PCRSYS: Sistemas Aplicado à Seleção de Primers para Reação em Cadeia da Polimerase

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(1)PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação ARTIGO em ORIGINAL cadeia / Oda RIGINAL polimerase ARTICLE. PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase PCRSYS: system applied to the selection of primers for polymerase chain reaction. Roberto Augusto Paula* William José Ferreira** *. **. Especialista em Gerência de Sistemas de Informação pela Faculdade de Ciências e Tecnologia de Unaí (FACTU-MG). Docente da Faculdade do Noroeste de Minas (FINOM). e-mail: <rap@correios.net.br> Doutor em Zootecnia pela Universidade Federal de Viçosa (UFV). Docente e Diretor Geral da Faculdade do Noroeste de Minas (FINOM). e-mail: <finom@finom.org.br>. Resumo O aumento no volume de dados provenientes de seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos produzidos pelos laboratórios de seqüenciamento genético tem-se configurado em uma fonte de informação importante. Diversas técnicas de biologia molecular estão disponíveis para detecção de variabilidade ao nível de seqüências de nucleotídeos que compõem a fita de DNA. Dentre essas técnicas, destaca-se a PCR. Um fator importante que influencia a qualidade da PCR é a escolha adequada dos primers. Entretanto, a escolha indevida de primers para PCR acarreta prejuízos consideráveis. Por isso, objetivou-se desenvolver um sistema computacional que auxilie na seleção adequada de primers. Palavras-chave: Bioinformática. Biotecnologia. Genética molecular. Informática aplicada. Programação.. )>IJH=?J The increase in the amount of data from nucleotide and amino acid sequences produced by genetic sequence laboratories has been shown to be an important information source. Several molecular biology technologies are in use to detect the variability at nucleotide level sequences of DNA filament. Amongst these technologies the PCR system stands out. An important factor that influences the PCR quality is the appropriate choice of primers. However, an inappropriate choice of primers results in considerable damage. Therefore this work aims at developing a computer system in order to help in the appropriate selection of primers. Key words: Bioinformatics. Biotechnology. Molecular genetics. Applied informatics. Software development.. 1 Introdução O aumento no volume de dados provenientes de seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos produzidos pelos laboratórios de seqüenciamento genético tem-se configurado em uma fonte de informação importante e de especialização para pesquisadores na área de biologia, principalmente, nos campos da biologia molecular, da ciência da computação e da matemática. A bioinformática é considerada uma área do conhecimento que se baseia no paradigma fundamental da biologia molecular, em que se postula que a informação genética está armazenada nas seqüências de bases do ácido desoxirribonucléico (DNA), traduzidas em seqüências de proteína (VASCONCELOS, 2001). Assim, a bioinformática tem sido vista como uma nova área de pesquisa; os primeiros esforços para sua consolidação começaram no início dos anos 80, com aplicação de metodologias computacionais para biologia. De uma maneira geral, podem-se relacionar três áreas importantes da bioinformática: o desenvolvimento de novos algoritmos; a análise e a interpretação dos vários tipos de dados; o desenvolvimento e a implementação de “ferramentas” que permitam acessar e gerenciar, de forma eficiente, os diferentes tipos de informação. Desta forma, o conhecimento do funcionamento das “ferramentas” de bioinformática, os problemas biológicos,. que podem ser estudados e/ou resolvidos por meio de sistemas computacionais, constituem-se em uma nova área de trabalho para pesquisadores interessados em identificar novos genes, novos padrões ou desenvolver e aplicar novos algoritmos computacionais a problemas da biologia. A técnica chamada de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi concebida por Kary Mullis e colaboradores na década de 80 (MULLIS; FALOONA, 1987), causando uma revolução na biologia, tanto na pesquisa visando ao entendimento de processos biológicos fundamentais como nas áreas envolvendo diagnósticos e melhoramento de plantas e animais. Essa técnica é amplamente utilizada em muitas áreas, tais como no diagnóstico de doenças genéticas, detecção de baixos níveis de infecção viral, medicina forense, entre outras (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1995). O método de PCR é extremamente sensível, pode detectar uma única molécula de ácido desoxirribonucléico ou DNA em uma amostra. Mesmo traços de ácido ribonucléico ou RNA podem ser analisados da mesma maneira, desde que eles sejam previamente transcritos para DNA com transcriptase reversa. A técnica permite que o DNA de uma região selecionada no genoma seja amplificado um bilhão de vezes, desde que pelo menos parte de sua seqüência nucleotídica já seja conhecida.. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004. 65.

(2) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. A disponibilidade de DNA-polimerases purificadas e de oligonucleotídeos de DNA, quimicamente sintetizados, tornou possível a clonagem de seqüências de DNA específicas num tubo de ensaio de forma rápida e sem a necessidade de uma célula viva. A parte conhecida da seqüência de DNA é utilizada para projetar dois oligonucleotídeos de DNA sintéticos, também chamados de primers, cada um complementar a uma das fitas da dupla-hélice de DNA, e posicionados em lados opostos da região a ser amplificada, ou seja, flanqueando a região alvo. Esses oligonucleotídeos ou primers servem como iniciadores para a síntese de DNA in vitro, que é catalisada por uma DNA-polimerase, e determinam as extremidades do fragmento de DNA finalmente obtido. Entretanto, um fator importante que influencia a qualidade da PCR é a escolha adequada dos primers (RYCHLIK, 1993). No desenho destes, algumas considerações devem ser observadas para garantir um anelamento correto entre eles e a seqüência alvo de DNA. Dentre elas, destacam-se: os primers escolhidos devem ter uma seqüência única dentro da região a ser amplificada; os pares de primers devem possuir a temperatura de anelamento (Tm) similar para garantir um anelamento simultâneo; a composição de bases e o comprimento dos primers devem ser mantidos em padrões pré-estabelecidos; os primers desenhados devem anelar em sítios espaçados entre 100 a 600 pares de base (pb), esta distância permite uma síntese eficiente durante a PCR; e a estabilidade de duplex é determinada de maneira precisa, por meio do cálculo da energia livre de formação de duplex (∆G). Uma vez que a escolha indevida de primers para a técnica da PCR acarreta prejuízos consideráveis, proporcionando resultados inespecíficos, o que implica perda de reagentes químicos, horas de trabalho de técnicos especializados e o uso de equipamentos laboratoriais, aliado ao fato de que nem sempre estão disponíveis sistemas computacionais que auxiliam nesta escolha, objetivou-se, com este trabalho, desenvolver um sistema computacional que auxilie na seleção adequada de primers que serão utilizados na técnica da PCR.. 2 Material e Métodos O método utilizado para o cálculo do ÄG é uma simplificação do método de Breslauer et al. (1986), descrito por Rychlik (1993) (Tabela 1). Assim, calcula-se o ∆G dos três pares de nucleotídeos da região terminal 3’ do primer, da seguinte forma: ∆ (ACGG/CCGT) ∆G(ACGG) = ∆G(AC) + ∆G(CG) + ∆G(GG) ∆G(ACGG) = - (1,3 + 3,6 + 3,1) = - 8,0 (kcal/mol) De acordo com Breslauer et al. (1986), devem-se escolher primers com ∆G maior que -8,0. O cálculo da Tm foi baseado na fórmula empírica proposta por Wu et al. (1991), descrita da seguinte maneira: Tm = 2AT + 4GC. No desenvolvimento do sistema PCRSYS, foi utilizada a técnica de análise estruturada de sistema 66. (GANE; SARSON, 1995; YOURDON, 1990; DAVIS, 1994; POMPILHO, 1995). Tabela 1. Valor da energia livre do nucleotídeo vizinho mais próximo. Segundo nucleotídeo Primeiro nucleotídeo (5’). dA. dC. dG. dT. DG (kcal/mol) DA. -1,9. -1,3. -1,6. -1,5. DC. -1,9. -3,1. -3,6. -1,6. DG. -1,6. -3,1. -3,1. -1,3. DT. -1,0. -1,6. -1,9. -1,9. Por meio da técnica de análise estruturada de sistema, é feito um estudo detalhado de uma área de trabalho (processo), que antecede uma ação que, quase sempre, implica o desenvolvimento de um conjunto de programas integrados (sistema) destinado à execução, ao controle e ao acompanhamento do processo. Assim, antes de se construir um sistema de informações, deve-se elaborar um modelo que seja capaz de expressar, com a máxima fidelidade possível, o conhecimento que se tem do ambiente onde o sistema será implantado, de modo a satisfazer a todos os requisitos necessários. De acordo com Pompilho (1995), o objetivo da análise estruturada de sistemas é proporcionar uma documentação padronizada, para um modelo de sistemas que deva ser passível de manutenção, gráfico, lógico, rigoroso, conciso e legível. Para se atingir aos objetivos propostos pela análise estruturada de sistemas, faz-se necessária a utilização de um conjunto de “ferramentas”. Dentre elas, destacase o Diagrama de Contexto (DC), Diagrama de Fluxo de Dados (DFD) e o Modelo de Entidades e Relacionamentos (MER). O sistema operacional utilizado como ambiente de trabalho para o desenvolvimento do sistema PCRSYS foi o Microsoft Windows. O sistema PCRSYS foi implementado utilizando-se a linguagem de programação Delphi, versão 5.0 (CANTU, 1999; OLIVEIRA; MEDEIROS, 2000; SONNINO, 2000). Segundo Oliveira e Medeiros (2000), a linguagem de programação Delphi, lançada em 1994, é um dos ambientes visuais de desenvolvimento preferidos por programadores de sistemas computacionais. Baseado na linguagem Object Pascal, uma versão do Pascal orientada a objetos, o Delphi oferece inúmeras “ferramentas” para tornar o desenvolvimento a ambiente Windows, fácil, rápido e seguro. Dentre as características do Delphi, pode-se citar: uma interface gráfica para desenvolvimento; um conjunto de componentes para realizar diversas operações, como entrada de dados, conexão com banco de dados, geração de relatórios, entre outros; um editor de código que oferece mensagens de erro, com cores diferentes para os comandos padrões. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004.

(3) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. e integrado a um depurador eficiente; um compilador que gera um programa executável com código otimizado; facilidade e rapidez na criação de aplicativos que manipulam banco de dados de diversos formatos. Para elaboração e gerenciamento dos arquivos de dados, foi utilizado o sistema gerenciador de banco de dados Microsoft Access (PRAGUE, 1993; VIESCAS, 1998). Esse sistema fornece todos os recursos de definição, manipulação e controle de dados necessários para manipular grandes volumes de dados. Por exemplo, é possível definir um formato e um padrão para cada campo de uma tabela. Ao se implementar uma completa integridade referencial, no nível de ação do banco de dados, o sistema Microsoft Access evita atualizações ou eliminações inconsistentes. Ainda, o Microsoft Access suporta todos os tipos de campos necessários, incluindo texto, número, moeda, data/hora, memo (memorando), sim/não, imagens, entre outros. Além disso, o sistema foi projetado para ser utilizado também em uma arquitetura cliente/servidor, permitindo seu funcionamento em ambiente de rede de computadores, tornando possível, assim, sua utilização por vários pesquisadores ao mesmo tempo, compartilhando informações entre eles.. 3 Resultados e Discussão O Diagrama de Contexto (DC), que descreve o sistema PCRSYS está apresentado na Figura 1. O Modelo de Entidades e Relacionamentos (MER) que descreve os relacionamentos existentes entre as tabelas de dados que compõem o sistema encontra-se apresentado na Figura 2. Em seguida, tem-se uma descrição geral das principais opções e funções do sistema PCRSYS.. 1. Arquivos Na opção arquivos, é possível realizar as seguintes operações: importação de genes, cadastro de genes, importação de primers e cadastro de primers. Em seguida, na Figura 3, encontra-se a tela que representa as funções disponíveis na opção de arquivos. 1.1. Importação de Genes: permite ao usuário “importar” o gene a ser utilizado no estudo. O gene, armazenado em um arquivo do tipo “texto”, poderá ser obtido nos bancos de dados disponibilizados pelos centros de pesquisas ou elaborado pelo próprio usuário. 1.2. Cadastro de Genes: permite ao usuário realizar operações de manipulação, tais como inclusão, alteração e exclusão dos genes que compõem o banco de dados do sistema. Deve-se destacar que a exclusão de um gene acarretará a exclusão de todos os primers a ele relacionados. Em seguida, ilustra-se, por meio da Figura 4, a tela de cadastro de genes. 1.3. Importação de Primers: possibilita a leitura de um arquivo contendo os primers candidatos a serem selecionados (forward e return). Este arquivo deverá ser do tipo “texto”, podendo ser obtido por meio de programas específicos que indicam um conjunto de primers, a partir de alguns parâmetros ou, ainda, podem ser elaborados pelo próprio usuário. 1.4. Cadastro de Primers: assim como a opção de cadastro de genes, o cadastro de primers permite ao usuário realizar operações de manipulação, tais como inclusão, alteração e exclusão dos primers relacionados a um determinado gene cadastrado no banco de dados do sistema. Além disso, no cadastro de primer, ficam armazenadas todas as informações e cálculos realizados pelo sistema, em relação a cada um dos primers constantes no banco de dados. A tela que representa o cadastro de primers encontra-se abaixo, ilustrada por meio da Figura 5.. Figura 1. Diagrama de Contexto (DC) do sistema PCRSYS. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004. 67.

(4) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. Figura 2. Modelo de Entidades e Relacionamentos (MER) do sistema PCRSYS.. 68. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004.

(5) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. Figura 3. Tela que representa as funções disponíveis na opção de arquivos.. Figura 4. Tela de cadastro de genes. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004. 69.

(6) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. Figura 5. Tela de cadastro de primers. 1.5. Cadastro de Endereços na Internet: permite ao usuário manter um cadastro de endereços de sites, como, por exemplo, do genebank, que poderão ser úteis no trabalho dos pesquisadores. 2. Relatórios Por meio desta opção, é possível visualizar e/ou imprimir relatórios contendo a descrição dos genes e primers, a composição dos genes e primers, bem como dos endereços da internet cadastrados no sistema. É na opção de relatórios que são processados os principais cálculos do sistema, tais como: número de bases, energia livre de formação de duplex (DG), temperatura de anelamento (Tm), posição dos primers no gene e distância dos primers. A tela com as opções de relatórios disponíSveis encontra-se abaixo, ilustrada pela Figura 6. Dentre as opções de relatório, merece destaque: 2.1. Composição dos Primers: é nesta opção que os cálculos mais importantes do sistema são efetivamente executados, os quais são: número de bases (tamanho do primer); temperatura de anelamento (Tm); energia livre de formação de duplex (∆G); posição do primer no gene; e distâncias entre os primers. A tela que representa esta opção está apresentada abaixo, na Figura 7. É importante destacar ainda que, além das possibilidades de visualização e/ou impressão dos relatórios, é permitido também ao usuário “exportar” os relatórios para diversos tipos de formatos de arquivos, que podem ser compreendidos pelos principais sistemas computacionais existentes tais como: a planilha de cálculo Excel for Windows, o editor de texto Word for Windows, entre outros. 3. Utilitários Esta opção é composta pelos seguintes módulos: altera 70. idioma, parâmetros básicos do sistema e informações sobre o sistema. A tela com as opções de utilitários encontra-se ilustrada a seguir, por meio da Figura 8. Dentre as opções de utilitários, merecem destaque as seguintes: 3.1. Altera Idioma: permite ao usuário alterar o idioma a ser utilizado pelo sistema. 3.2. Parâmetros Básicos do Sistema: por meio deste utilitário, é permitido realizar a manutenção dos parâmetros que estão sendo utilizados, como padrão atual, pelo sistema. São informações como: idioma, nome do usuário, endereço, telefone, entre outros. Para utilização do sistema, os recursos computacionais mínimos, em termos de Hardware e Software são: Hardware: microcomputador de 100 Mhz, 16 MB de memória RAM, disco rígido de 800 MB, placa de vídeo de 2 MB, monitor color SVGA, drive de disquete de 1.44 MB, teclado e mouse. Software: sistema gerenciador de banco de dados Microsoft Access 97, sistema operacional Microsoft Windows 98; DAO (Data Access Object) versão 3.5, que é um conjunto de arquivos que permite o acesso ao banco de dados Microsoft Access 97 ou superior. O Sistema Aplicado a Reação em Cadeia da Polimerase (PCRSYS) é uma ferramenta que auxilia o geneticista em pesquisas e estudos de genes já seqüenciados ou que estão sendo seqüenciados. Os cálculos executados pelo sistema permitem ao geneticista desenhar primers para utilizá-los na PCR com rapidez e precisão, reduzindo o tempo do experimento e evitando o desperdício de materiais de preço bastante elevado.. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004.

(7) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. Figura 6. Tela contendo as opções de relatórios.. Figura 7. Relatório de composição dos primers. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004. 71.

(8) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. Figura 8. Utilitários disponíveis no sistema PCRSYS. Sua interface amigável com escolha de idioma e facilidade de uso é de grande valia para seus usuários que contam ainda com possibilidades de importação e exportação de dados. A arquitetura cliente/servidor utilizada na sua construção permite que o sistema seja operacionalizado em rede, tornando possível sua utilização por vários pesquisadores ao mesmo tempo, compartilhando informações entre si. O sistema conta também com um cadastro de endereços da Internet, criando um banco de dados com os endereços relevantes e que servem de fonte de pesquisas e importação de genes. Além disso, pode-se criar um cadastro de genes e primers que poderão ser aproveitados em outras análises e, ao longo do tempo, o laboratório ou centro de pesquisa possuirá um banco de dados que acumulará informações de várias seqüências de DNA. O sistema atendeu adequadamente aos objetivos propostos, justificando, assim, a sua utilização em outras análises, ou seja, o sistema calculou vários parâmetros, com precisão, das seqüências candidatas a primers. Os testes foram realizados no Laboratório de Biotecnologia Animal, do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, onde foram amplificados fragmentos de genes de suínos, como, por exemplo: Hormônio de Crescimento, Fator de Crescimento I Semelhante à Insulina, Fator Miogênico 5 e Leptina.. 4 Conclusões Uma vez que, por meio do sistema PCRSYS, foi possível calcular com precisão os vários parâmetros 72. das seqüências candidatas a primers, pode-se concluir que o sistema atendeu adequadamente aos objetivos propostos, justificando, assim, a continuidade de sua utilização em outras análises. A informática constituiu-se em uma ciência imprescindível nos trabalhos envolvendo as áreas biológicas, consolidando, cada vez mais, os recentes conceitos e objetivos propostos pela bioinformática. Novas implementações serão desenvolvidas no sistema no sentido de aprimorar a detecção de seqüências candidatas a primers e, também, para análise de homologia entre seqüências de DNA.. Agradecimentos Os responsáveis por este trabalho agradecem ao Centro Brasileiro de Educação e Cultura (CENBEC) e à Faculdade do Noroeste de Minas (FINOM), localizados na cidade de Paracatu-MG, pelo apoio recebido na elaboração deste estudo.. Referências BRESLAUER, K.J. et al. Predicing DNA duplex stability from the base sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 83, p. 3746-3750, Jun. 1986. CANTU, M. Dominando o Delphi 5: a bíblia. São Paulo: Makron Books, 1999. DAVIS, W.S. Análise e projeto de sistemas: uma abordagem estruturada. Rio de Janeiro: LTC, 1994. FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004.

(9) PCRSYS: sistema aplicado à seleção de primers para reação em cadeia da polimerase. uso de marcadores moleculares em análise genética. 2. ed. Brasília: Embrapa-CENARGEN, 1995. GANE, C.; SARSON, T. Análise Estruturada de Sistemas. Rio de Janeiro: LTC, 1995. MULLIS, K.B.; FALOONA, F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, San Diego, v. 155, p. 335-350, 1987. OLIVEIRA, A.; MEDEIROS, M. Delphi 5: conceitos básicos. Florianópolis: Advanced, 2000.. Totowa, NJ: Humana Press, 1993. p. 31-40. SONNINO, B. Desenvolvendo aplicações com Delphi 5. São Paulo: Makron Books, 2000. VASCONCELOS, A.T. A bioinformática em projetos genomas. In: CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE COMPUTAÇÃO, 21., 2001, Fortaleza. Anais... Fortaleza: SBC, 2001. p. 5. (CD-ROM). VIESCAS, J.L. Microsoft Access 97: guia autorizado microsoft. São Paulo: Makron Books, 1998.. PRAGUE, C.N. Bíblia do microsoft access para windows. Rio de Janeiro: Berkeley, 1993.. WU, D.Y. et al. The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction. DNA and Cell Biology, New York, v. 10, n. 3, p. 233-238, Apr. 1991.. RYCHLIK, W. Selection of primer for polymerase chain reaction. In: WHITE, B.A. Methods in molecular biology.. YOURDON, E. Análise estruturada moderna. Rio de Janeiro: Campus, 1990.. POMPILHO, S. Análise Essencial: guia prático de análise de sistemas. Rio de Janeiro: Infobook, 1995.. PAULA, R. A.; FERREIRA, W. J. / UNOPAR Cient., Ciênc. Exatas Tecnol., Londrina, v. 2/3, n. 1, p. 65-73, nov. 2003/2004. 73.

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