UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Adriana Machado Fontes
“Biotemplates” para automontagem de nanopartículas de
ouro: buscando inspiração na natureza para sintetizar
estruturas complexas
Dissertação apresentada à Universidade Federal da Bahia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para a obtenção do título de Mestre em Química.
Orientador: Dr. Marcos Malta Co-Orientadora: Dra. Regina Geris
SALVADOR-BA Dezembro de 2012
Sistema de Bibliotecas da UFBA
Fontes, Adriana Machado.
“Biotemplates” para automontagem de nanopartículas de ouro: buscando inspiração na natureza para sintetizar estruturas complexas / Adriana Machado Fontes. - 2013.
108f.: il.
Inclui anexos.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Malta. Co-orientadora: Profª. Drª. Regina Geris.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Química, Salvador, 2012.
1. Nanopartículas de ouro. 2. Materiais híbridos. 3. Fungos. 4. Microscopia eletrônica de transmissão. I.
Malta, Marcos. II. Geris, Regina. III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Química. IV. Título.
CDD - 579.5 CDU - 582.28
II
Dedico este trabalho aos meus pais Ademar e Ilma e à minha irmã Danielle, que sempre me apoiaram e me acompanharam em todos os momentos da minha vida, inclusive na realização deste trabalho.
III
“Everything should be made as simple as possible but not simpler.” ALBERT EINSTEIN
IV
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me concedido a vida.
Ao Professor Dr. Marcos Malta e à Professora Dra. Regina Geris, pela excelente orientação perante a execução dos nossos trabalhos, pelo profissionalismo, pela paciência, competência, dedicação, grandes ensinamentos sobre todas as questões tanto profissionais como também sobre a vida; pela amizade, compreensão, e principalmente à confiança em todos os momentos desta trajetória, e também à Mari pelo seu carinho.
Aos professores do Instituto de Química da UFBA que nos ajudaram no desenvolvimento do trabalho: Frederico Guare Cruz, Zênis Novaes da Rocha, Fábio Gorzoni Doro e Joromota (José Roque Mota Carvalho).
Ao programa de Pós-graduação em Química da UFBA e ao corpo docente, pela oportunidade de crescimento científico.
Ao Laboratório de Biotecnologia e Química de Microrganismos (LBQM) do Departamento de Química Orgânica (UFBA) pelo acolhimento pessoal e pelo suporte laboratorial para a realização dos experimentos deste trabalho.
Ao Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) pelo serviço de microscopia eletrônica, pela viabilidade dos experimentos complementares a este trabalho, pela amizade, pelo acolhimento: Maria Lúcia Vieira Moreno, Adriana Lanfredi Rangel e Cláudio Pereira Figueira.
Aos professores Arnaud Victor dos Santos (UNEB) e Madson de Godói Pereira (UNEB) pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho.
Aos amigos que fazem parte do LBQM: Ailton (me ajudou nos momentos iniciais deste trabalho com sua atenção), Ivan (também pelas imagens construídas), Verônica,
V
Hênia, Maurício, Jeferson, Luiz Henrique, Leonardo, Felipe, Eduardo, Vanessa e Ícaro.
Ao Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica da UFBA (LAMUME), especialmente à Jessica Guerreiro pelas análises de microscopia eletrônica, pela sua competência, amizade e atenção.
Aos órgãos financiadores CNPq e FAPESB pelo suporte financeiro concedido.
A minha família: Ademar (meu pai), Ilma (minha mãe), Danielle (minha irmã), minhas tias e meus tios, minhas avós Lourdes e Maria, ao meu saudoso avô Antônio, aos meus primos e primas.
Às minhas amigas Cris Almeida e Juliana Almeida pela sua companhia e atenção em diversos momentos desta trajetória.
A todos os meus amigos, amigas, pessoas especiais em minha vida, que de alguma forma contribuíram para meu crescimento pessoal e profissional. Muito Obrigada!
VI
SUMÁRIO
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO...I DEDICATÓRIA...II MENSAGEM...III AGRADECIMENTOS ... IV SUMÁRIO ... VI LISTA DE FIGURAS ... VIII LISTA DE TABELAS ... XIIRESUMO ... 13 ABSTRACT ... 14 1. INTRODUÇÃO ... 15 2. OBJETIVOS ... 18 2.1 OBJETIVOS GERAIS ... 18 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 18 3. REVISÃO DE LITERATURA ... 19
3.1 NANOMATERIAIS: UM POUCO DA HISTÓRIA, AVANÇOS E APLICAÇÕES...19
4. NANOPARTÍCULAS DE METAIS NOBRES: “BUILDING BLOCKS” ... 23
4.1 EFEITOS DE SUPERFÍCIE... 24
4.2 EFEITO DO CONFINAMENTO QUÂNTICO ... 26
5. NANOPARTÍCULAS DE OURO (NPs-Au) ... 29
5.1 AS CORES DO OURO ... 30
5.2 SÍNTESE DE NPs-Au ... 32
6. BUSCANDO INSPIRAÇÃO NA NATUREZA: FUNGOS FILAMENTOSOS USADOS COMO “BIOTEMPLATES” ... 34
7. EXPERIMENTAL ... 40
VII
7.2 CARACTERIZAÇÕES ... 43
8. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 47
8.1 DEPOSIÇÃO CONTROLADA DE NPs-Au EM FUNGOS FILAMENTOSOS ... 47
8.1.1 Estudo e caracterização das soluções coloidais de ouro em diferentes concentrações do íon citrato...48
8.1.1.1 O espectro UV-Visível...49
a) Efeito da concentração do íon citrato em solução ... 50
b) Estabilidade das soluções coloidais ... 54
8.1.2 Estudo e caracterização das soluções coloidais de ouro em diferentes concentrações do estabilizante (íon citrato) após o cultivo dos fungos...56
8.2 ESTUDO DO MATERIAL HÍBRIDO: FUNGOS/NPs-Au EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DO ÍON CITRATO ... 61
8.2.1 Características microestruturais do material híbrido: Microscopia óptica...62
8.2.2 Características microestruturais do material híbrido: Microscopia eletrônica de varredura (MEV)...64
8.3 ESTUDO DO MATERIAL HÍBRIDO FORMADO POR FUNGOS/NPs-Au: UMA ABORDAGEM NANOMÉTRICA ... 76
8.4 COMPOSIÇÃO DA PAREDE CELULAR DOS FUNGOS FILAMENTOSOS E SUA INFLUÊNCIA SOBRE O ESTADO DE AGREGAÇÃO DAS NPs-Au ... 87
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 91
ANEXO I ... 92
ANEXO II ... 94
ANEXO III ... 96
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Representação esquemática simplificada para a formação do material híbrido Fungo/NPs-Au ... 17 Figura 02. Copo de Licurgus, à esquerda a cor verde é percebida quando a luz é incidida no exterior do copo e à direita a cor vermelha é visualizada quando a luz é transmitida do interior do copo ... 19 Figura 03. Variação da dispersão (F) em função do número de átomos (n). ... 25 Figura 04. Variação do intervalo entre as bandas (band gap) e densidade de estados quando o número de {tomos do sistema aumenta (da direita para a esquerda). δ é chamado de Kubo gap (intervalo entre níveis de energias consecutivos). ... 28 Figura 05. Esquema excitação coletiva dos plasmons superficiais. ... ....29 Figura 06. Origem do espectro de ressonância à partir da teoria de Mie para partículas esféricas, a absorbância A é gerada a partir do produto de dois termos. O produto dos dois termos gera o espectro observado experimentalmente. ... 32 Figura 07. Imagens de a) microscopia óptica do fungo LBQM 07 e b) fotografia digital do mesmo fungo cultivado em BDA ... 35 Figura 08. Representação esquemática das estruturas dos fungos filamentos...36 Figura 09. À esquerda, representação esquemática da distribuição dos polissacarídeos e proteínas presentes na parede celular de uma hifa de fungo e no septo. ... 37 Figura 10. (a) Espectro de absorção na região do visível típico de uma solução de NPs-Au. Destaca-se λmax, Amax e o PWHM. (b) Aspecto visual da solução coloidal de
ouro estabilizada em ânions citrato. A coloração vermelha intensa é proveniente das excitações plasmônicas dos elétrons da banda de condução. ... 50 Figura 11. Espectro UV-Vis das soluções coloidais de ouro em diferentes concentrações do estabilizante (ânion citrato) ... 51
IX
Figura 12. Espectros UV-Vis das soluções controle depois de 2 meses de
armazenamento no escuro ... ...55
Figura 13. Aspecto visual das soluções coloidais após o crescimento do fungo LBQM 01 a) [citrato]:[Au3+] = 0,3; b) [citrato]:[Au3+] = 2,0; c) [citrato]:[Au3+] = 3,7; d) [citrato]:[Au3+] = 7,1; e) [citrato]:[Au3+] = 17,3. ... 57
Figura 14. Comparação entre os valores de absorbância máxima das soluções controle e das soluções coloidais de ouro que serviram como meio de cultivo para os fungos indicados; todas depois de dois meses de incubação no escuro. ... 58
Figura 15. Porcentagem em massa do híbrido LBQM 01/NPs-Au e do ouro que sobra do material obtidos após calcinação por análise termogravimétrica. ... 61
Figura 16. Imagens obtidas por microscopia óptica das hifas dos fungos LBQM 01 a) 200X e b) 200X; LBQM 02 c) 400X e d) 400X; LBQM 07 e)200X e f) 200X, LBQM 67 g) 1000X e h) 400X, que cresceram em meio contendo apenas ânions citrato (lado esquerdo) e no meio contendo a solução coloidal [citrato]:[Au3+] = 3,7 (lado direito).. ... 63
Figura 17. Imagens de MEV do material híbrido formado pelo fungo LBQM 01/NPs-Au nos aumentos de a) 500X, b) 1000X, c) 2000X e d) 3500X. ... 66
Figura 18. Representação estrutural de uma cadeia de quitina ... ...67
Figura 19. Representação estrutural de uma cadeia de β-glucana ... 67
Figura 20. Representação esquemática da estrutura do íon citrato ... 68
Figura 21. Imagens MEV do material híbrido formado pelo fungo LBQM 02/NPs-Au nos aumentos de a) 500X , b) 1000X, c) 2000X e d) 3500X. ... 69
Figura 22. Imagens MEV do material híbrido formado pelo fungo LBQM 07 /NPs-Au nos aumentos de a) 500X , b) 1000X, c) 2000X e d) 3000X. ... 70
Figura 23. Imagens MEV do material híbrido formado pelo fungo LBQM 67/NPs-Au nos aumentos de a) 500X , b) 1000X, c) 2000X e d) 3500X. ... 71 Figura 24. Imagens e espectro obtidos por EDX. Mapa elementar do ouro no material híbrido formado pelo fungo LBQM 01/NPs-Au [citrato]:[Au3+] = 7,1 nos aumentos de
X
500X. a) Fungo/NPs-Au, b) distribuição do ouro no material, c) espectro dos elementos presentes ... 73 Figura 25. Detalhes dos esporos do híbrido formado pelo fungo LBQM 01 recoberto com ouro. ... 74 Figura 26. Quantidade de Au depositado nas diferentes espécies de fungos cultivados nas mesmas condições. Razão Au:(Carbono+Au) foram obtidos através da técnica de EDX. ... 75 Figura 27. Imagem MET e cortes transversais de esporos do fungo LBQM 01 sem a presença das NPs-Au no aumento de 60.000 X. ... 77 Figura 28. Imagens MET de cortes transversais de hifas do fungo LBQM 01 após cultivo em solução coloidal [citrato]:[Au3+] = 0,3, durante 2 meses nos aumentos de a)
15.000X, b) 50.000X, c) 100.000X e d) 200.00X. ... 79 Figura 29. Imagens MET de cortes transversais de hifas do fungo LBQM 01 após cultivo em solução coloidal [citrato]:[Au3+] = 2,0 durante 2 meses nos aumentos de a)
15.000X, b) 50.000X, c) 100.000X e d) 200.00X. ... 81 Figura 30. Imagens MET de cortes transversais de hifas do fungo LBQM 01 após cultivo em solução coloidal [citrato]:[Au3+] = 3,7 durante 2 meses nos aumentos de a)
15.000X, b) 50.000X, c) 100.000X e d) 200.00X. ... 82 Figura 31. Imagens MET de cortes transversais de hifas do fungo LBQM 01 após cultivo em solução coloidal [citrato]:[Au3+] = 7,1 durante 2 meses nos aumentos de a)
15.000X, b) 50.000X, c) 100.000X e d) 200.00X. ... 84 Figura 32. Imagens MET de cortes transversais de hifas do fungo LBQM 01 após cultivo em solução coloidal [citrato]:[Au3+] = 17,3 durante 2 meses nos aumentos de a)
15.000X, b) 50.000X, c) 100.000X e d) 200.00X ... 85 Figura 33. Histograma de distribuição de tamanhos de partículas, calculados à partir da análise de tamanho de partículas para o material híbrido cultivado em a) [citrato]:[Au3+] = 0,3; b) 2,0; c) 3,7; d) 7,1; e) 17,3, das regiões mostradas no Anexo III.
XI
Figura 34. Representação esquemática da parede celular dos fungos filamentosos. . 88 Figura 35. Representação esquemática da deposição das NPs-Au sobre parede celular dos LBQM 01 em [citrato]:[Au3+] = 0,3 e 2,0 ... 89
Figura 36. Representação esquemática da deposição das NPs-Au sobre parede celular dos LBQM 01 em [citrato]:[Au3+] = 3,7; 7,1 e 17...90
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Número de mols e relação [citrato]:[Au3+], mantendo-se fixo o número de
mols do ouro. ... 43 Tabela 02. Dados experimentais e teóricos obtidos através do espectro UV-Vis ... 52 Tabela 03. Dados obtidos com o espectro UV-Vis depois de 2 meses ... 55 Tabela 04. Dados obtidos das medidas de tamanho de partículas e espessura da parede do fungo LBQM 01 com o programa ImageJ ... 87
13
RESUMO
Neste trabalho buscou-se o melhor entendimento dos processos físico-químicos que envolvem a estabilização e deposição de nanopartículas de ouro (NPs-Au) na superfície de fungos filamentosos descrevendo a preparação destes biomateriais através da técnica de automontagem. Nestes tipos de materiais é possível combinar as propriedades físico-químicas das NPs com as estruturas biológicas altamente diversificadas dos fungos. Foi investigado como a variação na quantidade da fonte de carbono disponível para os microrganismos (razão entre as concentrações molar [citrato]:[Au3+] = 0,3; 2,0; 3,7; 7,1 e 17,3) nas soluções coloidais, afetava o processo de
deposição e estabilização destas NPs-Au sobre quatro diferentes espécies de fungos isoladas no Laboratório de Biotecnologia e Química de Microrganismos assim codificadas: LBQM 01, LBQM 02, LBQM 07 e LBQM 67. Através dos dados obtidos por espectrofotometria UV-Vis das soluções coloidais, foram calculados os diâmetros médios das NPs cujos valores encontrados foram 21, 20, 24, 30 e 17 nm para as soluções [citrato]:[Au3+] = 0,3; 2,0; 3,7; 7,1 e 17,3, respectivamente. Os materiais
híbridos obtidos foram caracterizados por microscopia óptica (MO), microscopia eletrônica de varredura acoplada com espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (MEV-EDraios-X), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e análises termogravimétricas (TG). Os resultados de MEV-EDX indicaram que o fungo LBQM 01 apresentou maior acúmulo de NPs-Au em sua superfície, seguido pelo fungo LBQM 07 ([citrato]:[Au] = 17,3), LBQM 67 ([citrato]:[Au] = 7,1) e LBQM 02 ([citrato]:[Au] = 0,3), fato que foi corroborado com os dados obtidos com análises termogravimétricas. As análises de microscopia eletrônica de transmissão do híbrido LBQM 01/NPs-Au revelaram que o aumento da concentração de íons citrato na solução coloidal provoca a deposição de uma camada metálica mais compacta sobre o micélio, com maior tendência de agregação entre as NPs-Au.
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ABSTRACT
In this study we sought to better understand the physicochemical processes that involve the stabilization and deposition of gold nanoparticles (AuNPs) on the surface of filamentous fungi describing the preparation of these biomaterials through the self-assembly technique. In these types of materials it is possible to combine the physicochemical properties of NPs with highly diversified biological structures of fungi. It was investigated how variations in the amount of carbon source available to organisms (ratio between the molar concentrations [citrate]: [Au3+] = 0,3; 2,0; 3,7; 7,1
and 17,3) in sols, affected the deposition process and stabilization of these AuNPs on four different species of fungi isolated in the Laboratory of Chemistry and Biotechnology of Microorganisms, coded: LBQM 01, LBQM 02, LBQM 07 and 67. Using data obtained by UV-Vis spectrophotometry of sols were calculated average diameters of NPs whose values found were 21, 20, 24, 30 and 17 nm for the solution [citrate]: [Au3+] = 0,3; 2,0; 3,7; 7,1 and 17,3, respectively. The hybrid materials were
characterized by optical microscopy (OM), scanning electron microscopy coupled with energy dispersive spectroscopy X-ray (SEM-EDX), transmission electron microscopy (TEM) and thermogravimetric analysis (TG). The results of SEM-EDX indicated that the fungus LBQM 01 showed greater accumulation of Au-NPs on its surface, followed by the fungus LBQM 07 ([citrate]: [Au] = 17,3), LBQM 67 ([citrate]: [Au] = 7,1) and LBQM 02 ([citrate]: [Au] = 0,3), a fact that was corroborated with the data obtained from thermogravimetric analysis. The analysis of transmission electron microscopy hybrid LBQM 01/AuNPs revealed that the increasing concentration of citrate ion in the colloidal solution causes deposition of a metallic layer on the mycelium more compact with higher tendency of aggregation between AuNPs.
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1. INTRODUÇÃO
A utilização de estruturas biológicas como templates para a síntese de materiais híbridos biológico/inorgânico visando aplicações tecnológicas vem ganhando mais interesse pela comunidade científica [1]. Por exemplo, Eychmüller e colaboradores utilizaram fungos filamentosos como templates para imobilização de nanopartículas de metais nobres (Au, Ag, Pt e Pd), e investigaram suas potenciais aplicações em catálise heterogênea. Sistemas híbridos formados por fungos e nanopartículas de platina foram capazes de catalisar a conversão redox de íons hexacianoferrato (III) a hexacianoferrato (II) em solução aquosa [1].
Sistemas biológicos (macromoléculas e microrganismos) formam estruturas sofisticadas nas escalas nano, meso e macroscópicas, com um elevado controle sobre a montagem dos blocos construtores. Ao utilizar essas estruturas formadas na natureza para organização de materiais inorgânicos em escalas de tamanhos que sejam relevantes para aplicações na eletrônica, catálise, sensores e na biotecnologia, são utilizadas variadas estratégias de síntese que tem por base o uso de biotemplates e a biomimética [2]. Por exemplo, um trabalho reportado por Mirkin et al., mostrou a viabilidade de deposição de nanopartículas de ouro (NPs-Au) funcionalizadas com fitas de oligonucleotídeos sobre o fungo Aspergillus niger, os quais apresentaram condutividade elétrica variando de 10-5 a 10-6 S cm-1 na temperatura ambiente [3].
Dutta et al. descreveram a utilização de NPs-Au estabilizadas em íons glutamato e posterior cultivo de fungos Aspergillus nidulans nestas soluções coloidais, para uma rota simples de síntese de materiais híbridos [3]. Esses mesmos autores realizaram testes de condutividade elétrica do híbrido Aspergillus nidulans/NPs-Au e verificaram que o material apresenta condutividade similar ao ouro massivo. Mais recentemente, Hussain et al. mostraram que é possível obter microfios porosos de ouro, utilizando hifas de fungos como moldes para a deposição de NPs-Au, utilizando como estabilizante e redutor para as NPs-Au, extrato de chá [4]. É possível perceber que
16 em todos os casos citados há uma preocupação com a estabilização da superfície das NPs-Au, utilizando-se biomoléculas compatíveis com a superfície dos microrganismos, através de rotas simples de síntese.
Em tamanhos nanométricos o ouro adquire propriedades bastante diversificadas daquelas encontradas no ouro massivo. Isto acontece porque quando há uma redução do tamanho, ocorre um aumento do confinamento eletrônico, os movimentos eletrônicos passam a ser quantizados e as propriedades passam a ser determinadas pelos elétrons dos átomos que se encontram na superfície [5]. A radiação eletromagnética que incide sobre estas nanopartículas é capaz de provocar movimentos oscilantes da nuvem eletrônica formando os plasmons superficiais, os quais quando acoplados ao campo elétrico da radiação apresentam energias em bandas detectadas dentro do espectro visível. Os valores do comprimento de onda da banda de absorção plasmônica dependem do tamanho e da forma das NPs e, mesmo em sistemas contendo quantidades ínfimas, as NPs podem ser detectadas [6]. Estas propriedades únicas das NPs-Au podem ser combinadas com as características morfológicas dos fungos, podendo-se funcionalizá-las na parede celular destes microrganismos que é formada basicamente por polissacarídeos e proteínas. O material microtubular formado pode apresentar diversas aplicações imediatas devido à sua facilidade de obtenção. Estes fatores são relevantes para o crescente desenvolvimento da área de biomateriais. Além das aplicações na eletrônica e como sensores, fungos decorados com NPs podem servir como ferramenta para investigação bioquímica, por exemplo, o efeito da acumulação de metais pesados sobre fungos, ou para detectar diferenças nas modificações da superfície dos esporos e hifas [1].
Neste trabalho de dissertação, os precursores para síntese do híbrido Fungo/NPs-Au são fungos filamentosos extraídos de plantas coletadas na Área de Proteção Ambiental (APA), Lagoas do Abaeté (Salvador-BA) e soluções coloidais de
17 NPs-Au estabilizadas em meio contendo ânions citrato. Devido ao papel duplo desempenhado pelo ânion citrato (de estabilizar as nanopartículas metálicas e também servir como fonte de carbono para os microrganismos), foi adotada a estratégia de variar a quantidade desse íon nas soluções coloidais de NPs. Assim, buscou-se modificar a quantidade da fonte de carbono de forma a verificar o comportamento do crescimento dos microrganismos e a quantidade de ouro depositada nas diferentes espécies de fungos estudadas. Na Figura 01 é mostrada uma representação esquemática simplificada para a formação do material híbrido Fungo/NPs-Au. À medida que o microrganismo cresce consumindo o ânion citrato, ocorre a deposição das NPs-Au na parede celular do microrganismo.
Figura 01. Representação esquemática simplificada para a formação do material híbrido Fungo/NPs-Au.
18
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVOS GERAIS
O objetivo central dessa dissertação de mestrado foi realizar um estudo detalhado sobre o controle da deposição de nanopartículas de ouro (NPs-Au) na superfície de quatro espécies de fungos filamentosos codificados como LBQM 01, LBQM 02, LBQM 07 e LBQM 67, através do processo automontagem (self-assembly). Parte da motivação desse trabalho teve origem no fato de que (a) o estudo de materiais bioinspirados ainda é uma área incipiente em nosso país e (b) os materiais híbridos fungo/NPs-Au podem ter aplicações imediatas como componentes de circuitos elétricos, sensores de alta área superficial, ou até mesmo estruturas opticamente ativas, dependendo da funcionalidade das nanopartículas [3, 7]. Além disso, é importante controlar a deposição das NPs nesses materiais porque são utilizados metais nobres (que são raros e caros), como também, as propriedades físico-químicas do material podem ser moduladas de acordo com a quantidade de metal depositada.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a. Sintetizar nanopartículas de ouro através da variação a concentração de íons citrato (ácido cítrico/citrato de sódio) em solução, o qual atua também como fonte de carbono para os fungos, mantendo o número de mols do precursor (Au3+)
constante nas soluções coloidais;
b. Verificar quais das quatro espécies de fungos estudadas apresentam maior afinidade com as NP-Au em cinco diferentes concentrações de íons citrato no meio coloidal, avaliando de que maneira estas variações na quantidade do ânion citrato interfere na deposição destas NPs-Au sobre os microrganismos;
c. Analisar morfologicamente as quatro espécies de fungos e quantificar o ouro presente nos mesmos através dos métodos de caracterização por microscopia eletrônica (MEV-EDX e MET) realizados na FIOCRUZ.
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3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 NANOMATERIAIS: UM POUCO DA HISTÓRIA, AVANÇOS E APLICAÇÕES
Apesar das técnicas de fabricação e aplicações dos materiais nanométricos (escala 1 x 10-9 m) terem sido desenvolvidas recentemente, o ouro já vem sendo
utilizado há muito tempo desde o início da sua extração na Bulgária aproximadamente no ano 5000 a.C. [8]. No século V a.C. foi descoberto o ouro ”solúvel” no Egito e na China [8]. Vidreiros romanos fabricavam vidros contendo nanopartículas metálicas durante o século IV d.C. [9]. Um famoso artefato proveniente deste período é conhecido como copo de Licurgus que retrata a morte do Rei Licurgus (Figura 02); este copo foi feito de vidro soda-cal contendo nanopartículas de prata e de ouro. A cor do copo muda de verde para um vermelho intenso quando a fonte de luz é incidida a partir do interior dele [9]. Paracelsus descreveu a preparação de ouro “potável”, o qual acreditava nas suas propriedades medicinais [8]. Até a Idade Média o ouro “solúvel” foi usado para curar e diagnosticar várias doenças tais como epilepsia, doenças venéreas, disenteria e tumores [8]. As características únicas do ouro coloidal já vêm sendo utilizada há séculos.
Figura 02. Copo de Licurgus, à esquerda a cor verde é percebida quando a luz é incidida no exterior do copo e à direita a cor vermelha é visualizada quando a luz é transmitida do interior do copo. Adaptado da referência [10].
20 O estudo sobre as nanopartículas metálicas tornou-se evidente quando em 1857 Michael Faraday publicou um artigo no periódico “Philosophical Transactions of
the Royal Society of London”, que tentava explicar como as partículas metálicas
afetavam as cores das janelas das igrejas, trazendo uma abordagem sobre a síntese e a coloração das soluções coloidais de ouro [9, 11]. Em 1908 Gustav Mie foi o primeiro a explicar teoricamente a dependência da cor dos vidros com o tamanho e o tipo dos metais através da resolução da equação de Maxwell [9].
Atualmente, o estudo, desenvolvimento e aplicações de nanomateriais tem sido foco de grande relevância na área de Química de Materiais. Os nanomateriais podem ser definidos como materiais que possuem ao menos uma dimensão na escala nanométrica, abaixo de um tamanho crítico capaz de alterar alguma de suas propriedades físico-químicas [12]. O grande interesse por esses tipos de materiais reside no fato de que pode-se modificar as propriedades de materiais existentes, simplesmente através da manipulação e controle do tamanho e da forma das nanopartículas. Além disso, a utilização de materiais pode ser sensivelmente reduzida, existindo a possibilidade de fabricação de dispositivos miniaturizados na escala nano e / ou micrométrica [13].
Há uma significativa diferença nas propriedades entre os materiais em escala nanométrica quando comparados a átomos individuais e o material macroscópico (bulk); de fato, os nanomateriais apresentam propriedades que fazem fronteira entre os átomos e o material na escala macroscópica [14-16]. Como o controle do tamanho é de fundamental importância, o desafio é desenvolver estratégias de síntese para obter um restrito controle sobre o tamanho, forma das nanopartículas e das propriedades de superfície [13, 17, 18]. Dessa forma faz-se necessário o planejamento do design de materiais em escala nanométrica para aplicá-los como blocos construtores com a finalidade de formar materiais funcionais nas escalas nano, micro e macroscópica, seja pela modificação de estratégias de sínteses já conhecidas, ou mesmo criando novas estratégias de síntese. [13]
21 O interesse sobre os sistemas nanoestruturados remete ao conhecimento e aplicações em diversas áreas da ciência, levando a uma abordagem interdisciplinar, o que faz desta área um foco de grande interesse e ampla faixa de aplicabilidade, englobando áreas como a Química, a Física e a Biologia.
Dentre os tipos de abordagem para a fabricação e design de materiais nanoestruturados pode-se citar o método top down (de cima para baixo) que consiste em tomar um objeto em escala macroscópica e reduzir suas dimensões até a escala nanométrica. Inicialmente é feito um planejamento do produto que se quer obter, então estruturas macroscópicas são reduzidas nas suas partes componentes e, assim, cada componente é refinado até obter maiores detalhes (miniaturização) [19, 20]. O outro tipo de fabricação chamado de buttom-up (de baixo pra cima) há o controle da síntese de nanopartículas individuais as quais servirão como blocos construtores
(building blocks) para a obtenção de estruturas maiores com propriedades desejadas,
onde a arquitetura é atingida através da montagem das partículas individuais. [19] Os métodos de síntese em solução os quais iniciam do controle individual sobre os arranjos atômicos para obter materiais em escalas maiores (método
buttom-up) são bastante empregados para o preparo de nanomateriais [21]. Em todos os
casos, para obter um controle ideal durante a síntese dos nanomateriais é necessário o conhecimento profundo da estrutura e propriedades das partículas individuais, bem como seu comportamento dinâmico no sistema [19, 22].
Além destas técnicas de fabricação já citadas, destacam-se também aquelas que fazem fronteira entre as abordagens top down e buttom-up as quais são conhecidas como técnicas de automontagem (self-assembly) [21]. Processos de automontagem são usados para organizar e construir os nanomateriais em arquiteturas funcionais para um determinado propósito [13]. Estes processos baseados nas forças da natureza (forças de interação fracas como de van der Waals, ligações de hidrogênio, interações dipolo-dipolo etc.) têm sido utilizados como um guia para alcançar avanços
22 crescentes na interface entre os nanomateriais e a biologia, como por exemplo, na fabricação de nanotubos metálicos utilizando dupla fita de DNA como molde (template) [19, 23].
A automontagem (self-assembly) pode ser definida como a formação espontânea de estruturas organizadas, provenientes de componentes discretos que interagem uns com os outros diretamente (através das interações eletrostáticas entre as partículas) e/ou indiretamente, através do seu meio [24, 25]. A automontagem está associada ao equilíbrio termodinâmico, as estruturas organizadas são caracterizadas pela energia mínima livre do sistema [25]. Em outras palavras, é a interação ou montagem espontânea entre duas ou mais subunidades de partículas (moléculas, íons, subunidades, building blocks, etc.) para formar um agregado com novas estruturas e propriedades [21].
A própria natureza fornece excelentes exemplos de automontagens: duas cadeias de oligonucleotídeos formam espontaneamente as duplas hélices de DNA [26], a formação da bicamada lipídica para produzir as membranas celulares, o enovelamento das proteínas em formas tridimensionais para gerar estados biologicamente ativos [26]. Os organismos superiores como mamíferos têm a capacidade de automontar macromoléculas de colágeno com cristais de hidroxiapatita formando os canais de Haver, os quais se organizam em estruturas concêntricas que envolvem um canal arterial central, gerando estruturas hierárquicas que constituem a forma final do osso, oferecendo-lhe rigidez e sustentação [13, 27].
Dentre os diversos tipos de automontagem, procura-se neste trabalho destacar a automontagem por molde (template) (que ocorre quando o sistema se organiza baseando-se nas interações entre seus componentes e os aspectos regulares de um ambiente) e a biológica, a qual ocorre em sistemas envolvendo a vida, como as células e os tecidos [21].
23 É muito difícil ter um controle total da síntese e montagem de nanomateriais utilizando somente métodos químicos ou físicos para obter estruturas funcionais em micro e macro escala [3]. Templates biológicos podem ser utilizados para sintetizar e estruturar materiais e compósitos. A razão para isso é que a natureza fornece as moléculas mais sofisticadas e estruturas únicas que não há como produzir no laboratório. Dentro deste contexto, se desenvolvem os materiais bioinspirados, os quais fazem fronteira entre os sistemas biológicos e os materiais inorgânicos [13, 21].
Neste trabalho são sintetizados materiais híbridos bioinspirados formados por fungos filamentosos (template biológico) decorados com nanopartículas de ouro (material inorgânico). Recentemente, vários microrganismos incluindo vírus [28, 29] e bactérias [30-33] foram utilizados como biotemplates na síntese de nanomateriais inorgânicos [32, 33]. A utilização de fungos apresenta várias vantagens na preparação de nanomateriais: são facilmente disponíveis, baratos e apresentam tamanho uniforme; como sobrevivem em condições brandas de temperatura e pH são os candidatos ideais para preparação de novos materiais em consonância com os conceitos de química verde.
4. NANOPARTÍCULAS DE METAIS NOBRES: “BUILDING
BLOCKS”
As nanopartículas de Au e Ag são conhecidas pelas suas características interessantes como mudança de coloração quando ocorrem alterações no seu tamanho e forma. Soluções contendo nanoesferas de ouro coloidal podem apresentar cores que variam entre o vermelho e o violeta; soluções coloidais contendo nanoesferas de prata apresentam cor amarela; por outro lado, nanoprismas de prata podem apresentar coloração azul [34], ou seja, as propriedades físicas e químicas variam com o tamanho e a forma das nanopartículas. Devido a estas características
24 singulares verificadas nas nanopartículas de metais nobres, desde muitos anos químicos e físicos vem investigando as razões pelas quais estas nanopartículas tornam-se tão peculiares.
Como já foi abordado anteriormente, nanomateriais apresentam pelo menos uma dimensão na faixa de tamanho nanométrica, abaixo de um tamanho crítico capaz de alterar algumas de suas propriedades. As mudanças nas propriedades dos materiais tornam-se altamente dependentes do seu tamanho, e esta é a base em que a ciência na escala nanométrica (nanociência) se apoia. Assim, estratégias de síntese para se obter o controle do tamanho e da forma das nanopartículas metálicas têm sido desenvolvidas no sentido de obter novos materiais com estas únicas propriedades e diversas possibilidades de utilização. As variações nas propriedades físico-químicas que surgem em função do tamanho e da forma das partículas em nanoescala são provenientes principalmente dos efeitos de superfície, do confinamento quântico e do estado de agregação das NPs [16]. Esses efeitos serão discutidos mais detalhadamente abaixo.
4.1 EFEITOS DE SUPERFÍCIE
Os efeitos de superfície dependem da fração de átomos na superfície, conhecida como dispersão (simbolizada pela letra F na Figura 03) que é medida em função da área superficial dividida pelo volume da NP [15]. Os átomos presentes da superfície de uma partícula possuem menos vizinhos diretos que os átomos internos da matéria estendida (bulk). Além disso, partículas com maior fração de átomos na superfície possuem menor número de coordenação (o qual está relacionado com o numero de átomos vizinhos). Já os átomos no interior da matéria estendida (bulk) são mais altamente coordenados, formam mais ligações e são mais estáveis que aqueles encontrados na superfície [15].
25 Figura 03. Variação da dispersão (F) em função do número de átomos (n). Adaptado da referência [15].
Analisando a Figura 03, para uma partícula cúbica hipotética, verifica-se que a dispersão (F) diminui à medida que decresce o número de átomos do material; os átomos dos vértices são menos saturados que aqueles das arestas, seguido daqueles da superfície plana e os completamente saturados estão presentes no interior da partícula. Por causa disso, os vértices dos átomos apresentam maior afinidade pelas moléculas adsorvidas, seguidos daqueles das arestas e por último das superfícies planas, apresentando propriedades que são bastante importantes para reações catalíticas [15].
4.1.1 Estabilidade das nanopartículas
As propriedades do material a ser obtido são dependentes da forma e da distância de interação entre as nanopartículas, que é dada em função das características do estabilizante [14]. As nanopartículas são termodinamicamente instáveis e possuem a tendência natural de se agregarem e crescerem [12].
As soluções coloidais de NPs são termodinamicamente instáveis, fato que pode ser explicado pela equação dG = γdσ, a qual mostra a relação entre a variação da energia livre de Gibbs (dG) e a variação da {rea superficial de uma amostra (dσ), em que γ é a tensão superficial interfacial, | temperatura e pressão constantes. A
D isp ersã o ( F) Número de átomos (n)
26 energia livre de Gibbs diminui quando há uma diminuição da área superficial do sistema, fato que indica a tendência natural de agregação [35].
Devido a sua baixa estabilidade dificilmente estas nanopartículas encontram-se isoladas [36]. É necessária uma estabilização extra [37], para manter as nanopartículas distantes umas das outras, e assim obter um controle rigoroso sobre a dispersão do meio. A passivação ou estabilização das nanopartículas pode ser efetuada pelos seguintes mecanismos: carregando-as eletricamente de maneira uniforme ou incorporando-as em uma matriz para evitar processos de agregação física e reatividade química [37]. A estabilização eletrostática de uma solução coloidal de nanopartículas é descrita pela teoria de Derjaguin-Landau-Verwey-Overbeek (DLVO), a qual retrata que a estabilidade do sistema é determinada pelo balanço entre as forças atrativas de van der Waals e repulsivas eletrostáticas [38]. Dessa forma, as nanopartículas se mantém estáveis se a intensidade das forças eletrostáticas repulsivas for maior que a intensidade da força atrativa de van der Waals, ou seja, as nanopartículas não se agregam se possuírem uma densidade de carga suficiente em sua superfície [38].
Por outro lado, quando as nanopartículas são incorporadas em uma matriz como biopolímeros ou dendrímeros, ocorre estabilização por efeito estérico [39]. As camadas poliméricas, macromoléculas ou tensoativos não iônicos adsorvidos na superfície, promove a repulsão inter-partícula através do efeito estérico. Em alguns casos são utilizados os polieletrólitos que podem estabilizar as nanopartículas tanto pelo efeito repulsivo das cargas como também por efeito estérico [38, 40].
4.2 EFEITO DO CONFINAMENTO QUÂNTICO
As propriedades físicas e químicas de um material são determinadas pelo movimento que os elétrons são permitidos a executar [5]. De acordo com El-Sayed, elétrons livres possuem movimento que não é quantizado e podem absorver qualquer quantidade de energia. Quando um elétron está ligado em um átomo ou
27 molécula seu movimento torna-se altamente confinado, ocorrendo a quantização de energia. Os tipos de movimentos eletrônicos permitidos nos orbitais atômicos e moleculares possuem energias bem definidas. Quanto menor é o espaço que os elétrons são permitidos a executar, maior é o confinamento e maior é a energia de separação entre os níveis de energias permitidos [5, 41].
No material massivo metálico, os elétrons são altamente deslocalizados sobre um amplo espaço (menor confinamento), as bandas eletrônicas formam um contínuo, e assim os elétrons podem se mover livremente entre a banda de valência e a banda de condução, atribuindo ao metal suas propriedades condutoras (Figura 04) [41]. Contudo, quando as dimensões deste mesmo material são reduzidas, estando as nanopartículas em escala intermediária entre a molecular e o material estendido, os estados individuais das moléculas e bandas contínuas dos sólidos estendidos tornam-se discretos, ou seja, há um maior confinamento eletrônico e sua separação entre a banda de valência e a banda de condução adquirem valores iguais ou superiores a kT, que corresponde à energia térmica [5], e o metal torna-se um semicondutor. Mostrando uma dependência com a dimensão espacial do material, aumentando ainda mais o confinamento, aumenta-se a separação entre as bandas e o material torna-se um isolante (Figura 04) [15].
Cada átomo contribui com uma densidade eletrônica, quanto maior a quantidade de átomos maior é a densidade de estados. Em tamanhos cada vez menores, estas separações entre os estados eletrônicos são ainda mais pronunciadas, promovendo mudanças nas propriedades dos materiais [15]. Nos metais nobres, o decréscimo tamanho entre o percurso livre médio dos elétrons (distância do movimento eletrônico entre espalhamento nas colisões com os centros de rede), resultam numa intensa absorção próxima ao espectro UV-Visível [5]. Isto ocorre devido à oscilação coletiva dos elétrons livres na superfície da partícula, os plasmons superficiais. Estas fortes absorções induzem a um forte acoplamento das NPs com a radiação eletromagnética da luz.
28 Figura 04. Variação do intervalo entre as bandas (band gap) e densidade de estados quando o número de átomos do sistema aumenta (da direita para a esquerda). δ é chamado de Kubo gap (intervalo entre níveis de energias consecutivos). Adaptado da referência [15].
4.2.1 Ressonância dos plasmons superficiais (SPR)
Outras características que surgem com a formação das nanopartículas são as propriedades ópticas. Uma pequena partícula de um sólido apresenta vários picos de ressonância nos espectros provenientes da absorção e espalhamento da luz, isso ocorre devido à presença dos elétrons livres (plasmons), phonons (vibrações reticulares) e éxcitons (par elétron-buraco). No caso das nanopartículas metálicas os picos que mais interessam são aqueles referentes aos plasmons e, como nas nanopartículas a fração de átomos superficiais é alta, os plasmons são superficiais [42]. Quando a luz interage com a superfície de uma nanopartícula de metais nobres a oscilação do componente elétrico da radiação promove uma oscilação simultânea dos elétrons, situação esquematizada na Figura 05 [43].
29 Figura 05. Esquema excitação coletiva dos plasmons superficiais. Adaptado da referência [43].
Quando a nuvem eletrônica é deslocada em relação ao núcleo, surge uma força restauradora de natureza eletrostática em função desta separação de cargas a qual é proveniente da atração entre cargas opostas (elétrons e núcleo), esta força restauradora acoplada ao deslocamento da nuvem eletrônica proveniente da interação com a luz dá origem às oscilações das nuvens eletrônicas. A frequência de oscilação depende da densidade eletrônica, da forma e do tamanho da distribuição de carga, consequentemente depende também do tamanho das partículas [5, 43, 44].
5. NANOPARTÍCULAS DE OURO (NPs-Au)
O ouro serviu de inspiração para os povos antigos durante muito tempo. Além de representar a riqueza, simbolizava religiosidade, imponência, vida eterna. Nanopartículas de ouro podem ter sua superfície modificada através da sua funcionalização com moléculas orgânicas. Essas moléculas têm a capacidade de recobrir toda a superfície do ouro estabilizando-o, isso ocorre devido ao seu efeito difusional sobre a superfície do ouro. As ligações são fracas o suficiente para permitir o movimento das moléculas pela superfície destas nanopartículas metálicas e sua associação por toda a área superficial [45]. NPs-Au podem ser estabilizadas, por exemplo, com o ânion citrato, o qual apresenta grupos funcionais carboxílicos que em
30 pH ≅ 7 se apresenta desprotonado, tornando a superfície do ouro negativamente carregada em água, com íons –COO¯ [45, 46].
Estas propriedades de superfície estabilizada ou funcionalizada têm permitido a ampla faixa de aplicações do ouro nanométrico, que vai desde monitoramento biomédico de fluidos, tratamento do câncer, até seu uso na cosmética, em lubrificantes, bem como na catálise [47]. Além das propriedades superficiais muito utilizadas nas áreas de catálise e biomedicina, os efeitos ópticos gerados pelas nanopartículas de ouro também tem ganhado elevada atenção. Soluções aquosas de ouro coloidal contendo nanopartículas com tamanhos na faixa de 20 a 30 nm apresentam intensa coloração vermelha, isso se deve a frequência de ressonância dos
plasmons superficiais.
5.1 AS CORES DO OURO
A cor dourada do ouro metálico é consequência da reflexão da luz em comprimentos de ondas específicos. As cores dos metais são provenientes da absorção e reflexão da luz, pois os metais apresentam bandas de energias contínuas capazes de absorver qualquer comprimento de onda e excitar os elétrons para níveis mais altos de energias, contudo estes elétrons retornam aos níveis mais baixos emitindo a mesma energia absorvida ocasionando na reflexão da radiação. Metais finamente divididos são em sua maioria escuros, pois a luz é absorvida, refletida e reabsorvida, não refletida aos nossos olhos [48].
Quando o ouro se encontra em nanoescala, a melhor explicação para a cor observada foi desenvolvida por Mie para nanopartículas esféricas, onde a cor depende da absorção e espalhamento da luz [34, 43]. Mesmo com o desenvolvimento de técnicas mais sofisticadas para caracterização das nanopartículas, por exemplo, a espectroscopia Raman, as propriedades de extinção, absorção e espalhamento da luz ainda são de grande interesse, pois são as características primárias para a interação da luz com as partículas [43]. Uma das razões que fazem com que a teoria de Mie
31 ainda ganhe destaque por tanto tempo, é que ela é a mais simples solução exata da equação de Maxwell, a qual é relevante para as partículas que são esféricas; ou até mesmo para as partículas que são aproximadamente esféricas, suas propriedades ópticas podem ser modeladas razoavelmente bem através do uso da teoria de Mie [43].
Analisando simplificadamente a teoria de Mie para nanopartículas esféricas (diluídas em um meio, formando uma dispersão coloidal), é possível relacionar a ressonância plasmônica superficial com a constante dielétrica da nanopartícula metálica e com a constante dielétrica do meio, considerando que a nanopartícula seja muito menor que o comprimento de onda da luz incidente [34, 43]. Nestas circunstâncias o campo elétrico pode ser considerado constante e as interações que governam são as eletrostáticas [43].
A absorbância depende do produto de dois termos com origens físicas diferentes, segundo a Equação 01 [45].
⁄
( )
(Equação 01)
Em que o primeiro fator à esquerda representa o espalhamento da luz, o qual depende de (a constante dielétrica do meio), de (o cubo do raio da partícula) e do inverso do comprimento de onda da radiação, [45].
O segundo termo representa a absorção devido à ressonância plasmônica a qual depende da parte real e imaginaria da constante dielétrica da partícula, e da constante dielétrica do meio . A parte real da constante dielétrica da partícula ( ) está relacionada com o índice de refração e assim com a capacidade que o material tem de desacelerar a luz, enquanto que a parte imaginária esta relacionada com as perdas provenientes da absorção da luz que atravessa o material. O denominador ( ) vai se aproximar de zero se se aproximar de , sendo assim o segundo termo da equação vai aumentar consideravelmente gerando a
32 condição de ressonância do plasmon o qual é representado por um pico de absorbância de plasmons. Este modelo é resumido na Figura 06.
Figura 06. Origem do espectro de ressonância à partir da teoria de Mie para partículas esféricas, a absorbância (A) é gerada a partir do produto de dois termos. O produto dos dois termos gera o espectro observado experimentalmente. Adaptado de [45]
Apesar da teoria de Mie possuir limitações para partículas com formas não esféricas, ela representa uma boa aproximação para o entendimento dos espectros obtidos experimentalmente, bem como suas propriedades ópticas relacionadas com o tamanho das partículas.
5.2 SÍNTESE DE NPs-Au
Muitas estratégias de síntese já vêm sendo utilizadas para o preparo das NPs-Au. Na síntese química de nanopartículas por via úmida, em geral utiliza-se um sal metálico, o qual sofre um processo de redução química na presença do agente redutor. São utilizados agentes estabilizantes que se ligam química ou fisicamente à superfície da partícula para controlar o tamanho e a estabilidade das nanopartículas formadas. Dentre os métodos convencionais para o preparo das NPs-Au através da redução dos sais de ouro (Au3+), a redução do precursor ácido tetracloroáurico
33 (HAuCl4) pelo íon citrato (agente redutor e estabilizante) em meio aquoso, sob
aquecimento, é o método mais utilizado desde a primeira síntese proposta por Turkevich em 1951 [49]. Em 1973, Frens [50] mostrou que é possível controlar o tamanho das NPs-Au através da variação na razão [Au3+]:[íon citrato] em solução.
Esse autor conseguiu sintetizar nanopartículas com tamanhos variados entre 16 e 147 nm. Assim, este método ainda é bastante utilizado quando se deseja obter NPs-Au com diferentes faixas de tamanho [51].
Nas rotas de síntese em que se utilizam apenas o íon citrato como agente redutor e estabilizante, o controle do tamanho não é totalmente adequado, pois as nanopartículas apresentam tamanhos variados (polidispersão), e tal fato é um fator limitante para os processos de aplicações catalíticas, por exemplo, no qual se exige um controle rigoroso do tamanho das partículas a serem utilizadas [34].
Diante disso, outras estratégias de síntese vêm utilizando um agente redutor mais forte para promover a formação dos núcleos de crescimento das NPs, na presença do agente estabilizante, desta forma é possível obter nanopartículas com estreita faixa de tamanhos (monodispersas). Por exemplo, é possível obter nanopartículas de ouro com tamanhos de 1 a 2 nm imobilizando-as em macromoléculas de dendrímeros na presença de um forte agente redutor como o NaBH4 [52].
O íon BH4- apresenta quatro ligações covalentes polares e, como o NaBH4 é um
forte agente redutor, ele se oxida em água. O BH4- em água libera o íon hidreto (H-);
esse ânion liberado se associa com um dos hidrogênios da água, formando a espécie H2 e a espécie BH3(OH)- em meio aquoso neutro. O BH3(OH)- formado provoca a
redução do íon AuCl4-. Contudo, como o meio é ácido devido a presença do HAuCl4,
34 processos de nucleação e crescimento das partículas na presença do agente estabilizante (Equação 02).
n(C3H5(COO)3)3-.2H2O(aq) + nAuCl4-.3H2O(aq) + NaBH4(aq) n(C3H5(COO)3)3Au0(aq) + nNaB(OH)4(aq) + nH2O(aq) + nHCl(aq) (Equação 02)
Devido a sua elevada reatividade, o NaBH4 é extensivamente utilizado como
agente redutor em muitas reações orgânicas (síntese de alcoóis primários e acetonas) e também na síntese inorgânica. Atualmente sua utilização na redução de sais metálicos para formar nanopartículas metálicas, tem sido amplamente divulgada. As NPs-Au formadas e estabilizadas são então utilizadas como blocos construtores para a automontagem de micro estruturas funcionais numa abordagem buttom-up.
6. BUSCANDO INSPIRAÇÃO NA NATUREZA: FUNGOS
FILAMENTOSOS USADOS COMO “BIOTEMPLATES”
Todos os dias, é possível perceber a presença de muitos tipos diferentes de microrganismos no nosso cotidiano. Os fungos em especial, constituem um grupo de microrganismos de grande interesse prático e científico para muitos pesquisadores [53]. Em 1990 a magnitude da diversidade dos fungos no mundo foi estimada em cerca de 1,5 milhões de espécies [54, 55]. Contudo, apenas 69.000 são conhecidas e desde 1983, aproximadamente 11.900 novas espécies foram descritas e aceitas [55]. No Brasil há uma grande diversidade de espécies de fungos, em 1995 estimava-se cerca de 2.770 espécies de fungos registradas [56]. Entretanto, a maior parte das espécies ainda não é conhecida. Grande parte desses microrganismos não se encontram sozinhos na natureza, vivendo em algum tipo de interação com espécies do mesmo grupo ou com plantas e/ ou animais [56].
35 Uma parcela dos microrganismos que habita o interior das plantas são os endofíticos. Os microrganismos (fungos e bactérias) endofíticos colonizam os tecidos sadios de partes aéreas das plantas, em algum tempo do seu ciclo de vida, sem lhe causar danos aparentes [57]. Dentre os fungos endofíticos, existem aqueles que formam nódulos nas raízes das plantas, os micorrizas, que vivem em simbiose mutualística com as plantas, especificamente nas raízes [56, 57]. Os fungos utilizados como templates para o preparo do material híbrido, neste trabalho, são endofíticos de plantas coletados na Área de Proteção Ambiental (APA) da Lagoa do Abaeté em Salvador-Ba.
Os fungos são seres heterotróficos (não produzem seu próprio alimento) e são eucarióticos. Em sua maioria, reproduzem-se naturalmente através de esporos. Os fungos apresentam uma característica interessante: a maioria das suas partes é potencialmente capaz de crescimento, ou seja, um minúsculo fragmento é suficiente para originar um novo indivíduo (Figura 07) [53].
Figura 07. Imagens de a) microscopia óptica do fungo LBQM 07 e b) fotografia digital do mesmo fungo cultivado em BDA.
Os fungos estudados são filamentosos (Figura 07), ramificados, imóveis e os filamentos são formados por paredes celulares rígidas constituídas basicamente por polissacarídeos tais como quitina e glucanas [53]. O corpo de um fungo filamentoso é
36 chamado de micélio o qual é uma massa de filamentos denominada de hifas, como representado na Figura 08.
Figura 08. Representação esquemática das estruturas dos fungos filamentosos. Adaptado da referência [58].
As hifas podem ser septadas (Figura 08) ou não-septadas (cenocíticas). Os septos são formados pela invaginação da parede celular entre as células que formam um longo filamento; além disso, são capazes de dividir os filamentos em células distintas contendo os núcleos. No entanto, existe um poro em cada septo que permite a migração do citoplasma e o núcleo dentro das células [53].
Os fungos filamentosos apresentam uma forma de crescimento especializada unidirecional nos quais as hifas crescem por meio da elongação das suas extremidades [53, 59] e, cada fragmento que contém os núcleos é capaz de crescer em um novo organismo [53]. Nas células eucarióticas dos fungos filamentosos, os microtúbulos e grânulos de actina desempenham um papel fundamental que determinam a direção de crescimento [59]. As hifas se apresentam bastante uniformes para cada tipo de espécie nos diferentes grupos. [60]
A parede celular dos fungos filamentosos desempenha importante função na manutenção da vida destes microrganismos, é uma estrutura dinâmica que fornece força mecânica, resistência a variações na pressão osmótica do meio, penetração etc. [61], e que permitem a interação das células fúngicas com o meio [62]. A composição
37 da parede celular dos fungos varia entre as classes. Algumas classes de fungos tais como dos Ascomycetes possuem uma porcentagem de glucanas menor do que aqueles encontrados na classe dos Oomycetes [60]. Em contrapartida, fungos desta classe não apresentam quitina na composição da sua parede, enquanto que nas outras classes (Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes etc.), todos os fungos apresentam quitina em sua composição [60]. A presença da quitina e β-glucana oferece um aspecto mais rígido à estrutura da parede celular enquanto que as manoproteínas e glicoproteínas oferecem uma característica mais gelatinosa [61]. A parede celular dos fungos filamentosos é constituída por camadas, sendo que a quitina e β-glucana se apresentam principalmente nas regiões mais internas, enquanto que uma matriz em fase gel formada pelas glicoproteínas e manoproteínas se distribuem em sua maioria nas regiões mais externas da parede [61]. (Figura 09)
Figura 09. À esquerda, representação esquemática da distribuição dos polissacarídeos e proteínas presentes na parede celular de uma hifa de fungo e no septo. Adaptado de [61].
Os fungos filamentosos são microrganismos bastante versáteis, pois podem se adaptar a meios sob condições mais severas que a maioria dos microrganismos. Podem tolerar concentrações altas de ácidos, suportando variações de pH entre 2 e 9,
38 embora o pH ótimo para a maioria das espécies seja em torno de 5,6 [53]. Diferentemente da maioria dos animais que se alimentam através da ingestão, os fungos obtém seus nutrientes através da digestão extracelular devido à atividade de enzimas secretadas no meio, seguida da absorção dos produtos solúveis [60].
Os fungos apresentam características únicas, estrutura uniforme, fácil disponibilidade no ambiente, facilidade de cultivo, estes fatores fazem destes microrganismos excelentes precursores (biotemplates) para a síntese de materiais híbridos que podem combinar características dos sistemas biológicos com as propriedades dos materiais inorgânicos. Atualmente, o foco pelas tecnologias sustentáveis tem sido exigido principalmente pelo fato de poder obter recursos da natureza sem impactar o meio ambiente. Para a síntese destes materiais não se gasta muita energia, e como se trabalha com metais nobres em escala nanométrica, há um controle da quantidade de reagentes que são utilizados.
Os biomateriais têm sido construídos e abordados dentro de duas linhas de pensamentos:
a) A imitação dos recursos encontrados na natureza, conhecida também como biomimetismo, onde tenta-se imitar ou duplicar características de sistemas naturais usando componentes sintéticos e técnicas de fabricação tradicionais [13]. Por exemplo, um novo material formado com nanoesferas de SiO2 recobrindo
microesfereas deste mesmo material que foi sintetizado por técnicas de litografia suave apresentam as mesmas propriedades dos olhos do mosquito de evitar que seja molhado por gotas de água [63].
b) E a segunda linha de pensamento direciona o uso de construções biológicas em sistemas sintéticos, ou seja, bioestruturas podem ser usadas para a criação de novas classes de materiais sem a necessidade de imitar os recursos da natureza [13]. Por exemplo, duplas fitas de DNA foram utilizadas como moldes para a síntese de nanofios de prata. O DNA é exposto a íons prata através da utilização de eletrodos,
39 os íons prata se ligam eletrostaticamente aos grupos fosfatos, com ação de um forte agente redutor como a hidroquinona, os íons prata são reduzidos e crescem em fios contínuos por deposição eletrolítica da prata [13, 23]. Estes nanofios de prata formados, não desempenham as mesmas funções do DNA e nem apresentam as mesmas propriedades físico-químicas do DNA, contudo o DNA (estrutura biológica, encontrada na natureza) serviu como inspiração para a síntese e design destes nanofios. Ou seja, os nanofios de pratas formados por esta rota são materiais “bioinspirados”. Nesta dissertação, foi adotada a estratégia descrita em (b) para o desenvolvimento de microtubos híbridos constituídos de Fungos filamentosos/NPs-Au.
40
7. EXPERIMENTAL
7.1 PROCEDIMENTO
Diferentes espécies de fungos foram cultivadas de acordo com a metodologia desenvolvida por Eychmüller e colaboradores [1], desenvolvida em quatro etapas distintas: a) cultivo dos fungos em meio nutritivo contendo batata, dextrose e ágar (BDA); b) pré-adaptação dos fungos em meio contento solução de ácido cítrico e citrato de sódio; c) síntese das NPs-Au estabilizadas em solução contendo ácido cítrico e citrato de sódio (íons citrato) e d) inóculo de fragmentos e esporos fúngicos nestas soluções contendo NPs-Au estabilizadas em citrato.
7.1.1 Cultivo dos fungos em meio nutritivo BDA (batata, dextrose e ágar)
Os fungos foram cultivados durante sete dias em placas de Petri contendo aproximadamente 20 mL de meio com 30% de batata, 1,5% de ágar (Acumidia) e 2% de dextrose - glucose (Synth) em água deionizada. 150g de batata foi cortada em cubos, em seguida 500 mL de água deionizada foi adicionada ao recipiente contendo a batata e submetida ao aquecimento em microondas a 70% de potência durante 10 min. Após a fervura, o caldo obtido foi filtrado e transferido para um Erlenmeyer de 1L, onde adicionou-se 7,5g de ágar e 10 g de dextrose. Mexeu-se até obter uma mistura homogênea, em seguida este meio foi tampado com tampões feitos de algodão hidrofóbico e gaze, e então submetidos ao autoclave à 120 oC e 5 atm
juntamente com as placas de Petri por 30 minutos. Depois de preparado o meio, este foi então transferido para as placas de Petri sob condições estéreis. Os fungos do meio de cultura antigos foram repicados e transferidos para estes novos meios de cultura distribuídos nas placas de Petri utilizando-se um bisturi contendo lâmina esterilizada e descartável.
Todo o procedimento para o repique dos fungos foi efetuado em capela de fluxo laminar, com o auxílio de um bico de Bünsen utilizando-se uma chama azul de
41 gás de cozinha. Antes de trabalhar na capela de fluxo laminar, todo o ambiente foi higienizado. Inicialmente lavou-se com água e sabão toda a parte interna da capela, em seguida com a ajuda de um borrifador espalhou-se álcool etílico 70% pelas paredes internas e mesa da capela de fluxo laminar, limpou-se com o papel toalha e em seguida utilizou-se a luz ultravioleta para esterilizar o ambiente por aproximadamente 30 minutos. Após estes procedimentos a capela estava pronta para uso e manuseio dos microrganismos.
7.1.2 Pré-adaptação dos fungos em meio contento solução de ácido cítrico e citrato de sódio
Antes de inocular as diferentes espécies de fungos nas soluções coloidais de ouro, fez-se uma pré-adaptação em meio contendo solução 0,05% de ácido cítrico e 1% citrato de sódio durante um mês em temperatura ambiente e condições estéreis. 0,023g de ácido cítrico e 0,323g de citrato de sódio foram diluídos em 500 ml de água deionizada, em seguida 50 ml desta solução foi transferida para 9 Erlenmeyers de 125 mL, todos os Erlenmeyers foram tampados com algodão hidrofóbico e gaze e em seguida esterilizados em autoclave por 20 minutos. Os fungos foram transferidos do meio nutritivo para o meio pobre em nutrientes contendo apenas ânions citrato como fonte de carbono. Foram então incubados à temperatura ambiente durante 1 mês sob condições estéreis.
7.1.3 Síntese das NPs-Au estabilizadas em solução contendo ácido cítrico e citrato de sódio
As NPs-Au foram sintetizadas de acordo com a metodologia proposta por Eychmüller com pequenas modificações. Para o preparo das NPs-Au foram utilizados: o precursor cloreto de ouro (III) trihidratado (HAuCl4. 3H2O-Sigma
Aldrich ≥ 99,9%), o agente redutor borohidreto de sódio (NaBH4) e os estabilizantes
42 Foram preparadas soluções com diferentes concentrações de citrato de sódio/ ácido cítrico, mantendo-se fixo o numero de mols do HAuCl4, para verificar a
atuação do ânion citrato como agente estabilizante das NPs-Au, e se sua disponibilidade altera o crescimento dos fungos e a deposição das NPs.
Separaram-se 5 Erlermeyers de 1L, cada um contendo 500 ml de água deionizada esterilizada. 1,00 g de citrato de sódio e 0,05 g de ácido cítrico (solução citrato de sódio 1% e ácido cítrico 0,05%) foram diluídos em balão volumétrico de 100 ml com água deionizada esterilizada. Em seguida separou-se 1,35 mL de HAuCl4
0,101 mol.L-1. Ferveu-se 500 mL da água deionizada esterilizada em Erlenmeyer de 1
L utilizando uma placa de aquecimento sob agitação magnética. Quando se iniciou a fervura foi acrescentado 1,35 mL de HAuCl4 0,101 mol.L-1; depois de 1 min
adicionou-se 1,1 mL da solução de citrato de sódio 1% e ácido cítrico 0,05%; depois de 20s acrescentou-se os 2,75 mL da solução de NaBH4 (0,08% diluída em solução
citrato de sódio 1% e ácido cítrico 0,05%). Esperou-se 10 minutos para completar a reação de redução até a completa estabilização da cor da solução. Este mesmo procedimento foi repetido para os outros quatro Erlenmeyers. Como se desejava alterar a concentração apenas do íon citrato, manteve-se fixa a concentração do ouro; após as sínteses esperou-se 10 min e foram adicionados a partir do segundo Erlenmeyer os volumes de 5,5; 11; 22 e 55 mL de solução citrato de sódio 1% e ácido cítrico 0,05%. As quantidades necessárias foram calculadas para o preparo de 500 mL de solução (volume final da solução - Anexo I). A quantidade de materiais é apresentada na Tabela 01.
