – saturated fatty acid
MUFA – monounsaturated fatty acid PUFA – polyunsaturated fatty acid N – porcentagem do ácido graxo M – massa molecular do ácido graxo D – número de duplas ligações Em – éster de metil
FCC – fator de comprimento da cadeia PEFF – ponto de entupimento de filtro a frio
xiv RESUMO
O objetivo da dissertação foi avaliar o potencial da produção de matérias graxas por microalgas em processos de seqüestro de carbono e a qualidade do biodiesel produzido pela biomassa produzida. A biomassa de microalgas foi produzida em reatores de coluna de bolhas, a partir de meios de cultivo sintéticos, nas condições de concentração celular inicial de 100mg.L-1, reator isotérmico operando em temperaturas de 35ºC, intensidades luminosas de 11klux e aeração contínua de 1VVM com injeção de ar contaminado com 15% dióxido de carbono. Nesta dissertação de mestrado, as espécies de microalgas descritas pela literatura como produtoras de matérias graxas foram cultivadas em condições fotossintéticas e avaliadas pelo estudo da correlação entre a produção de biomassa e a produção de biodiesel. Nesta etapa, a produção mássica das gorduras e análise qualitativa dos lipídeos produzidos das diferentes espécies foram os fatores determinantes para escolha da microalga com potencial para produção de biodiesel. Uma vez definida a espécie com maior potencial de exploração (melhores parâmetros de conversão de biomassa em materiais graxos, rendimento e produtividade), a composição dos materiais graxos foi determinada para estudo da compatibilidade ao perfil desejado para produção de biodiesel, bem como a qualidade final do biodiesel produzido para cada espécie estudada.
xv ABSTRACT
The objective of the dissertation was to evaluate the potential of production of greases by microalgae in processes of carbon sequestration and the quality of biodiesel produced by the biomass produced. The microalgae biomass was produced in reactors, bubble column, based on synthetic culture media, under the initial cell concentration 100mg.L-1, isothermal reactor operating at temperatures of 35 º C, light intensities of 11klux and continuous aeration of 1VVM with injection of air contaminated with 15% carbon dioxide. In this master's thesis of microalgae species described in the literature as producers of raw grease were grown under photosynthetic and evaluated by the study of the correlation between biomass production and the production of biodiesel. In this step, the mass production of fats and qualitative analysis of lipids produced from different species were the determining factors for selection of microalgae with potential for biodiesel production. After determining the species with the highest potential for exploitation (best parameters for conversion of biomass materials in acids, yield and productivity), the composition of fatty material was determined to study the compatibility of the desired profile for biodiesel production and the final quality biodiesel produced for all species.
1
CAPÍTULO 1
2 1 Introdução
As preocupações com as crescentes questões ambientais e a alta do petróleo tornaram o biodiesel uma alternativa viável para o uso conjunto, ou até mesmo à substituição parcial ao diesel (GERPEN, 2005).
Song et al. (2008) citam como vantagens do biodiesel, propriedades químicas e físicas similares ao petrodiesel, como a característica de ser renovável, podendo ser obtido a partir de óleos vegetais, gordura animal e lipídeos de origem microbiana, podendo reduzir emissões atmosféricas, principalmente em áreas urbanas. Tais emissões como materiais particulados, monóxido de carbono, hidrocarbonetos, óxidos sulfônicos e nitrogenados, e gases tóxicos.
Atualmente as reservas comerciais de biodiesel incluem óleos de soja, colza, palma, milho, gordura animal e óleo de fritura. Segundo Chisti (2007a), apesar do bom desenvolvimento do biodiesel a partir de oleaginosas em grande escala, a produção não é satisfatória para suprir a demanda global.
Por essa razão, o biodiesel microalgal tem emergido como a melhor promessa, devido a vários fatores, dentre eles, o cultivo sem necessidade de grandes áreas, como no caso da plantação de soja, colza e girassol. O biodiesel proveniente de microalgas também pode ser visto como um agente para a minimização das concentrações atmosféricas de dióxido de carbono (caso de fotobiorreatores) ou o aproveitamento de efluentes industriais em cultivos heterotróficos (VALDERRAMA et al., 2002; DE-BASHAN et al., 2004; SHEEHAN et al., 1998; CHISTI, 2007b; ZEPKA et al, 2007).
O presente trabalho foi desenvolvido com a finalidade de avaliar a viabilidade da produção de matérias graxas por microalgas bem como a qualificação do biodiesel obtido conforme especificações estabelecidas.
3 2 Objetivos
2.1 Objetivo geral
Avaliar a viabilidade técnica da produção de matérias graxas por microalgas em fotobiorreatores, bem como a qualidade do biodiesel produzido.
2.2 Objetivos específicos
Selecionar espécies de microalgas com potencial para a produção de matérias graxas e biofixação de dióxido de carbono;
Avaliar a produtividade da biomassa das espécies em questão;
Avaliar o rendimento da produção de matérias graxas quanto à produtividade lipídica (conteúdo em lipídeos x produtividade em biomassa);
Avaliar a composição das matérias graxas e a compatibilidade para a produção de biodiesel microalgal;
Avaliar a qualidade do biodiesel produzido conforme especificações internacionais e nacionais (ANP).
4
CAPÍTULO 2
5 1 Aquecimento global e biocombustíveis
A partir do Protocolo de Kyoto, grande parte da atenção global tem sido para reduzir emissões de carbono pela utilização de fontes de energias não convencionais e combustíveis renováveis, visando a minimização da liberação de CO2 bem como a condução da economia com baixos teores de gases produtores de efeito estufa. Ação como o seqüestro de dióxido de carbono, a redução dos níveis de emissão, a redução do uso de energia bem como o uso de biocombustíveis, podem somente aliviar o problema (MATHEWS, 2008).
Xiong et al. (2008) citam que devido à diminuição de reservas de petróleo e impactos ambientais ocasionados pela exaustão de gases do diesel fóssil, a produção de materiais como combustíveis alternativos tem atraído grande atenção. Nesse contexto, o biodiesel que é caracterizado como produto renovável, biodegradável, e um combustível ambientalmente correto, tem tido um crescente interesse científico.
Um grande número de pesquisas sugere que a biofixação de CO2 por microalgas em fotobiorreatores é uma alternativa sustentável, uma vez que a partir de reações fotossintéticas, átomos de carbono podem ser incorporados à estrutura molecular das células na forma de carboidratos e lipídeos (TAKAGI et al., 2006). As vantagens destes processos estão relacionadas à maior eficiência fotossintéticas dos sistemas quando comparados a plantas superiores, a resistência de alguns destes microrganismos, às elevadas concentrações de dióxido de carbono e a possibilidade do controle das condições de crescimento das culturas. Além disso, a biomassa produzida através da bioconversão do dióxido de carbono possibilita a obtenção de produtos de valor agregado como, por exemplo, ácidos graxos, proteínas, biodiesel, biogás, e fertilizantes orgânicos, dependendo da espécie de microalga utilizada e do resíduo a ser tratado (JACOB-LOPES et al., 2008; YEN & BRUNE, 2007). O reuso de
6 resíduos pode apresentar um grande benefício à economia, diminuindo custo com tratamentos, e melhorando a qualidade ambiental (RITTMANN, 2008).
Knothe (2005) cita que as pesquisas para o uso de óleos vegetais na produção de biocombustíveis surgiram durante a Segunda Guerra Mundial, a partir de preocupações com o aumento descontrolado do uso de derivados do petróleo e a perspectiva de que houvesse falta desses produtos nos estados Unidos. Neste sentido, criaram-se projetos na Universidade Estadual de Ohio (Columbus, OH) sobre o uso de misturas binárias, onde foram feitas investigações sobre o uso de óleos de caroço de algodão e milho, e o uso destes em misturas com o óleo diesel.
Atualmente, discute-se muito sobre o cultivo de oleaginosas vegetais para a produção de biodiesel, pois todos os continentes possuem uma área cultivável limitada, bem como suas reservas de grãos. Uma pequena parte dos grãos que esta sendo usada para a produção de biodiesel teve um efeito considerado como dominó, causando o aumento expressivo no valor dos grãos. Podendo acarretar no aumento do valor de todos os demais alimentos (GRESSEL, 2008).
Segundo Chisti (2007b) as microalgas produzem lipídeos, hidrocarbonetos e outros complexos oleosos, com potencial para transformação em biocombustível. Neste sentido a integração do processo de seqüestro de dióxido de carbono com a produção paralela de biomassa rica em óleos, poderá representar uma importante tecnologia a ser desenvolvida para a nova matriz energética que as sociedades estão buscando.
As microalgas cultivadas em tanques podem ter maior eficiência que certos vegetais na captura de energia solar, principalmente em biorreatores. Se a produção microalgal puder ser escalonada industrialmente, menos de 6 milhões de hectares no mundo seriam necessários para responder à atual demanda de combustíveis, um
7 montante inferior a 0,4% das terras aráveis, o que seria uma meta representativa para a agricultura global (SHEEHAN et al., 1998).
2 Microalgas
As microalgas são encontradas no ambiente marinho, em água doce e no solo, sendo consideradas responsáveis por pelo menos 60% da produção de matéria orgânica da biosfera. O número das espécies destes organismos não é conhecido exatamente, no entanto, são encontradas citações que relatam a existência de 200.000 até alguns milhões de representantes deste grupo. Essa diversidade também se reflete na composição bioquímica, dando às microalgas, a qualidade de fonte ilimitada de bioprodutos (NORTON et al., 1996; PULZ & GROSS, 2004).
A classificação das algas esta em plena evolução e em certos grupos ainda muito instável, pois em alguns casos específicos, pode parecer extremamente complexa, e até mesmo confusa (RIVIERS, 2006). Segundo Tomaselli (2007), as microalgas são classificadas a partir de alguns critérios como a natureza química dos produtos de reserva, diferentes tipos de pigmentos e segundo os constituintes da parede celular bem como também aspectos como critérios citológicos e morfológicos.
Apesar de as microalgas serem frequentemente consideradas fotoautotróficas, requerendo luz para seu crescimento, segundo Wen & Chen (2003), um número considerável de microalgas é capaz de crescer heterotroficamente com um ou mais substratos orgânicos como fonte de energia. Para este tipo de microalga, tecnologias de fermentação podem ser adotadas e modificadas para uma produção em grande escala de bioprodutos.
A maioria das espécies fotoautróficas obtém energia através da luz para realizar a fixação de carbono, necessário para a construção da biomassa (GLADUE, 1991). A
8 absorção da radiação eletromagnética pelos organismos fotossintetizantes só é feita no comprimento de onda entre 400 e 720 nm, isto é, no espectro visível, e é realizada pelos pigmentos fotossintéticos (LIPS & AVISAR, 1990). No caso das microalgas, os pigmentos são classificados em grupos, como as clorofilas, os carotenóides e as ficobilinas, diferenciando-se quanto à capacidade de absorção luminosa e composição química (ROUND, 1983).
As microalgas armazenam energia na forma de adenosina-trifosfato (ATP) e nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH), compostos utilizados como fonte de energia durante a síntese de carboidratos, e outros compostos orgânicos celulares a partir da água e da redução do CO2 (LEHNINGER, 1990). No caso da via de fixação do carbono inorgânico, a enzima envolvida é a Ribulose Difosfato Carboxilase (Rubisco), uma parte do carbono fixado é usado para a manutenção celular e para o crescimento, enquanto a outra é estocada (FALKOWSKI, 1997).
O estudo de microalgas, bem como outros microrganismos, fungos e bactérias, tem tido sua importância intensificada para utilização nas mais diversas áreas. No caso das microalgas, além do seu potencial para o uso em produção de biocombustíveis e fixação de CO2, também há a possibilidade de obtenção de produtos químicos, alimentos e aplicação na purificação de água (BENEMANN et al., 2003).
Segundo Mata et al. (2010), os consumidores estão cada vez mais preocupados com problemas de saúde como colesterol, osteoporose, doenças cardíacas entre outras. Em vista disto, microrganismos aquáticos estão sendo investigados e tendo maior apreciação no mercado, especialmente desde a introdução de suprimentos probióticos (BARROW & SHAHIDI, 2008). Pesquisas com microalgas estão sendo desenvolvidas por diversos motivos, um deles é a presença de proteínas com qualidade superior à outras fontes vegetais, como também a presença de diferentes
9 tipos de esteróis e antioxidantes em sua biomassa (MATA et al., 2010; BARROW & SHAHIDI, 2008).
Na questão do uso de microalgas para purificação aquática, a aplicação da produção de biocombustíveis em conjunto ao tratamento de esgotos, é uma questão muito discutida atualmente. Tais sistemas fornecem uma via para a remoção de contaminantes químicos, orgânicos, metais pesados e patógenos em águas residuárias (MUÑOZ & GUIEYSSE, 2006; BRENNAN & OWENDE, 2010).
2.1 Cianobactérias
As cianobactérias estão classificadas no grupo Cyanophyta, possuem clorofila a, como também os fotossistemas I e II, ao contrário de outras bactérias fotossintetizantes, o que as permite realizar a fotossíntese na presença de oxigênio (REVIERS, 2002).
Essas algas são conhecidas como “algas azuis” devido à sua pigmentação, ou como “cianobactérias” por serem procariontes. Segundo microbiologistas, são classificadas no reino das Eubactérias. Nunca apresentam flagelos e por terem sua organização celular do tipo procarionte, não possuem núcleo nem organelas. Algumas espécies são estritamente fototróficas, na presença de luz; enquanto outras são de modo facultativo, podendo crescer na obscuridade utilizando uma fonte de carbono. O habitat das cianobactérias é extremamente variado, existindo espécies dulciaqüícolas e marinhas, tanto planctônicas quanto bentônicas, espécies aéreas encontradas na atmosfera, na poeira doméstica, sobre ou nos solos úmidos, e, possui uma grande diversidade nas condições que são suscetíveis de suportar, como neves, geleiras, águas termais ou as mais áridas regiões desérticas, onde provavelmente utilizam o orvalho para sobreviver (REVIERS, 2006). Exemplos de cianobactérias são a
10 Aphanothece microscopica Nagëli e a Phormidium sp., utilizadas na dissertação de mestrado.
2.2 Microalgas verdes
As microalgas verdes estão classificadas como algas presentes no Sub-reino Viridiplantae ou Chlorobiota. As algas verdes representam um grupo gigantesco, 550 a 570 gêneros com 16.000 a 17.000 espécies, sua estrutura vegetativa apresenta grande variedade nos níveis de organização, desde unicelulares, microalgas flageladas ou não, até talos morfologicamente complexos. Em sua maioria são microscópicas e dulciaqüícolas, mas podem ser encontradas em quase todos os ambientes, como em salinas, neves, desertos, cinzas vulcânicas, sobre solos ou casca de árvores (REVIERS, 2006).
Três das espécies de microalgas utilizadas na dissertação são classificadas como microalgas verdes, da classe Chlorophyceae stricto sensu, a Chlorella vulgaris, Scenedesmus obliquus e a Dunaliella tertiolecta; sendo as duas primeiras da ordem Chlorococcales, que são organismos unicelulares isolados com ou sem flagelos, coloniais ou multicelulares, sempre providos de uma parede; já a espécie Dunaliella tertiolecta está classificada na ordem Dunaliellales, que são organismos unicelulares biflagelados sem uma parede rígida, mas, contendo um revestimento mucilaginoso (REVIERS, 2006).
11 2.3 Diatomáceas
As algas e microalgas diatomáceas estão classificadas na divisão Ochrophyta, e são conhecidas como algas castanho-douradas. A espécie Phaeodactylum tricornutum, espécie utilizada na dissertação em questão, esta dentro da classe Bacillariophyceae. As diatomáceas possuem cerca de 250 gêneros, e em geral, de 10.000 a 12.000 espécies atuais, sendo que alguns autores estimam a existência de cerca de até 100.000 espécies. As diatomáceas apresentam em sua estrutura uma frústula silicosa, e além da clorofila a e c, os plastídeos contém fucoxantina e outras xantinas, como neofucoxantina, diadinoxantina e diatoxantina. A principal substância de reservas de tais organismos é a crisominarina, mas as células também podem acumular lipídeos, e de um modo geral, são desprovidas de flagelos e quase sempre autotróficas. As diatomáceas são amplamente distribuídas na natureza, depois das bactérias são os organismos aquáticos de distribuição mais ampla, exercendo papel importante como produtor primário (REVIERS, 2006).
3 Microalgas como fonte de bioprodutos
As microalgas são uma importante fonte produtora de pigmentos, como o β-caroteno, astaxantina clorofila a e ficocianina, e vitaminas de interesse comercial, tais como a vitamina B12 e vitamina E, que estão diretamente relacionadas com a síntese celular. Devido à grande diversidade no número de componentes que constituem a biomassa das microalgas, atualmente observa-se um emprego bem amplo na sua comercialização na alimentação natural, conhecida também por “health food”, bem como em suplementos alimentares nas mais diversas formas (BAKER & GUNTER, 2004; PULZ & GROSS, 2004; KIM et al., 2007).
A grande biodiversidade que resulta numa imensa variabilidade na composição química, aliada em determinados casos ao melhoramento genético e desenvolvimento
12 de tecnologias de cultivo em grande escala, vem permitindo o uso das microalgas nas mais diversas aplicações, como por exemplo, na produção de biomassa para a elaboração de alimentos e para a obtenção de produtos bioativos e medicinais, que possuem alto valor no marcado mundial (BOROWITZKA, 1999; MOLINA GRIMA et al., 2003). Segundo Borowitzka (1993), devido à grande diversidade na composição da biomassa, seguida da influência de fatores físicos, químicos e biológicos, a sua composição pode ter uma alteração significante pelas condições de cultivo, como por exemplo, a composição dos ácidos graxos. A biotecnologia microalgal tem se revelado muito útil para a produção de ácidos graxos poliinsaturados que são de interesse para a indústria de alimentos funcionais (PULZ & GROSS, 2004).
O Quadro 1 apresenta alguns usos comerciais da biomassa microalgal e seus compostos.
Quadro 1: Usos comerciais da biomassa microalgal.
Produtos Aplicações
Biomassa Biomassa Alimentos naturais
Alimentos funcionais Agricultura
Aditivos alimentares Enzimas Superóxido dismutase – SOD
Fosfoglicerato quinase – PGK Luciferase e Luciferína Enzimas de restrição Alimentos naturais Pesquisa Medicina
13 Quadro 1: Usos comerciais da biomassa microalgal (Continuação).
Polímeros Polissacarídeos Amido Ácido poli-beta-hidroxibutírico – PHB Aditivos alimentares Medicina Cosmético Corantes e Antioxidanes Luteína Beta-caroteno Vitamina C e E Xantofilas Aditivos alimentares Cosméticos Ácidos Graxos
Ácido araquidônico – ARA Ácido eicosapentaenóico - EPA Ácido docosahexaenóico - DHA Ácido linoléico - LA
Ácido gama-linolênico – GCA
Aditivos alimentares Produtos Especiais Toxinas Isótopos Esteróis Aminoácidos Peptídeos Medicina Pesquisa Fonte: BARBOSA (2003)
A composição bioquímica das microalgas pode mudar com suas taxas de crescimento ou também pelas condições ambientais, bem como com a fase dos ciclos de vida (RICHMOND, 1986). Por exemplo, no uso nutricional, duas características são importantes para avaliar o potencial das espécies utilizadas, a taxa de crescimento, em termos de números de células por biomassa e a composição bioquímica, visando a otimização em termos de nutrientes essenciais (ARAÚJO & GARCIA, 2005).
14 No caso de cianobactérias, alguns trabalhos pesquisaram o seu uso para várias funções, como as espécies Spirulina e Nostoc, empregadas na produção de proteínas, vitaminas, corante alimentar e suplemento alimentar humano e animal (CIFERRI, 1983; GAO, 1998; KAY, 1991). A disponibilidade de avançadas tecnologias em genética permitiu o uso das cianobactérias para obtenção de produtos específicos, com a finalidade de biodegradação de poluentes orgânicos em águas de superfície, para controle de insetos e outras finalidades (KOKSHAROVAT & WOLK, 2002).
Lebeau & Robert (2003) realizaram estudos metabólicos de diatomáceas e observaram acúmulo intracelular de lipídeos, particularmente eicosapentaenóico, para aplicações farmacêuticas bem como aminoácidos, utilizados na produção de cosméticos. No caso do metabolismo extracelular, estudou-se a liberação de pigmentos e antibióticos dentro do meio. Apesar da grande abundância na diversidade das diatomáceas, poucas espécies são cultivadas para a aquacultura e para a obtenção de produtos com relevância biotecnológica. Essas espécies são geralmente cultivadas em laboratório e utilizadas comercialmente para a produção de silicones, em aplicações tecnológicas na área de nanotecnologia, remediação de poluição ou alimentação em tanques aquáticos.
A clorofila a, pigmento fotossintético das microalgas, é o principal composto ativo fotoquimicamente, atuando como receptor de luz para a condução da fotossíntese, seu conteúdo está relacionado com a atividade fotossintética (MACINTYRE et al., 2002). Estudos citam que a eficiência fotossintética e o crescimento celular são associados com a quantidade de clorofila a (FLYNN et al., 1993; SILVA et al., 1998). A captação da luz pelo pigmento pode influenciar na produção de biomassa e no acúmulo de bioprodutos pela microalga cultivada sob diferentes condições. A determinação da clorofila a e a quantidade de lipídeos podem fornecer informações úteis sobre o status do crescimento durante o cultivo.
15 No início dos anos 90, a biomassa microalgal se mostrou uma boa candidata na fabricação de proteínas, que apresentava uma certa insuficiência para o abastecimento comercial (BECKER, 2004; CORNET, 1998). O carboidrato encontrado na microalga pode se apresentar na forma de amido, glicose, açúcares e outros polissacarídeos.
4 Microalgas como fonte de lipídeos
A produção de biodiesel usando lipídeos microbianos, organismos unicelulares, também chamados de “single cell oils (SCO)”, tem atraído grande atenção no mundo inteiro. Embora exista a presença de óleos em microrganismos, como microalgas, bacilos, fungos e leveduras, nem todos podem ser utilizados para a produção de biodiesel, a produção comercial de SCO teve início após o ano de 1995 (RATLEDGE & COHEN, 2008).
Os óleos provenientes de microalgas se diferem da maioria dos óleos vegetais por serem ricos em ácidos graxos poliinsaturados com quatro ou mais duplas ligações (BELARB et al., 2000). Os triaglicerídeos são os lipídeos mais comumente acumulados e podem constituir acima de 80% da fração total dos lipídeos nas cianobactérias (KLYACHKO-GEVAVICH, 1974; TORNABENE et al., 1983)
As microalgas além de terem um crescimento extremamente rápido, comparando-se com outras oleaginosas, ainda são ricas em óleos. Nem todas as espécies podem ser consideradas como satisfatórias para a produção de biodiesel, mas os óleos adequados para essa finalidade parecem comumente em suas células. O uso das microalgas ainda oferece a vantagem de não comprometer a produção de alimentos (CHISTI, 2007b). O Quadro 2 apresenta algumas espécies produtoras de lipídeos e suas respectivas quantidades em massa seca.
16 Quadro 2: porcentagem lipídica em microalgas.
Espécies Conteúdo de óleo (% em massa seca)
Botryococcus braunii 25 – 75 Chlorella sp. 28 – 32 Crypthecodinuim cohnii 20 Cylindrotheca sp. 16 – 37 Dunaliella primolecta 23 Isochysis sp. 25 – 33 Monallanthus salina >20 Nannochloris sp. 20 – 35 Nannochloropsos sp. 31 – 68 Neochloris oleoabundans 35 – 54 Nitzschia sp. 45 – 47 Phaeodactylum tricornutum 20 – 30 Schizochytrium sp. 50 – 77 Tetraselmis sueica 15 – 23 Fonte: CHISTI (2007b)
A cultura de microalgas pode ser vista como uma alternativa para a produção de ácidos graxos poliinsaturados, esses cultivos também apresentam uma série de vantagens quando comparados com fontes convencionais (MEDINA et al., 1998).
17 Além das microalgas, outros microrganismos, como leveduras e fungos, estão sendo estudados para a produção de lipídeos (CERTIK & SHIMIZU, 1999).
Microalgas oleaginosas tendem a alojar sua fonte de energia na forma de lipídeos conforme a idade da cultura (YONGMANTCHAI & WARD, 1989). O armazenamento de lipídeos pelas microalgas pode ser bem elevado em relação à quantidade total dos demais compostos, os lipídeos são principalmente estocados nos vacúolos como material de reserva (BOROWITZKA, 1994).
Essa característica de estocagem de grandes quantidades de lipídeos pode ser explicada pela teoria da evolução, onde determinadas espécies foram favorecidas pelo acúmulo de reserva energética para atravessar longos períodos (FALKOWSKI, 1997).
As cianobactérias acumulam lipídeos em suas membranas tilacóides, que são associadas com altos níveis de fotossíntese e altas taxas de crescimento. Deste modo, bactérias fotossintetizantes possuem a vantagem natural para a produção de altas taxas de lipídeos. Além disso, cianobactérias são procariontes, podendo ser aperfeiçoadas através de manipulações genéticas muito mais facilmente que microalgas eucarióticas (VERMAAS, 1998).
O total da fração lipídica em cianobactérias pode variar de 1% a mais de 70% em peso seco, podendo atingir até 90% sob determinadas condições. A maioria dos lipídeos encontrados nas microalgas são ésteres de glicerol e ácidos graxos, contendo entre 12 e 22 carbonos, podendo ser tanto saturados quanto mono ou poliinsaturados (CASSAN et al., 2006).
Algumas espécies apresentam maior porcentagem de ácidos graxos na fase estacionária enquanto outras, na fase exponencial. Geralmente a porcentagem total aumenta na fase estacionária tanto para ácidos graxos saturados, monoinsaturados quanto para poliinsaturados (PRATOOMYOT et al., 2005). No cultivo das microalgas,
18 a taxa de crescimento e a concentração de ácidos graxos poliinsaturados podem ser potencializados pelo uso de fontes de carbono suplementares (CERÓN GARCÍA et al., 2005).
Miao & Wu (2006) estudaram a microalga Chlorella protothecoides para cultivos heretotróficos e autotróficos; em cultivos heterotróficos, a concentração de lipídeos contidos nas células chegou a 55,2% aproximadamente, já em cultivos autotróficos, o estudo mostrou uma concentração de 14,65%. Os autores ainda verificaram maiores concentrações de lipídeos e carboidratos no cultivo heterotrófico, e de proteínas em cultivo autotrófico.
5 Sistemas para o cultivo de microalgas
O cultivo de microalgas pode ser realizado em diversos sistemas, variando-se o seu volume. O sistema de cultivo por empresas não possuem muita sofisticação, sendo em alguns casos em tanques abertos sem total controle de parâmetros ambientais, ocasionando problemas de produção. Esses aspectos levaram a um aumento nos estudos de biotecnologia microalgal, resultando no recente uso de fotobiorreatores, que são sistemas onde controla-se os parâmetros ambientais, viabilizando a produção industrial de produtos de alto valor comercial (BOROWITZKA, 1993; RODOLFI et al., 2009).
Autores como Cohen (1986) e Richmond (1990) citam algumas vantagens para justificar a produção microalgal em larga escala, como o crescimento satisfatório em regiões com extremas condições climáticas. A realização de cultivos com água marinha ou de estuários, ou até com água proveniente de diversos processos de produção, como agropecuária, industrial e dejetos domésticos. A indução da sintetização e acúmulo de altas concentrações de compostos apresentam um elevado valor comercial, como carboidratos, proteínas, lipídeos entre outras substâncias
19 através da manipulação das condições ambientais de cultivo, como por exemplo, a temperatura, luz, pH e nutrientes. Tais cultivos são considerados sistemas biológicos eficientes na utilização da energia solar para a produção de matéria orgânica, obtendo maior produtividade de biomassa comparando-se com espécies terrestres. A maioria das microalgas possui um ciclo de vida completo em poucas horas, fator que favorece a seleção de cepas e o melhoramento genético. O fator de serem unicelulares assegura à biomassa uma homogeneidade na composição bioquímica, ao contrário de plantas terrestres, onde compostos de interesse se localizam em partes específicas como folhas, sementes, raízes e frutos.
Quando falamos em nutrição, apesar das diferenças entre as espécies, para um crescimento ótimo, as microalgas têm necessidade de uma série de nutrientes. Para essa boa nutrição elas necessitam de macronutrientes e micronutrientes, como macronutrientes temos C, N, O, H e P, que são considerados como essenciais, e também Ca, Mg, S e K. No caso dos micronutrientes, temos Fe, Mn, Cu, Mo e Co; algumas espécies também necessitam de baixas concentrações de vitaminas (GUILLARD, 1975).
O carbono constitui em torno de 50% da biomassa microalgal, e em cultivos, pode ser considerado como o macronutriente mais importante, podendo ser o componente limitante no cultivo (ABALDE et al., 1995). A fonte de carbono mais utilizada pelas microalgas é o dióxido de carbono (CO2), provavelmente por ter uma difusão rápida da água para o interior das células, sendo usado diretamente em processos de fixação (RAVEN, 1998).
Segundo Wen e Chen (2000), apesar de o dióxido de carbono ser a principal fonte de carbono empregada em cultivos de microalgas, muitos estudos comprovam um bom crescimento utilizando compostos orgânicos como aminoácidos, glicose, acetatos, bem como outros substratos.
20 Existem diferentes métodos de cultivos, como o autotrófico também chamado de fotoautrófico, que consiste no emprego de luz como fonte energética para a fixação de CO2 pela oxidação de substratos; o heterotrófico, que é o emprego de compostos orgânicos sem a utilização de luz, onde o carbono orgânico é utilizado como fonte energética e para a construção de biomassa; e o mixotrófico, utilização tanto de uma fonte luminosa quanto de substrato orgânico como fonte de energia, sendo a fotossíntese a principal fonte energética (CHOJNACKA & MÁRQUEZ-ROCHA, 2004).
O cultivo mixotrófico pode se apresentar como o processo mais eficiente para a produção de biomassa, já que o uso simultâneo do dióxido de carbono e do carbono orgânico implica em uma economia na energia gasta para a síntese de todo o aparato fotossintético e para a fixação de carbono (LEE, 2004). Para uma escolha correta do meio de cultivo a ser utilizado, é necessário levar em consideração o tipo de cepa utilizada e o produto desejado, como biomassa, ácido graxo e pigmentos, entre outros (JIANG et al., 1999).
Tratando-se de cultivos fotoautróficos, vê-se que a quantidade de energia luminosa recebida através da fotossíntese irá repercutir na quantidade de carbono a ser fixado, determinando a taxa de crescimento e a produção de biomassa (TZOVENIS et al., 2003). Estudos realizados por Jacob-Lopes et al. (2009) utilizando fotobiorreatores, apresentaram valores representativos para a produção da biomassa bem como para a taxa de fixação de dióxido de carbono.
Borowitzka (1999) cita que microrganismos fotossintéticos são normalmente cultivados em tanques abertos usando luz natural ou artificial, mas estes métodos requerem uma larga área de cultivo e sofrem várias desvantagens, incluindo dificuldade no controle das condições de cultivo. Considerando tais desvantagens, as pesquisas para o uso de fotobiorreatores começaram a deslanchar.
21 A definição de fotobiorreatores pode ser descrita por sistemas utilizados para o desenvolvimento de reações fotossintéticas e pode ser classificado através do tipo de escoamento, que se trata da mistura completa ou pistonada; através da sua configuração, aberto ou fechado; através do modo de alimentação, contínua ou descontínua; e, pelo tipo de cultivo aplicado, células livres ou imobilizadas (MUÑOZ & GUIEYSSE, 2006).
Chisti (2008) cita que a produção de biodiesel através de microalgas requer grandes quantidades de biomassa, portanto, um crescimento em fotobiorreator de grande escala. Muitos reatores estão sendo pesquisados para tal objetivo, mas o reator tubular tem apresentado maior sofisticação. Esses reatores geralmente consistem em tubos retos e transparentes, de vidro ou plástico, próprios para captar a luz solar.
Fotobiorreatores de configuração fechada podem reduzir as chances de contaminação, favorecendo o crescimento da microalga e melhorando o controle da variação de temperatura e da intensidade luminosa. Contudo, tais sistemas possuem desvantagens obvias, como por exemplo, a dificuldade de escalonamento e elevados custos devida sua complexidade de configuração e construção. Além disso, a limitação luminosa não pode ser superada por completo, pois a penetração luminosa é inversamente proporcional à concentração celular (WEN & CHEN, 2003; JANSSEN et al., 2001).
Um estudo desenvolvido por Jacob-Lopes et al. (2009) cita que o desenvolvimento de fotobiorreatores para seqüestro de CO2 é uma tecnologia em potencial para aplicação em países tropicais, com elevada intensidade luminosa disponível. Porém, para se prever taxas reais de remoção de CO2 e produção de biomassa em tais sistemas, a falta de disponibilidade da energia luminosa durante parte do tempo num período de 24 horas deve ser considerada, o que foi constatado
22 para a espécie estudada, Aphanothece microscópica Nagëli, que foi submetida a diferentes condições de fotoperíodo.
6 Biodiesel
A definição de biodiesel segundo a Lei de nº 11.097 de 13 de janeiro de 2005, é que um “biodiesel é derivado de biomassa renovável para uso em motores e combustão interna com ignição por compressão ou, conforme o regulamento, para geração de outro tipo de energia, que possa substituir parcial ou totalmente combustíveis de origem fóssil”.
Em geral, o biodiesel é derivado de fontes renováveis como óleos vegetais, o Quadro 3 apresenta oleaginosas que podem ser utilizadas na produção de biodiesel. Ele é constituído por cadeias de ésteres metílicos de ácidos graxos, e é utilizado na substituição do diesel ou no uso de misturas binárias diesel/biodiesel, que não são caracterizadas como biodiesel. Dependendo da matéria-prima utilizada, o biodiesel pode apresentar maior ou menor número de ácidos graxos insaturados (KNOTHE, 2005). Os óleos vegetais utilizados para tal finalidade são selecionados a partir de vários fatores, como o desempenho como combustível, propriedades de armazenamento, disponibilidade local, viabilidade econômica, entre outros. Os óleos mais utilizados são os de palma, em países tropicais, o óleo de girassol, na Europa, e gorduras animais e soja nos Estados Unidos. O Brasil apesar de ser o segundo maior produtor de soja, possui programas que buscam favorecer o uso do óleo de mamona, pelo fato de o biodiesel a partir do óleo de soja ser um produto já estabelecido no marcado internacional (HAAS & FOGLIA, 2005).
23 Quadro 3: Principais ácidos graxos contidos em algumas oleaginosas.
Biodiesel Ácido Palmítico Ácido Esteárico Ácido Oléico Ácido Linoléico
Girassol 5,6% 3,6% 42,4% 47,8% Milho 13,6% 2,8% 34,9% 47,9% Algodão 23,1% 2,8% 18,4% 54,3% Arroz 19,8% 2,4% 40,2% 36,4% Canola 6,0% 3,2% 67,7% 22,2% Soja 12,2% 4,9% 29,8% 52,5% Fonte: KNOTHE (2005).
Segundo Neto & Rossi (2000) no início do século XX iniciaram-se os testes de utilização do biodiesel como combustível alternativo. E na época em que esses autores desenvolveram tal pesquisa, a comercialização do biodiesel encontrava obstáculos tecnológicos como problemas de ignição. Os mesmos autores citam que o biodiesel pode ser caracterizado pela ausência de enxofre e aromáticos; por um número de cetano elevado; pelo teor de oxigênio próximo a 11%; pela elevada viscosidade; por um ponto de fulgor maior que o do diesel convencional; a um direcionamento a mercado específico, especialmente voltado a atividades agrícolas e pelas vantagens ambientais no caso do biodiesel proveniente de óleos vegetais e gorduras.
O biodiesel tem sua produção desvalorizada comparando-se com o diesel, pois o custo do material lipídico é de 70 a 85% do custo total da produção (HAAS & FOGLIA, 2005).
Qualitativamente, o biodiesel extraído de microalgas é similar ao produzido a partir de plantas oleaginosas, entretanto, as principais diferenças estão relacionadas à composição predominantemente poliinsaturada dos ácidos graxos, que podem reduzir a estabilidade do biodiesel. Por outro lado estes compostos por terem pontos de
24 congelamento inferiores quando comparado aos ácidos graxos monoinsaturados, representam um benefício adicional para o biodiesel usado em climas frios. Outro fator a ser considerado nesta comparação, está relacionado às questões de rendimento, que de acordo com estimativas de escala laboratorial podem ser até 200 vezes maior quando comparado às oleaginosas vegetais (SCRAGG et al., 2003; MIAO & WU, 2006).
Existem quatro vias primárias para a fabricação de biodiesel, uso direto, microemulsão, pirólise e transesterificação (MA e HANNA, 1999). A transesterificação é o método mais usado para se reduzir a alta viscosidade dos óleos vegetais, mas outros métodos, como os já citados, também são bem conhecidos no uso de misturas binárias com petrodiesel, a Figura 1 apresenta o processo de transesterificação (GERPEN & KNOTHE, 2005).
Figura 1: reação de transesterificação. (R representa uma mistura de várias cadeias de ácidos graxos).
O processo de transesterificação não altera a composição do ácido graxo já que essa composição representa um importante papel em alguns parâmetros críticos
25 para o biodiesel, como o número de cetano e propriedades de congelamento (RAMOS et al., 2009).
O álcool mais utilizado no processo de transesterificação é o metanol, pelo seu custo ser mais acessível, mas no Brasil, o etanol possui um valor ainda mais baixo, viabilizando a sua utilização. A transesterificação pode ser realizada tanto por catálise básica quanto ácida. Esse processo constitui numa reação reversível, mas pode ser considerada negligenciável no caso da produção de biodiesel a partir de óleos vegetais, pelo fato de o glicerol formado não ser miscível no produto (GERPEN & KNOTHE, 2005).
Os compostos aromáticos se apresentam entre 25 e 35%, apesar de tais compostos contribuírem para o aumento de energia por litro do diesel, podem ser responsáveis pelo baixo número de cetano, pelo aumento das emissões de NOx e de particulados, já o biodiesel não contém esses compostos aromáticos, o que significa um fator positivo para seu uso (GERPEN, 2005).
McCormick & Alleman (2005) citam que uma propriedade significativa do biodiesel é a de reduzir emissões de particulados totais no motor, aumentando o seu rendimento. A exploração de vias para a redução do alto custo do biodiesel é o maior fator a ser desenvolvido, principalmente em métodos para a minimização do uso de materiais caros (MIAO & WU, 2006).
7 Parâmetros de Qualidade do Biodiesel
A qualidade do biodiesel é na maioria dos casos influenciada por diversos fatores, como o processo empregado na produção, o uso de materiais adicionais, composição dos ácidos graxos da matéria prima utilizada e a qualidade dessa matéria prima. A qualidade deve atender a padrões apropriados, como as normas de
26 padronização do biodiesel, como a ASTM D6751 dos Estados Unidos, a norma européia EN14214, a norma australiana de biodiesel aprovada em 2000 e a norma da Agência Nacional de Petróleo ANP255, divulgada em setembro de 2003. Estas especificações devem ser atendidas inclusive no caso do uso de biodiesel em misturas com diesel de petróleo. O biodiesel tendo as especificações atendidas pode ser utilizado na maioria dos motores, sem qualquer modificação no motor em questão. No caso do uso do biodiesel em misturas com o diesel de petróleo existem alguns métodos analíticos desenvolvidos por organizações ligadas à oleoquímica, que podem ser utilizados como parâmetros de qualidade, como os mencionados pela American Oil Chemist’s (GERPEN & KNOTHE, 2005).
Na maior parte da Europa e dos Estados Unidos, o biodiesel é utilizado em misturas com o petrodiesel, já na Alemanha, ele é vendido para ser utilizado puro, esse fato gerou a necessidade de um controle mais rigoroso na qualidade do biodiesel produzido, surgindo então a AGQM (ArbeitsGermeinschaft Qualitäts Management Biodiesel), a Associação para a Gestão da Qualidade do Biodiesel, fundada no ano de 1999 (FISCHER, 2005).
Comparando o diesel e o biodiesel conforme a formação de cristais, podemos citar que o diesel contém hidrocarbonetos de cadeias longas, que em baixas temperaturas podem ocasionar aglomeração de cristais, que são comumente formadas em temperaturas normais, ocasionando entupimento dos filtros de combustível, resultando em problemas no motor. Já no biodiesel, esse fenômeno é conseqüência de ácidos graxos saturados, que a partir da produção de ésteres metílicos ocasionam cristalizações em diferentes temperaturas para cada tipo de óleo ou gordura utilizada (GERPEN, 2005).
Lee et al. (2002) cita que desde a década de 30 alguns óleos vegetais vem sendo testados como combustíveis alternativos, mas o desempenho dos motores
27 acaba sendo comprometido em determinados casos devido a alta viscosidade do material utilizado.
Outra característica que pode ser prejudicial ao motor é a temperatura inicial de cristalização dos óleos, que é conhecida como ponto de névoa, podendo influenciar negativamente no sistema de alimentação do motor e no filtro de combustível, principalmente quando o motor é acionado sob condições de baixa temperatura. Por esta razão o uso de óleos vegetais in natura em motores de ciclo diesel é desfavorecido. Um processo utilizado para evitar a solidificação parcial dos óleos consiste em um pré-aquecimento, ou no uso de aditivos que proporcionam melhor fluidez (NETO & ROSSI, 2000).
Lee et al. (2002), cita que alguns parâmetros devem ser testados para a avaliação do biodiesel, tais como os teores de ácidos graxos livres – FFA (free fatty acids); de triacilgliceróis – TAG; de diacilgliceróis – DAG; de monoacilgliceróis – MAG; a composição dos ácidos graxos – FAME (fatty acid methyl esters); os teores de glicerol e de água.
Sendo que as determinações de glicerol, MAG, DAG, TAG e FAME podem ser realizadas sem maiores problemas por cromatografia gasosa (CG), sendo que para a análise dos FAME’s, os ácidos graxos precisam ser convertidos em ésteres metílicos (LEE et al., 2002).
Segundo Knothe et al. (1996), o valor do índice de iodo ter sido estabelecido por padrões internacionais, permite a avaliação das condições de insaturação dos ésteres metílicos, mas não resolve problemas com relação à posição das duplas ligações, fator que influencia no número de cetano.
A qualidade do biodiesel pode ser analisada através de alguns parâmetros como o número de cetano, o ponto de entupimento de filtro a frio, as emissões de
28 exaustão, o índice de iodo, índice de saponificação, os ésteres contidos no biodiesel, entre outros (KNOTHE, 2005).
O parâmetro número de cetano (NC), descreve a qualidade de ignição, é um conceito similar à escala de octanagem, utilizada na padronização da gasolina. O número de cetano tem sua qualidade influenciada pela composição de ácidos graxos, quanto maior o número de ramificações, mais alto será o número de cetano. Este parâmetro é medido a partir do tempo de retardamento da ignição, quanto menor o tempo de retardamento, mais elevado o número de cetano. O valor do número de cetano não pode ser muito baixo, pois pode acarretar vários inconvenientes, como aquecimento lento do motor, falhas, combustão incompleta, entre outros problemas. Já no caso de um valor muito elevado, pode-se acarretar na emissão de fumaça e combustão incompleta, devido a uma combustão prematura. As especificações mais utilizadas para a análise deste parâmetro são a norma americana ASTM D6751, que especifica um número de cetano mínimo de 47 e a norma européia EN14214, que cita como apropriado um valor de no mínimo 51 (KNOTHE, 2005).
A estabilidade de oxidação é a questão que mais afeta o uso do biodiesel por causa da presença de poliinsaturações. A estabilidade dos compostos dos ácidos graxos é influenciada por fatores como presença de ar, temperatura, metais traços, peróxidos, luz, aspectos estruturais dos próprios compostos, principalmente a presença de duplas ligações. A estabilidade de oxidação diminui com o aumento de ésteres de metil poliinsaturados contidos no biodiesel (RAMOS et al., 2009).
Um parâmetro muito conhecido é o índice de iodo, que pode ser descrito pelo número de duplas ligações contidas nos ácidos graxos, ou seja, medição do grau de saturação. Em seus estudos McCormick & Alleman (2005) verificaram que o biodiesel de maior grau de saturação apresentou menores índices de emissões de NOx e os mesmos níveis de material particulado.
29 Ramos et al. (2009), descreve o índice de iodo como a medida de insaturações totais numa mistura de ácidos graxos. É expresso em gramas de iodo qual reage com 100g da respectiva amostra quando adicionado iodo a restrições duplas. Os valores de iodo de óleos vegetais e animais são aproximadamente idênticos aos ésteres de metil correspondentes. A limitação de ácidos graxos insaturados é necessário devido ao fato do alto aquecimento dos ácidos graxos insaturados resultantes da polimerização de glicerídeos, que pode acarretar à formação de depósitos ou para a deterioração na lubrificação.
O ponto de entupimento de filtro a frio (PEFF), é um parâmetro muito estudado, pois os ácidos graxos como o palmítico (16:0) e o esteárico (18:0), se apresentam como limitantes, podendo prejudicar o fluxo a frio do biodiesel, ao contrário dos ácidos graxos poliinsaturados, que por outro lado possuem o inconveniente de serem mais sensíveis quanto à oxidação. A baixa porcentagem de ácidos graxos poliinsaturados também pode ocasionar menores níveis de emissões de óxidos de nitrogênio (BRINGE, 2005). Knothe (2005) cita que o ponto de entupimento de filtro a frio, é geralmente determinado pelo método ASTM D6371, e é definido como a menor temperatura em que 20mL de óleo passa com segurança através do filtro em um tempo de 60 segundos, e também cita um PEFF de 6 para a azeitona, de -2 para a soja e o girassol, de 9 para o sebo, de -1 para a fritura usada, de 0 para a graxa de descarte e de -9 para a azeitona de descarte. Tal parâmetro pode ser correlacionado com outro parâmetro, o fator do comprimento da cadeia saturada. Os ésteres insaturados não são incluídos nessa correlação, pelo fato de terem seus pontos de fusão significativamente baixo comparados aos ésteres saturados. (RAMOS et al., 2009).
30
CAPÍTULO 3
31 1 Cultivo e origem das espécies
Seis espécies foram utilizadas, a cianobactéria Aphanothece microscopica Nagëli, doada pela Universidade Federal do Rio Grande (UFURG), as microalgas Chlorella vulgaris (UTCC90), Dunaliella tertiolecta (UTCC420), Scenedesmus obliquus (UTCC5) e a diatomácea Phaeodactylum tricornutum (UTCC162), obtidas da Coleção de Culturas de Algas e Cianobactérias (UTCC) da Universidade de Toronto, e a espécie Phormidium sp., isolada do Deserto Cuatro Sienegas do México. As culturas estoque foram propagadas e mantidas em meio sintético, nas condições de 25ºC, 1klux de luminosidade, fotoperíodo de 12h e agitação constante. Os meios sintéticos utilizados foram o BGN (RIPKA et al., 1979) para a Aphanothece e Phormidium, BBM (STEIN, 1973) para a Chlorella e Scenedesmus, ESAW (HARRISON et al., 1980) para a Dunaliella, e Ukeles (GUILLARD & RYTHER, 1962), para a Phaeodactylum. As composições químicas dos meios de cultivo estão descritas abaixo:
BGN:
K2HPO4 (0,03g.L-1), MgSO4 (0,075g.L-1), CaCl2.2H2O (0,036g.L-1), citrato de amônio e ferro (0,0006g.L-1), Na2EDTA (0,001g.L-1), NaCl (0,00072g.L-1), NaNO3 (0,015g.L-1), ácido cítrico (0,0006g.L-1), Na2CO3 (1,5g.L-1), metais traços: [H3BO3 (0,0028g.L-1), MnCl2.4H2O (0,0018g.L-1), ZnSO4.7H2O (0,00022g.L-1), Na2MoO4.2H2O (0,00039g.L-1), CoSO4.6H2O (0,00004g.L-1)].
BBM:
KH2PO4 (0,175g.L-1), CaCl2.2H2O (0,025g.L-1), K2HPO4 (0,075g.L-1), Na2EDTA (0,01g.L-1), MgSO4.7H2O (0,075g.L-1), NaNO3 (0,25g.L-1), NaCl (0,025g.L-1), FeSO4.7H2O (0,0049g.L-1), H3BO3 (0,115g.L-1).
32 ESAW:
NaCl (24,5g.L-1), MgCl2.6H2O (9,8g.L-1), K2SO4 (0,85g.L-1), CaCl2.2H2O (0,53g.L-1), Na2SO4 (3,2g.L-1), 0,1L de solução estoque I: [NaNO3 (135,98g.L-1), Na2HPO4 (14,2g.L -1
), NaHCO3 (42g.L-1)]; 0,1L de solução estoque II: [Na2EDTA (2,29g.L-1), FeCl3.6H2O (0,62g.L-1), CuSO4.5H2O (0,0052g.L-1), ZnSO4.7H2O (0,0087g.L-1), CoCL2.6H2O (0,002g.L-1), MnCl2.4H2O (0,036g.L-1), Na2Mo4 (0,0012g.L-1)].
Ukeles:
NaCl (24,512gL-1), CaCl2.2H2O (0,53g.L-1), K2SO4 (0,85gL-1), MgCl.6H20 (9,8g.L-1), Na2SO4 (3,2g.L-1), 0,1L de solução estoque: [NaH2PO4 (2,46g.L-1), citrato de amônio e ferro (0,98g.L-1), ZnSO4.7H2O (0,057g.L-1), CuSO4.5H2O (0,005g.L-1), NaNO3 (100g.L -1
), Na2EDTA (2,0g.L-1), MnCl2.4H2O (0,198g.L-1), CoCl2.6H20 (0,0048g.L-1), Na2MoO4.2H2O (0,048g.L-1)].
2 Fotobiorreator
O diagrama do aparato experimental está expresso na Figura 2. O fotobiorreator de coluna de bolhas foi construído em vidro de 4mm de espessura, com um diâmetro interno de 7,5cm e uma altura de 75cm, perfazendo um volume nominal de trabalho de 3,0L. O sistema de dispersão de ar consiste em um difusor de 1,5cm de diâmetro localizado no centro da coluna. O reator está localizado em uma câmara de fotoperíodo, que contem 16 lâmpadas fluorescentes de 20W conectadas em paralelo. Diferentes números de lâmpadas em cada lado da câmara são combinados de forma a ajustar a intensidade luminosa desejada. A injeção de ar contaminado com dióxido de carbono no fotobiorreator foi provida através de ar comprimido e dióxido de carbono industrial obtido através de um cilindro. A vazão de ar, CO2 e da mistura entre os gases foi controlada por 3 rotâmetros.
33 Figura 2: Diagrama experimental.1:Câmara de fotoperíodo; 2: Analisador de pH, temperatura e CO2; 3: Sensores de pH, temperatura e CO2; 4: Fotobiorreator; 5: Sistema para controle da vazão e mistura de gases; 6: Difusor de gases. Dimensões em mm.
3 Produção de biomassa e biofixação de CO2
A produção de biomassa e fixação de dióxido de carbono foi conduzida em fotobiorreatores, operando em regime intermitente, alimentados com 3,0L de meio sintético. As condições dos experimentos foram: concentração celular inicial de 100mg.L-1, reator isotérmico, operando em temperaturas de 30ºC, intensidades luminosas constante de 11klux e aeração contínua de 1VVM com injeção da mistura de ar com 15% dióxido de carbono. As condições operacionais utilizadas foram padronizadas em estudos anteriores (JACOB-LOPES et al., 2008a)
3.1Obtenção dos parâmetros cinéticos
A concentração celular, pH do meio de cultivo e consumo de CO2 foram monitorados a cada 12h, durante as fases de crescimento dos microrganismos. Os perfis de concentração celular e seqüestro de CO2 em função do tempo foram
34 avaliados pelos seguintes parâmetros cinéticos: produtividade volumétrica de biomassa (PX, mg/L.h), produtividade volumétrica de óleo (PL, mg/L.h) e capacidade de absorção de dióxido de carbono (rCO2, mg/L.min).
Nesta etapa a concentração celular foi avaliada gravimetricamente através da filtração de 10mL de meio de cultura em filtro de diâmetro 0,45µm, seco a 60oC por 24 horas. A concentração de dióxido de carbono livre dissolvido na fase líquida foi determinada através de um sensor polarográfico InPro5000 Series (Metler Toledo, Suíça) e avaliada através do método dinâmico, no qual a transferência de CO2 será interrompida a cada 12h de cultivo, e a concentração de dióxido de carbono livre medida como uma função do tempo por um período de 5 min, com tomadas de dados a cada 0,5 min. As estimativas da dessorção de dióxido de carbono foram realizadas através de experimentos controle, na ausência do microrganismo, para cada condição experimental em função de concentração de CO2, pH, temperatura e agitação envolvidas no sistema. Os dados de concentração de dióxido de carbono dessorvido da fase líquida serão registrados em regime transiente, a cada 0,5min, por um período de 5 min. As duas séries de dados experimentais (absorção e dessorção) obtidas foram ajustadas cineticamente, visando a determinar as taxas de eliminação do sistema, de acordo com metodologia descrita por Jacob-Lopes et al., (2008b).
4 Análise da matéria graxa produzida
4.1 Secagem da biomassa
A biomassa foi separada do meio de cultivo por decantação, seguido de centrifugação. Posteriormente, a pasta obtida foi liofilizada em um sistema Liobras (Modelo L101), nas condições -40ºC e pressão de 50µHg.
35 4.2 Extração e determinação quantitativa do lipídeo
Para a extração de lipídeos totais da biomassa, foi utilizado o método de Bligh e Dyer (1959) modificado, levando-se em conta as proporções entre os solventes metanol e clorofórmio, e água destilada (2:1:0.8). Os lipídios da biomassa seca foram extraídos após secagem e trituração em almofariz. A quantidade de lipídeos foi determinada por gravimetria a partir do extrato total de clorofórmio, evaporando-se o solvente em atmosfera de nitrogênio e posteriormente seco em estufa e submetido a peso constante.
4.3 Preparação dos ésteres metílicos
A saponificação e esterificação (metilação) do extrato lipídico seco foram realizadas através do método de Hartman & Lago (1976), seguido da análise qualitativa e quantitativa através de cromatografia.
4.4 Determinação da composição dos ácidos graxos por cromatografia gasosa e espectrometria de massas (CG-MS)
Os perfis de ácidos graxos das espécies foram determinados usando-se um cromatógrafo da marca VARIAN 3600 CX (Varian, Palo Alto, CA, USA), equipado com um detector de ionização de chama e coluna capilar modelo DB-FFAP Megabore (fase estacionária: ácido nitrotereftálico modificado por polietileno glicol). A coluna possui 30m de comprimento e 0,25mm de diâmetro, com filme de 0,25µm de espessura. O gás de arraste foi o nitrogênio a uma vazão de 2mLmin-1 e 15psi. A temperatura do injetor e do detector foi de 250ºC e 270 ºC, respectivamente. A temperatura inicial da coluna foi de 120ºC, aumentando em seguida de 120 a 170ºC a 5ºCmin-1, permanecendo a 170ºC por um minuto; em seguida a temperatura foi aumentada
36 novamente de 170 a 190ºC a 2ºCmin-1, permanecendo por 2 minutos; e finalizando, foi aumentada de 190 a 220ºC a 5ºCmin-1, permanecendo por 20 minutos, totalizando um tempo total da corrida de 32 minutos. A quantidade de amostra injetada foi de 1µL. Os ácidos graxos foram identificados pela comparação dos tempos de retenção com padrões da marca SupelcoTM37 (FAME mix, St. Louis, MO, USA), previamente injetados no equipamento, e quantificados por normalização de áreas, através do software Varian Star 4.51. A identificação foi confirmada por espectrometria de massas, utilizando o mesmo equipamento nas mesmas condições e mesmo volume de injeção. Os picos foram identificados usando espectrômetro de massas (MS Saturn 2000 Varian) através do sistema de ionização por impacto de elétrons (EI) a 70kV, e analisador de massas por aprisionamento de íons (Íon Trap), o espectro de massas de cada pico foi examinado utilizando o software Workstation 6.6 (Palo alto, CA, USA).
5 Parâmetros para a determinação da qualidade do biodiesel
5.1 Número de cetano (NC)
O número de cetano (NCem) de cada ácido graxo é estimado pela Eq. (1), onde IS é o índice de saponificação Eq. (2), II é o índice de iodo Eq. (3) e os valores 46.3, 5458 e 0.225, são constantes (KRISNANGKURA, 1986).
NCem = 46,3 + 5458 – 0,225 x II (1) IS IS = ∑ (560 x N) (2) M II = ∑ (254 x D x N) (3) M
37 Onde: N = porcentagem de cada ácido graxo
M = massa molecular de cada ácido graxo D = número de duplas ligações
em = éster de metil
O número de cetano do biodiesel é obtido através da Eq. (4), onde Xem é a porcentagem e o NCem o número de cetano de cada ácido graxo (RAMOS et al., 2008).
5.2 Grau de insaturação (GI)
O parâmetro grau de insaturação é calculado a partir da equação empírica Eq. (5), considerando-se a soma da quantidade de ácidos graxos saturados e insaturados contidos nos componentes do biodiesel (RAMOS et al., 2009).
5.3 Fator do comprimento da cadeia (FCC) e ponto de entupimento de filtro a frio (PEFF)
O fator de comprimento de filtro a frio é o parâmetro calculado a partir da Eq. (6), que leva em consideração a composição de ácido graxos contidos na mistura, atribuindo maior peso aos ácidos graxos saturados de cadeia longa. O FCC foi correlacionado com o parâmetro ponto de entupimento de filtro a frio (PEFF) descrito pela Eq. (7) (RAMOS et al., 2009).
NC = ∑ Xem(%) x NCem (4)
GI = (% monoinsaturados) + 2 x (% poliinsaturados) (5)
38 Onde: C16, C18, C20, C22 e C24 representam os percentuais em massa de cada um dos ácidos graxos e os números 3,1417 e 16,477 são constantes.
6 Análise estatística
6.1 Análise de variância (ANOVA)
A análise de variância (ANOVA) a partir do teste de Tukey utilizando o software Statistica 7.0, foi utilizada para analisar os parâmetros cinéticos de crescimento, produção de gordura e seqüestro de CO2 para as diferentes microalgas avaliadas.
6.2 Análise multivariada de agrupamento
Análise multivariada de agrupamento foi utilizada para determinação da similaridade entre as fontes de biodiesel. As análises foram realizadas utilizando o software Statistica 7.0.
39
CAPÍTULO 4
40 1 Produção de biomassa e seqüestro de CO2
A multiplicação celular associada ao aumento da biomassa deve ser considerada como critérios primários para a análise de espécies de microalgas com potencial para a produção de óleos. Perfis crescentes de aumento de pH para todos os cultivos foram evidenciados, típicos de culturas cultivadas fotoautotroficamente. As variações no pH das culturas são devidas principalmente ao consumo de CO2, embora variações devido ao consumo de outros nutrientes ou a degradação de metabólicos secretados possam também ocorrer. A perda do CO2 livre dissolvido é parcialmente compensada pela regeneração a partir dos carbonatos e bicarbonatos. Conseqüentemente, o consumo de CO2 é acompanhado de alterações no pH (LIVANSKY, 1990).
41 Figura 3: Dinâmica do crescimento celular e pH para as diferentes espécies estudadas.
Tais resultados são melhores evidenciados na Tabela 1, que apresenta os parâmetros cinéticos de crescimento, produção de gordura e seqüestro de CO2 para as diferentes microalgas avaliadas.
