Análise do polimorfismo genético da lectina de ligação da manose (MBL) e a doença periodontal em diabéticos

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO CLÍNICA INTEGRADA NATÁLIA COSTA ARAÚJO. ANÁLISE DO POLIMORFISMO GENÉTICO DA LECTINA DE LIGAÇÃO DA MANOSE (MBL) E A DOENÇA PERIODONTAL EM DIABÉTICOS. Recife – PE 2009.

(2) NATÁLIA COSTA ARAÚJO. ANÁLISE DO POLIMORFISMO GENÉTICO DA LECTINA DE LIGAÇÃO DA MANOSE (MBL) E A DOENÇA PERIODONTAL EM DIABÉTICOS. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Odontologia com área de concentração em Clínica Integrada. Orientadora: Profª. Drª. Renata Cimões Jovino Silveira Co-orientador: Prof. Dr. Paulo Roberto Eleutério de Souza. Recife – PE 2009.

(3) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR Prof. Dr. Amaro Henrique Pessoa Lins VICE-REITOR Prof. Dr. Gilson Edmar Gonçalves e Silva PRÓ-REITOR DA PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DIRETOR Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro COORDENADOR DA PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Prof. Dr. Jair Carneiro Leão PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA ODONTOLÓGICA INTEGRADA COLEGIADO Profa. Dra. Alessandra de Albuquerque T. Carvalho Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva Prof. Dr. Etenildo Dantas Cabral Prof. Dr. Geraldo Bosco Lindoso Couto Prof. Dr. Jair Carneiro Leão Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro Profa. Dra. Liriane Baratella Profa. Dra. Lúcia Carneiro de Souza Beatrice Profa. Dra. Renata Cimões Jovino Silveira Profa. Dra. Silvana Maria Orestes Cardoso SECRETARIA Oziclere de Araújo Sena.

(4) Recife – PE 2009.

(5) Agradecimentos Especiais.

(6) Agradecimentos especiais. A Deus por me dar forças e saúde para enfrentar mais uma etapa de minha vida e por sempre ter iluminado meus passos.. A minha mãe, Fátima, por seu amor e dedicação ao longo de toda a minha vida.. Ao meu pai, Williams, pela educação que me foi proporcionada.. A minha irmã, Marília, pela amizade e apoio durante a realização deste trabalho.. A minha irmã, Cecília, pelos bons momentos vividos.. Ao meu namorado, Igor, porque Deus também atua através das pessoas.. Aos meus avós, Manoel Arthur e Gisélia, exemplos de fé e perseverança a serem seguidos.. Aos meus familiares por todo amor e carinho.. Aos meus amigos de infância, Érika Rebeca, Juliana Paes, Alice Maranhão, Fernando Antônio e Renata Medeiros (in memorian), pelo companheirismo, confiança e fidelidade..

(7) Agradecimentos.

(8) Agradecimentos Aos professores do curso de Graduação da Faculdade de Odontologia de Pernambuco (FOP) responsáveis pela minha formação acadêmica, em especial, à Profª. Drª. Verônica Maria de Sá Rodrigues e à amiga Patrícia Maria de Andrade que me apresentaram o mundo científico.. Aos professores do curso de Pós-Graduação da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) que contribuíram com seus ensinamentos para o sucesso deste trabalho.. A minha orientadora. Profª. Drª. Renata Cimões, pela sua dedicação, competência e. principalmente pelos conhecimentos transmitidos para o meu crescimento profissional.. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Paulo Roberto Eleutério de Souza, pelo qual tenho grande admiração e gratidão pelos seus ensinamentos.. Aos colegas do LIKA, Rafael Guimarães, Lucas Brandão e Dayse Vasconcelos, sempre dispostos para ajudar. Aos professores, Alfredo Gaspar e Eduardo Leite, pelo incentivo e momentos agradáveis na Clínica Integrada.. Aos funcionários da Pós-Graduação em Odontologia da UFPE pela ajuda prestada.. A todos os amigos do mestrado pela agradável convivência. Em especial, à Águida Henriques, pela sua carinhosa acolhida, à Andreza Barkokebas, que desvendou comigo os mistérios da Biologia Molecular e à Darcyla Bello, pelo seu companheirismo. Aos pacientes do Hospital das Clínicas e do Centro Médico Senador José Ermírio de Moraes que tornaram possível a realização deste trabalho. Por fim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para o sucesso deste trabalho..

(9) EPÍGRAFE. “Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir um castelo...”. Fernando Pessoa.

(10) RESUMO. A lectina de ligação da manose (MBL) é uma proteína plasmática sintetizada no fígado e é um importante constituinte do sistema imune inato. É capaz de se ligar a determinados carboidratos presentes na superfície de vários patógenos e interagir com proteínas séricas (MASPs) para realizar a ativação do complemento. Seus níveis séricos são afetados por polimorfismos genéticos do gene MBL2 e têm sido associados à suscetibilidade a doenças infecciosas e autoimunes. Este estudo investigou a associação entre o polimorfismo no exon-1 do gene MBL2 com a doença periodontal em pacientes diabéticos tipo 2. A amostra foi composta por 100 pacientes que se submeteram ao exame clínico periodontal que avaliou, em seis sítios de cada dente, profundidade de sondagem, sangramento à sondagem, nível de inserção clínica, placa dental e número de dentes presentes. A doença periodontal foi definida como a presença de 4 + sítios com perda de inserção de ≥5 mm com um ou mais destes sítios com profundidade de sondagem de 4 + mm. Foi realizada a coleta das células de descamação da mucosa oral e a detecção do polimorfismo foi feita através da técnica de PCR em tempo real e análise da temperatura da curva de melting. Os dados evidenciaram não haver diferença estatisticamente significante entre as freqüências genotípicas (p=1,00) e alélicas (p=1,00) observadas entre os indivíduos controles e aqueles com periodontite. Este estudo indica que polimorfismo no exon-1 do gene MBL2 não esteve associado com a presença de doença periodontal na amostra estudada. Palavras-chaves: MBL2. Polimorfismos. PCR em tempo real. Periodontite..

(11) ABSTRACT. Mannose-binding lectin (MBL) is a plasma protein synthesized in the liver and it is an important constituent of the innate immune system. It is able to bind to sugar groups displayed on the surfaces of a wide range of microorganisms and interacts with serine proteases (MASPs) to effect the activation of complement. MBL serum levels are greatly affected by polymorphisms of the MBL2 gene and have been associated with the susceptibility to some infectious and autoimmune disease. This study assessed the association between the polymorphism in exon-1 of the MBL2 gene and the periodontal disease in type 2 diabetic patients. The sample was comprised 100 patients, who were submitted to a clinical periodontal examination that evaluated in six sites per tooth probing depth, bleeding on probing, attachment loss, dental plaque and the number of teeth present. Periodontal disease was defined as 4 + sites loss of attachment of 5 + mm, with one or more of those sites having a pocket of 4 + mm. The collection of scaling cells from the oral mucosa was carried out and the detection of polymorphism was made by the technique of real time PCR (RT-PCR) using the melting temperature curve analysis. The data revealed that no significant statistical differences in the genotype (p=1.00) or allele (p=1.00) frequencies were observed among the healthy individuals or those with periodontitis. This study indicates that the polymorphism in exon-1 of the MBL2 gene was not related to periodontal disease in the sample evaluated. Key words: MBL2. Polymorphisms. Real time PCR. Periodontitis..

(12) Lista de Ilustrações.

(13) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. PG Figura 1: Comparação entre as curvas de melting de três padrões. 34. utilizados na genotipagem do gene MBL2.. Tabela 1 – Análise descritiva do número de dentes presentes,. 35. percentagem de sangramento à sondagem e placa dental.. Tabela 2 – Freqüência da doença periodontal e dos genótipos da MBL. 36. em uma população diabética tipo 2.. Tabela 3 – Freqüências do polimorfismo do exon-1 do gene MBL 2 em diabéticos tipo 2 com periodontite e controles sadios. 37.

(14) Lista de Abreviaturas.

(15) LISTA DE ABREVIATURAS. MBL. Lectina Ligadora de Manose. CRD. Domínio de Reconhecimento de Carboidrato. MASP. Manose Associada a Serino Proteases. ELISA. Ensaio de Imunoadsorção Enzimática. SNPs. Polimorfismos de um Único Nucleotídeo. HIV. Vírus da Imunodeficiência Humana. PCR. Reação em Cadeia da Polimerase. RT-PCR. Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real. DNA. Ácido desoxirribonucléico. ml. Mililitro. µl. Microlitro. ºC. Graus Celsius. DP. Desvio padrão. min. Minuto. %. Percentual. p. Nível de significância estatística.

(16) SUMÁRIO. Artigo. 16. Introdução. 17. Metodologia. 20. Resultados. 23. Discussão. 24. Agradecimentos. 27. Referências. 28. Apêndices Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. 38. Ficha clínica. 39. Carta de acompanhamento. 41. Anexos Normas da revista Microbiology and Immunology. 42. Parecer do Comitê de Ética. 50.

(17) 16. Imunidade Inata. ANÁLISE DO POLIMORFISMO GENÉTICO DA LECTINA DE LIGAÇÃO DA MANOSE (MBL) E A DOENÇA PERIODONTAL EM DIABÉTICOS.. Natália Costa Araújo* Paulo Roberto Eleutério de Souza† Renata Cimões‡ * Estudante de Pós-graduação, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil. † Doutor em Biologia, Departamento de Genética, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil. ‡ Doutora em Odontologia, Departamento de Prótese e Cirurgia Buco, Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil.. Renata Cimões (autor para correspondência). Endereço: Rua Guedes Pereira 114/302, Casa Amarela, Recife-PE, 52060-150 Brasil. Telefone/Fax: 81 33047292. E-mail: renata.cimoes@globo.com.. Título corrido: Polimorfismo de gene MBL2 e doença periodontal. Sentença resumo: O polimorfismo do exon-1 do gene MBL 2 não está associado com doença periodontal em uma amostra de pacientes diabéticos..

(18) 17. INTRODUÇÃO A colectina humana, lectina de ligação da manose (MBL), é uma importante proteína do sistema imune inato. Com múltiplos domínios de reconhecimento de carboidratos, pode se ligar a grupos de açúcar como N-acetil-Dglucosamina, manose, N-acetil-manosamina, fucose e glucose, expressos por diferentes microorganismos, mediando a fagocitose e a ativação do complemento1. A unidade estrutural básica da MBL é um homotrímero constituído de um polipeptídeo dividido em quatro domínios distintos. Um pequeno domínio N-terminal rico em cisteína, seguido por um domínio de colágeno, um terceiro domínio correspondente a uma porção α-hélice, conhecida como “neck”, e um domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD). Três polipeptídeos idênticos se associam para formar subunidades. A MBL funcional circulante tem eficiência gradativa de acordo com o número de subunidades associadas e esse aumento na atividade deve-se a uma maior interação entre o domínio CRD da MBL com os carboidratos dispostos na superfície dos microorganismos, resultando em uma mudança conformacional da proteína e ativação de moléculas associadas à MBL, manose associada à serino proteases (MASP)2. Existem dois genes MBL, no entanto MBL1 é um pseudogene, ou seja, um gene não funcional incapaz de codificar proteínas funcionais por deficiência na transcrição ou na tradução ou em ambas. Somente o gene MBL2 codifica uma proteína como produto. O gene funcional da MBL está localizado no cromossomo 10 (q11.2-q21) e compreende 4 exons e 3 íntrons. O exon 1 codifica o peptídio sinal, a região N-terminal rica em cisteína e parte da região colagenosa, enquanto o exon 2 codifica o restante da região colagenosa. O exon 3 codifica a porção α-hélice (“neck”) e o exon 4 o CRD1, 2, 3..

(19) 18. Em 1991, a seqüência nucleotídica completa dos quatro exons do gene MBL2 foi determinada e identificou-se uma mutação no códon 54, decorrente da troca da glicina pelo ácido aspártico4; em 1992, uma segunda mutação no exon 1 foi observada no códon 57, resultante da troca da glicina pelo ácido glutâmico5; e em 1994, relatou-se uma mutação no códon 52, em conseqüência da troca da arginina pela cisteína6. Esses sítios polimórficos usualmente são referidos como os alelos B, C, e D respectivamente. O alelo normal para a MBL é o A e a designação usual para os alelos variantes é O3, 7. Os polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) são considerados uma poderosa. ferramenta. na. identificação. de. genes. envolvidos. em. doenças. mendelianas, poligênicas e multifatoriais. Análises de mutações deste tipo vêm sendo usadas com sucesso para um melhor entendimento da patogênese de diversas doenças8. Tais SNPs provocam uma redução dos níveis da proteína funcional no soro1. Em 1989, observou-se que a deficiência de MBL no soro de humanos era a base para o defeito na opsonização de microorganismos9 e posteriormente demonstrou-se que baixas concentrações desta proteína estavam associadas a infecções recorrentes na infância10. A partir daí, uma grande variedade de afecções clínicas tem sido associada à deficiência de MBL, tais como infecções recorrentes, especialmente em crianças; imunodeficiências primárias e secundárias, como infecção pelo HIV11; arteroesclerose12; fibrose cística13; doenças autoimunes, como lupus eritematoso14; artrite reumatóide15, doenças cardíacas3, e diabetes mellitus16. Diabetes mellitus é uma doença complexa com componentes metabólicos e vasculares, caracterizada pela hiperglicemia resultante da falha na secreção ou na ação do hormônio insulina17. A diabetes mellitus tipo 1 está relacionada à destruição.

(20) 19. autoimune das células pancreáticas, responsáveis pela produção da insulina18. Enquanto que a diabetes mellitus tipo 2 está relacionada à alteração na produção e resistência celular à insulina19 e corresponde a cerca de 90% da população diabética20. A diabetes mellitus é reconhecida como um dos principais problemas de saúde na América Latina, afetando quase 19 milhões de pessoas na região. No Brasil estima-se que a prevalência média desta enfermidade seja de 7,6% na população maior que 40 anos21. A hiperglicemia característica da diabetes mellitus resulta em alterações fisiológicas como disfunções leucocitárias e neutrofílicas que diminuem a capacidade imunológica e a resposta inflamatória desses pacientes22. Dentre as afecções mais prevalentes desses pacientes, destaca-se a doença periodontal como a manifestação odontológica mais comum23, sendo referida como a sexta complicação clássica do indivíduo portador de diabetes mellitus24. A periodontite é uma doença inflamatória crônica que afeta os tecidos de suporte dos dentes25 e sua evolução está determinada por múltiplos fatores. Além da presença crucial do biofilme dental, fatores ambientais26, imunológicos27 e genéticos28 determinam o desenvolvimento e a susceptibilidade da doença. A relação entre o potencial de periodontopatogenicidade da placa bacteriana e a resposta imune do hospedeiro determina a progressão da doença periodontal29 e, uma vez que o sistema imunológico desempenha um importante papel na patogênese da doença30, é concebível que as variações nos níveis séricos de MBL devido aos polimorfismos genéticos possam ser parte da susceptibilidade à periodontite. Outro fator a ser considerado é que importantes patógenos periodontais como Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis também.

(21) 20. aparentam ter em suas superfícies celulares polissacarídeos ricos em manose potencialmente capazes de se ligarem com a MBL31, 32. Por este motivo a MBL pode desempenhar uma importante função na defesa do hospedeiro contra a invasão de microorganismos periodontopatogênicos. Diante do exposto, o objetivo deste estudo é investigar a associação entre a freqüência alélica e genotípica do polimorfismo no exon-1 do gene MBL2 e a doença periodontal em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2.. METODOLOGIA O presente estudo realizou-se no Departamento de Endocrinologia do Hospital das Clínicas de Pernambuco e no Centro Médico Senador Ermírio de Moraes, Recife, Brasil. Um total de 100 pacientes com diagnóstico de diabetes mellitus tipo 2 foram avaliados. A amostra foi obtida por conveniência de acordo com a demanda das clínicas envolvidas. Todos os pacientes que se apresentaram para consulta no período de março a setembro de 2008 foram abordados e selecionados de acordo com os seguintes critérios de inclusão: ter diabetes tipo 2, não ter usado antibióticos nos últimos 6 meses, não apresentar complicações médicas maiores (ex. doença coronariana), ter ao menos oito dentes naturais, não ter se submetido a tratamento periodontal nos últimos 6 meses, não estar grávida ou amamentando e concordar em participar do estudo. A presente pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Pernambuco (protocolo número 285/07). Após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido, um questionário com dados sobre idade, gênero, renda, nível educacional, estado civil, hábito de fumar, uso de insulina e duração do tratamento da diabetes foi realizado..

(22) 21. A seguir, um exame clínico foi realizado em uma cadeira odontológica por duas examinadoras previamente calibradas usando uma sonda milimetrada tipo Carolina do Norte (Trinity® - São Paulo, SP, Brazil). Seis sítios por dente foram avaliados. (distovestibular,. médiovestibular,. mésiovestibular,. distolingual,. médiolingual e mésiolingual), excetuando-se os terceiros molares. Registraram-se dados de profundidade de sondagem, sangramento à sondagem, nível de inserção clínica, placa dental e número de dentes presentes. Para definição da doença periodontal, utilizou-se os critérios sugeridos por Beck et al. (1990)33, que estabelece a periodontite como a presença de quatro ou mais sítios com perda de inserção de ≥5 mm, sendo um ou mais destes sítios com profundidade de sondagem de 4 mm ou mais. A perda de inserção corresponde à distância da porção mais apical da bolsa periodontal até a junção amelocementária. Para efeito de análise, após a aplicação do critério de definição de doença periodontal, a amostra foi dividida em um grupo controle (pacientes diabéticos sem periodontite) e um grupo de estudo (pacientes diabéticos com periodontite). Extração do DNA Após o exame clínico, foi realizada a coleta das células de descamação da mucosa oral com escovas do tipo cytobrush (Kolplast® – São Paulo, SP, Brasil), que foram subsequentemente armazenadas em 1 ml de solução salina de cloreto de sódio (Laboratory Tayuyna Ltda – Nova Odessa, SP, Brasil). O material coletado foi armazenado no freezer a – 20° C para extração do ma terial genético. Para extração e purificação de DNA, utilizou-se o kit Geneclean®, (GENECLEAN® Kit, BIO 101, La Jolla, CA, USA) de acordo com o protocolo proposto por Leão et al. (1999)34. Genotipagem do gene MBL2.

(23) 22. A detecção do polimorfismo do gene MBL2 foi feita pela técnica da PCR em tempo real (RT-PCR) e a análise da curva de melting35. A genotipagem foi realizada utilizando-se os seguintes primers designados com o software Primer Express 1.5 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA): primer “forward” 5'-AGGCATCAACGGCTTCCCA-3' e primer “reverse” 5'-CAGAA CAGCCCAACACGTACCT-3'. As reações de amplificação foram processadas com um volume final de 25 µl, contendo 1X SYBR Green I Amplification Master Mix (Euroclone, Milan, Italy), 0,75 µl do primer “forward” 10mM e 0,2 µl do primer “reverse” 10mM e 2 µl de DNA genômico. Os ciclos apresentaram as seguintes condições: aquecimento inicial a 95º C por 10 min, seguido de 40 ciclos com etapas de 95º C por 30 s, 60º C por 1 min. Após o final da PCR, foi promovido um aquecimento lento e gradativo de 60º C para 95º C para obtenção dos perfis das curvas de melting utilizando como plataforma o software de dissociação do Rotor Gene RG 3000 (Corbett Research Mortlake, Sydney, Australia)11. A avaliação da temperatura de melting auxilia a distinguir os perfis de melting dos três genótipos do gene MBL (AA, A0 e 00). As temperaturas de melting são as seguintes: A/A (um pico de 83.1 ± 0.1ºC), A/0 (dois picos de 82.6 ± 0.3 e 80.7 ± 0.1ºC), e 0/0 (um pico de 81.7 ± 0.1ºC)11(Figura 1). A genotipagem foi realizada sobrepondo a curva de melting dos pacientes com a curva de melting de três amostras controles: uma selvagem, uma mutante e uma heterozigota. Quando existia uma sobreposição dessas curvas era possível inferir sobre o genótipo em questão. As freqüências alélicas foram calculadas pela contagem direta do gene e as diferenças analisadas pelo teste exato de Fisher’s..

(24) 23. O intervalo de confiança considerado foi de 95%, resultados com p<0.05 foram considerados com significância. A análise estatística dos dados foi realizada utilizando o pacote estatístico SPSS versão 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).. RESULTADOS As freqüências genotípicas do gene MBL2 estavam dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A média de idade da amostra investigada foi de 54,1 anos (DP=9,54), 37/100 (37%) eram do sexo masculino e 63/100 (63%) eram do sexo feminino. A Tabela 1 apresenta as medidas de análise descritiva que caracterizam a amostra estudada. Média, mediana, desvio-padrão, mínimo e máximo do número de dentes presentes, porcentagem de sangramento à sondagem e de placa dental são mostrados. A prevalência da doença periodontal na amostra estudada é apresentada na Tabela 2. Sessenta e um por cento dos pacientes tinham periodontite e 39% não apresentavam doença periodontal. Também é observada na tabela 2, a distribuição dos genótipos do gene MBL2. Quarenta e seis por cento da amostra apresentaram genótipo AA, 54% genótipo A0 e nenhum indivíduo analisado apresentou genótipo 00. A Tabela 3 apresenta o estudo da associação entre o polimorfismo do gene MBL2 e doença periodontal. As freqüências dos polimorfismos revelam que 45,9% dos pacientes com periodontite apresentavam o genótipo AA e 54,1% o genótipo A0, enquanto os controles apresentavam 46,2% e 53,8%, respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significante entre pacientes com periodontite e controles na freqüência genotípica do gene MBL2 (p =1,00)..

(25) 24. A freqüência alélica também é mostrada na Tabela 3. No grupo com periodontite, 72,9% eram portadores do alelo A e 27,1% do alelo 0 versus 73,0% e 27,0%, respectivamente, dos controles. Os resultados indicaram que não existiu diferença estatisticamente significante na freqüência dos alelos do gene MBL2 entre os indivíduos diabéticos tipo 2 saudáveis e com periodontite (p = 1,00).. DISCUSSÃO Está bem estabelecido que pacientes com diabetes mellitus exibem um discreto aumento da extensão e severidade da doença periodontal quando comparados com indivíduos não diabéticos24. Os dados obtidos demonstram que a população diabética exibe uma alta prevalência da doença periodontal, pois, mais da metade da amostra foi diagnosticada como portadora de periodontite. Resultados que estão em concordância com outros estudos que investigaram a relação entre a diabetes mellitus tipo 2 e a doença periodontal e observaram a maior prevalência desta enfermidade neste tipo de população36,37,38,39. Diversos mecanismos biológicos foram propostos para a maior predisposição à periodontite do indivíduo diabético e incluem: microangiopatia, alterações do fluido crevicular gengival, disfunção de neutrófilos e leucócitos, alterações no metabolismo do colágeno, mudanças na microbiota subgengival e predisposição genética40. A heterogeneidade genética da população brasileira, caracterizada pela mistura dos genótipos, pode dificultar a realização de mapeamentos genéticos. Não é fácil determinar a origem étnica da população brasileira, especialmente aquela do Nordeste brasileiro que deriva de populações africanas, caucasianas e americanas nativas (estimado respectivamente, em 44%, 34%, e 22%)41..

(26) 25. As freqüências dos polimorfismos estruturais no gene MBL2 variam entre diferentes grupos étnicos. Alelos mutantes no códon 54 são mais comuns em populações caucasianas42; esquimós43 e chineses44 com freqüência gênica variando entre 0,11 e 0,17. O alelo mutante 57 é encontrado exclusivamente em populações de origem africana com uma freqüência média de 0,2945. A mutação no códon 52 é a menos comum das mutações estruturais e está presente em ambas populações brancas e caucasóides, com freqüência gênica de 0.055. O presente estudo investigou uma população portadora de diabetes mellitus tipo 2 do Nordeste brasileiro e observou uma freqüência de 0,27 dos alelos mutantes do gene MBL2 (alelo 0) que se aproxima daquela observada no códon 57 de populações de origem africana. Apesar do polimorfismo genético da MBL favorecer o desenvolvimento de diversas doenças, este ainda é observado em freqüências elevadas nas populações. Garred et al. 46, 47 sugerem que a permanência dos polimorfismos do gene MBL2 em altas freqüências pode oferecer uma vantagem potencial para o indivíduo. Uma hipótese para este fato é que níveis baixos de MBL podem reduzir possíveis conseqüências deletérias, próprias da ativação do complemento, que podem ocasionar danos teciduais. Em geral, um terço da população é considerada MBL deficiente. Estudos genéticos são necessários para relacionar os níveis plasmáticos dessa proteína com o polimorfismo genético e avaliar a sua relevância no desenvolvimento de diversas doenças48. Indivíduos que são homozigotos para o alelo mutante (0/0) produzem MBL em quantidades indetectáveis pelo ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA), enquanto os heterozigotos para a mutação (A/0) possuem concentrações séricas. significativamente. reduzidas. quando. comparados. com. indivíduos.

(27) 26. homozigotos para o alelo selvagem (A/A)5. Garred et al.47 registraram uma freqüência de 40% dos genótipos A0 e 00 em duas populações Caucasianas (dinamarquesa e britânica), Arraes et al.11 encontraram em uma população brasileira a prevalência de 38,9% dos referidos genótipos, no presente estudo, uma maior prevalência do genótipo produtor da redução dos níveis plasmáticos de MBL foi encontrada (54%). Alguns estudos relacionaram os polimorfismos do gene MBL2 com a diabetes mellitus. Foi demonstrado que indivíduos que possuem um polimorfismo do gene MBL2 têm um risco significantemente maior de desenvolveram diabetes tipo 1 durante a infância e adolescência16. Assim como, medições dos níveis séricos de MBL em pacientes diabéticos tipo 2, podem prover um prognóstico sobre a mortalidade e desenvolvimento de complicações vasculares49. Na atual literatura, poucos trabalhos analisaram a correlação entre o polimorfismo genético da MBL com a periodontite. Louropoulou et al.50, em um estudo limitado a uma população de origem Caucasiana, investigaram a correlação da doença periodontal com o polimorfismo do gene MBL2 e observaram que a prevalência dos genótipos produtores de baixos níveis plasmáticos de MBL foi maior para os pacientes com periodontite que para os controles, e que não existiu diferença estatisticamente significante entre os grupos. O presente estudo identificou que 54% da amostra apresentou genótipo produtor de baixos níveis plasmáticos de MBL (A0), destes, 54,09% tinha periodontite e 53,84% eram controles sadios, não se observando diferença estatisticamente significante. Em um estudo anterior, Maffei et al.48 analisaram os níveis plasmáticos de MBL em relação à periodontite e demonstraram que a deficiência de MBL não estava relacionada com a susceptibilidade à doença periodontal. Apesar de esses resultados estarem de.

(28) 27. acordo com os dados obtidos por este estudo e não oferecerem uma base para implicar a deficiência da MBL na patogênese da doença periodontal, a investigação do polimorfismo do gene MBL2 e sua associação com a doença periodontal deve prosseguir em indivíduos de outros grupos étnicos para que conclusões mais bem fundamentadas sejam obtidas.. Agradecimentos Esta pesquisa foi apoiada pela CAPES, Brasil (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)..

(29) 28. REFERÊNCIAS 1. Dommett R.M., Klein N., Turner M.W. (2006) Mannose-binding lectin in innate immunity: past, present and future. Tissue Antigens 68:193-209. 2. Worthley D.L., Bardy P.G., Mullighan C.G. (2005) Mannose-binding lectin: biology and clinical implications. Intern Med J 35:548-555. 3. Turner M.W. (2003) The role of mannose-binding lectin in health and disease. Mol Immunol 40:423-429. 4. Sumiya M., Super M., Tabona P., Levinsky R.J., Arai T., Turner M.W., Summerfield J.A. (1991) Molecular basis of opsonic defect in immunodeficient children. Lancet 337:1569-70. 5. Lipscombe R.J., Sumiya M., Hill A.V.S., Lau Y.L., Levinsky R.J., Summerfield J.A, Turner M.W (1992). High frequencies in African and non-African populations of independent mutations in the mannose binding protein gene. Hum Mol Genet 1:709-15. 6. Madsen H.O., Garred P., Kurtzhals J.A., Lamm L.U., Ryder L.P., Thiel S., Svejgaard A (1994). A new frequent allele is the missing link in the structural polymorphism of the human mannan-binding protein. Immunogenetics 40:3744. 7. Garred P., Madsen H.O., Balslev U., Hofmann B., Pedersen C., Gerstoft J., Svejgaard A. (1997) Susceptibility to HIV infection and progression of AIDS in relation to variant alleles of mannose-binding lectin. Lancet 349:236-240. 8. Mullighan C.G., Marshall S.E., Welsh K.I. (2000) Mannose binding lectin polymorphisms are associated with early age of disease onset and autoimmunity in common variable immunodeficiency. Scand J Immunol 51:111-122..

(30) 29. 9. Super M., Thiel S., Lu J., Levinsky R.J., Turner M.W. (1989) Association of low levels of mannan-binding protein with a common defect of opsonization. Lancet 2:1236-1239. 10. Cedzynski M., Szemraj J., Swierzko A.S., Bak-Romaniszyn L., Banasik M., Zeman K., Kilpatrick D.C. (2004) Mannan-binding lectin insufficiency in children with recurrent infections of the respiratory system. Clin Exp Immunol 136:304–311. 11. Arraes L.C., Souza P.R., Bruneska D., Castelo Filho A., Cavada B. de S., de Lima Filho J.L., Crovella S. (2006) A cost-effective melting temperature assay for the detection of single-nucleotide polymorphism in the MBL2 gene of HIV1-infected children. Braz J Med Biol Res 39:719-723. 12. Tsutsumi A., Takahashi R., Sumida T. (2005) Mannose binding lectin: genetics and autoimmune disease. Autoimmun Rev 4:364-372. 13. Olesen H.V., Jensenius J.C., Steffensen R., Thiel S., Schiotz P.O. (2006) The mannan-binding lectin pathway and lung disease in cystic fibrosis dysfunction of mannan binding lectin associated serine proteases 2 (MASP-2) may be a major modifier. Clin Immunol 121:324-331. 14. Bultink I.E., Hamann D., Seelen M.A., Hart M.H., Dijkmans B.A., Daha M.R., Voskuyl A.E. (2006) Deficiency of functional mannose-binding lectin is not associated with infections in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Arthritis Res Ther 8:R183. 15. Troelsen L.N., Garred P., Madsen H.O., Jacobsen S. (2007) Genetically determined high serum levels of mannose-binding lectin and agalactosyl IgG are associated with ischemic heart disease in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 56:21-9..

(31) 30. 16. Araujo J., Brandão L.A., Guimarães R.L., Santos S., Falcão E.A., Milanese M., Segat L., Souza P.R., de Lima-Filho J.L., Crovella S. (2007). Mannose binding lectin gene polymorphisms are associated with type 1 diabetes in Brazilian children and adolescents. Hum Immunol 68:739-43. 17. Kiran M., Arpak N., Ünsal E., Erdogan M.F. (2005) The effect of improved periodontal health on metabolic control in type 2 diabetes mellitus. J Clin Periodontol 32:266-272. 18. Mealey B.L., Oates T.W. (2006) Diabetes mellitus and periodontal disease. J Periodontol 77:1289-303. 19. Donahue R.P., Wu T. (2001) Insulin resistance and periodontal disease: an epidemiologic overview of research needs and future directions. Ann Periodontol 6:119-24. 20. Matthews D.C. (2002) The relationship between diabetes and periodontal disease. Clinical Practice 68:161-164. 21. King H., Aubert R.E., Herman W.H. (1998) Global burden of diabetes, 19952025: prevalence, numeral estimates, and projections. Diabetes Care 21:1414-31. 22. Iacopino A.M. (2001) Periodontitis and diabetes interrelationships: the role of inflammation. Ann Periodontol 6:125-137. 23. Sousa R.R., Castro R.D., Monteiro C.H., Silva S.C., Nunes A.B. (2003) Buccal attendance of the patient with diabetes mellitus: a revision of literature (in Portuguese). Pesq Bras Odontoped Clin Integr 3:71-77. 24. Loe H. (1993) Periodontal disease. The sixth complication of diabetes mellitus. Diabetes Care 16:329-34..

(32) 31. 25. Socransky S.S., Haffajee A.D., Cugini M.A., Smith C., Kent R.L. Jr. (1998) Microbial complexes in subgiginval plaque. J Clin Periodontol 25:134-144. 26. Kinane D.F., Peterson M., Stathopoulou P.G. (2006) Environmental and other modifying factors of the periodontal diseases. Periodontol 2000 40:107-119. 27. Azuma M. (2006) Fundamental mechanisms of host immune responses to infection. J Periodont Res 41:361-373. 28. Loos B.G., John R.P., Laine M.L. (2005) Identification of genetic risk factors for periodontitis and possible mechanisms of action. J Clin Periodontol 32(Suppl6):159-179. 29. Newman M.G, Takei H.H., Carranza F.A. (2004) Clinical Periodontology (in Portuguese) 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2004:118-136. 30. Loss B.G., Leppers-Van de Straat F.G.J., Van de Winkel J.G.J., Van der Velden U. (2003) Fcgamma receptor polymorphisms in relation to periodontitis. J Clin Periodontol 30:595-602. 31. Califano J.V., Schenkein H.A., Tew J.G. (1991) Immunodominant antigens of Actinobacillus actinomycetemcomitans serotypes a and c in high-responder patients. Oral Microbiol Immunol 6:228-235. 32. Farquharson S.I., Germaine G.R., Gray G.R. (2000) Isolation and characterization of the cell-surface polysaccharides of Porphyromonas gingivallis ATCC 53978. Oral Microbiol Immunol 15:151-157. 33. Beck J.D., Koch G.G., Rozier R.G., Tudor G.E. (1990) Prevalence and Risk indicatiors for periodontal attachment loss in a population of older community dwelling blacks and whites. J Periodontol 61:521-528. 34. Leão J.C., Hinrichsen S.L., de Freitas B.L., Porter S.R. (1999) Human herpes virus 8 and Kaposi's sarcoma. Rev Assoc Med Bras 45:55-62..

(33) 32. 35. Boniotto M.L., Braida I., Pirulli D., Arraes L., Amoroso A., Crovella S. (2003) MBL2 polymorphisms are involved in HIV-1 infection in Brazilian perinatally infected children. AIDS 17:779-780. 36. Nelson R.G., Shlossman M., Budding L.M., Pettitt D.J., Saad M.F., Genco R.J., Knowler W.C. (1990) Periodontal disease and NIDDM in Pima Indians. Diabetes Care 13:836-840. 37. Emrich L.J., Shlossman M., Genco R.J. (1991) Periodontal destruction in type II diabetes mellitus. J Periodontol 62:123-130. 38. Taylor G.W., Burt B.A., Becker M.P., Genco R.J., Shlossman M., Knowler W.C., Pettitt D.J. (1998) Non-insulin dependent diabetes mellitus and alveolar bone loss progression over 2 years. J Periodontol 69:76-83. 39. Kung Lu H., Chyu Yang P. (2004) Analyse transversale de différentes variables parodontales de patients diabétiques non insulino-dépendants. J Parodont Dent 24:71-79 40. Tsai C., Hayes C., Taylor G.W. (2002) Glycemic control of type 2 diabetes and severe periodontal disease in US adult population. Community Dent Oral Epidemiol 30:182-92. 41. Alves-Silva J., da Silva Santos M., Guimarães P.E., Ferreira A.C., Bandelt H.J., Pena S.D., Prado V.F. (2000) The ancestry of Brazilian mtDNA lineages. Am J Hum Genet 67:444-61. 42. Lipscombe R.J., Beatty D.W., Ganczakowski M., Goddard E.A., Jenkins T., Lau Y.L., Spurdle A.B., Sumiya M., Summerfield J.A., Turner M.W. (1996) Mutations in the human mannose-binding protein gene: frequencies in several population groups. Eur J Hum Genet 4:13-19..

(34) 33. 43. Mead R., Jack D., Pembrey M., Tyfield L., Turner M. (1997) Mannose-binding lectin alleles in a prospectively recruited UK population. The ALSPAC Study Team. Avon Longitudinal Study of Pregnancy and Childhood. Lancet 349:1669-70. 44. Lau Y.L., Lau C.S., Chan S.Y., Karlberg J., Turner M.W. (1996) Mannosebinding protein in Chinese patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 39:706-708. 45. Sullivan K.E., Wooten C., Goldman D., Petri M. (1996) Mannose-binding protein genetic polymorphisms in black patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 39:2046-51. 46. Garred P., Harboe M., Oettinger T., Koch C., Svejgaard A. (1994) Dual role of mannan-binding protein in infections: another case of heterosis? Eur J Immunogenet 21:125-31. 47. Garred P., Larsen F., Seyfarth J., Fujita R., Madsen H.O. (2006) Mannosebinding lectin and its genetic variants. Genes Immun 7:85-94. 48. Maffei G., Brouwer N., Dolman K.M., van der Velden U., Ross D., Loss B.G. (2005) Plasma levels of mannan-binding lectin in relation to periodontitis and smoking. J Periodontol 76:1881-9. 49. Hansen T.K., Gall M.A., Tarnow L., Thiel S., Stehouwer C.D., Schalkwijk C.G., Parving H.H., Flyvbjerg A. (2006) Mannose-binding lectin and mortality in type 2 diabetes. Arch Intern Med 166:2007-13. 50. Louropoulou A., Schoenmaker T., Catsburg A., Savelkoul P.H.M., Loos B.G. (2008) Mannose-binding lectin gene polymorphisms in relation to periodontitis. J Clin Periodontol 35:923-930..

(35) 34. FIGURAS. Figura 1: Comparação entre as curvas de melting de três padrões utilizados na genotipagem do gene MBL2..

(36) 35. TABELAS. Tabela 1 – Análise descritiva do número de dentes presentes, porcentagem de sangramento à sondagem e placa dental. Número de dentes Porcentagem de na cavidade oral sangramento à sondagem n 100 100 Média 16,42 34,44 Mediana 16,00 25,00 SD 6,563 24,34 Mínimo 8 0,00 Máximo 32 100,00 n (número de pacientes) SD (desvio padrão). Porcentagem de placa dental 100 63,83 67,87 29,33 6,40 100,00.

(37) 36. Tabela 2 – Freqüência e porcentagem da doença periodontal e dos genótipos da MBL em uma população diabética tipo 2. Freqüência. Porcentagem. Distribuição da doença periodontal Indivíduos com periodontite Indivíduos sem periodontite. 61 39. 61,0 39,0. Distribuição dos genótipos da MBL AA A0 00. 46 54 0. 46,0 54,0 0,0. 100. 100,0. Total.

(38) 37. Tabela 3 - Freqüências do polimorfismo do exon-1 do gene MBL 2 em diabéticos tipo 2 com periodontite e controles sadios. Doença Periodontal SIM Freqüências. Valor de P. NÃO. genotípicas n. %. n. %. 28. 45,9%. 18. 46,2%. do gene MBL2 AA. p(1) = 1,00 A0. 33. 54,1%. 21. 53,8%. Total. 61. 100%. 39. 100%. n. %. n. %. 89. 72,9%. 57. 73,0%. Freqüências. alélicas. do. gene MBL2 A. p(1) = 1,00 0. 33. (1): Através do teste exato de Fisher.. 27,1%. 21. 27,0%.

(39) 38. TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO. APÊNDICE A. NOME DA PESQUISA: Associação do polimorfismo do gene MBL2 em pacientes diabéticos com periodontite. PESQUISADORA RESPONSÁVEL: Natália Costa Araújo (Mestranda em Clínica Integrada UFPE). Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, 1235. Recife-PE. CEP 50670-901. Fone/Fax: 81 21268818 (Secretaria de Pós-graduação da UFPE). OBJETIVO: Verificar se existe associação do polimorfismo do gene da MBL com a severidade da doença periodontal em pacientes diabéticos atendidos no Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco. METODOLOGIA: Serão avaliados o sangramento, profundidade de bolsa, perda de inserção através de um exame clínico e coleta de sangue do paciente diabético para avaliar o polimorfismo do gene da MBL. JUSTIFICATIVA: Através desse estudo poderemos ajudar pesquisas futuras a desenvolver novas terapêuticas com o uso da MBL, visando minimizar a susceptibilidade de pacientes à doenças que possuem um forte componente imunológico. BENEFÍCIO: os participantes receberão orientações para prevenir e tratar a doença periodontal. Pacientes com doença periodontal serão encaminhados para o Curso de Especialização em Periodontia da UFPE. RISCO: Ao paciente submetido à pesquisa, poderá ocorrer o risco de, durante o exame clínico, constrangimento, sangramento gengival e na coleta de sangue, o risco de hematoma e desconforto. Eu,__________________________________________________,RG.Nº. ________________________ Abaixo assinado, tendo recebido as informações acima, e ciente dos meus direitos abaixo relacionados, concordo participar desta pesquisa, para o trabalho de mestrado realizado no Curso de Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco – UFPE, bem como autorizo toda a documentação necessária, a divulgação e a publicação da mesma, em periódicos científicos, na área de Odontologia. DIREITOS: 1. A garantia de receber respostas a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida a cerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros relacionados com a pesquisa; 2. A liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar no estudo sem que isso me traga prejuízo; 3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido caráter confidencial da informação relacionada com minha privacidade; 4. A disponibilidade de tratamento médico e a indenização que legalmente teria direito por parte da instrução à saúde, em casos de danos que a justifiquem, diretamente causados pela pesquisa; 5. O compromisso de proporcionar-me informação atualizada durante o estudo, ainda que este possa afetar a minha vontade de continuar participando; 6. Caso existirem gastos adicionais estes serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.. Tendo ciência do exposto acima, desejo participar da pesquisa.. Recife, ____ de ________________ de ___________.. _______________________________________________________ Assinatura do paciente __________________________ Assinatura do Pesquisador. __________________________ Assinatura da Testemunha. _________________________ Assinatura da Testemunha.

(40) 39. APÊNDICE B. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO DE ODONTOLOGIA. FICHA CLÍNICA. IDENTIFICAÇÃO. 1. Nome: ____________________________________________________ 2. Nacionalidade:________________Sexo:______ Idade:______________ 3. Estado civil:_______________Fone: ____________cel: _____________ 4. Renda (salários): _________________Tipo de diabetes:_____________ 5. Tempo do tratamento do diabetes: ______________________________ 6. Uso de insulina: ______________Hábito de fumar: _________________. 7. Escolaridade: I. ( ) Não sabe ler ou escrever II. ( ) 1º grau incompleto III. ( ) 1º grau completo IV. ( ) 2º grau incompleto V. ( ) 2º grau completo VI. ( ) Universidade incompleta VII. ( ) Universidade completa VIII. ( ) Pós-graduação IX. ( ) Não sei.

(41) 40. FICHA PERIODONTAL PACIENTE: __________________________________________________________ DATA:_____________ Dente. Sondagem (mm) Vestibular Palatina D C M D C. M. D. Recessão Gengival (mm) Vestibular Palatina C M D C. Furca M. M. D. Mob P. 18 17 16 15 14 13 12 11 21 22 23 24 25 26 27 28 38 37 36 35 34 33 32 31 41 42 43 44 45 46 47 48. SANGRAMENTO: Faces______________________________ %________________________. 18. 17. 16. 15. 14. 13. 12. 11. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 48. 47. 46. 45. 44. 43. 42. 41. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. PLACA: Faces______________________________________%________________________. 18. 17. 16. 15. 14. 13. 12. 11. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 48. 47. 46. 45. 44. 43. 42. 41. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.

(42) 41. CARTA DE ACOMPANHAMENTO. Certifico que participei da concepção do trabalho para tornar pública minha responsabilidade pelo seu conteúdo, não omitindo quaisquer ligações ou acordos de financiamento entre os autores e companhias que possam ter interesse na publicação deste artigo.. Natália Costa Araújo _______________________________________. Paulo Roberto Eleutério de Souza _______________________________________. Renata Cimões _______________________________________.

(43) 42. ANEXO A Microbiology and Immunology Published on behalf of Japanese Society for Bacteriology, Japanese Society for Virology, and Japanese Society for Host Defense Research Edited by: Yasuhiko Horiguchi, Takaji Wakita and Terutaka Kakiuchi Print ISSN: 0385-5600 Online ISSN: 1348-0421 Frequency: Monthly Current Volume: 52 / 2008 ISI Journal Citation Reports® Ranking: 2007: 101/119 (Immunology); 71/94 (Microbiology) Impact Factor: 1.295 Author Guidelines EDITORIAL REVIEW AND ACCEPTANCE The acceptance criteria for all papers are the quality and originality of the research and its significance to our readership. Except where otherwise stated, manuscripts are peer reviewed by two anonymous reviewers and the Editor. Final acceptance or rejection rests with the Editorial Board, who reserves the right to refuse any material for publication. Manuscripts should be written so that they are intelligible to the professional reader who is not a specialist in the particular field. They should be written in a clear, concise, direct style. Where contributions are judged as acceptable for publication on the basis of content, the Editor and the Publisher reserve the right to modify typescripts to eliminate ambiguity and repetition and improve communication between author and reader. If extensive alterations are required, the manuscript will be returned to the author for revision.. SUBMISSION OF MANUSCRIPTS Manuscripts should be submitted online at http://mc.manuscriptcentral.com/mai. Authors must supply an email address as all correspondence will be by email. Two files should be supplied: the covering letter and the manuscript (in Word or rich text format (.rtf)). The covering letter should be uploaded as a file not for review. All articles submitted to the Journal must comply with these instructions. Failure to do so will result in return of the manuscript and possible delay in publication. Will authors please note that Word 2007 is not yet compatible with journal production systems. Unfortunately, the journal cannot accept Microsoft Word 2007 documents until such time as a stable production version is released. Please use Word's 'Save As' option therefore to save your document as an older (.doc) file type. • Submissions should be double-spaced. • All margins should be at least 30 mm. • All pages should be numbered consecutively in the top right-hand corner, beginning with the title page. • Do not use Enter at the end of lines within a paragraph..

(44) 43. • Turn the hyphenation option off; include only those hyphens that are essential to the meaning. • Specify any special characters used to represent non-keyboard characters. • Take care not to use l (ell) for 1 (one), O (capital o) for 0 (Greek beta). β(zero) or ß (German esszett) for • Use a tab, not spaces, to separate data points in tables. If you use a table editor function, ensure that each data point is contained within a unique cell (i.e. do not use carriage returns within cells). Each figure should be supplied as a separate file, with the figure number incorporated in the file name. For submission, low-resolution figures saved as .jpg or .bmp files should be uploaded, for ease of transmission during the review process. Upon acceptance of the article, high-resolution figures (at least 300 d.p.i.) saved as .eps or .tif files should be uploaded. Digital images supplied only as low-resolution files cannot be used. Further instructions are available at the submission site. Covering letter Papers are accepted for publication in the Journal on the understanding that the content has not been published or submitted for publication elsewhere except as a brief abstract in the proceedings of a scientific meeting or symposium. This must be stated in the covering letter. The covering letter must also contain an acknowledgment that all authors have contributed significantly, and that all authors are in agreement with the content of the manuscript. Authors must declare any financial support or relationships that may pose conflict of interest by disclosing at the time of submission any financial arrangements they have with a company whose product figures prominently in the submitted manuscript or with a company making a competing product. Such information will be held in confidence while the paper is under review and will not influence the editorial decision but, if the article is accepted for publication, the Editor will usually discuss with the authors the manner in which such information is to be communicated to the reader. If tables or figures have been reproduced from another source, a letter from the copyright holder (usually the Publisher), stating authorization to reproduce the material, must be attached to the covering letter. Author material archive policy Authors who require the return of any submitted material that is accepted for publication should inform the Editorial Office after acceptance. If no indication is given that author material should be returned, Blackwell Publishing will dispose of all hardcopy and electronic material two months after publication.. ARTICLE TYPES Original Articles. Original reports of research or papers giving a full account of an investigation can be submitted. Original Articles are preferably limited to seven printed pages of less and should be divided into sections under the subheadings: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements and References, with an accompanying abstract not exceeding 250 words. Notes. Short preliminary reports of important findings can be submitted as Notes. A Note is preferably limited to three printed pages or less. A Note should not be divided into individual sections, but should be accompanied by an Abstract not exceeding 100 words. Reviews and Mini-Reviews. In addition to solicited reviews and mini-reviews (reviews.

(45) 44. hereafter), Microbiology and Immunology will consider publication of unsolicited reviews on timely subjects. These will be subjected to peer review by the editorial board to determine whether the topic is of interest to the readers of Microbiology and Immunology, whether the authors provide a balanced viewpoint and whether the article is clearly presented and timely. ETHICAL CONSIDERATIONS Authors must state that the protocol for the research project has been approved by a suitably constituted Ethics Committee of the institution within which the work was undertaken and that it conforms to the provisions of the Declaration of Helsinki (as revised in Tokyo 2004), available at http://www.wma.net/e/policy/b3.htm. All investigations on human subjects must include a statement that the subject gave informed consent. Patient anonymity should be preserved. Photographs need to be cropped sufficiently to prevent human subjects being recognized (or an eye bar should be used). Any experiments involving animals must be demonstrated to be ethically acceptable and where relevant conform to national guidelines for animal usage in research.. COPYRIGHT Authors publishing in the Journal will be asked to sign a Copyright Transfer Agreement. In signing the form it is assumed that authors have obtained permission to use any copyrighted or previously published material. All authors must read and agree to the conditions outlined in the form, and must sign the form or agree that the corresponding author can sign on their behalf. Articles cannot be published until a signed form has been received. Authors can download the form from http://www.blackwellpublishing.com/pdf/mim_cta.pdf. STYLE OF THE MANUSCRIPT Manuscripts should follow the style of the Vancouver agreement detailed in the International Committee of Medical Journal Editors' revised 'Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical Journals: Writing and Editing for Biomedical Publication', as presented at http://www.ICMJE.org/. Spelling. The Journal uses US spelling and authors should therefore follow the latest edition of the Merriam-Webster's Collegiate Dictionary. Units. All measurements must be given in SI or SI-derived units. Abbreviations for measurable units should be as follows (without period): cm, mm, µm, nm, A, ml, µl, g, µg, ng, pg, C (degree, Celsius), hr, mm, sec, nM, nM, rpm, Hz, cpm, Ci. mCi, pCi, nCi, pCi, R, log (base 10), ln (base e), etc., but liter(s). Abbreviations. Genus names, drugs, or any other abbreviations should be spelled out in full when first used in the text and in the Abstract. A list of the abbreviations arranged in alphabetical order must be provided on a separate page. Trade names. Drugs should be referred to by their generic names. If proprietary drugs have been used in the study, refer to these by their generic name, mentioning the proprietary name, and the name and location of the manufacturer, in parentheses. Micro-organism nomenclature. The names of the organism and binary names must conform with international rules of nomenclature. The spelling of bacterial names should follow the amended edition of the Approved List of Bacterial Names published at American Society for Microbiology, 1990 and validation lists published in the International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (formerly the International Journal of Systematic Bacteriology). Non-valid names must be enclosed in quotation marks. Current approved bacterial names can be confirmed at the world wide web site of the List of the Bacterial.

(46) 45. Names with Standing in Nomenclature (http://www.bacterio.cict.fr) or Bacterial Nomenclature Up-to-Date (http://www.dsmz.de/bactnoml bactname.htm). Descriptions of new taxon should not be submitted unless a specimen (normally a live culture) has been deposited in at least two or more public culture collections from two or more countries and it is designated as a type strain in the paper. Names used for viruses should be those approved by the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) and published in Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (M.H.V. van Regenmortel et al., ed., Academic Press, San Diego, CA, 2000). Vernacular names may be used after viruses are first identified. Registration of DNA sequences. A new DNA sequence(s) described in the article appearing in this journal is requested to be registered in DNA Data Bank of Japan (DDBJ), National Institute of Genetics, Mishima, Japan. A format for this registration is sent from DDBJ directly to the author after the publication.. PARTS OF THE MANUSCRIPT Manuscripts should be presented in the following order: (i) title page, (ii) abstract and key words, (iii) text, (iv) acknowledgments, (v) references, (vi) appendices, (vii) figure legends, (viii) tables (each table complete with title and footnotes), (ix) figures and (x) list of abbreviations. Footnotes to the text are not allowed and any such material should be incorporated into the text as parenthetical matter. Title page The title page should contain (i) the title of the paper, (ii) the full names of the authors and (iii) the complete mailing addresses of the institutions at which the work was carried out together with (iv) the email address, facsimile and telephone numbers of the author to whom correspondence about the manuscript should be sent. The present address of any author, if different from that where the work was carried out, should be supplied in a footnote. The title should be short, informative and contain the major key words. Do not use abbreviations in the title. A short running title (less than 40 characters) should also be provided. The subject section and specified field must also be included on the title page (see Table 1 for information on these). Original Articles and Notes must have an abstract that states in 250 or 100 (respectively) words or fewer, the purpose, basic procedures, main findings and principal conclusions of the study. The abstract should not contain references. Two to four key words (for the purposes of indexing) should be supplied below the abstract in alphabetical order. References The Vancouver system of referencing should be used (examples are given below). In the text, references should be cited using Arabic numerals in round parentheses in the order in which they appear. If cited in tables or figure legends, number according to the first identification of the table or figure in the text. In the reference list, cite the names of all authors. Do not use ibid. or op cit. Reference to unpublished data and personal communications should not appear in the list but should be cited in the text only (e.g. Smith A, 2000, unpublished data). All citations mentioned in the text, tables or figures must be listed in the reference list. Names of journals should be abbreviated according to the Serial Sources for the Biosis Data.

(47) 46. Base, available in most libraries or from http://www.biosis.org. Authors are responsible for the accuracy of the references. We recommend the use of a tool such as EndNote or Reference Manager for reference management and formatting. EndNote reference styles can be searched for here: http://www.endnote.com/support/enstyles.asp. Reference Manager reference styles can be searched for here: http://www.refman.com/support/rmstyles.asp Journal article 1 Vega K.J., Pina I., Krevsky B. (2006) Heart transplantation is associated with an increased risk for pancreatobiliary disease. Ann Intern Med 124: 980-83. Book 2 Ringsven M.K., Bond D. (2007) Gerontology and Leadership Skills for Nurses, 2nd edn. Albany, NY: Delmar Publishers. Chapter in a Book 3 Phillips S.J., Whisnant J.P. (2001) Hypertension and stroke. In: Laragh J.H., Brenner B.M., eds. Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis, and Management, 2nd edn. New York: Raven Press, pp. 465-78. Appendices These should be placed at the end of the paper, numbered in Roman numerals and referred to in the text. If written by a person other than the author of the main text, the writer's name should be included below the title. Tables Tables should be self-contained and complement, but not duplicate, information contained in the text. Number tables consecutively in the text in Arabic numerals. Type tables on a separate page with the legend above. Legends should be concise but comprehensive - the table, legend and footnotes must be understandable without reference to the text. Vertical lines should not be used to separate columns. Column headings should be brief, with units of measurement in parentheses; all abbreviations must be defined in footnotes. Footnote symbols: †, ‡, §, ¶, should be used (in that order) and *, **, *** should be reserved for Pvalues. Statistical measures such as SD or SEM should be identified in the headings. Figures All illustrations (line drawings and photographs) are classified as figures. Figures should be cited in consecutive order in the text. Magnifications should be indicated using a scale bar on the illustration. Use lower case figure part labels in multi-part figures: (a), (b), (c), etc. Line figures should be sharp, black and white graphs or diagrams, drawn professionally or with a computer graphics package. Lettering must be included and should be sized to be no larger than the journal text. Figure legends. Type figure legends on a separate page. Legends should be concise but comprehensive - the figure and its legend must be understandable without reference to the text. Include definitions of any symbols used and define/explain all abbreviations and units of measurement. Equations Equations should be numbered sequentially with Arabic numerals; these should be ranged right in square parentheses. All variables should appear in italics. Use the simplest possible form for all mathematical symbols..

(48) 47. ONLINE GUIDELINES Visit the Microbiology and Immunology home page at http://www.blackwellpublishing.com/mai for more information, and Blackwell Publishing's web pages for submission guidelines and digital graphics standards at http://www.blackwellpublishing.com/bauthor/journal.asp and http://www.blackwellpublishing.com/bauthor/illustration.asp Author Services enables authors to track their article, once it has been accepted, through the production process to publication online and in print. Authors can check the status of their articles online and choose to receive automated emails at key stages of production so they do not need to contact the production editor to check on progress. Visit www.blackwellpublishing.com/bauthor for more details on online production tracking and for a wealth of resources, including FAQs and tips on article preparation, submission and more. Microbiology and Immunology is also available online at http://www.blackwell-synergy.com Accepted Articles Microbiology and Immunology offers Accepted Articles for all articles. Accepted Articles is a Wiley-Blackwell service whereby peer-reviewed accepted articles are published online prior to their ultimate inclusion in a print or online issue. Articles published within Accepted Articles have been fully refereed, but have not been through the copy-editing, typesetting and proof correction process. PROOFS It is essential that corresponding authors supply an email address to which correspondence can be emailed while their article is in production. Word files of edited articles will be sent for checking via email, and should be returned to the Publisher. It is essential that these files are checked carefully, as the cost of changes made at a later stage may be charged to the author. Full instructions on how to correct and return the file will be attached to the email. Notification of the URL from where to download a Portable Document Format (PDF) typeset page proof, associated forms and further instructions will be sent by email to the corresponding author. The purpose of the PDF proof is a final check of the layout, and of tables and figures. Alterations other than the essential correction of errors are unacceptable at PDF proof stage. The proof should be checked, and approval to publish the article should be emailed to the Publisher by the date indicated, otherwise, it may be signed off on by the Editor or held over to the next issue. OFFPRINTS A free PDF offprint will be supplied to the corresponding author. A minimum of 50 additional offprints will be provided upon request, at the author's expense. These paper offprints may be ordered online. Please visit http://offprint.cosprinters.com/, fill in the necessary details and ensure that you type information in all of the required fields. If you have queries about offprints please email offprint@cosprinters.com PUBLICATION FEES Page charge. No page charge is levied for Originals Articles of seven pages or less and notes of three pages or less. A page charge fee of ¥14,000 is required per printed page for excess pages (eight or more for Original Articles and four or more for a Note). A form requesting payment will be available for download with your PDF proof. Colour figure charge. A charge of $A990/$US530/¥64,000 for the first three colour.

(49) 48. figures and $A495/$US265/¥32,000 for each extra colour figure thereafter will be charged to the author. EDITORIAL OFFICE ADDRESS Microbiology and Immunology Editorial Office Wiley-Blackwell, Wiley Japan Frontier Koishikawa Bldg. 4F 1-28-1 Koishikawa Bunkyo-ku, Tokyo 112-0002 Japan Email: mai@wiley.com; tel: +81 3 3830 1255; fax: +81 3 5689 7278. Table 1. Subject sections (bacteriology, virology and immunology) and specified fields listing Bacteriology Antibacterial agents and chemotherapy Applied microbiology Bacterial components Bacterial ecology Clinical bacteriology Epidemiology Genetics Intracellular parasitology (Chlamydia, Rickettsia) Morphology Mycology Pathogenesis Physiology and metabolisms Taxonomy Toxin Vaccines Miscellaneous Virology Animal DNA virus Animal RNA virus Bacterial virus Clinical virology Epidemiology Oncology Plant virus Retrovirus Vaccines and antiviral agents Viral immunology Viral vector Miscellaneous Immunology (Host Defense) Adhesion and costimulation Allergy and inflammation.

(50) 49. Antigen and superantigen Autoimmunity and immunodeficiency Clinical immunology Cytokines and cytokine receptors Developmental immunology Infection immunity Innate immunity Lymphocytes Macrophages, dendritic cells and leukocytes MHC and antigen presentation Tolerance and immune regulation Transplantation immunity Tumor immunity.

(51) 50.

(52) Araújo, Natália Costa Análise do polimorfismo genético da lectina de ligação da manose (MBL) e a doença periodontal em diabéticos / Natália Costa Araújo. – Recife: O Autor, 2009. 50 folhas : il., fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Odontologia, 2009.. Inclui bibliografia, anexos e apêndices. 1. MBL2.. 616.311.2 617.645. 2. Periodontite.. I. Título.. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). UFPE CCS2009-062.

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