FACULDADE
DE
FÁRMACIA
RELATÓRIO FINAL DE ESTÁGIO
Ana Paula Silvério da Silva
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
UNIVERSIDADE
DE
LISBOA
FACULDADE
DE
FÁRMACIA
Relatório de Estágio no Laboratório Dr. Joaquim Chaves
Ana Paula Silvério da Silva
Relatório de Estágio orientado pelo Dr. Carlos Oliveira
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
I
Índice
Índice de tabelas e figuras ... III Abreviaturas ... VI
Introdução ... 1
1. Hematologia ... 5
1.1. Anemias ... 5
1.2. Hemoglobinopatias e Talassemias ... 10
1.3. Regulação do metabolismo do ferro - Hemosiderose e Hemocromatose ... 17
1.4. Alterações dos leucócitos ... 19
1.5. Hemostase e Coagulação ... 24
1.6. Teste de agregação plaquetária ... 30
1.7. Velocidade de sedimentação eritrocitária ... 32
1.8. Fenotipagem sanguínea - Sistema ABO e Rh ... 33
2. Bioquímica Clínica ... 37
2.1. Exame Sumário de urina (Urina Tipo II): ... 38
2.2. Proteínas ... 42
2.3. Metabolismo dos Hidratos de Carbono ... 47
2.4. Função Renal ... 49 2.5. Equilíbrio ácido-base ... 54 2.6. Função Hepática ... 56 2.7. Função Pancreática ... 59 2.8. Função cardíaca ... 61 2.8.1. Marcadores de necrose ... 61 2.8.2. Marcadores de dislipidémia ... 64 2.9. Função Tiroideia ... 67 3. Imunologia ... 71
3.1. Sistemas Automatizados nos Imunoensaios ... 71
3.2. Alergologia ... 74
3.3. Endocrinologia ... 77
3.4. Serologia infeciosa – Reações de aglutinação ... 84
3.5. Immunodifusão radial ... 88
3.6. Nefelometria ... 90
II
3.8. Marcadores séricos de doenças infeciosas ... 93
3.8.1. Vírus da Hepatite C ... 93
3.8.2. Vírus da Imunodeficiência Humana ... 95
3.8.3. Citomegalovírus ... 97
3.8.4. Toxoplasma gondii ... 99
3.9. ELISA ... 101
3.10. Imuno Fluorescência Indireta ... 102
3.11. Auto-imunidade ... 103
4. Microbiologia ... 105
4.1. Equipamentos em Microbiologia ... 105
4.2. Meios de cultura e suas características ... 108
4.3. Procedimentos em microbiologia ... 113
4.4. Teste de Suscetibilidade aos Antibióticos ... 118
4.5. Produtos Biológicos ... 120
4.5.1. Hemoculturas ... 121
4.5.2. Líquido Cefalorraquidiano ... 122
4.5.3. Exsudado ocular e auricular ... 124
4.5.4. Exsudado nasal, faríngeo e amigdalino ... 125
4.5.5. Expetoração ... 127
4.5.6. Urina assética ... 130
4.5.7. Exsudado Vaginal /Vulvar ... 132
4.5.8. Exsudado uretral ... 135
4.5.9. Esperma ... 136
4.5.10. Fezes ... 139
4.5.11. Feridas e fluídos purulentos ... 143
4.6. Resistências a Antibióticos ... 144
4.6.1. Beta-lactamase de espectro alargado ... 144
4.6.2. Staphylococcus aureus meticilina resistente ... 145
III
Índice de tabelas e figuras
Tabela 1 - Percentagens de referência de Hb A, Hb F e Hb A2 no recém-nascido e no
adulto. ... 11
Tabela 2– Classificação fenotípica das hiperlipidemias (Fredrickson) ... 65
Tabela 3 - Principais auto-anticorpos, patologias associadas e percentagem da ocorrência. ... 104
Tabela 4 - Classificação de amostras segundo o critério de Murray e Washington ... 128
Figura 1- Plataforma do CORE laboratorial ... 3
Figura 2- Gestão de Dados ... 4
Figura 3 - ADVIA 2120 Hematology System à esquerda e o mesmo acoplado a ADVIA Autoslide Slide Maker Stainer à direita. ... 5
Figura 4- Citograma de Peroxidase. ... 6
Figura 5 - Citograma de Baso ... 6
Figura 6 - Em cima esfregaço sanguíneo bem corado, em baixo área ideal para observação de esfregaços ao centro (2) e franjas á direita (3). ... 7
Figura 7 – Neutrófilo hipersegmentado no contexto de anemia megaloblástica. ... 10
Figura 8 - As diferentes cadeias de globinas ao longo do desenvolvimento... 11
Figura 9- ADAMSTM A1C HA-8180V ... 15
Figura 10 - Capillarys 2 Flex Percing Sebia. ... 15
Figura 11 - Padrão eletroforético (ECZ) da amostra do sangue de controlo (AFSC). ... 16
Figura 12 – Linfócitos reativos. ... 19
Figura 13 – Pseudo-anomalia de Pelger-Huët ... 20
Figura 14 – Mieloblasto com corpo de Aüer – Corpos de fusão de grânulos característico da LMA. ... 21
Figura 15 – Hairy cells. ... 23
Figura 16 – Células de Sézary. ... 23
Figura 17- Vias intrínseca, extrínseca e comum da coagulação (a cheio) e vias de anticoagulação (a tracejado). ... 25
Figura 18 - Sistema de Coagulação BCS® XP ... 26
Figura 19- Curvas de agregação plaquetária ... 31
IV
Figura 21 - ORTHO AutoVue® System ... 34
Figura 22 - Critério de positividade: ... 35
Figura 23 - Exemplo de Cassete do Sistema Ortho BioVue... 35
Figura 24 - ADVIA®2400 ... 37
Figura 25 - Clinitek Atlas® com manipulador de amostras tipo porta amostras. ... 38
Figura 26 - Cristais de tirosina (à esquerda), e cristais de cistina (à direita) ... 40
Figura 27 - Sebia Hydraplus pipeta as amostras- à esquerda. ... 42
Figura 28 - Capillarys 2 Sebia ... 44
Figura 29 - Perfil eletroforético – Zonas de localização das proteínas. ... 45
Figura 30 – Variações de Proteína Total, Albumina, zonas alfa-1 e alfa-2, zona beta e zona gama, para screening de várias patologias. ... 46
Figura 31 – Principais processos de transporte no nefrónio. ... 52
Figura 32 – Reação envolvida no processo do sistema tampão ácido carbónico/bicarbonato. Envolvimento do sistema pulmonar e do renal. ... 54
Figura 33 – Alterações do equilíbrio ácido-base e compensações renal e respiratória. . 55
Figura 34– História natural das doenças do fígado. ... 56
Figura 35– Marcadores de necrose cardíaca após enfarte agudo do miocárdio. ... 63
Figura 36- Estratégia de diagnóstico da tiroide usando TSH como passo inicial. ... 67
Figura 37 - Analisadores Automáticos de Imunoensaios: à esquerda ADVIA Ceutaur e à direita IMMULITE 2000. ... 71
Figura 38 - Analisador cobas e 411 ... 73
Figura 39 - Analisador de Alergologia ImmunoCAP® 250 ... 74
Figura 40 - Eixos endocrinológicos da hipófise ... 77
Figura 41- Radioimunoensaio competitivo ou indirecto ... 82
Figura 42-Radioimunoensaio não competitivo, direto ou imunométrico ... 82
Figura 43- Placa do teste TP-PA ... 86
Figura 44 - Sistemas BN ProSpec® ... 90
Figura 45- Sistema VIDAS ... 96
Figura 46 - Equipamento EUROIMMUN Analyzer I, racks dos reagentes à esquerda e placas de diluição de amostra à direita. ... 98
Figura 47 - Placa de ELISA – aplicação de branco, controlos e amostras. ... 101
Figura 48 - Padrões ANA por imunofluorescência indireta em células HEp2. ... 103
Figura 49 - Analisador automático de partículas de urina – citómetro de fluxo Sysmex UF – 1000i ... 105
V Figura 50 - Estação de Trabalho (à esquerda) e Cartas (à direita) do Sistema Vitek 2 106
Figura 51 - SistemaVitek2 Biomérieux ... 106
Figura 52 - À esquerda, frasco com tampa verde – para aerobiose e à direita, frasco com tampa laranja – para anaerobiose... 107
Figura 53 - Kit de Pastorex TM STAPH – PLUS - ... 114
Figura 54- Teste CAMP – Sinergia em placa em forma de seta. ... 117
Figura 55 - Antibiograma em Placa (Método de Difusão Kirby-Bauer) ... 119
Figura 56 - Meio Löwenstein – Jensen (LJ) ... 129
Figura 57- Imagem de diplococos Gram negativo no interior do neutrófilo característico de infeção por Neisseria gonorrhoeae. ... 137
Figura 58 - À esquerda célula epitelial normal e alguns bacilos de Doderlein. À direita “clue cell” ... 138
Figura 59 - Quistos de Giardia lamblia ... 142
Figura 60 - Ovos de Ascaris lumbricoides ... 142
Figura 61 - Ovos de Trichuris trichiuria ... 142
Figura 62 - Ovos de Hymenolepsis nana ... 142
Figura 63 - Larvas de Strongyloides stercoralis ... 142
Figura 64 - Larvas de Enterobius vermicula ... 142
Figura 65 - Potenciais interações na difusão dos discos de antibióticos para testar sinergia bacteriana ... 144
VI
Abreviaturas
ACTH - Hormona Adrenocorticotrófica ADC – Anemia de doença crónica ADH - Hormona Antidiurética ADP – Adenosina Difosfato AHG - Globulina Anti-humana ALP - Fosfatase Alcalina
AMA - Anticorpo Anti-mitocôndria ANA - Anticorpo Anti-nuclear
anti- TG - Anticorpos Anti-tiroglobulina
anti-TPO – Anticorpos Anti-peroxidase da Tiroide AP – Agregação Plaquetária
APCA - Anticorpo Anti-células Parietais
aPTT - Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada AR – Artrite Reumatoide
ASMA - Anticorpo Anti-músculo Liso AT – Antitrombina
BLSE - β- lactamases de Espectro Alargado C4bBP - Proteína de Ligação C4b
CDC – Centers for Disease Control and Prevention CHGM - Concentração de Hemoglobina Globular Média CID - Coagulação Intravascular Disseminada
CLIA – Imunoensaio Quimioluminescente CMV – Citomegalovírus
DGS - Direção Geral de Saúde DNA – Ácido Desoxirribonucleico dNTPs – Desoxinucleotídos
EBV - Vírus Epstein-Barr
ECL - Electroquimioluminescência ECP - Proteína Catiónica dos Eosinófilos EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-acético EIA - Ensaio Imunoenzimático
VII ELISA - Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay
ETM - Meio de Transporte Entérico
FAB - Classificação French-American-British FEIA - Fluoro Enzyme Immuno Assay
FLC - Cadeias Leves Livres FT4 – Tiroxina livre
HAV – Vírus da Hepatite A Hb – Hemoglobina
HbA1c - Hemoglobina Glicada HBC – Vírus da Hepatite C HbF – Hemoglobina Fetal
HbsAg – Antigénio de superfície do Vírus da Hepatite B HBV – Vírus da Hepatite B
HCG - Gonadotropina Coriónica Humana HDAg – Antigénio da Hepatite Delta HDV – Vírus da Hepatite Delta HEV – Vírus da Hepatite E HGB – Hemoglobina
hGH - Hormona de Crescimento humano HGM - Hemoglobina Globular Média HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Definição HPV - Papilomavirus humano
HSV – Vírus Herpes simplex Ht - Hematócrito
IFI - Imuno Fluorescência Indireta Ig - Imunoglobulina
INH – Isoniazida
INR - Ratio Normalizado Internacional IRMA – Ensaio Imunorradiométrico ISI - Índice Internacional de Sensibilidade LA – Anticoagulante lúpico
LBA - Líquidos Bronco-alveolares LCR - Líquido Cefalorraquidiano
VIII LES - Lúpus Eritematoso Sistémico
LH – Hormona Luteínizante LISS - Low Ionic Strenght Saline LUC – Células Grandes não-coradas MDR-TB – Tuberculose Multirresistente MI – Mononucleose Infecciosa
MRAI - Material de Referência Analítico Interno MRSA - S. aureus Meticilina Resistentes
MSSA - S. aureus Meticilina Sensível OMS – Organização Mundial de Saúde PBP - Proteínas de Ligação das Penicilinas PCR - Reação de Polimerização em Cadeia PCR- RT – PCR em Tempo Real
Plt – Plaquetas
PMT - Tubo Fotomultiplicador PPP - Plasma Pobre em Plaquetas PRP - Plasma Rico em Plaquetas RBC – Red Blood Cells
RDW - Índice de dispersão eritrocitária Rh – Rhesus
RIA – Radio Imuno Assay RMP – Rifampicina
RNA – Ácido Ribonucleico RP - Ratio de Protrombina RPR - Rapid Plasma Reagin SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SHBG - Globulina de Ligação às Hormonas Sexuais SIDA – Síndroma da Imunodeficiência Humana TBG - Globulina de Ligação à Tiroxina
TBPA - Pré-albumina de Ligação à Tiroxina
TeBG - Globulina de Ligação ao Estradiol-testosterona TFPI - Inibidor do Fator Tissular
TP – Tempo de Protrombina
IX TSA - Teste de Suscetibilidade aos Antibióticos
TSH - Hormona Estimulante da Tiroide TSTO – Testosterona
TT – Tempo de Trombina
UFC – Unidades Formadoras de Colónias ULR - Unidades de Luz Relativa
UTR – Região Não Traduzida
VDRL - Venereal Disease Research Laboratory VGM - Volume Globular Médio
Vs - Velocidade de Sedimentação VZV – Vírus da Varicela Zoster
1
Introdução
A concretização de um desejo de adquirir um maior conhecimento na área das Análises Clínicas levou-me a realizar este Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa. Como profissional de saúde, com formação em Ciências Farmacêuticas, pela mesma faculdade, decidi investir nesta área de conhecimento para poder dar no futuro o meu contributo.
Apostar na prevenção e no diagnóstico precoce da doença é uma opção que traz numerosos benefícios, não só, na melhoria da qualidade de vida dos utentes, mas também dos ganhos na Saúde. Neste sentido, é importante a sensibilização da população do recurso às análises clínicas como meio de prevenção de doenças ou da deteção destas, numa fase precoce, através do seu rápido rastreio, contribuindo para o diagnóstico precoce.
Este relatório tem por base o estágio efetuado no Laboratório Dr. Joaquim Chaves. O laboratório encontra-se dividido em áreas pré-analíticas, analíticas e pós-analíticas. A Receção, as Colheitas e a Triagem são áreas pré-pós-analíticas. O processamento de dados para envio e entrega de boletins de análise é uma área pós-analítica.
Na Triagem é da maior importância o controlo da fase pré-analítica do laboratório, na verificação da identificação e testes pedidos, tratamento e manipulação das amostras biológicas. A partir da Triagem as amostras seguem para as Áreas Analíticas, nas quais são realizadas as análises que vão ser abordadas neste relatório de estágio.
Em relação às áreas analíticas do laboratório segue-se uma pequena caracterização relacionada com os ensaios efetuados em cada uma.
No CORE Laboratorial realizam-se ensaios hematológicos, bioquímicos e imunológicos. Faz-se o estudo dos elementos figurados do sangue, a hemostase e a coagulação, o estudo da agregação plaquetária e a fenotipagem sanguínea do sistema AB0 e Rh (Hematologia). Realizam-se determinações em soro para o estudo bioquímico dos diversos órgãos e determinações em urina: o estudo físico-químico e o exame microscópico, bem como, o doseamento de diversos analitos (Bioquímica). Realizam-se imunoensaios para pesquisa e quantificação de marcadores séricos de doenças infecciosas e marcadores tumorais (Imunologia).
2 Na área de Radioimunoensaio efetua-se o estudo bioquímico e avaliação funcional dos eixos endocrinológicos. O estudo laboratorial da doença alérgica e das atopias faz-se nesta área por questões logísticas.
Na Imunologia faz-se a quantificação e confirmação da presença de marcadores séricos de doença infecciosa; o estudo qualitativo e quantitativo de antigénios e anticorpos; estudo da imunidade através da pesquisa e/ou doseamento dos auto-anticorpos.
Na Microbiologia faz-se o estudo laboratorial dos agentes etiológicos de doenças infecciosas (bacterianas, micológicas e parasitológicas) através do exame morfológico direto, do isolamento, identificação e determinação da resistência aos agentes antimicrobianos, presentes nas diferentes amostras biológicas.
Na área de Biologia Molecular Infecciosa faz-se o estudo qualitativo e quantitativo de sequências genómicas de ácidos nucleicos específicas de microrganismos potencialmente patogénicos.
Na área de Química Analítica faz-se o estudo laboratorial de metabolitos, hormonas, vitaminas, elementos traço, neurotransmissores, metais pesados; confirmação da presença de drogas ilícitas, monitorização de fármacos e identificação dos seus metabolitos e análise espectroscópica do cálculo urinário.
CORE laboratorial
O CORE laboratorial tem um Sistema Modular Advia Labcell para a centralização laboratorial numa única plataforma de Hematologia, Química Clínica e Imunoensaios. É constituído por uma cadeia de automatização da Siemens. Consiste numa cadeia de transporte de amostras aos equipamentos acoplados; Sistemas de colocação e recolha de amostras, os Sample Manager, Robot Racks para os equipamentos de Hematologia e um sistema de ligação em Rede de Processamento e Gestão de Dados (LineMaster, Software de Router e CentraLink).
3 Entre o CentraLink e os equipamentos existe uma comunicação bidirecional, isto é, os equipamentos recebem as amostras e enviam os resultados. Os tubos de amostras têm um código de barras que define o processo aberto no software do Laboratório, o E-DEIA lab, que também tem comunicação bidirecional com o CentraLink. No processo estão definidos os parâmetros de análises e esta informação é enviada para o CentraLink onde é definida a rota a efetuar na cadeia para que os testes sejam realizados. O CentraLink recebe informação dos parâmetros, após a realização dos testes e envia-os para o E-DEIA lab, onde os resultados são validados.
Sample Manager 3 ADVIA Labcell ADVIA 2400 – 1 Chemistry System ADVIA 2400 – 2 Chemistry System Sample Manager 2 ADVIA Labcell Sample Manager 1 ADVIA Labcell Siemens ADVIA Centaur – 3 Siemens ADVIA Centaur – 2 Siemens ADVIA Centaur – 1 Immulite 2000 Terminal CentraLink ADVIA 2120 -1 ADVIA 2120 -2 Hematologia Imunoensaios Química Clínica
4 No início do dia são efetuadas as manutenções necessárias nos equipamentos e são efetuados os controlos e as calibrações necessárias para cada parâmetro. Através do terminal informático com o software CentraLink é possível ver o estado de cada parâmetro.
Outros dados importantes que o CentraLink recebe dos equipamentos são relativos ao Controlo de Qualidade que envia de forma unidirecional para o UNITY Real Time, o software de Gestão da Qualidade.
Este Sistema de automatização traz numerosas vantagens:
facilidade de operação,
o conceito de código de barras integrado que facilita e aumenta o fluxo de trabalho,
monitorização dos analisadores em tempo real,
acesso permanente às amostras, evitando a interrupção de testes de rotina, garantindo a disponibilização de resultados tão rapidamente quanto possível,
as amostras de processamento urgente são prioritárias,
controlo de todo o processo a partir de um só terminal, onde é possível, se necessário, repetir uma análise em qualquer ponto da cadeia, sem parar o sistema e sem ser necessário o operador intervir para além de dar uma ordem de repetição do parâmetro, no terminal.
Equipamentos
E-DEIA lab CentraLink UNITY Real Time
CQ Entrada de registo Abertura de processo Software do Laboratório Validação Processamento e envio de resultados Software de Gestão da Qualidade
5
1. Hematologia
1.1. Anemias
As anemias são avaliadas com base nos hemogramas, que se realizam no Sistema Automatizado de hematologia ADVIA 2120.
Equipamento: ADVIA 2120 Hematology System
Figura 3 - ADVIA 2120 Hematology System à esquerda e o mesmo acoplado a ADVIA Autoslide Slide
Maker Stainer à direita.
Princípio dos métodos:
Este Sistema ADVIA 2120 tem uma válvula de cerâmica que divide a amostra em 5 alíquotas para os diferentes canais e métodos para cada câmara de reação.
Os canais do Sistema ADVIA 2120 e os métodos usados são:
Canal HGB – Hemoglobina - Os eritrócitos são lisados libertando Hb, o ferro do heme da Hb é oxidado, passando do estado ferroso para o estado férrico, sendo depois combinado com o cianeto do reagente para formar o produto da reação, cuja transmitância vai ser lida a 546 nm.
Canal RBC/Plt – Eritrócitos e Plaquetas -O reagente ADVIA contém dodecil sulfato de sódio (SDS) e glutaraldeído que provoca a esferificação isovolumétrica do eritrócito, neste caso o fator de variação da interpretação é eliminado. As plaquetas e os eritrócitos são fixados.
Canal Retic. – Reticulócitos - O reagente ADVIA autoRetic contém um detergente zwitteriónico (surfactante) que esferifica isovolumetricamente os eritrócitos. Também
6 contém um corante vital, oxazine 750, que cora as células de acordo com o seu conteúdo de RNA.
Canal PEROX – Peroxidase - Os surfactantes combinados com stress térmico lisam os eritrócitos. O formaldeído fixa os leucócitos. O meio hipertónico causa alguma contração e crenação dos leucócitos incrementando o índice de refração das células melhorando a deteção dos linfócitos.No citograma Perox as células absorvem a luz proporcionalmente à quantidade de coloração da peroxidase presente (eixo x). As células dispersam a luz proporcionalmente ao seu tamanho (eixo y). Quando os dados de dispersão da luz e de absorção são traçados, formam-se clusters distintos. A análise de clusters identifica cada população com base na sua posição, área e densidade, a seguir, é processado o número de células de cada população.
Figura 4- Citograma de Peroxidase.
Canal BASO - O reagente ADVIA BASO contém ácido ftálico e um surfactante que lisam os eritrócitos e as plaquetas. No citograma BASO a dispersão da luz relativa à configuração do núcleo é traçada no eixo x e a dispersão da luz relativa ao tamanho da célula é traçada no eixo y e formam-se populações ou clusters diferentes.
1. Ruído
2. Núcleos de células blásticas 3. Leucócitos mononucleares 4. Basófilos
5. Suspeita Baso 6. Saturação
7. Leucócitos polimorfonucleares
Figura 5 - Citograma de Baso
Monócitos
Eosinófilos LUC – células grandes
não coradas, atípicas
Linfócitos e Basófilos
Eritroblastos
7 Como rotina, depois das manutenções diárias, deve-se passar um sangue como primer, passar os controlos e só depois dos resultados dos controlos estarem dentro dos valores das cartas de controlo é que se pode iniciar o trabalho das amostras para realizar os hemogramas.
Hemogramas
Com a determinação da Hemoglobina (Hb), do Hematócrito (Ht) e da contagem de eritrócitos é possível calcular o Volume Globular Médio (VGM), a Hemoglobina Globular Média (HGM) e a Concentração de Hemoglobina Globular Média (CHGM), chamados índices eritrocitários. Todos estes parâmetros são calculados pelo equipamento e fazem parte do hemograma.
Microscopia
O Equipamento Autoslide Slide Maker acoplado a um ADVIA 2120, pode preparar e corar automaticamente um esfregaço sanguíneo de qualidade elevada numa lâmina para análise citológica e fórmula leucocitária. Produz lâminas para amostras aspiradas apenas no modo do dispositivo coletor de amostras automático (Autosampler). Na observação de lâminas de sangue periférico ao microscópio ótico começa-se por observar um esfregaço normal em termos de morfologia, e só depois se observam os desconhecidos.
Figura 6 - Em cima esfregaço sanguíneo bem corado, em baixo área ideal para observação de
8 Nas anemias o hemograma pode mostrar microcitose, macrocitose ou algum tipo específico de poiquilocitose. A presença de policromatose indica uma resposta adequada da medula óssea à anemia sugerindo que esta possa ter sido causada por hemólise ou hemorragia.
Quando a etiologia da anemia não é esclarecida pela história clínica e pelo hemograma são necessários exames adicionais, como a contagem de reticulócitos, o doseamento de ferritina sérica e ferro sérico; doseamento de vitamina B12 sérica e folato sérico e eritrocitário, testes de função renal, tiroideia e hepática.
A identificação de anemia hemolítica é particularmente importante no feto e no recém-nascido.
Anemia ferropénica
Na anemia por deficiência de ferro, as alterações morfológicas não costumam ser evidentes até à queda da hemoglobina abaixo de 10 a 11 g/dL. Nesta altura surgem os aspetos característicos: microcitose, hipocromia, e poiquilocitose.(1)
No hemograma feito no contador eletrónico automatizado, a primeira evidência da deficiência em ferro é o aumento do RDW (índice de dispersão eritrocitária), indicativo de anisocitose. A alteração observada em seguida é a diminuição de Hb, da contagem de eritrócitos e do hematócrito, seguida pela diminuição do VGM e da HGM. Em relação aos exames adicionais, na anemia ferropénica o diagnóstico pode ser confirmado por ferritina sérica baixa ou ferro sérico baixo. O doseamento isolado do ferro é pouco útil uma vez que este está diminuído tanto na deficiência por ferro como na anemia de doença crónica. (1)
Anemia de doença crónica (ADC)
ADC é o termo usado para descrever a anemia que resulta de infeção ou inflamação crónicas ou de doença oncológica. Esta caracteriza-se por baixo ferro sérico e incorporação defeituosa na hemoglobina (havendo reservas adequadas na medula óssea), resposta inadequada da eritropoietina à anemia e diminuição moderada da sobrevida dos eritrócitos. (1)
No hemograma surge hipocromia e microcitose à medida que se agrava. Na inflamação crónica grave, o grau de microcitose pode ser tão acentuado quanto na deficiência em ferro. A contagem absoluta de reticulócitos está diminuída. Podem estar
9 presentes sinais indicativos de inflamação crónica, como neutrofilia, trombocitose e formação de rouleaux. É necessário diferenciar da anemia ferropénica. (1)
Em relação aos exames adicionais, o ferro sérico e a transferrina sérica estão diminuídos. A ferritina sérica está aumentada devido à síntese de apoferritina pelas células inflamatórias ou neoplásicas. Outros sinais que podem ser encontrados são a velocidade de sedimentação e a proteína C reativa aumentadas, bem como, o fibrinogénio, a α2-macroglobulina e as γ-globulinas. (1)
Anemia megaloblástica
Anemia macrocítica que resulta de eritropoiese anormal caracterizada por aumento do tamanho dos precursores eritróides e maturação citoplasmática precedendo a maturação nuclear. (1)
A anemia megaloblástica geralmente resulta de deficiência de vitamina B12 ou de ácido fólico ou da administração de fármacos que interferem na síntese de DNA. Algumas causas são particularmente importantes na infância, nomeadamente erros congénitos do metabolismo de vitamina B12 ou do folato. (1)
Os sinais clínicos nos doentes com falta de vitamina B12 ou de ácido fólico são os habituais de anemia, mas também pode haver glossite, esplenomegalia e icterícia. (1)
O hemograma mostra baixa contagem de eritrócitos, Hb e Ht. Há um aumento paralelo do VGM e da HGM. A CHGM é normal e o RDW aumentada. À medida que a anemia se agrava, pode aparecer poiquilocitose severa acompanhada de fragmentação eritrocitária, que pode diminuir o VGM e aumentar muito o RDW. (1)
No esfregaço sanguíneo pode-se observar anemia, macrocitose, anisocitose, e poiquilocitose (incluindo a presença de macrovalócitos e dacriócitos) e hipersegmentação dos neutrófilos. Às vezes, a macrocitose está associada a sinais de hipoesplenismo, particularmente a presença de corpúsculos de Pappenheimer e de corpos de Howell-Jolly. (1)
A hipersegmentação dos neutrófilos (núcleo com mais de 5 lóbulos) está relacionada com o diagnóstico de anemia megaloblástica. Pleocariócitos são neutrófilos de grande tamanho e núcleo hipersegmentado que se observam no sangue periférico na anemia megaloblástica.
10
Figura 7 – Neutrófilo hipersegmentado no contexto de anemia megaloblástica.
As características do esfregaço também são úteis no diagnóstico diferencial: na macrocitose devida à hepatopatia ou a abuso crónico do álcool, os macrócitos são redondos em vez de ovais e não há neutrófilos hipersegmentados. Na anemia hemolítica crónica a macrocitose pode ser acentuada e a policromasia é geralmente evidente. (1)
Os exames úteis para estabelecer a distinção entre deficiência de vitamina B12 e deficiência em ácido fólico são os doseamentos de vitamina B12 sérica e de folato sérico e eritrocitário.
1.2. Hemoglobinopatias e Talassemias
As patologias da hemoglobina são doenças hereditárias com transmissão autossómica recessiva com 25% de homozigóticos (2 genes anormais), 50% de heterozigótico (1 gene anormal) e 25% de normais. Podem ser anormalidades quantitativas ou qualitativas.
As anormalidades quantitativas, as talassemias ocorrem por ausência ou síntese reduzida de uma ou várias cadeias de globinas ou aumento de síntese de outras cadeias, como por exemplo β-talassemia, α-talassemia e a persistência hereditária de hemoglobina fetal (HbF).
As anormalidades qualitativas ocorrem por alteração estrutural, mutação ou substituição de 1 ou mais aminoácidos conduzindo a modificação da carga da molécula de Hb. As variantes mais frequentes são da β-globina. As variantes das cadeias α e δ são mais raras.
Estão descritas, atualmente, mais de 900 variantes diferentes. A HbS, a HbC, a HbD-Punjab ou Los Angeles, a HbO-Árabe, a HbE e a HbLepore representam, no seu conjunto, mais de 90% das variantes observadas; são relativamente frequentes, mas são recessivas e aparecem em populações específicas.
11 Os portadores são indivíduos saudáveis e as crianças podem nascer com doença severa.
Tabela 1 - Percentagens de referência de Hb A, Hb F e Hb A2 no recém-nascido e no adulto.
Hemoglobina Recém-nascido Adulto
Hb A: α2β2 25% 96 – 98%
Hb F: α2δ2 75% <1%
Hb A2: α2γ2 <1% <3,5%
As hemoglobinas humanas normais são a HbA (α2β2), a HbA2 (α2δ2) e a HbF (α2γ2). O padrão do adulto (HbA> 95% e HbA2 até 3,5%) é atingido por volta dos 6 meses de idade, embora, muitas vezes, a HbF só atinja os valores do adulto normal no final do segundo ano de vida ( < 1%).(2)
Figura 8 - As diferentes cadeias de globinas ao longo do desenvolvimento.
A hemoglobina fetal à nascença representa cerca de 60-80% da Hb total. No adulto a HbF é normalmente <1%. Em alguns indivíduos observa-se um nível de HbF elevado mesmo na vida adulta, esta característica é herdada e denomina-se persistência hereditária de HbF. (2)
12
β-talassemias
As β-talassemias podem ser classificadas em β0
(ausência da síntese da cadeia) ou β+
(redução da síntese da cadeia). Podem ser classificadas em homozigotia ou heterozigotia (portador). Em termos clínicos são classificadas em talassemia major (dependente de transfusões), intermédia ou minor (assintomática).(1)
β-talassemia major
O doente com β-talassemia major pode apresentar anemia muito grave, esplenomegalia, hepatomegalia e expansão dos ossos que contêm medula hematopoiética. Apresentam um grande desequilíbrio de síntese de cadeias α/β-globinas, eritropoiese ineficaz e sobrecarga em ferro. A HbA2 pode estar normal ou ligeiramente aumentada. (1)
A anemia é grave com hemoglobina muito baixa. O esfregaço sanguíneo mostra anisocitose e poiquilocitose extremas, incluindo eritrócitos em alvo, dacriócitos e eliptócitos. A hipocromia é evidente. Pode haver ponteado basófilo e corpúsculos de Pappenheimer. (1)
β-talassemia minor
O portador de β-talassemia minor ou traço β-talassémico em geral é clinicamente assintomático. O quadro hematológico típico apresenta: contagem de eritrócitos aumentada, microcitose, hipocromia e a HbA2 > 3,5%. (1)
A maioria dos indivíduos com β-talassemia minor tem Hb dentro dos limites de referência. Uma pequena percentagem é anémica. A microcitose geralmente é acentuada e pode mostrar hipocromia. A Hb e o Ht são normais ou quase, ao passo que o VGM e a HGM estão muito diminuídos. Em contraste com a deficiência em ferro, o RDW é geralmente normal. (1)
Não é possível, apenas com o hemograma, distinguir o traço β-talassémico de outros. Para o diagnóstico definitivo são necessárias a eletroforese da hemoglobina para excluir uma hemoglobina variante, e a determinação de percentagem de HbA2. Esta deve estar aumentada. (1)
13
α-talassemias
Trata-se de um grupo de condições resultantes de uma redução de síntese das cadeias α-globina. A redução na quantidade de tetrâmero α2β2 leva à anemia. As cadeias β em excesso agregam-se formando homotetrâmeros β4. Estes são solúveis não havendo precipitação significativa na medula. Os tetrâmeros vão precipitando à medida que o eritrócito vai envelhecendo, dando origem à formação de corpos de inclusão HbH. Os eritrócitos vão sendo destruídos no baço. A anemia é sobretudo devida à redução do tempo de vida dos eritrócitos. Esta cursa com microcitose, hipocromia e HbA2 normal.(1)
Variantes da hemoglobina
Drepanocitose ou anemia das células falciformes
A anemia das células falciformes (ou drepanocitose) é a doença causada pela homozigotia para uma variante da cadeia β da hemoglobina, a hemoglobina S (de sickle = foice). Há redução da solubilidade da HbS e ocorre polimerização. Formam-se grandes polímeros que deformam o eritrócito em forma de foice (drepanócitos). (1)
O indivíduo heterozigótico (AS) é praticamente assintomático (HbS cerca de 40%) e muito raramente terá manifestações clínicas de vaso-oclusão. O indivíduo homozigótico (SS) apresenta uma anemia hemolítica crónica com manifestações clínicas devida a ausência de HbA e níveis de HbS na ordem dos 80%. (1)
É uma anemia hemolítica crónica caracterizada por eventos recorrentes de vaso-oclusão, hemólise crónica, infeções e consequente falha de diversos órgãos. (1)
A Hb é geralmente da ordem de 7 a 8 g/dL, mas com limites mais amplos, entre 4 e 11 g/dL. O esfregaço típico mostra anisocitose, anisocromia, drepanócitos, eritrócitos em alvo, policromatose, ponteado basófilo e eritroblastos. O hemograma mostra redução de eritrócitos, Hb e Ht. O VGM é normal ou elevado. Existe aumento na contagem de reticulócitos e apresenta RDW aumentado. (1).
14
Hemoglobinopatia C
Homozigóticos para Hb C, têm hemólise crónica e, em geral, anemia hemolítica. Pode haver esplenomegalia. Costuma haver anemia leve e moderada. O esfregaço mostra grande número de eritrócitos em alvo. Há hipocromia e microcitose. A contagem de eritrócitos, Hb e Ht são normais ou moderadamente reduzidos. Costuma haver acentuada redução do VGM e da HGM, com aumento da CHGM, do RDW e da contagem de reticulócitos. Os eritrócitos podem apresentar cristais tetragonais, visto que a Hb C tem solubilidade reduzida. Os exames para confirmar são o teste de solubilidade (que deve ser negativo), HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Definição) ou Eletroforese de Hb, que mostram Hb C e HbA2 (que dificilmente se distinguem) e pequena quantidade de HbF.
Heterozigóticos para Hb C, com Hb C <40% são clinicamente assintomáticos, com fenótipo normal ou ligeira microcitose.
Pode existir síndroma drepanocítica composta HbS/HbC com presença de duas variantes, uma migrando no sítio da S e outra no sítio da C, na ausência de HbA.
Rastreio de Hemoglobinopatias
Amostra:
As determinações analíticas devem ser efetuadas a partir de amostras de sangue (EDTA dipotássico) colhidas recentemente, em particular quando se suspeita da presença de uma Hb instável.
O rastreio inicial das hemoglobinopatias e das síndromas talassémicas é efetuado através do hemograma (índices eritrocitários), da eletroforese das hemoglobinas em pH alcalino (Eletroforese Capilar de Zona- ECZ) e da determinação quantitativa da HbA2 e da HbF (HPLC). Os seus resultados devem ser sempre interpretados tendo em consideração, não só a origem étnica dos doentes, mas também a história clínica de administração de transfusão de sangue nos últimos 4 meses.
15
Equipamento: ADAMSTM A1C HA-8180V
Figura 9- ADAMSTM A1C HA-8180V
Trata-se de um analisador baseado em HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Definição) totalmente automatizado.
Os itens de medição são as seguintes:
HA-8180 no modo rápido mede HbA1c e HbF.
HA-8180 no modo variante, podem ser detetadas HbA1c, HbF, HbS e HbC.
A hemoglobina glicada (HbA1c) é um bom parâmetro para a monitorização de glicose no sangue, a 3 meses, em doentes que sofrem de Diabetes Mellitus. (ver Bioquímica Clínica 2.3 – Metabolismo dos Hidratos de Carbono).
Para a medição das variantes da Hb, o equipamento HA - 8180V é adequado. Outro equipamento HA – 8160 é eficaz para o rastreio de β-talassémia, com o modo talassémico ativado, e para detetar HbF, HbA2 e variantes HbS e HbC.
Equipamento: Capillarys 2 Flex Percing Sebia
Utiliza-se este equipamento de Eletroforese Capilar de Zona para quantificar as variantes da hemoglobina.
16
Princípio do método:
A Eletroforese capilar de zona (ECZ) baseia-se na diferença de mobilidade que as moléculas proteicas têm de acordo com as suas cargas elétricas próprias, assim como com a sua massa, forma e hidrofobicidade. A separação das hemoglobinas ocorre num meio liquido tamponado a pH alcalino, no interior de tubos capilares de sílica termostatizados. A velocidade da eletroendosmose leva a uma migração catódica das moléculas que, são detetadas e semiquantificadas (%) diretamente por espectrofotometria a 415 nm.
17
1.3. Regulação do metabolismo do ferro - Hemosiderose e
Hemocromatose
Hemosiderose
Hemosiderose é a deposição de hemossiderina nos tecidos. Nestas condições há aumento do armazenamento do ferro nos tecidos corporais, particularmente no fígado e sistema mononuclear fagocítico, sem dano tecidular demonstrável. O nome refere-se à presença de ferro que pode ser detetado no tecido na forma de hemossiderina.
A hemossiderose é um estado em que os depósitos de Fe2+ ainda são reversíveis antes de formar fibrose e necrose. A hemocromatose é irreversível.
Hemocromatose
O ferro acumula-se muito na hemocromatose hereditária (HH), porfiria cutânea tardia, e nas anemias hemolíticas. Nas alterações primárias, ou genéticas, a absorção do ferro da dieta normal aumenta devido à alteração de fatores hereditários que controlam a absorção e retenção do ferro.(3)
Nas alterações secundárias, ou adquiridas, o excesso de ferro pode resultar de doenças crónicas ou anemias hemolíticas, anemia sideroblástica, devido à ingestão de suplementos de ferro, após múltiplas transfusões, abuso de álcool ou carcinoma hepatocelular. (3)
No passado, a hemocromatose era identificada com base no excesso de ferro acompanhado de danos nos órgãos, pigmentação da pele, hepatomegalia, Diabetes mellitus, artropatia e hipogonadismo. Uma hipótese de diagnóstico que conduzia a biópsia do fígado.(3)
Os sintomas mais comuns são: fraqueza, perda de peso, artralgias, dor abdominal, diminuição da líbido e / ou impotência, complicações cardíacas mas pode ser assintomática. (3)
Ocorre depósito de ferro nos tecidos em virtude do seu excesso no organismo e alterações na sua distribuição. Os principais locais de depósito são o fígado, o pâncreas, o coração e a hipófise, que podem perder progressivamente as suas funções. (3)
18
Hemocromatose Hereditária (HH)
A HH é um erro genético do metabolismo que produz aumento inapropriado (2 a 3X maior que o normal) da absorção GI do ferro. É uma doença genética autossómica e recessiva. Esta definição estabelece uma causa genética e não requer a presença de excesso de ferro ou sinais de doença. Os doentes com HH não conseguem impedir a acumulação em excesso em vários órgãos, provocando problemas cardíacos, cirrose, fibrose e cancro hepático. (3)
Testes de rastreio
O transporte e armazenamento de ferro é largamente mediado por 3 proteínas: a transferrina, o recetor da transferrina e a ferritina. Não tem grande interesse em pedir a quantificação da transferrina a não ser para calcular a sua saturação.(2)
Os 2 testes sanguíneos representativos do armazenamento de ferro, disponíveis para o rastreio são a % de saturação da transferrina e a concentração sérica de ferritina. (2)
Significado de diagnóstico
O diagnóstico de hemocromatose pode ser feito num indivíduo que tenha repetidamente elevada a % de saturação da transferrina, na ausência de transfusões prévias. O excesso de ferro pode não estar presente num indivíduo que seja homozigótico para a hemocromatose. (3)
O diagnóstico de excesso de ferro é feito pela observação de níveis elevados da concentração da ferritina sérica, que se correlaciona bem com os níveis de ferro armazenados no fígado. A ferritina é o melhor indicador das reservas de ferro. (3)
A ferritina é uma proteína solúvel em água. Contém mais de 20% do seu peso em ferro e não é visível ao microscópio. A hemossiderina é uma proteína insolúvel, variando a sua composição contendo cerca de 37% de ferro. (3)
Na microscopia do sangue periférico podem-se observar siderócitos, eritrócitos com pequenas pontuações de hemossiderina. A ferritina é solúvel, por isso se doseia (por quimioluminiscência). A hemossiderina é insolúvel, por isso precipita dentro dos eritrócitos e fica visível e de cor azul com a coloração de Perls. O ferro tanto na ferritina como na hemossiderina encontra-se na forma férrica. O excesso de ferro causa um
19 aumento da ferritina e uma baixa de recetor de transferrina, enquanto na deficiência em ferro a ferritina baixa e o recetor da transferrina aumenta. (2)
O tratamento da hemocromatose consiste em remover o ferro acumulado. No caso dos doentes em que a eritropoiese seja capaz de responder a flebotomia, a remoção do sangue é geralmente o tratamento de escolha. Quando o doente não responde pela eritropoiese, como na talassemia major, é necessário empregar agentes quelantes para remover o ferro, contudo ocasionalmente a flebotomia vai estimular suficientemente a eritropoiese para tornar a terapia viável. (3)
A saturação da transferrina e o nível de ferritina sérica devem ser medidas cada 2 a 3 meses. Alguns doentes requerem flebotomia mensal para manter o valor de ferritina, enquanto outros podem requerer 2 ou 3 flebotomias por ano. (3)
1.4. Alterações dos leucócitos
Infeção viral – Mononucleose infecciosa
A presença de uma linfocitose, com a observação de linfócitos de aspeto reativo no sangue periférico deve-se geralmente a infeções de etiologia vírica (Vírus Epstein-Barr, Citomegalovírus, Vírus da hepatite C) ou parasitária como a Toxoplasmose. (4)
É muito frequente a associação dos linfócitos reativos com o Vírus Epstein-Barr, responsável pela Mononucleose infecciosa. Os linfócitos ativados são de maior tamanho que o linfócito normal, com moderada relação núcleo-citoplasma, um núcleo de perfil arredondado de cromatina pouco condensada e um citoplasma intensamente basófilo. Existe um predomínio de basofilia na periferia da célula e o citoplasma mostra tendência a aderir às hemácias próximas. (4)
20
Eosinofilia reacional
É comum em condições alérgicas e em infestações parasitárias. A eosinofilia varia de leve a acentuada. Os eosinófilos podem ser citologicamente normais ou mostrar desgranulação ou vacuolização variável. (4)
O primeiro passo na investigação de uma eosinofilia acentuada é uma história completa, que inclua dados sobre viagens seguida de exame físico. (4)
Acima de 1,1 de valor absoluto de eosinófilos é mandatório fazer pesquisa de microfilárias com a objetiva de 10X.
Pseudo-anomalia de Pelger-Huët
Os neutrófilos podem mostrar alterações congénitas ou adquiridas da lobulação. Nesta pseudo-anomalia de Pelger-Huët, os neutrófilos são hipolobulados e os lóbulos são arredondados. O perfil nuclear pode chegar a ser completamente redondo. A cromatina nuclear é marcadamente condensada. (4)
Transmite-se como uma característica autossómica dominante. A forma homozigótica manifesta-se com a ausência de segmentação na totalidade dos neutrófilos. A forma heterozigótica não deve confundir-se com um desvio à esquerda. A anomalia morfológica não se acompanha de alterações funcionais dos neutrófilos, excepto para a quimiotaxia. A anomalia também pode ser adquirida, o que constitui um sinal de displasia medular. Pode acompanhar-se da presença de desgranulação dos neutrófilos ou outros sinais de mielodisplasia. (4)
21
Reação leucemóide
A reação leucemóide é uma anormalidade hematológica que simula e pode ser confundida com leucemia, mas que, de facto, é reacional a outra doença. As causas de reações leucemóides mielóides incluem estímulos graves à atividade da medula óssea, como uma infeção bacteriana séria, tuberculose, algumas viroses, hemorragia e carcinoma ou outra doença oncológica (com ou sem metástases na medula óssea). (4)
Leucemias agudas
Até recentemente, a classificação mais aceite era a FAB, mas a da OMS está a ser progressivamente adotada. Nesta o critério de leucemia aguda é de 20% de blastos. Como a aplicação desta classificação exige o conhecimento das anomalias citogenéticas e moleculares, há um certo atraso no diagnóstico definitivo. Portanto persiste um diagnóstico morfológico preliminar baseado na FAB. (1)
A leucemia mielóide aguda (LMA) decorre da proliferação de um clone de células mieloides indiferenciadas que mostram maturação defeituosa ou ausente. A maioria dos doentes apresenta:
mais de 20% de blastos no sangue periférico, que podem ser mieloblastos, monoblastos, megacarioblastos, eritroblastos precursores.
anemia normocítica normocrónica;
neutropenia ou mais frequentemente neutrofilia;
trombocitopenia. (1)
22 A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é mais frequente em crianças com menos de 10 anos, mas persiste ocorrendo durante a infância, adolescência e vida adulta. Pode ter linhagem T ou B. Alguns casos apresentam-se com anemia e trombocitopenia. Outros apresentam número variável de linfoblastos no sangue periférico, com grande elevação da contagem de leucócitos. É comum existir anemia, neutropenia e trombocitopenia. (1)
Leucemias crónicas
As várias leucemias crónicas de origem mielóide diferem da LMA por haver maturação celular, com produção efetiva de granulócitos. A leucemia mielóide crónica (LMC), que se associa a uma translocação específica que dá origem ao cromossoma de Filadélfia (Ph), é usada para designar esta entidade Ph-positiva assim como um modo mais geral. (1)
A LMC é uma doença principalmente de adultos, caracterizada clinicamente por anemia, esplenomegalia e hepatomegalia. A contagem de leucócitos está elevada, com os neutrófilos como célula predominante e os mielócitos em segundo lugar. Em doentes com contagem muito elevada, os blastos podem chegar aos 15%, mas representam menor percentagem do que os promielócitos e mielócitos. Geralmente, a contagem de plaquetas é normal ou aumentada, e estas são macrocíticas. (1)
As leucemias linfóides crónicas (LLC) e linfomas são neoplasias linfóides. Nas LLC há linfoblastos circulantes enquanto os linfomas envolvem principalmente os nódulos linfáticos e outros tecidos linfóides. Contudo os linfomas podem apresentar uma fase leucémica inicialmente ou na progressão da doença. (1)
O diagnóstico deve basear-se nos aspetos clínicos, no hemograma, na citologia e no imunofenótipo, suplementados, quando necessário, com análise citogenética e molecular. (1)
Na LLC os linfócitos são de tamanho semelhante ao normal, mas com aparência mais uniforme. As células apresentam uma maior fragilidade mecânica, pelo que costuma haver sombras nucleares no esfregaço.
23
Leucemia a Hairy cell ou Tricoleucemia
É uma neoplasia de linfócitos B típica da idade adulta, mais frequente nos homens, e que se caracteriza pela presença de uma pancitopenia, esplenomegalia e ausência de adenopatias. Constitui 2% das neoplasias linfoproliferativas crónicas com expressão leucémica. Normalmente é acompanhado de anemia normocítica e monocitopénia. (4)
As células linfóides características da tricoleucemia são de maior tamanho que os linfócitos normais. O núcleo é de perfil arredondado ou lobulado, de posição maioritariamente central e a cromatina pouco condensada ou laxa, a maioria das vezes com ausência de nucléolo visível. O citoplasma mostra uma tonalidade azul-arroxeada, aspeto hialino e de forma característica apresenta umas vilosidades muito típicas (largas e numerosas projeções como pelos) que rodeiam o perímetro da célula linfóide. (4)
Figura 15 – Hairy cells.
Síndroma de Sézary – Linfoma cutâneo T
Variante leucémica da micose fungoide, denominada Síndroma de Sézary, que se caracteriza por afeção da pele, gânglios linfáticos e sangue periférico com a presença de células de aspeto cerebriforme, tamanho relativamente pequeno e contorno nuclear irregular. Nas células de Sézary o núcleo apresenta sulcos característicos da cromatina que se assemelham a circunvalações cerebrais. (4)
24
1.5. Hemostase e Coagulação
Fases da Hemostase
Hemostase primária depende do sistema vascular por constrição do vaso lesado, e do tempo plaquetário pela formação do trombo plaquetário.
Hemostase secundária (coagulação) por formação de fibrina.
Hemostase terciária (fibrinólise) por destruição de fibrina e manutenção da permeabilidade do vaso.
Coagulação
A coagulação é um processo multifatorial e dinâmico que culmina na formação de trombina em quantidades suficientes para conversão do fibrinogénio em fibrina.
Anticoagulantes Naturais
1. Antitrombina 2. Proteína C 3. Proteína S
4. Inibidor do Fator Tissular (TFPI)
A Antitrombina é uma glicoproteína plasmática de síntese hepática que inibe a trombina e os fatores Xa, IXa e XIa. A Heparina existente nas células endoteliais ativa a AT que por sua vez inibe os fatores IIa, IXa, Xa, XIa, XIIa.
A Proteína C é uma glicoproteína plasmática de síntese hepática dependente da Vitamina K. É ativada pelo complexo trombomodulina + trombina. É responsável pela inativação dos fatores Va e VIIa na presença do cofator Proteína S, fosfolípidos e Cálcio. Esta reação produz-se na superfície das plaquetas e no endotélio.
A Proteína S é uma glicoproteína plasmática sintetizada no fígado, no endotélio e megacariócitos. É Cofator da Proteína C ativada na degradação dos fatores Va e VIIIa. Circula em forma funcional, livre no plasma (40%) ou unida a uma proteína transportadora da subunidade C4b do complemento (60%).
25
Figura 17- Vias intrínseca, extrínseca e comum da coagulação (a cheio) e vias de anticoagulação (a
tracejado).
Amostra:
Plasma obtido por mistura de 1 parte de solução de citrato de sódio a 3,2% com 9 partes de sangue. Os tubos com citrato (1:9) levam uma parte de citrato e o tubo de colheita é cheio com sangue, de forma rigorosa, até ao traço.
É centrifugado à temperatura ambiente, 15 minutos a 1500 g. É estável durante 4 horas à temperatura de 15 – 25 ºC.
26
Sistema de Coagulação BCS® XP
Figura 18 - Sistema de Coagulação BCS® XP
O Sistema de Coagulação BCS® XP contém as primeiras 4 filas para os reagentes (1 a 4), que são refrigeradas. E contém as filas 5 a 14 para os controlos e as amostras.
Faz-se a calibração e os controlos para os reagentes que são utilizados no dia. As análises mais pedidas são o Tempo de Protrombina em segundos (TP seg.), TP % e TP Inr.
Todos os dias são efetuados os controlos nível 1 e nível 3 da coagulação dos seguintes testes: TP em segundos, TP%, TP Inr, aPTT em segundos, aPTT-R (razão), Fibrinogénio (mg/mL), Antitrombina III, Tempo de Trombina em segundos, DDímeros (mg/mL), Anticoagulante lúpico LA 1 (teste de rastreio). O LA 2 (teste de confirmação) realiza-se se o LA1 for superior a 45 segundos.
As amostras que não se fazem diariamente, como os fatores de coagulação, são imediatamente congeladas e só se descongelam num banho-maria a 37ºC, imediatamente antes de colocar no equipamento para realizar a análise. É preciso passar os controlos antes de todas as análises dos vários fatores de coagulação.
27
Tempo de Protrombina (TP)
Aplicação:
Serve para determinar o tempo de protrombina (TP) e determinar, juntamente com os correspondentes plasmas deficitários, a atividade dos fatores II, V, VII, X.
Princípio do método:
O processo de coagulação é desencadeado mediante a incubação do plasma com quantidades ótimas de tromboplastina e cálcio. Mede-se o tempo que decorre até à formação do coágulo de fibrina.
Significado de diagnóstico:
A determinação do TP constitui um teste de triagem rápido e sensível para detetar perturbações da coagulação no âmbito da via extrínseca (fatores II, V, VII e X). É adequado para:
Regulação e controlo da terapia por via oral com anticoagulantes cumarínicos análogos da Vitamina K (varfarina).
Deteção das deficiências nos fatores de coagulação da via extrínseca.
Controlo da síntese hepática nas doenças do fígado.
Avaliação dos Resultados:
O resultado da medição pode ser expresso em segundos, em % do valor de referência, como ratio de protrombina (RP) ou Ratio Normalizado Internacional (INR). Para o RP divide-se o tempo de reação da amostra pelo tempo de reação da pool de plasmas normais. Usando o Índice Internacional de Sensibilidade (ISI) pode converter-se o RP em valores internacionais comparáveis. Desta maneira obtém-converter-se o INR.
INR = RP ISI
Tempo de Tromboplastina parcial ativada (aPTT)
Aplicação:
Determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) em plasmas humanos citratados. Teste rápido para deteção de transtornos da via intrínseca da coagulação e que deteta de modo sensível os fatores VIII e IX, assim como os fatores de contato XI e XII.
28
Princípio do método:
A incubação do plasma com quantidades ótimas de fosfolípidos e um ativador de superfície leva a uma ativação dos fatores da via intrínseca da coagulação. Mediante a agregação dos iões cálcio é desencadeado o processo de coagulação. Mede-se o tempo até à formação de um coágulo de fibrina.
Significado de diagnóstico:
Usado com plasmas deficitários é um instrumento apropriado para a determinação de fatores singulares da via intrínseca e o diagnóstico da hemofilia. Além disso pode ser utilizado para o controlo da terapia heparínica. A medição do aPTT está indicada como teste de triagem de perturbações da coagulação especialmente antes de intervenções cirúrgicas, e a fim de poder submeter potenciais hemofílicos a um tratamento preventivo. Um tempo muito aumentado de aPTT por défice dos fatores VIII e IX revela as hemofilias A ou B.
Tempo de Trombina (TT)
Aplicação:
Determinação quantitativa do tempo de trombina no plasma humano.
Princípio do método:
A trombina converte o fibrinogénio contido na amostra em fibrina, através do qual se produz o coágulo. É medido o tempo que decorre até à formação do coágulo.
Significado de diagnóstico:
A determinação do TT é adequada para:
Monitorização da terapia fibrinolítica.
Como rastreio das perturbações da formação de fibrina ou em caso de suspeita de estados graves de deficiências de fibrinogénio.
Diferenciação entre o prolongamento de TT induzido por heparina e as perturbações da fibrina. O prolongamento da TT é medido tanto nas perturbações de polimerização da fibrina, como em presença de trombina. A diferenciação consegue-se usando o reagente de batroxobina.
29
Antitrombina
Aplicação:
Para a determinação quantitativa da atividade funcional da antitrombina (AT) no plasma, para o diagnóstico da síntese reduzida de AT, aumento do consumo e monitorização da substituição.
Princípio do método:
A AT da amostra é convertida num inibidor imediato através da heparina e inativa a trombina presente. O conteúdo residual de trombina é determinado num teste cinético medindo o aumento da absorvância a 405 nm. A alteração na absorção está inversamente relacionada com a atividade de AT na amostra.
Significado de diagnóstico:
A AT é o inibidor plasmático da trombina e do fator X ativado e forma um complexo inativo, irreversível com essas enzimas. A inativação dos fatores de coagulação ativados é acelerada, em grande quantidade, pela heparina. Este reagente serve para a determinação rápida da AT fisiologicamente ativa e permite o diagnóstico da deficiência hereditária e adquirida de AT que representa um risco elevado de trombose. As deficiências adquiridas de AT ocorrem, frequentemente, como consequência do consumo após operações de maior dimensão, ou como consequência de coagulação intravascular disseminada (CID) nos casos de sépsis, nefroses, lesões do parênquima hepático (hepatite, intoxicação por drogas, alcoolismo) e contracetivos contendo estrogénios. O teste permite a deteção precoce dos doentes com elevado risco de trombose.
30
1.6. Teste de agregação plaquetária
Amostra:
Sangue total – Colheita de 1 tubo em EDTA dipotássico e em 6 tubos de citrato de sódio a 3,2% (1:9),tanto para o doente como para o controlo.
Preparação prévia:
Para a realização do ensaio é necessário que o doente esteja em jejum e suspenda durante 1 a 2 semanas, com autorização médica, a terapêutica inflamatória e anti-agregante. Deve reduzir hábitos tabágicos e alcoólicos. Os ensaios laboratoriais devem ser iniciados até 3h após a colheita. O valor das plaquetas deve ser superior a 100x109/L.
É necessário Plasma Rico em Plaquetas (PRP) e Plasma Pobre em Plaquetas (PPP).São preparados por centrifugação de 15 min a 800rpm para o PRP e 20 min a 4500 rpm para o PPP. O PRP deve estar à temperatura ambiente e deve-se esperar 30 minutos antes de realizar o teste. O PPP serve como branco.
Princípio do método:
São usados os seguintes reagentes agonistas (indutores de agregação)
ADP
Colagénio
Ristocetina
Epinefrina
Os valores de referência são de 60 a 100%. Branco: Plasma Pobre em Plaquetas
A medição da agregação plaquetária (AP) utiliza um método turbidimétrico. A absorvância da luz pelo PRP diminui com a AP. A magnitude e a velocidade da diminuição dependem da reatividade das plaquetas aos agonistas adicionados. A AP é medida como o aumento da passagem da luz (transmitância) observada durante 5 minutos após adição do agonista, estando a escala ajustada a 0% de transmitância com PRP e a 100% com o PPP.
31
Resultados:
Figura 19- Curvas de agregação plaquetária
Significado clínico:
Este teste tem aplicação em hematologia e é de grande valor para o diagnóstico das alterações funcionais das plaquetas de origem congénita ou adquirida. Estas alterações geralmente produzem sangramento das membranas mucosas, o aparecimento de pequenas equimoses na pele, ou o sangramento anormal de pequenos golpes, feridas ou durante uma cirurgia. Este teste serve também para monitorizar os efeitos terapêuticos de medicamentos (por exemplo da Aspirina) e verificar a função plaquetária após transfusão ou após terapêutica anticoagulante.
32
1.7. Velocidade de sedimentação eritrocitária
A Vs (Velocidade de sedimentação) trata-se de um teste usado normalmente, mas que não é específico. Mede a velocidade de sedimentação dos eritrócitos no plasma num período de 1h. A velocidade é dependente da concentração plasmática de proteínas como o fibrinogénio e as imunoglobulinas. Valores elevados estão associados com formação marcada de rouleaux de eritrócitos no sangue periférico. Valores mais baixos podem ocorrer na policitémia vera devido à elevada concentração de eritrócitos. Valores mais elevados que o esperado podem ocorrer em anemia severa devido à baixa concentração de eritrócitos.(2)
Equipamento: Vesmatic cube 200
Figura 20- Vesmatic cube 200
Significado Clínico
Os valores de referência no homem são entre 1–5 mm/h e na mulher 5–15 mm/h, mas existe um aumento progressivo na idade mais avançada. A Vs está aumentada na gravidez e nas doenças inflamatórias sistémicas e neoplásicas. É utilizada para diagnóstico e monitorização temporal de artrite e polimialgia reumática e para monitorização de doentes com doença de Hodgkin. Valores muito elevados têm 90% de valor preditivo positivo para infeções ou doença oncológica (particularmente no mieloma). Variações da Vs podem ser usadas para monitorizar a resposta à terapêutica. (2)
33
1.8. Fenotipagem sanguínea - Sistema ABO e Rh
Grupos Sanguíneos
Foram descritos aproximadamente 400 grupos de antigénios dos eritrócitos. Os diferentes grupos de antigénios podem variar bastante, mas no significado clínico os grupos ABO e Rhesus (Rh) são os mais importantes.(2)
Sistema ABO
O sistema ABO consiste em 3 genes alélicos: A, B e O. Os genes A e B controlam a síntese de enzimas específicas responsáveis pela adição de um resíduo único de hidratos de carbono (N-acetil-galactosamina para o grupo A e D-galactose para o grupo B) ao antigénio básico, que é uma glicoproteína ou glicolípido, com um açúcar terminal L-fucose nos eritrócitos, conhecido como substância H. O gene O é amorfo e não transforma a substância H. Contudo, há 10 possíveis genótipos e 6 fenótipos. Os 2 maiores subgrupos de A são A1 e A2. Os anticorpos anti-A e anti-B ocorrem naturalmente no plasma de indivíduos cujos eritrócitos têm falta do correspondente antigénio. (5)
Sistema Rh
O locus do grupo sanguíneo Rh é composto por 2 genes estruturais relacionados RhD e RhCE que codificam as proteínas da membrana que possuem o antigénio D, Cc e Ee. O gene RhD pode estar presente ou ausente dando o fenótipo RhD+ ou RhD- respetivamente. O splicing alternativo do RNA do gene RhCE gera 2 proteínas que codificam os antigénios C, c, E, ou e. (5)
Os anticorpos Rh raramente ocorrem naturalmente, a maioria resulta de uma transfusão ou gravidez prévia. O anti-D é responsável pela maior parte dos problemas clínicos como a doença hemolítica do recém-nascido. A subdivisão simples dos indivíduos em RhD+ e RhD- usando o anti-D é suficiente para os propósitos clínicos de rotina. O anti-C, anti-c, anti-E e anti-e são ocasionalmente encontrados e podem causar reações de transfusão e doença hemolítica do recém-nascido. (5)
34
Outros Sistemas de Grupos Sanguíneos
Existem 30 sistemas de grupos sanguíneos descritos pela ISBT (International Society of Blood Transfusion). Estes outros sistemas são menos frequentes na clínica. Contudo, podem ter imunogenicidade e implicação em reações transfusionais hemolíticas. Podem ocorrer naturalmente anticorpos dos sistemas P, Lewis e MN. (2)
Os anticorpos destes sistemas são detetados pouco frequentemente. Alguns exemplos são o sistema Kell, Duffy, Kidd, MNS.(2)
Técnicas de Serologia de Grupos Sanguíneos
As técnicas mais importantes são baseadas na aglutinação dos eritrócitos (hemaglutinação). A aglutinação salina com o LISS (low ionic strenght saline) é importante na deteção de anticorpos IgM.
Equipamento: ORTHO AutoVue® System
Figura 21 - ORTHO AutoVue® System
Foi concebido para automatizar a execução de testes imunohematológicos in vitro de sangue humano, utilizando a tecnologia de cassete e procedimento de imagens digitais do sistema ORTHO BioVue. Utiliza cassetes com 6 colunas. Cada coluna contém uma câmara de reação, uma zona de ar, um reagente com esferas de vidro.
35
Leitura das cassetes - Ortho BioVue System
O resultado é negativo quando os eritrócitos atravessam a coluna e se depositam no fundo da coluna.O resultado é positivo quando se forma uma aglutinação que fica no topo do reagente e não atravessa as esferas de vidro.
Figura 22 - Critério de positividade:
0 corresponde a resultado negativo e 4 corresponde a resultado positivo.
Figura 23 - Exemplo de Cassete do Sistema Ortho BioVue.
Determinação de grupo sanguíneo ABO
A tipagem ABO é definida pelos antigénios presentes nos eritrócitos e pelos anticorpos naturais presentes no soro ou plasma. Na avaliação imuno-hematológica, são realizadas as provas, direta e reversa. Na tipagem direta, pesquisa-se os antigénios do sistema ABO na membrana do eritrócito. Na tipagem reversa, investiga-se a presença de anticorpos do sistema ABO presentes regularmente no soro ou plasma do indivíduo. A prova direta caracteriza-se pela reação dos eritrócitos da amostra com soros comerciais
