Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
Eletroforese das proteínas plasmáticas em Strix aluco (Coruja-do-mato)
- Versão Definitiva-
Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária
Roberto Filipe Joaquim Sargo
Orientadores:
Professor Doutor Filipe da Costa Silva, UTAD
Professora Doutora Ana Cristina Silvestre Ferreira, UTAD
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Eletroforese das proteínas plasmáticas em Strix aluco (Coruja-do-mato)
Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária
Roberto Filipe Joaquim Sargo
Orientadores:
Professor Doutor Filipe da Costa Silva, UTAD
Professora Doutora Ana Cristina Silvestre Ferreira, UTAD
Composição do Júri:
iii As ideias apresentadas neste trabalho são da inteira responsabilidade do candidato
iv Agradeço ao Magnífico Senhor Reitor da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Professor Doutor António Augusto Fontainhas Fernandes, pela oportunidade que me deu para a realização deste trabalho.
Agradeço à Direção do Hospital Veterinário da Universidade de Trás-os-Montes, no nome da Professora Doutora Maria Isabel Dias, pela cedência do material necessário para a realização deste trabalho.
Agradeço aos meus orientadores, Professor Doutor Filipe da Costa Silva e Professora Doutora Ana Cristina Silvestre Ferreira, pelo apoio em todas as fases deste trabalho, pela total disponibilidade demonstrada e pela persistência na otimização da dissertação.
Agradeço aos colegas que me acompanharam ao longo destes 12 anos de trabalho no CRAS-HVUTAD, em especial à Joana e à Filipa que iniciaram este trabalho comigo.
Aos meus pais.
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A eletroforese de proteínas plasmáticas é um fator chave na prática clínica médico-veterinária dos Centros de Recuperação de Animais Selvagens. Naqueles animais onde a história clínica raramente está disponível, o uso desta técnica é um excelente auxílio para a diferenciação entre processos inflamatórios agudos e crónicos. Embora existam vários métodos de eletroforese de proteínas plasmáticas, a eletroforese capilar de zona oferece uma melhor resolução para a interpretação do proteinograma do que as técnicas baseadas em gel. A Coruja-do-mato (Strix aluco) é uma ave de rapina noturna comum em toda a Europa. Esta é uma das espécies mais comummente admitida em centros de recuperação de animais selvagem. O objetivo principal deste trabalho é a definição de valores de referência para as diferentes frações das proteínas plasmáticas, por eletroforese capilar, nesta espécie. Amostras de sangue heparinizadas foram colhidas de 46 Corujas-do-mato saudáveis admitidas no Centro de Recuperação de Animais Selvagens do Hospital Veterinário da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, entre janeiro de 2015 e julho de 2017, e analisadas por eletroforese capilar de zona, de forma a obter intervalos de referência para as proteínas plasmáticas, desta espécie em Portugal. Este estudo seguiu as diretrizes da Sociedade Americana de Patologia Clínica Veterinária para a determinação de intervalos de referência, em animais. Métodos de estatística robusta foram utilizados para calcular intervalos de referência para as proteínas totais (2,8-4,3 g/dl), albumina (1,2-2,4 g/dl), α2-globulinas (0,1-1,2 g/dl), β-globulinas (0,1-1,4), γ-globulinas (0-0,6 g/dl) e rácio A/G (0,6-1,9). O intervalo de referência para a fração das α1-globulinas (0-0,5 g/dl) foi calculado por métodos não paramétricos. Uma diferença estaticamente significativa foi encontrada entre os resultados de machos e fêmeas na fração das α1-globulinas. A idade também influenciou o intervalo de referência para a fração γ-globulinas, sendo significativamente diferente entre ninhadas e filhotes ou adultos. Os intervalos de referência obtidos neste estudo foram comparados com os existentes na literatura, para a mesma espécie e podem ser utilizados como guia na avaliação do estado de saúde de Corujas-do-mato selvagens, admitidas em centros de recuperação de animais selvagens, em Portugal.
Palavras-chave: Eletroforese capilar de zona, Strix aluco, proteinograma, animais selvagens, globulinas, proteínas plasmáticas.
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Plasma protein electrophoresis is a key factor in the clinical setting of Wildlife Rehabilitation Centres. The use of this technic is mandatory for differentiating between acute and chronic inflammatory processes, in animals where no clinical history is available. Although several methods of proteins electrophoresis are available, capillary zone electrophoresis offers a better resolution for the interpretation of the proteinogram than gel-based technics. Tawny owls (Strix aluco) is a common nocturnal raptor in all of Europe, being one of the commonest species admitted in wildlife rehabilitation centres. The aim of this study is to define reference values for the different plasmatic protein fractions, by capillary electrophoresis. Heparinized blood samples were collected from 46 healthy Tawny owls admitted to the Wildlife Rehabilitation Centre of the Veterinary Hospital of The University of Trás-os-Montes e Alto Douro, between January 2015 and July 2017, and analysed by capillary zone electrophoresis, in order to obtain reference intervals for plasmatic proteins, for this species in Portugal. This study followed the guidelines of the American Society for Veterinary Clinical Pathology for the determination of reference intervals, in veterinary species. Robust methods were used for establishing reference intervals for total protein (2,8-4,3 g/dl), albumin (1,2-2,4 g/dl), α2-globulins (0,1-1,2 g/dl), β-α2-globulins (0,1-1,4), γ-α2-globulins (0-0,6 g/dl) e A/G ratio (0,6-1,9). α1-globulins (0-0,5 g/dl) reference interval was generated by means of non-parametric statistical methods. A statically significant difference was found between males and females results for the fraction of α1-globulins. Age was found to influence the interval for the γ-globulins fraction being significantly different between nestlings and fledglings or adults. The reference intervals obtained in this study were compared with those published in the literature for the same species and can be used as a guide in the evaluation of the health status of wild Tawny owls admitted to wildlife rehabilitation centres, in Portugal.
Key words: Capillary zone electrophoresis, Strix aluco, proteinogram, wildlife, globulins, plasma proteins.
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NOTA INTRODUTÓRIA 1
1. CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5
1.1. Proteínas plasmáticas 5
51.2. Estudo das proteínas plasmáticas das aves 6
1.3. Mensuração das frações proteicas 8
1.4. Eletroforese das proteínas plasmáticas das aves 9
1.4.1. Eletroforese em gel de agarose 9
1.4.2. Eletroforese capilar de zona 10
1.5. Proteinograma 13
1.6. Proteinograma das aves 13
1.6.1. Prealbumina 14
1.6.2. Albumina 15
1.6.3. Globulinas 15
1.6.4. Proteínas de fase aguda 16
1.6.5. Proteínas do Complemento 18
1.6.6. Imunoglobulinas 19
1.7. Avaliação do perfil eletroforético normal das aves 20
1.8. Disproteínemias 23
1.8.1. Hipoproteinemia 23
1.8.2. Hiperproteinemia 23
1.9. Importância clínica da eletroforese das proteínas plasmáticas em
aves selvagens
25
1.10. Alterações não patológicas que conduzem a variações do perfil
eletroforético
26
1.10.1. Alterações fisiológicas 26
1.10.2. Erros de determinação pré-analíticos e analíticos 28
2. CAPÍTULO II – OBJETIVOS 31
3. CAPÍTULO III - MATERIAIS E MÉTODOS 33
3.1. Caracterização da amostra 33
3.2. Critérios de inclusão 34
xi
3.4. Avaliação do perfil proteico 35
3.4.1 Eletroforese capilar 35
3.4.2 Análise dos dados 36
4. CAPÍTULO IV – RESULTADOS 37
4.1. Caracterização da população em estudo 37
4.2. Dados obtidos por eletroforese 39
5. CAPÍTULO V –DISCUSSÃO 45
6. CAPÍTULO VI –LIMITAÇÕES DO TRABALHO 51
7. CAPÍTULO VII –CONCLUSÃO 53
xii Figura 1 Coruja-do-mato (Strix aluco) em recuperação no
CRAS-HVUTAD.
1
Figura 2 Esquema representativo do processo de eletroforese capilar. 12 Figura 3 Padrões eletroforéticos normais de várias espécies de aves. 22 Figura 4 Padrões eletroforéticos em animais com doenças infeciosas. 25 Figura 5 Perfis eletroforéticos com géis de eletroforese de amostras com
graus elevados de lipemia (A) e de hemólise (B).
29
Figura 6 Perfis eletroforéticos de um Milhafre-preto (Milvus migrans) realizados num sistema semiautomático de eletroforese em gel de agarose (A) e num sistema de eletroforese capilar de zona (B).
30
Figura 7 Mapa de Portugal. A azul encontram-se as regiões de onde foram resgatados os animais admitidos no estudo.
37
Figura 8 Proteinograma padrão obtido por eletroforese capilar de zona da Coruja-do-mato (Strix aluco) com o número V086/16.
40
Figura 9 Proteinograma padrão obtido por eletroforese capilar de zona da
Coruja-do-mato (Strix aluco) com o número 2835/N550.
40
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1 Distribuição dos 46 animais incluídos no estudo, de acordo com o grupo etário.
38
Gráfico 1 Distribuição dos 22 animais de acordo com o género. 38
Gráfico 2 Análise de variância e dos círculos de comparação do teste t de Student, demonstrando a diferença entre médias para a fração das alfa 1-globulinas, segundo o género da Coruja-do-mato (Strix
aluco).
xiii Gráfico 3 Análise de variância e dos círculos de comparação do teste t de
Student, demonstrando a diferença entre médias para a fração das gamaglobulinas, segundo a idade da Coruja-do-mato (Strix
aluco).
43
Gráfico 4 Análise de variância e dos círculos de comparação do teste t de Student, demonstrando a diferença entre médias para a fração gamaglobulinas, entre crias e adultos fêmeas de Coruja-do-mato (Strix aluco).
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ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 APPs detetadas em diferentes espécies de aves. 17
Tabela 2 Distribuição das diferentes proteínas identificadas no plasma de aves pelas frações do proteinograma.
21
Tabela 3 Alterações nas frações proteicas e doenças a elas associadas. 24 Tabela 4 Descrição dos 46 animais incluídos no estudo, de acordo com o
género e a idade.
39
Tabela 5 Valores de referência obtidos por eletroforese das proteínas plasmáticas da Coruja-do-mato (Strix aluco).
41
Tabela 6 Valor de P obtido pelo teste t de Student para as médias dos diferentes parâmetros segundo o género da Coruja-do-mato (Strix
aluco)
41
Tabela 7 Comparação entre o presente estudo e outros estudos publicados para os valores da média, mínimo e máximo obtidos para cada parâmetro em proteinogramas de Coruja-do-mato (Strix aluco).
xiv
α – nível de significância µm - micrometro
A/G – rácio albumina/globulinas Alb - albumina
APPs - proteínas de fase aguda AST - Aspartato-amino-transferase CI – intervalo de confiança
CRAS-HVUTAD - Centro de Recuperação de Animais Selvagens do Hospital Veterinário da UTAD
CRP – Proteína C reativa dL - decilitro
g - unidade de aceleração aproximadamente igual à aceleração devida à gravidade na superfície da Terra
g/dL – Grama por decilitro g/mL – Grama por mililitro
GNR – Guarda Nacional Republicana h – hora
HSD - diferença honestamente significativa HT - hematócrito
Ig – imunoglobulina IL-1 - Interleucina-1 IL-6 - Interleucina-6 m - minuto
MBL – Lecitina de ligação à manose mL – mililitro
n - amostra
p – significância estatísitica
PCR – Polymersase Chain Reaction pg/mL – picograma por mililitro
xv
Pre - prealbumina PT – proteínas totais
TNF-α - fator de necrose tumoral-α
UTAD – Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro UV - ultravioleta
1 NOTA INTRODUTÓRIA
A clínica de animais selvagens é um ramo da Medicina Veterinária que tem despertado interesse, entre a classe médico-veterinária, nos últimos anos. O papel do médico veterinário na conservação de espécies ganhou também relevância com a necessidade de enfrentar as grandes dificuldades que a comunidade internacional atravessa, na tentativa de reduzir o impacto do Homem sobre a taxa de extinção das espécies que connosco coabitam, no planeta Terra. O trabalho desenvolvido nos centros de recuperação de animais selvagens é visto como uma primeira linha de uma rede de epidemiovigilância que se espera vir a desempenhar um papel fulcral na deteção surtos de doenças, mas também de novos impactos das atividades antropogénicas sobre as populações selvagens. Os esforços realizados na recuperação de espécies em risco de extinção são mediatizados, promovendo globalmente a criação de legislação e de estruturas que permitam a conservação de espécies e habitats. No entanto, o trabalho dos centros de recuperação com espécies mais comuns revela-se essencial para a promoção do equilíbrio entre a conservação e as atividades humanas. As espécies que são admitidas em maior número nos centros de recuperação, permitem um olhar mais abrangente sobre a saúde dos ecossistemas.
Durante os últimos 15 anos mais de uma centena de Corujas-do-mato foram admitidas no Centro de Recuperação de Animais
Selvagens do Hospital Veterinário da UTAD (CRAS-HVUTAD). As causas de admissão foram variadas, mas, a sua maioria resulta da atividade humana, direta ou indireta.
A Coruja-do-mato (Figura 1) é uma das aves de rapinas noturnas, pertencente à família dos Strigiformes, mais comuns em toda a Europa (Gooders, 1986). É caracterizada como sendo uma ave de rapina de médio porte e compacta. Com comprimento entre os 37 e os 43 cm, o seu peso varia entre as 350g e as 530g nos machos e os 365g a 575g nas fêmeas (Svenson, 2009). Sem dimorfismo sexual, as fêmeas
Figura 1 Coruja-do-mato (Strix aluco) em recuperação no CRAS-HVUTAD.
NOTA INTRODUTÓRIA
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parecem ser maiores do que os machos, o que não permite, no entanto, a sua distinção (Lack, 1986; Martínez, et al., 2002).
A identificação desta espécie é relativamente fácil devido à coloração da sua plumagem. Esta varia entre o castanho acinzentado e o castanho arruivado, num padrão malhado. A coloração é independente da idade e do género estando ligada, aparentemente, à temperatura de incubação, pelo que nas latitudes mais a sul da Europa predomina a fase castanho-arruivada e no Norte a fase acinzentada (Galeotti & Cesaris, 1996). Em Portugal a subespécie residente, Strix aluco sylvatica, pode ser confundida em voo com a Coruja-do-nabal (Asio flammeus) ou com o Bufo-pequeno (Asio otus), em função do seu porte médio, no entanto, as suas asas curtas e arredondadas (envergadura de 81 a 96 cm) são relativamente diferentes das dessas espécies. Ao perto, a sua identificação é facilitada pela sua coloração, cabeça grande e arredondada com um disco facial bem marcado e olhos castanhos, tornando-a inconfundível (Svenson, 2009).
Amplamente distribuída pelo Paleártico, pode ser escutada desde a Península Ibérica até à Rússia, existindo populações em regiões do médio oriente e no Norte de África (International, 2017). É uma espécie residente em Portugal Continental que pode ser encontrada de norte a sul do país, estando classificada com um estatuto de Pouco Preocupante a nível europeu (International, 2017). A BirdLife International estimava, em 2015, que a população europeia era constituída por 535.000 a 949.000 casais. Em Portugal as estimativas apontam para a existência de 1000 a 10,000 casais, um intervalo largo devido ao facto de parte do território não ter sido estudado durante os censos (Atlas, 2008; International, 2017).
Esta espécie prefere florestas e bosques mistos, parques e campos agrícolas, como habitat, podendo também ser encontrada em florestas de coníferas e zonas urbanizadas. Durante o Inverno podem ser encontradas em edifícios devolutos e cavidades rochosas que podem utilizar como abrigo (Lack, 1986; Svenson, 2009).
A Coruja-do-mato é considerada um predador generalista, sendo que a sua dieta depende das presas que encontra no seu habitat. Pode alimentar-se de micromamíferos, que usualmente constituem grande parte da dieta, outras aves, anfíbios, répteis e insetos (Adánez, 2000; Cramp, 1985). As Corujas-do-mato são territoriais pelo que a sua dieta depende diretamente das presas presentes nesse território (Adánez, 2000). Um estudo realizado na Polónia demonstrou existir uma grande diferença nas presas consumidas por Corujas-do-mato, entre animais que viviam em ambiente urbano e animais que viviam em áreas rurais (Zalewski, 1994).
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A parada nupcial desta espécie é longa e ruidosa. Normalmente tem inicio no Outono, sendo que corresponde à altura do ano em que estes animais se tornam audíveis com mais frequência. Segue-se um período de escolha do ninho, usualmente cavidades em árvores velhas e ocas, mas, também podem utilizar estruturas construídas pelo homem ou ninhos antigos de gralhas ou de outras aves rapina. A postura geralmente acontece entre março e abril e geralmente é composta por 2 a 4 ovos com 24 a 48h de diferença. A incubação é realizada pela fêmea durante 30 dias, período durante o qual o macho se responsabiliza pela alimentação da mesma. Esta função mantém-se até as crias abandonarem o ninho, altura em que a fêmea auxilia o macho na alimentação das mesmas até serem capazes de caçar (Birds, 2017).
Esta coruja é um animal com uma atividade essencialmente noturna. Utiliza o seu elevado sentido de audição para detetar as presas, caçando a partir de um poleiro, podendo, no entanto, caçar em voo. Estes poleiros são utilizados de forma regular e são facilmente identificáveis pelo acumular de egagropilos nas imediações. Animal agressivo durante a época reprodutiva, pode atacar possíveis ameaças em redor do ninho (Cramp, 1985).
Os principais fatores de ameaça para esta espécie foram identificados como sendo a fragmentação do habitat, a utilização de inseticidas, a caça ilegal e a colisão com veículos motorizados (Redpath, 1995).
5 1. CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1. Proteínas plasmáticas
O plasma sanguíneo é o compartimento sanguíneo de maior expressão perfazendo cerca de 55% do volume do sangue total. É constituído por vários componentes, sendo que estes apresentam funções diferentes. Entre estes encontram-se as proteínas plasmáticas, macromoléculas formadas por uma ou mais cadeias de aminoácidos, com funções distintas. Entre elas encontramos o transporte e armazenamento de lípidos, hormonas, vitaminas e minerais, a regulação do equilíbrio osmótico e ácido-base, a regulação da atividade celular e do sistema imunitário (Anderson & Anderson, 2002; Eckersall, 2008; Schaller, et al., 2008). Às proteínas plasmáticas são ainda atribuídos papéis importantes na hemóstase, com intervenção direta na coagulação e fibrinólise, como fatores fundamentais do complemento, e ainda como enzimas e inibidores de protéases (Schaller, et al., 2008). A atividade biológica das proteinas plasmáticas está intrinsecamente dependente da sua estrutura molecular (Eckersall, 2008; Schaller, et al., 2008). A maioria das proteínas plasmáticas é sintetizada pelos hepatócitos, no entanto uma importante fração, as imunoglobulinas, são produzidas pelo sistema imunitário, mais concretamente pelos sistemas reticuloendotelial e sistema linfoide (Eckersall, 2008). Outros órgãos podem também estar envolvidos na produção de proteínas plasmáticas tal como os intestinos, os pulmões, o tecido adiposo e a glândula mamária, durante episódios inflamatórios (Eckersall, 2008). Virtualmente, todas as proteínas sintetizadas no corpo podem estar presentes no plasma, num determinado momento, dependendo do estado fisiológico do animal. As proteínas normalmente ausentes do plasma, podem funcionar como marcadores específicos para determinadas doenças (Schaller, et al., 2008). Até à data, foram identificadas 10546 proteínas no plasma humano (http://www.plasmaproteomedatabase.org/) (Human Proteome Organization's, 2017). As proteínas encontradas em maior concentração no plasma incluem a albumina, as globulinas, a haptoglobina, a transferritina e lipoproteínas, sendo que estas encontram-se em concentrações na ordem das g/mL. Outras proteínas plasmáticas têm uma concentração muito menor, sendo que as interleucinas são mensuradas apenas em pg/mL (Schaller, et al., 2008).
A concentração de determinadas proteínas plasmáticas é afetada pelo estado fisiológico do indivíduo. A idade é um fator determinante uma vez que os recém-nascidos apresentam níveis mais baixos de imunoglobulinas. As concentrações de proteínas plasmáticas
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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sofrem uma evolução gradual até à idade adulta, verificando-se normalmente um aumento da concentração total das proteínas plasmáticas associado a uma ligeira diminuição dos níveis plasmáticos de albumina em contraste com o aumento progressivo da concentração das globulinas (Eckersall, 2008). A concentração total de proteínas plasmáticas varia também com o estado reprodutivo, em função da atividade hormonal. As hormonas como a testosterona, estrogénios e hormona de crescimento têm efeitos anabólicos, conduzindo a um aumento das proteínas plasmáticas, enquanto que as hormonas como a tiroxina e o cortisol produzem o efeito inverso (Eckersall, 2008).
1.2. Estudo das proteínas plasmáticas das aves
O estudo das proteínas plasmáticas tem sido considerado como quase indispensável no diagnóstico de várias doenças em medicina humana e veterinária (Cray & Tatum, 1998; Eckersall, 2008). É utilizado como meio complementar de diagnóstico de doenças inflamatórias e infeciosas agudas ou crónicas, doenças com perda de proteína renal ou gastrointestinal, imunodeficiências ou paraproteinemias, como nos casos de neoplasia linfoide ou plasmocítica (Werner, 1999; Eckersall, 2008). A sua utilização em medicina veterinária tornou-se usual na última década, à medida que o aperfeiçoamento das técnicas de eletroforese e a publicação de estudos espécie-específicos foi avançando (Cray, et al., 2007; Bailey, 2015). A determinação isolada das proteínas plasmáticas raramente poderá conduzir ao diagnóstico de uma doença específica, contudo, a conjugação dos resultados com outros exames complementares, como o hemograma, tem impacto na decisão clínica e no estabelecimento do prognóstico (Rosenthal, 2000; Lumeij, 2008). Assim, vários autores aconselham a inclusão da mensuração das proteínas plasmáticas no painel analítico inicial, quer em animais saudáveis, quer em animais com sintomatologia inespecífica ou gravemente doentes (Werner, 1999; Rosenthal, 2000; Tatum, et al., 2000).
O estudo das proteínas sanguíneas pode ser efetuado em plasma ou em soro. É necessário ter em conta que o soro é obtido após a coagulação do sangue colhido sem anticoagulante e deixado em repouso durante pelo menos 20 minutos. Uma vez ativada a coagulação, o fibrinogénio da amostra é consumido e, portanto, encontra-se ausente no soro (Eckersall, 2008; Mellilo, 2013). O baixo volume de sangue recolhido na maioria das aves torna imprescindível a utilização de tubos com anticoagulante, usualmente heparina lítio, ou a
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heparinização da seringa de colheita, uma vez que a mesma amostra terá de ser utilizada para outros fins (ex. hemograma). Assim, na maioria dos casos, o estudo das proteínas plasmáticas das aves é realizado em plasma (Mellilo, 2013; Werner, 1999). A utilização de plasma ou soro no estudo das proteínas plasmáticas continua a ser um ponto de discórdia entre autores. O principal argumento a favor da utilização do plasma, deve-se ao facto do fibrinogénio ser uma proteína de fase aguda positiva, pelo que em estados inflamatórios a sua concentração no sangue circulante aumenta (Joseph, 1999; Rosenthal, 2000).
A concentração de proteínas plasmáticas totais das aves é, em regra geral, menor do que a dos mamíferos, situando-se num intervalo entre 2,5 a 4,5 g/dL. A quantificação das proteínas totais é um procedimento básico do estudo das proteínas plasmáticas. A sua determinação é necessária para a avaliação complementar das concentrações das diferentes frações (Jenkins, 1999; Campbell, 2012). A mensuração das proteínas plasmáticas pode ser realizada quer através de métodos químicos, quer através de métodos físicos. Os métodos químicos são mais utilizados nos laboratórios de diagnóstico uma vez que facilmente são adaptados aos analisadores automáticos. No entanto, na prática clínica, a mensuração do valor das proteínas totais (plasmáticas ou séricas) pode ser rapidamente obtida através da utilização de um refratómetro (Eckersall, 2008; Allison, 2012). O método do biureto foi descrito por Gornall e colaboradores em 1949 e continua a ser a técnica de referência, quer em analisadores de química líquida, quer como método base em dispositivos de química seca, para a determinação das proteínas totais plasmáticas. A sua sensibilidade permite a determinação das proteínas totais em soluções onde a concentração se encontre entre 1 a 10 g/dL (Gornall, et al., 1949; Eckersall, 2008). Apesar da maioria dos laboratórios utilizarem padrões de medicina humana para a determinação das proteinas totais, vários estudos demonstraram uma elevada correlação entre os resultados obtidos quando se utilizam estes padrões e os que se obtêm quando são usados padrões para outras espécies, pelo que se aconselha que os valores de referência sejam estabelecidos para cada espécie num determinado laboratório (Lumeij, 2008).
A refratometria é utilizada frequentemente na prática clínica para a rápida determinação das proteínas séricas ou plasmáticas. Os refratómetros utilizam o princípio da refração da luz para avaliar a concentração de proteína em relação ao índice de refração da água (Allison, 2012; Eckersall, 2008). Por esta razão, os valores obtidos em amostras de plasma são ligeiramente mais elevados do que em amostras de soro do mesmo animal, uma vez que o plasma conserva o fibrinogénio (Allison, 2012). Este método apresenta uma boa correlação com
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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o método do biureto existindo, no entanto, uma margem de erro de 0.6 g/dL no cão e de 0.2 g/dL no gato (Briend-Marchal, 2005). Lumeij e Maclean em 1996 demonstraram uma maior margem de erro entre a refratometria e o método do biureto para a determinação das proteínas totais em amostras de plasma e soro de pombos (Lumeij & Maclean, 1996). A refratometria tende a sobrestimar a concentração das proteínas totais em aves. A alta concentração de glucose e de cromogéneos no sangue das aves conduz a sobrestimação deste método em relação ao método do biureto (Anderson, 1989; Harr, 2002). Os fatores como a lipemia e a hemólise causam turbidez da amostra dificultando a correta mensuração das proteínas por refratometria (Allison, 2012; Eckersall, 2008).
1.3. Mensuração das frações proteicas
A identificação e quantificação das proteínas plasmáticas numa determinada amostra só pode ser alcançada se se conseguir separar as diferentes proteínas ou mensurá-las diretamente de forma independente. O fracionamento proteico permite a identificação de biomarcadores e aporta informação crítica para a prática clínica (Ahmed, 2009).
As proteínas plasmáticas são separadas normalmente em duas frações, albumina e globulinas. O estudo básico do total destas frações é realizado através da determinação inicial das proteínas totais e da albumina, o que permite estimar, por diferença, o valor da fração correspondente às globulinas (Eckersall, 2008). A mensuração da albumina plasmática é realizada, por rotina, em analisadores automáticos segundo o método colorimétrico do verde de bromocresol, utilizando padrões de albumina humana. Este método não é fiável para a determinação da albumina das aves tendo demonstrado enormes diferenças em relação aos valores obtidos por eletroforese em patos, galinhas, perus, pombos e pinguins (Lumeij, et al., 1990; Schmidt, 2012; Spano, et al., 1998; Cray, et al., 2011).
A eletroforese das proteínas plasmáticas é o método de eleição para o estudo das diferentes frações proteicas das aves (Lumeij, et al., 1990; Schmidt, 2012; Spano, et al., 1998; Cray, et al., 2011).
9 1.4. Eletroforese das proteínas plasmáticas das aves
A eletroforese é um método analítico que se baseia no movimento de partículas carregadas eletricamente através de uma solução, quando esta é submetida a um campo elétrico. A utilização de técnicas de eletroforese na clínica laboratorial é empregue no estudo das proteínas sanguíneas. Quando as proteínas de soro ou pasma são submetidas a um diferencial elétrico sobre uma substância condutora, estas migram de acordo com a sua carga, peso e forma molecular, intensidade do campo elétrico, meio de suporte utilizado e temperatura. No laboratório, a temperatura, o meio de suporte e a intensidade do campo elétrico são padronizados e mantidos de forma constante, pelo que o movimento das moléculas depende assim das suas características intrínsecas. Assente neste princípio, espera-se que diferentes proteínas migrem a velocidades, distâncias e possivelmente direções diferentes (Weiser, 2012). Vários métodos foram descritos desde a publicação inicial sobre a separação das proteínas séricas por Tiselius em 1937. A principal diferença entre os métodos está assente no meio de suporte utilizado. Na década de 50 do século passado as membranas de acetato de celulose tornaram-se o meio de suporte de eleição (Kohn, 1957). Nos finais do século passado surgiram novos métodos e equipamentos para aplicação clínica da eletroforese. A introdução de sistemas semiautomáticos utilizando gel de agarose como meio de suporte (Cray, et al. 2011), foi posteriormente acompanhada por inovações como os sistemas de eletroforese alta de resolução em gel de agarose (Kummrow, et al., 2012) e em gel de poliacrilamida (Weiser, 2012), e os sistemas de eletroforese capilar (Roman, et al. 2013). A eletroforese de duas dimensões é utilizada como ferramenta de investigação e ainda não foi validada para a sua utilização na prática clínica veterinária. A sua capacidade de separação e identificação das proteínas recorrendo a técnicas de proteómica, abrem um promissor novo mundo no futuro do estudo das proteínas sanguíneas em medicina veterinária (Eckersall, 2008).
1.4.1. Eletroforese em gel de agarose
A eletroforese em gel de agarose tornou-se rapidamente o sistema mais utilizado nos laboratórios clínicos devido à sua facilidade de execução e relativa pequena amostra de soro ou plasma necessária (Eckersall, 2008).
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
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O gel de agarose é obtido a partir do extrato de algas, sendo um material com uma base de polissacarídeos. Quando este é usado em concentrações de aproximadamente 1%, proporciona um meio onde as proteínas séricas ou plasmáticas podem mover-se de forma relativamente livre. Os sistemas comerciais proporcionam assim um método mais rápido e fiável de manusear, corar e mensurar os resultados. A amostra de soro é colocada sobre a superfície do gel, ligeiramente mais perto do cátodo e após a sua difusão uma corrente elétrica é aplicada ao gel e as proteínas demonstram a sua carga, migrando através do gel em direção ao ânodo ou ao cátodo. A um pH de 8,6 a maior parte das proteínas apresenta uma carga negativa migrando assim em direção ao ânodo. A albumina nestas condições apresenta uma carga fortemente negativa e, devido às suas reduzidas dimensões, migra rapidamente em direção ao ânodo. As globulinas, moléculas menos carregadas negativamente, apresentam uma migração mais curta e geralmente em direção ao cátodo. A eletroforese em gel de agarose permite a identificação de várias frações de globulinas, α1, α2, β1, β2, γ1 e γ2. No entanto, estas
podem não ser identificáveis em todos as espécies ou mesmo em todas as amostras do mesmo indivíduo (Eckersall, 2008).
Após a eletroforese segue-se a fixação e a coloração (com o corante negro de amido) e leitura automática por densitometria, resultando na obtenção de um gráfico de distribuição das proteínas acompanhado das percentagens relativas de cada fração. Estes resultados são utilizados em conjunto com a determinação das proteínas totais (pelo método do biureto), para obter as concentrações relativas de cada fração (Eckersall, 2008).
1.4.2. Eletroforese capilar de zona
A eletroforese capilar diferencia-se das outras técnicas por ocorrer no interior de um capilar de diâmetro reduzido. Estes capilares produzidos em sílica, apresentam diâmetros que podem variar entre os 20 e 100 µm, sendo que a parede dos mesmos apresenta uma espessura maior ao seu diâmetro de modo a dar resistência ao mesmo. Estes capilares são normalmente revestidos por uma cobertura de poliamida de modo a manter a temperatura constante durante a aplicação da carga elétrica (Whatley, 2001).
O processo de separação das proteínas no interior do capilar respeita os princípios da eletroforese. Os capilares apresentam várias vantagens em relação aos métodos tradicionais,
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uma vez que o seu diâmetro estreito em relação ao seu comprimento, impede a difusão lateral das substâncias e as suas paredes revestidas diminuem o diferencial de temperatura entre as suas paredes e o lúmen do capilar. Outra vantagem advém da elevada relação entre superfície de contacto e volume da amostra no interior de um capilar. Ao aplicarmos um campo elétrico a um fluído em contacto com as paredes, eletricamente carregado nos capilares, surge um movimento superficial de distribuição das cargas, o fluxo eletroendosmótico. As paredes de sílica dos capilares podem ser facilmente hidrolisadas de modo a adquirirem uma carga elétrica negativa que atrai catiões da solução no interior dos capilares formando assim uma dupla camada elétrica. A exposição a um campo elétrico promove o movimento dos catiões em direção ao cátodo, provocando o movimento da água e formando assim um fluxo através do capilar. Este fluxo, em condições de temperatura e pH constantes, é maior do que a força eletroforética, permitindo a distribuição das proteínas em relação ao seu peso molecular e carga, facilitando a leitura das mesmas. Como a carga molecular é influenciada pelo pH, os capilares são previamente lavados com uma solução tampão antes de cada análise e as amostras são diluídas na mesma (Whatley, 2001).
A deteção das proteínas é realizada diretamente no capilar, recorrendo a uma célula de deteção por fotometria de absorção. O software analisa os dados recolhidos, emitindo posteriormente os resultados em forma de gráfico, a partir do qual se obtêm as diferentes percentagens de cada fração proteica (Figura 2) (Whatley, 2001).
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
12 Figura 2 Esquema representativo do processo de eletroforese capilar. (Sebia, 2005) Adaptado de Capillarys Training Manual. Sebia , Inc. Georgia. 2005
A interpretação dos resultados obtidos por eletroforese capilar deve ser comparada com valores de referência criados com esta mesma técnica, sendo o mesmo válido para os outros métodos. Giordano e Paltrinieri (2010), em cães e gatos, demonstraram que existe um subfracionamento das proteínas, com formação de picos dentro das frações, que podem originar dificuldades de interpretação nas amostras processadas por eletroforese capilar. O estudo comparativo entre eletroforese capilar de zona e eletroforese em gel de agarose, para a avaliação das proteínas sanguíneas de três espécies diferentes de aves, demonstrou, no entanto, uma melhor identificação das frações proteicas no sistema de eletroforese capilar. De facto, segundo o estudo, a eletroforese em gel de agarose revelou uma baixa capacidade para a identificação da fração correspondente à prealbumina (Roman, et al. 2013). Tal como no estudo de Giordano e Paltrinieri (2010), vários picos correspondentes a subfrações proteicas foram identificados, não sendo ainda interpretáveis pelo que mais estudos devem ser efetuados (Roman, et al. 2013).
13 1.5. Proteinograma
A eletroforese permite a separação das proteínas plasmáticas em 4 frações básicas: albumina, α-, β-, γ-globulinas. As bandas reconhecidas na eletroforese são na realidade constituídas por uma ou mais proteínas, com propriedades intrínsecas e metabólicas diferentes. A interpretação dos perfis eletroforéticos não é, porém, transversal a todas as espécies (Keay & Doxey, 1982; Cray, et al., 2007). O tamanho, forma e número das frações exibidas no gráfico do perfil eletroforético varia com a espécie, até mesmo com a raça, sendo que as frações das β-globulinas e das γ-β-globulinas são onde se verificam a maior parte das diferenças (Fayos, et al., 2005).
Em medicina veterinária vários estudos foram conduzidos com vista ao estabelecimento de valores de referência para o perfil eletroforético de várias espécies. A eletroforese das proteínas séricas é uma técnica laboratorial de elevada importância, tanto na clínica de animais de companhia, como na clínica de cavalos e de animais exóticos (McGrotty & Knottenbelt, 2002; Riond, 2009; Cray & Tatum, 1998). O perfil eletroforético dos cães normalmente apresenta 6 frações distintas albumina, α1, α2, β1, β2, γ1 (Abate, et al., 2000; Fayos,
et al., 2005), assim como o dos gatos (Baker & Valli, 1988). No entanto, Gerou-Ferriani e colaboradores. em 2011, apresentaram um estudo, em gatos, onde as frações α podiam ser divididas em mais subfrações: α1a, α1b α2a, α2b, revelando uma necessidade de padronização dos
valores de referência (Gerou-Ferriani, et al., 2011).
1.6. Proteinograma das aves
A eletroforese das proteínas plasmáticas nas aves é considerada como um meio complementar de diagnóstico essencial na clínica de aves. É recomendada como a única forma fiável de mensuração da concentração da albumina e das globulinas. A sua importância é exponenciada pelo facto de animais com concentrações normais de proteínas totais poderem apresentar alterações significativas do perfil eletroforético (Lumeij, et al., 1990; Cray & Tatum, 1998). O proteinograma das aves varia mais entre as espécies de aves, do que as variações encontradas entre os mamíferos (Werner, 1999). As principais diferenças encontram-se nas concentrações de prealbumina, α1-globulinas e β-globulinas (Cray & Tatum, 1998).
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
14 1.6.1. Prealbumina
A prealbumina, ou transtirretina, é a proteína que se desloca de forma mais rápida durante a eletroforese, situando-se anodal à albumina, daí a sua designação de prealbumina, sendo responsável pelo transporte da tiroxina e do retinol por interação com a proteína transportadora deste último. Esta proteína é normalmente visível no perfil eletroforético do plasma dos primatas, aves e cavalos. No entanto, na maioria dos vertebrados esta proteína parece migrar juntamente com a albumina ou estar catodal a esta, o que torna impossível a sua diferenciação no perfil eletroforético (Larsson, et al., 1985; Chang, et al., 1999). Esta parece também ser a realidade em várias espécies de aves dando origem a perfis espécie-específicos. Um bom exemplo desta disparidade de valores pode ser encontrado quando comparamos o perfil eletroforético de periquitos (Melopsittacus undulatus) ou caturras (Nymphicus
hollandicus), em que a prealbumina pode representar 75% da fração conjunta da prealbumina
com a albumina, com a percentagem média da prealbumina na mesma fração no Papagaio-cinzento-africano (Psittacus erithacus), na qual a prealbumina não ultrapassa os 10%, sendo por vezes impercetível (Cray, et al., 2007). Vários fatores parecem influenciar os valores mensurados de prealbumina. A muda das penas provoca um aumento da prealbumina circulante no Ganso-cabeça-listrada (Anser indicus) e na Cegonha-branca (Ciconia ciconia), provavelmente pelo aumento das hormonas tiroideas circulantes responsáveis por este processo fisiológico (Roman, et al., 2009; Cookson, et al., 1988). Roman e colaboradores (2013) também descrevem uma grande discrepância entre os valores de prealbumina obtidos por eletroforese capilar de zona e por eletroforese em gel de agarose. Esta diferença substancial nos perfis obtidos, reforça a ideia de que os valores de referência para cada fração proteica devem ser definidos para cada técnica utilizada (Roman, et al. 2013).
A prealbumina é considerada uma proteína de fase aguda negativa. Ao ser produzida no fígado, a sua concentração diminui na presença de estados inflamatórios, de stresse prolongado e de malnutrição, sendo considerada um fator indicativo de prognóstico em doentes humanos geriátricos hospitalizados (Sullivan, et al., 1999; Beck & Rosenthal, 2002).
15 1.6.2. Albumina
A albumina é a maior fração identificável no perfil eletroforético da maior parte dos animais e as aves não são exceção (Lumeij, 2008). A sua carga negativa relativa coloca-a perto do ânodo, sendo a primeira fração facilmente identificável em muitas espécies (Eckersall, 2008).A albumina é a principal proteína responsável pela manutenção da pressão oncótica, sendo-lhe atribuída cerca de 80% da pressão osmótica coloidal (Eckersall, 2008). Tem também funções como proteína de transporte, assistindo no transporte de metabolitos endógenos como colesterol ou a bilirrubina, mas também, de metabolitos resultantes da administração de drogas como antibióticos, anti-inflamatórios, entre outros (Evans, 2002). A albumina assume um papel principal enquanto proteína de fase aguda negativa. Durante a produção das proteínas de fase aguda positivas, existe uma diminuição da atividade transcricional dos genes responsáveis pela produção de albumina, conduzindo a uma diminuição da sua síntese (Aldred & Schreiber, 1993; Mellilo, 2013).
1.6.3. Globulinas
As globulinas são um grupo heterogéneo de proteínas tradicionalmente divididas em 3 frações: α, β e γ. Estas podem ainda ser subdivididas em duas ou mais subfrações dependendo da espécie. Vários estudos demonstraram que a maioria das espécies de vertebrados estudadas apresenta uma ou duas subfrações das mesmas (Eckersall, 2008). As aves na sua generalidade parecem possuir apenas 2 subfrações α, uma subfração β e uma subfração γ (Cray & Tatum, 1998).
As globulinas são um grupo heterogéneo de proteínas que compreende proteínas de fase aguda e imunoglobulinas (Ig). As primeiras localizam-se nas frações α e β do proteinograma, as imunoglobulinas IgA e IgM podem ser encontradas na fração β, enquanto as IgΓ estão restritas à fração γ (Mellilo, 2013).
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
16 1.6.4. Proteínas de fase aguda
As proteínas de fase aguda, também designadas de APPs (abreviatura do inglês Acute Phase Proteins), são parte integrante da resposta de fase aguda, a pedra basilar da imunidade inata a qualquer agressão ao organismo. Estas proteínas sofrem alterações da sua concentração quando o organismo sofre algum tipo de agressão tecidular, quer seja de origem infeciosa, inflamatória, neoplásica ou traumática. Até mesmo o stresse pode mediar alterações nas concentrações de APPs (Gordon & Koy, 1985; Cray, 2012). É pelo facto destas alterações surgirem de forma aguda que as APPs são consideradas biomarcadores úteis na definição do prognóstico, no entanto, estudos em animais demonstraram que a sua mensuração pode ser extremamente útil como meio de diagnóstico em doenças subclínicas. Nos últimos 20 anos, as APPs têm sido utilizadas como biomarcadores tanto na medicina veterinária como na humana (Cray, 2012).
A produção de APPs é mediada pela resposta local, a primeira resposta à agressão tecidular. As citocinas pró-inflamatórias Interleucina-1 (IL-1), Interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-α (TNF-α, abreviatura em inglês de tumor necrosis factor), são as principais responsáveis pela sinalização dos hepatócitos para a produção de uma vasta gama de proteínas, com papéis diferentes na resposta de fase aguda (Cray, 2012). A produção de APPs foi também detetada noutros tecidos como o trato gastrointestinal, glândula mamária, rins e pulmões (Ramadori, et al., 1985; Vreugdenhil, et al., 1999). A resposta de fase aguda conduz a alterações em mais de 200 proteínas, aquelas que sofrem alterações em mais de 25% das suas concentrações são consideradas APPs. As proteínas de fase aguda podem ser denominadas como positivas ou negativas em função do aumento ou diminuição das suas concentrações, respetivamente (Kushner & Mackiewicz, 1985; Eckersall, 2008). Apesar da identificação de muitas APPs em vários animais, o seu papel na resposta de fase aguda difere de espécie para espécie e, por vezes, de indivíduo para indivíduo (Eckersall, 2008; Eckersall & Bell, 2010). Cada uma das proteínas de fase aguda positivas pode ser também classificada segundo a evolução da sua concentração sanguínea, durante a resposta de fase aguda, em maior, moderada ou menor. As APPs de resposta maior apresentam-se normalmente em muito baixas concentrações na circulação sanguínea, mas experimentam um aumento de concentração na ordem de até 1000 vezes a sua concentração basal, atingindo o pico passado 24 a 48 horas após o processo desencadeador e revertem rapidamente à sua concentração basal durante a
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recuperação. As proteínas de resposta moderada podem ser detetadas no sangue de animais saudáveis, mas aumentam duas a cinco vezes a sua concentração após o estímulo, sendo que o pico da sua concentração só acontece passados dois a três dias, a diminuição acontece mais lentamente e, portanto, encontram-se valores acima da média em animais em recuperação. As APPs de resposta menor apresentam um aumento gradual da sua concentração, na ordem dos 50% a 100% (Eckersall, 2008; Eckersall & Bell, 2010; Juul-Madsen, et al., 2014). Nas aves várias APPs foram identificadas e caracterizadas em relação à sua utilidade no diagnóstico e prognóstico de doenças. A tabela 1 resume a informação disponível.
Tabela 1 APPs detetadas em diferentes espécies de aves.
APP Espécie Referência
Amiloide A sérica Galinhas, falcões Landman, et al., 1996 Chamanza, et al., 1999 Nazifi, et al., 2010 Caliendo, et al., 2013 Fischer, et al., 2014
Glicoproteína α1-ácida Galinhas Nakamura, et al., 1996
Inoue, et al., 1997 Nakamura, et al., 1998 Takahashi, et al., 1998 Murata, et al., 2004 Sylte & Suarez, 2012 O'Reilly, 2014
Ovotransferrina Galinhas Xie, et al., 2002
Xie, et al., 2002a Rath, et al., 2009 Giansanti, 2012 Sylte & Suarez, 2012
Ceruloplasmina Galinhas, Buteo
jamaicensis
Disilvestro & Harris, 1985 Chamanza, et al., 1999 Georgieva, et al., 2010 Nazifi, et al., 2010 Lee, et al., 2015
Fibrinogénio Várias espécies Hawkey & Hart, 1988
Harr, 2002
Georgieva, et al., 2010 Nazifi, et al., 2010
PIT54 (haptoglobina) Várias espécies Iwasaki, et al., 2001 Ascenzi, et al., 2005 Millet, et al., 2007 Troisia, et al., 2007 Georgieva, et al., 2010
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18 Nazifi, et al., 2010 Nazifi, , et al., 2011 Goetting, et al., 2013 Fischer, et al. ,2014 Lee, et al., 2015
Hemopexina Galinhas Grieninger, et al., 1986
Adler, et al., 2001 Barnes, et al., 2002 Garcia, et al,. 2009 Tolosano, et al., 2010
Proteína C reativa (CRP) Galinhas Abernethy & Avery, 1941 Patterson & Mora, 1964 Patterson & Mora, 1965 Gruys, et al., 2005 Cray, et al., 2009 Seifi, et al., 2014
Lecitina de ligação à manose (MBL)
Galinhas Nielsen, et al., 1998
Nielsen, et al., 1999 Juul-Madsen, et al., 2003 Millet, et al., 2007 Schou, et al., 2010)
1.6.5. Proteínas do Complemento
O sistema do complemento é composto por mais de 30 proteínas, que circulam inativas na circulação sanguínea (Carroll & Sim, 2011). Quando entram em contacto com assinaturas moleculares de microrganismos, estas ativam-se de forma sequencial, dando origem a uma cascata de ativação na qual cada proteína ativada, ativa consequentemente a proteína seguinte. As proteínas do complemento são sintetizadas maioritariamente pelos hepatócitos, sendo que os macrófagos conseguem produzir os primeiros 4 fatores: C1, C2, C4 e C3. A ativação do complemento promove a fagocitose (opsonização) e a resposta inflamatória, estimula os linfócitos B e T e conduz à citólise das células afetadas (Carroll, 2004). A libertação de certas citocinas pró-inflamatórias conduz à ativação direta da C3 bem como a um aumento da concentração de MBL ou CRP que estimulam outra via do complemento (Juul-Madsen, et al., 2014).
Em mamíferos o complemento é ativado por três vias diferentes, denominadas de clássica, alternativa e via da lecitina. A via clássica é mediada por complexos anticorpo-antigénio, a via da lecitina pela interação das coletinas, como a MBL, com os ligantes exógenos e a via alternativa é conduzida pela hidrolise espontânea da C3 no plasma, ativando a cascata (Carroll & Sim, 2011).
19 1.6.6. Imunoglobulinas
As imunoglobulinas são proteínas de elevado peso molecular, compostas por quatro cadeias de aminoácidos, 2 pesadas e 2 leves. A composição das cadeias pesadas permite dividir as Ig em 5 grupos, nomeados de acordo com o alfabeto grego: gama (IgG), mu (IgM), alfa (IgA), épsilon (IgE) e delta (IgD) (Eckersall, 2008; Mellilo, 2013; Härtle, et al., 2014; Kaiser & Balic, 2015). Poucos foram os estudos realizados sobre a expressão das imunoglobulinas em aves, sendo que, apenas foram detetados 3 tipos de Ig: IgM, IgA e IgG (Härtle, et al., 2014; Kaiser & Balic, 2015).
IgM
A IgM das galinhas é estruturalmente e funcionalmente análoga à IgM dos mamíferos, apesar de ter um peso molecular diferente, o que pressupõe uma forma molecular diferente. A IgM é produzida e secretada pelos linfócitos-B e plasmócitos e é a primeira Ig a ser produzida após a apresentação de um antigénio. Tal como nos mamíferos, a produção de IgM é transitória, sendo um bom marcador do contacto agudo com o agente (Härtle, et al., 2014; Kaiser e Balic, 2015). A sua principal função parece ser a ativação do complemento (Mellilo, 2013).
IgA
A IgA é uma Ig comum a todos os mamíferos e provavelmente a todas as aves. É a forma predominante de Ig nas secreções corporais. Produzida por linfócitos B, esta Ig liga-se ao recetor na superfície da célula, formando um complexo denominado complemento secretor, o que permite à IgA, atravessar o citoplasma celular sem ser destruída pelas protéases e ser secretada no lúmen do órgão em questão (Härtle, et al., 2014; Kaiser & Balic, 2015). Esta Ig foi identificada em galinhas, perus, Galinha-d’angola, Codorniz-japónica e pombos (Parry & Aitken, 1975).
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
20 IgY (IgG)
Nas aves a IgY é uma Ig homóloga da IgG dos mamíferos, que apresenta similaridades com a IgE dos mamíferos também. Pensa-se que terá sido o predecessor evolucionário da IgG e da IgE dos mamíferos (Ratcliffe, 2006). A sua homologia com a IgG conduziu ao termo IgG aviar, no entanto uma vez que a nível molecular estas Ig são diferentes, o termo mais apropriado parece ser IgY (Bengten, et al., 2000). A IgY é a Ig predominante no soro das galinhas, sendo produzida tanto na resposta imunitária primária como na secundária (Härtle, et al. 2014). A sua produção é estimulada por bactérias, vírus ou tóxicos, atuando como opsoninas e permitindo a fagocitose do agente pelos macrófagos (Mellilo, 2013).
Tanto quanto é do conhecimento do autor, nada se sabe quanto às proteínas de fase aguda e Ig na espécie em estudo, a Coruja-do-mato.
1.7. Avaliação do perfil eletroforético normal das aves
O perfil eletroforético das aves é constituído por 5 a 6 frações proteicas. A tabela 2 mostra a distribuição das diferentes proteínas pelas diferentes frações do proteinograma. As frações correspondentes à albumina, α1-globulinas, α2-globulinas, β-globulinas e γ-globulinas, são comuns a todos os proteinogramas, a presença ou não da fração relativa à prealbumina, apresenta uma grande variação entre espécies (Lumeij, 2008). Nos psitacídeos, por exemplo, a prealbumina pode não ser mensurável em Psittacus erithacus e ser a maior fração detetável no plasma de Melopsittacus undulatus (Cray, et al., 2007). A albumina é normalmente a maior fração identificável no perfil eletroforético das aves. As diferenças entre espécies prosseguem na avaliação das globulinas. As α-globulinas normalmente são identificáveis em 2 frações distintas, mas, ao contrário dos psitacídeos onde a fração das α1-globulinas parece ser pouco expressiva (Cray, et al., 2007), esta fração pode, em aves de rapina, atingir os 27% das proteínas totais de um determinado individuo (Cray & Tatum, 1998). A fração das α1-globulinas é maioritariamente constituída por alfa1-antitripsina nas aves. A fração das α2-globulinas é marcada pela migração da α2-macroglobulina, uma das maiores proteínas no plasma das aves. A área das β-globulinas corresponde à fração onde estão representadas a ovotransferrina (transferrina), as beta-lipoproteinas, o complemento (Cray & Tatum, 1998), o fibrinogénio (Mellilo, 2013), a IgA e a IgM (Cray, et al., 2007). As γ-globulinas são a fração onde migram
21
as IgY e alguns produtos de degradação do complemento (Cray & Tatum, 1998). A tabela 2 resume as diferentes proteínas encontradas em cada fração nas aves.
Tabela 2 Distribuição das diferentes proteínas identificadas no plasma de aves pelas frações do proteinograma.
Fração Proteínas
Zona da albumina Prealbumina
Albumina Zona das α1-globulinas α1-antitripsina
Zona das α2-globulinas α 2-macroglobulina
Zona das β-globulinas Fibrinogénio Beta-lipoproteínas Ovotransferrina Complemento IgA
IgM
Zona das γ-globulinas IgΓ
Produtos de degradação do complemento
O cálculo do rácio Albumina/Globulinas é considerado como um excelente indicador de inflamação aguda. A adição da prealbumina à parcela da albumina, aumenta o valor de diagnóstico do rácio calculado e é justificada pelo facto de também ser uma APP negativa, (Mellilo, 2013).
As imagens seguintes (Figura 3) representam proteinogramas normais em várias espécies de aves.
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
22
~
Figura 3 Padrões eletroforéticos normais de várias espécies de aves. As frações proteicas são caracterizadas da esquerda para a direita em: Prealbumina, albumina, α1-globulinas, α2-globulinas, β-globulinas e γ-globulinas. A – Galinha (Cray, et al., 2007); B – Águia-de-cabeça branca (Haliaeetus leucocephalus) (Tatum, et al. 2000); C – Papagaio-cinzento-africano (Psittacus erithacus) (Cray, et al., 2007); D – Periquito (Melopsitaccus undulatus) (Cray, et al., 2007); E - Ganso-de-cabeça-listada (Anser indicus) (Roman, et al., 2009); F – Flamingo (Phoenicopterus ruber) (Delk, et al., 2015)
F α1 α2 β γ Pre Alb E α1 α2 β γ Pre Alb B α1 α2 β γ PreAlb
23 1.8. Disproteínemias
As alterações na concentração das proteínas plasmáticas têm sido estudadas ao longo dos anos e em várias espécies, de modo a que a eletroforese seja um meio complementar de diagnóstico útil para os clínicos. A interpretação dos resultados obtidos através da eletroforese das proteínas plasmáticas em conjunto com outros exames como o hemograma, a bioquímica sanguínea e/ou testes sorológicos, permite alcançar um diagnóstico e avaliar a progressão da doença (Cray & Tatum, 1998).
1.8.1. Hipoproteinemia
Nas aves, a hipoproteinemia pode estar associada com hipoalbuminemia, hipoglobulinemia ou ambas. A hipoproteinemia pode ser artefactual, em casos de sobrehidratação devido à administração de fluídos, ou patológica, associada a hemorragias graves, presença de derrames cavitários, nos casos de enteropatia ou glomerulopatia com perda de proteína. A hipoalbuminemia pode também ser o resultado de falha na produção de albumina, como nos casos de insuficiência hepática, má nutrição, má absorção intestinal ou hiperparasitismo intestinal (Campbell, 2012).
1.8.2. Hiperproteinemia
A hiperproteinemia resulta do aumento de uma ou mais frações proteicas no sangue circulante. Na maior parte das aves, corresponde à mensuração de um valor superior a 4,5 g/dL das proteínas plasmáticas, segundo o método do biureto. A hiperproteinemia pode ser um artefacto resultante da desidratação ou pode ser secundária a inflamações agudas ou crónicas. Nas fêmeas, a hiperproteinemia pode ser secundária ao desenvolvimento dos folículos na pré-ovulação. O aumento simultâneo das concentrações de albumina e das globulinas é indicativo de desidratação. A albumina, enquanto APP negativa, encontra-se normalmente em valores inferiores ao normal em situações inflamatórias, pelo que o aumento das globulinas conduz a uma redução do rácio albumina/globulinas. A foliculogénese induz uma hiperproteinemia, com
CAPÍTULO I – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
24
redução do rácio albumina/globulinas, devido ao estímulo para a produção de proteínas da gema que migram para a região das globulinas durante a eletroforese (Campbell, 2012).
As doenças inflamatórias agudas apresentam um perfil eletroforético onde a percentagem de albumina muitas vezes ainda é normal, mas existe um aumento das alfa e/ou beta globulinas. As gamaglobulinas podem ou não estar aumentadas. Já as doenças inflamatórias crónicas conduzem à hipoalbuminemia com aumento das imunoglobulinas, refletindo um aumento das frações beta e/ou gama (Campbell, 2012). Um resumo destas alterações e as suas possíveis interpretações é apresentado na tabela 3. Na figura 4 apresentamos alguns padrões eletroforéticos em diferentes espécies de aves com doenças infeciosas.
Tabela 3 Alterações nas frações proteicas e doenças a elas associadas.
Frações alteradas Doenças associadas
α-globulinas Inflamação/infeção aguda, foliculogénese (Dorrestein, 2008) α1: Parasitismo em psitacídeos (Cray & Tatum, 1998) α2: Nefrite aguda, síndrome nefrótico (Mellilo, 2013) α2: Doença hepatobiliar (Kummrow, et al., 2012) β-globulinas Inflamação/infeção aguda (Dorrestein, 2008)
Aspergilose (Cray & Tatum, 1998) Nefrite (Cray & Tatum, 1998) Hepatite (Cray & Tatum, 1998)
γ-globulinas Inflamação/infeção crónica (Dorrestein, 2008)
Gamopatia monoclonal secundária a neoplasia (Mellilo, 2013) α- e β-globulinas Inflamação/infeção aguda (Dorrestein, 2008)
β - e γ -globulinas Inflamação/infeção crónica ativa (Cray & Tatum, 1998) Aspergilose (Campbell, 2012)
Clamidiose (Campbell, 2012) Micobacteriose (Campbell, 2012) Sarcocistose (Cray & Tatum, 1998)
25
Figura 4 Padrões eletroforéticos em animais com doenças infeciosas. As frações proteicas são caracterizadas da esquerda para a direita em: Prealbumina (Pre), albumina (Alb), α1-globulinas (α1), α2-globulinas (α2), β-globulinas (β) e γ-β-globulinas (γ). A - Aspergilose em Papagaio amazonas (Amazonas spp.); B - Aspergilose em Bufo-real (Bubo bubo); C - Clamidiose aguda em Bútio-de-cauda-vermelha (Buteo jamaicensis); D - Clamidiose aguda em cacatua (Cacatua spp.). Adaptado de (Cray & Tatum, 1998).
1.9. Importância clínica da eletroforese das proteínas plasmáticas em aves selvagens
A clínica de animais selvagens apresenta-se como um ramo desafiante da Medicina Veterinária. A multiplicidade de espécies, a falta de informação acerca das mesmas e a escassa formação disponível nas universidades, conduz à necessidade de investigação para a obtenção e divulgação de conhecimento em múltiplas áreas. A definição de valores de referência normais é assim muitas vezes substituída pela definição de valores de referência em animais saudáveis, o que exclui obviamente os animais doentes. Na conceção destes intervalos de referência são assim incluídas as amostras dos animais saudáveis disponíveis, o que em muitos casos não reflete uma aproximação à população geral. Os fatores como a proveniência do animal (cativeiro vs selvagem), sazonalidade, estado nutricional ou estado reprodutivo podem ter uma grande influência nos resultados obtidos (Walton, 2001).
A eletroforese das proteínas plasmáticas tem sido utilizada como meio auxiliar de diagnóstico e como teste de despiste de doença na clínica de aves, tornando-se numa ferramenta extremamente útil em animais selvagens, onde uma história prévia não está normalmente
A Alb α1α2 β γ Pre C Alb α1 α2 β γ B Alb α1 α2 β γ Pre
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disponível. A sua aplicação na rotina clínica, em conjunto com outros testes, tem auxiliado no diagnóstico de doenças infeciosas, como a aspergilose, a clamidiose ou a micobacteriose, entre outras de origem não infeciosa como a peritonite associada ao ovo, ou doenças neoplásicas (Campbell, 2012). Vários estudos foram realizados com o intuito de estabelecer valores de referência para várias espécies/grupos de aves, comparando também os perfis eletroforéticos com os de outras espécies já conhecidos (Cray & Tatum, 1998; Tatum, et al., 2000; García-Montijano, et al., 2002; Spagnolo, et al., 2006; Spagnolo, et al., 2008; Jones, et al.,2014; Fischer, et al., 2014). Os estudos realizados demonstram uma grande variabilidade nos valores basais entre espécies, impedindo a extrapolação direta dos valores de referência. No entanto, existem semelhanças nos perfis eletroforéticos de várias espécies em resposta a doenças crónicas e agudas (Cray & Tatum, 1998).
1.10. Alterações não patológicas que conduzem a variações do perfil eletroforético
Vários fatores podem influenciar o perfil proteico do plasma sanguíneo, impedindo uma correta avaliação do mesmo. Conhecer estes fatores pode ajudar a prevenir uma má interpretação dos proteinogramas, auxiliando os clínicos a obter a informação mais acertada do perfil eletroforético (Eckersall, 2008).
1.10.1. Alterações fisiológicas
Idade, desenvolvimento e espécie
A concentração das diferentes proteínas plasmáticas muda com a faixa etária e fase de desenvolvimento em que cada indivíduo se encontra à data da sua mensuração. Em regra geral, ao longo da vida dos animais, a concentração das proteínas totais aumenta, enquanto a concentração de albumina desce, a concentração das globulinas aumenta. Em idade avançada, assistimos a uma diminuição geral das proteínas totais (Eckersall, 2008). Em várias espécies, durante as fases iniciais de desenvolvimento, existe um aumento gradual da albumina e das globulinas que, posteriormente, estabiliza. A fase a partir da qual se denota a diminuição da
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albumina é provavelmente diferente de espécie para espécie. Existe assim uma necessidade para a elaboração de valores de referência específicos para cada faixa etária (Clubb, et al., 1991; Eckersall & Bell, 2010).
A mudança da plumagem das aves corresponde a um período de enorme exigência proteica. Durante este período, de modo a que o animal não perca o isolamento térmico e a capacidade de voo, a síntese proteica é concentrada na produção de novas penas. Este período pode demorar várias semanas a meses, dependendo da espécie (Roman, et al. 2009). Foram realizados estudos em Patos-reais (Anas platyrhyncus) e Gansos-de-cabeça-listada (Anser
indicus) para avaliar o impacto da mudança de plumagem nas proteínas plasmáticas. Parece ser
concordante entre estas espécies o decréscimo das proteínas totais, albumina e globulinas, nesta fase (Driver, 1981; Roman, et al., 2009). A prealbumina aumenta significativamente nos gansos durante a época da muda, provavelmente devido ao seu papel no transporte das hormonas da tiroide, cuja concentração também aumenta durante este período (Hertzberg, et al., 1981; Roman, et al., 2009).
Género e estado hormonal
Muitas espécies de aves não apresentam dimorfismo sexual dificultando a interpretação do efeito do género no perfil eletroforético. Em psitacídeos foi demonstrado que as fêmeas durante o período reprodutivo apresentam picos monoclonais, normalmente na fração das β-globulinas, referentes ao aumento da transferrina e de percursores das proteínas da gema (Cray, 1997). A testosterona e os estrogénios têm efeitos catabólicos sobre as proteínas pelo que é de esperar alterações nas concentrações das proteínas plasmáticas quando existem altas concentrações destas hormonas em circulação. Pelo contrário, a tiroxina tem um efeito anabólico, conduzindo a uma diminuição da concentração de algumas proteínas plasmáticas (Eckersall & Bell, 2010).
Estado nutricional
O estado nutricional afeta diretamente a produção de proteínas pelo organismo. A falta de alimento conduz a uma diminuição da síntese proteica e consequente diminuição das proteínas plasmáticas. Já o aumento da disponibilidade de alimento conduz apenas a alterações subtis nas concentrações das proteínas plasmáticas. Em avestruzes alimentadas com uma dieta
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rica em proteínas, registou-se o aumento das α-globulinas e uma diminuição das γ-globulinas (Polat, et al., 2000). Já em frangos, o aumento do teor proteico da dieta conduziu a um aumento das proteínas plasmáticas totais através do aumento da concentração de albumina (Leveille & Sauberlich, 1961).
Stresse e desidratação
A temperatura corporal tem um efeito marcante sobre as proteínas plasmáticas. Tanto a febre como a hipotermia conduzem à perda de nitrogénio, ao aumento da atividade adrenal e consequente aumento do catabolismo proteico. Estas alterações na homeostase conduzem a uma diminuição das proteínas plasmáticas totais e da albumina, sendo que, na maioria das vezes, existe concomitantemente um aumento das α2-globulinas devido à ativação da resposta de fase aguda. O mesmo tipo de alterações é espectável em lesões por esmagamento, fraturas ósseas e cirurgias prolongadas. Durante a fase inflamatória os fluídos intravasculares e as proteínas plasmáticas migram para os tecidos afetados, originando o edema local, o que conduz a hipoalbuminemia (Eckersall, 2008).
A desidratação conduz a uma hiperproteinemia por hemoconcentração.
1.10.2. Erros de determinação pré-analíticos e analíticos
A colheita, conservação e preparação das amostras podem ter efeitos artefactuais sobre o proteinograma. As amostras hemolisadas ou lipémicas devem ser desprezadas devido às alterações que produzem no perfil eletroforético. A hemólise conduz à formação de um pico na fração das γ-globulinas e à alteração do rácio albumina/globulinas. A lipemia, por outro lado, conduz à formação de um pico estreito na região das β-globulinas e induz, também, a uma diminuição do rácio albumina/globulinas (Figura 5) (Cray, et al., 2007).
