CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE AGRONOMIA
MAYARA GAMA DA CUNHA
CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E FISIOLÓGICA DE ESTIRPES DE RIZÓBIOS ORIUNDAS DA REGIÃO DE BAIXO ACARAÚ NO CEARÁ
FORTALEZA 2018
MAYARA GAMA DA CUNHA
CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E FISIOLÓGICA DE ESTIRPES DE RIZÓBIOS ORIUNDAS DA REGIÃO DE BAIXO ACARAÚ NO CEARÁ
Monografia apresentada ao Curso de Agronomia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de bacharel em Agronomia
Orientadora: Profa. Dra. Claudia Miranda Martins
FORTALEZA 2018
MAYARA GAMA DA CUNHA
CARACTERIZAÇÃO CULTURAL E FISIOLÓGICA DE ESTIRPES DE RIZÓBIOS ORIUNDAS DA REGIÃO DE BAIXO ACARAÚ NO CEARÁ
Monografia apresentada ao Curso de Agronomia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de bacharel em Agronomia
Aprovada em: 29/11/2018.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Profa. Dra. Claudia Miranda Martins (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Suzana Claudia Silveira Martins
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Dr. Marcelo de Sousa Pinheiro
Primeiramente a Deus, por ter me dado saúde, sensatez e muita força para persistir nessa longa caminhada, cheia de intempéries, que é a graduação.
Aos meus amados pais, José e Selma, pois é graças a eles, ao grande esforço deles, que eu estou conquistando mais um passo da minha vida profissional.
A minha irmã Emmanuelle, por ser sempre minha companheira em todos os momentos.
Ao meu marido Reinaldo, por ser sempre um porto seguro, estando sempre ao meu lado me apoiando e compartilhando todas as angústias, felicidades e decepções da vida acadêmica.
Meu Tio Agostinho, que não está mais conosco, mas sei que onde ele estiver ele está muito orgulhoso muito orgulhoso de mim.
Minha Tia Nágela, por estar sempre cuidando de mim de minha irmã.
A Universidade Federal do Ceará pela oportunidade de cursar uma graduação. A Professora Claudia Miranda por ter enxergado um potencial em mim que nem eu mesma conhecia, por toda sua atenção, compreensão e dedicação para com seus orientandos.
A Professora Suzana pelo apoio e ajuda quando precisei.
Aos meus amigos de curso: Alexandre, Luana, Julyanne, Caio, Pedro, Bruna, Leonardo e Anderson. Vocês tornaram todos os momentos de desespero e incertezas muito mais leves e divertidos, com todas as risadas, brincadeiras e piadas. Fico muito feliz de ter conhecido vocês. Hoje os chamo de pequena família já que a UFC nos fez passar a maior parte dos nossos dias juntos, fazendo com que compartilhássemos nossas vidas.
Ao Marcelo, por ter dedicado parte do seu tempo me ensinando e me ajudando tanto nas atividades laboratoriais como nas de pesquisa.
Ao Fernando, Juliani, Clarice, Valéria, Vinícius e Andro por sempre estarem me ajudando, aprendi e ainda aprendo muito com vocês.
A todos os integrantes do LAMAB: Leonardo, Filipe, Érica, Karol, Jamili, Mariane, Vítor, Rogério, João Carlos, Mesaque e Daniel.
RESUMO
A disponibilidade de nitrogênio é um fator limitante para os sistemas de produção vegetal, as bactérias que fixam nitrogênio desempenham um importante papel nesse tipo de produção, reduzindo os custos e os impactos ambientais além do aumento na produtividade. O objetivo desse trabalho foi isolar, caracterizar,testar a resistência a diferentes níveis de salinidade e avaliar a tolerância a pH extremos (pH 4 e pH 10) a elevadas temperaturas de estirpes de rizóbio obtidos de nódulos radicularesoriundos da região de Acaraú no Ceará. Das 19 estirpes testadas, uma tornou o pH do meio alcalino e em 18 o pH manteve-se neutro. Todas apresentaram velocidade de crescimento lento, consistência do muco butírica. Para o diâmetro das colônias, uma é puntiforme, quinze têm diâmetro inferior a 1 mm e três têm diâmetro superior a 1 mm. Nenhuma das estirpes foram capazes tolerar pH 4, crescendo apenas em pH 10. No teste de temperatura 18 estirpes cresceram a 45°C e no teste de salinidade 8 estirpes cresceram a concentração de NaCl 10gL-1.As estirpes estudadas não mostraram significativas variações nas características culturais, contudo houve variações nas características que se a resistência a elevadas temperaturas e tolerância a diferentes níveis de salinidade
Nitrogen availability is a limiting factor for plant production systems, bacteria that fix nitrogen, play an important role in this type of production, reducing costs, environmental impacts and increase productivity. The objective of this work was to isolate, characterize, test the salinity levels and evaluate the tolerance to extreme pH (pH 4 and pH 10) at elevated temperatures of rhizobia from the Acaraú region in Ceará. Out of the 19 strains, just one turn the medium pH to alkaline and 18 maintained the medium pH at neutral. All presented slow growth and mucus with butyric consistency. According with colony diameter evaluation, one is punctiform, fifteen have a diameter less than 1 mm and three have a diameter greater than 1 mm. None of the strains were able to tolerate pH 4, growing at pH 10 only. In the temperature test 18 strains were grown at 45 ° C and in salinity test 8 were grown at 10gL-1 NaCl concentration.The did not show significant variations in the cultural characteristics, however there were variations in the resistance to high temperatures and tolerance to different levels of salinity.
Keywords: Diazotrophicbacteria. Salinity. Semi-arid. .
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 9
2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 11
2.1 Nitrogênio ... 11
2.2 Fixação Biológica de Nitrogênio ... 12
2.3 Fatores que afetam a FBN em leguminosas ... 13
2.4 Rizóbios ... 14
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 16
3.1 Obtenção, isolamento e purificação das colônias ... 16
3.2 Autenticação dos isolados ... 16
3.3 Caracterização cultural ... 17
3.4 Tolerância a pH extremos in vitro ... 18
3.5 Teste de resistência a elevadas temperaturas in vitro ... 18
3.6 Tolerância à salinidade in vitro ... 18
3.7 Análise estatística ... 19
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 20
4.1 Autenticação dos isolados ... 20
4.2 Caracterização cultural ... 20
4.2 Tolerância a pH extremos in vitro ... 21
4.3 Teste de resistência a elevadas temperaturas in vitro ... 22
4.4 Tolerância à salinidade in vitro ... 23
4.5 Análise estatística ... 25
1 INTRODUÇÃO
Em muitos sistemas de produção, a disponibilidade de nitrogênio é quase sempre um fator limitante, influenciando o crescimento da planta, mais do que qualquer outro nutriente (BREDEMEIER; MUNDSTOCK, 2000). Na natureza este elemento é encontrado em abundância em uma forma quimicamente muito estável (N2) e, portanto, sua pronta assimilação pela maioria dos seres vivos é limitada, requerendo a transformação para uma forma combinada que facilite sua assimilação (MARIN et al., 1999).
Rizóbios são bactérias do solo fixadoras de nitrogênio que formam nódulos nas raízes e/ou nos caules das leguminosas. A fixação biológica de nitrogênio (FBN) é realizada a partir da simbiose das espécies leguminosas com bactérias fixadoras, que formam nódulos em suas raízes, capazes de absorver o nitrogênio da atmosfera convertendo em amônia para posterior conversão em aminoácidos para nutrição vegetal (PEREIRA et al., 2017). Essa fixação biológica desempenha um importante papel nos sistemas de cultivos e na sustentabilidade dos ecossistemas (CARDOSO; ANDREOTE, 2016).
As bactérias que fixam nitrogênio são exploradas na agricultura e na silvicultura para produção e aplicação de inoculantes rizobianos que reduzem os custos e os impactos ambientais da produção vegetal, além do aumento na produtividade (HUNGRIA et al., 2015; RODRIGUES et al., 2018).
O estudo da diversidade dessas bactérias que nodulam leguminosas tem aplicações agrícolas significativas. Em termos de manejo cultural, visa promover a sobrevivência de populações mais eficientes e específicas, e a obtenção de genótipos mais adaptados aos tipos de solo e tolerantes aos diferentes estresses ambientais (EHRHARDT-BROCARDO et al., 2015). O conhecimento da diversidade de bactérias diazotróficas, por meio da caracterização fenotípica é o passo inicial para a seleção de estirpes eficientes para a produção de inoculantes (SOUSA et al., 2014). A caracterização morfológica decolônias bacterianas para a avaliação de diversidade serve como um complemento importante para as análises genéticas, uma vez que possibilita a construção de agrupamentos de indivíduos
morfologicamente semelhantes (NAVROSKI et al., 2015).
Alguns fatores como pH do solo, deficiência de nutrientes, temperatura e umidade do ambiente, podem dificultar o processo de nodulação e FBN (CARDOSO; ANDREOTE, 2016). Para que ocorra uma simbiose eficiente é necessário o conhecimento não só da disponibilidade de nitrogênio para a planta, mas também há a necessidade de analisar as características fenotípicas desses microrganismos, pois estas podem auxiliar em estudos de
10 adaptabilidade e tolerância às condições ambientais em que essas associações simbióticas estão inseridas e que afetam a produção agrícola.
Características do solo, como pH e salinidade podem comprometer a eficiência simbiótica e desenvolvimento de plantas. Nesse sentido, a hipótese desse trabalho é que estirpes de rizóbios apresentam diversidade cultural.
Esse trabalho objetivou isolar, caracterizar, testar a resistência a diferentes níveis de salinidade e avaliar a tolerância a pH extremos (pH 4 e pH 10) a elevadas temperaturas, de estirpes de rizóbios oriundos da região de Acaraú no Estado do Ceará.
2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Nitrogênio
O nitrogênio (N) é o elemento químico mais abundante da atmosfera, onde se encontra predominantemente como nitrogênio molecular (N2), uma forma gasosa e quimicamente muito estável (RODRIGUES et al., 2017). Esse elemento é um nutriente essencial, requerido por todos os organismos vivos e frequentemente limita a produção primária em ecossistemas aquáticos e terrestres, sendo necessário em grandes quantidades, uma vez que é componente essencial de proteínas, ácidos nucleicos e de outros constituintes celulares (VIEIRA, 2017).
O N é um constituinte importante na Terra, principalmente na litosfera, onde está distribuído nas rochas, no fundo dos oceanos e nos sedimentos, representando 98% do N existente. Na matéria orgânica morta encontram-se 98% do total de N orgânico terrestre e, apenas 4% nos organismos vivos. Na matéria viva, esse componente se encontra predominantemente nas plantas (94%), achando-se os 6% restantes nos seres vivos: 4% na microbiota e 2% nos animais (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
O nitrogênio está presente nos solos predominantemente sob a forma orgânica e inorgânica. Nas formas orgânicas, este elemento é encontrado em grandes quantidades principalmente na fração proteica da matéria orgânica. Na forma inorgânica, destaca-se sua ocorrência como amônio (NH4+), nitrito (NO2-), nitrato (NO3-) e óxido nitroso (N2O) (CARDOSO; ANDREOTE, 2016).
Para que este elementopossa ser utilizado pelas plantaso mesmodeve ser fixado ou convertido para a forma de amônioou íons nitrito (KRAPP, 2015). As plantas absorvem e assimilam o nitrogênio inorgânico principalmente nas formas de nitrato (NO3) em solos bem drenados, e amônio (NH4+) em solos alagados ou ácidos (XUAN; BEECKMAN; XU, 2017; XU; FAN; MILLER, 2012).
No ciclo global de nitrogênio, a fase atmosférica predomina, onde a fixação desse nutriente e desnitrificação por organismos microbianos são as mais importantes. O nitrogênio está continuamente penetrando na atmosfera pela ação de bactérias desnitrificantes, e sempre voltando ao ciclo por meio da ação de microrganismos fixadores de nitrogênio (biofixação), como também pela ação de descargas elétricas durante tempestades e outras fixações físicas
12 (ODUM; BARRETT, 2007; BEGON et al., 2007).O ciclo deste elemento tem sido tradicionalmente dividido em três processos - fixação de N2, nitrificação e desnitrificação (STEIN;KLOTZ, 2016).
Nitrificação é o termo usado para descrever a oxidação de N orgânico e inorgânico reduzido para formar NO2 e NO3. É um processo aeróbico que ocorre por dois caminhos: nitrificação autotrófica executada por bactérias quimiolitotrófica, como bactérias dos gêneros Nitrosomonas e Nitrobacter, e nitrificação heterotrófica realizada por bactérias quimioheterotróficas,por exemplos gêneros Arthrobacter e Streptomyces (POFFENBARGER et. al., 2018).
A desnitrificação é um processo respiratório no qual o nitrato (NO3-), nitrito (NO2 -), óxido nítrico (NO) e óxido nitroso (N2O-), sucessivamente, são utilizados por microrganismos como aceptores finais de elétrons durante o processo respiratório produzindo gás nitrogênio (N2). Esta via é considerada a maior causa de perda de nitrogênio na agricultura, sendo que parte significante se dá na forma de produção de N2O. A maior parte dos organismos descritos como desnitrificadores são afiliados ao filo Proteobacteria (Divisões Alfa, Beta, Gama e Epsilonproteobacteria) (CARDOSO; ANDREOTE, 2016)
2.2 Fixação Biológica de Nitrogênio
A Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) é responsável pela fixação de grandes quantidades de nitrogênio, revelando a importância desse processo na manutenção da vida na terra, e entre os processos biológicos que ocorrem no planeta, é o segundo mais abundante, juntamente com a decomposição da matéria orgânica, perdendo apenas para a fotossíntese (CARDOSO; ANDREOTE, 2016).
A fixação biológica de N2 é mediada por uma parcela dos procariotos que apresenta alta diversidade morfológica, fisiológica, genética e filogenética. A maioria das espécies de fixadores de N2 é de vida livre, ocorrendo em todos os tipos de solo, na rizosfera e filosfera de plantas, em águas doces e salgadas no trato intestinal de certos animais, como os cupins. Alguns fixadores são encontrados em simbiose com fungos, diatomáceas e/ou com várias espécies vegetais, enquanto outros estabelecem relações menos especializadas com plantas, denominadas de modo geral, de associações (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Já foram descritas espécies representantes de vários grupos de procariotos que fixam nitrogênio, tais como: bactérias fotossintéticas (ex.: Rhodospirillumrubrum), bactérias anaeróbicas (ex.:Clostridium spp.), microaeróbicas (ex.: Azospirillum spp., Herbaspirillum
spp., Acetobacter diazotrophicus, Azorhizobium caulinodans, Azoarcus spp., Burkholderia spp., etc), bactérias aeróbicas (ex.:Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobacter spp. e Derxia spp.) e também alguns representantes das cianobactérias (algas verdes-azuladas) e
actinobactérias (Frankia) (FERNANDES JUNIOR; REIS, 2008; MARIN et al., 1999; SPRENT; SPRENT, 1990).
Os micro-organismos diazotróficos podem ser encontrados em vida livre no solo, associado a plantas contribuindo para o crescimento vegetativo sem a formação de estruturas diferenciadas, ou em simbiose com plantas da família Fabaceae, formando estruturas especializadas denominadas nódulos (SILVA, 2012).
De acordo com Reis e Teixeira (2005), a FBN só é possível porque esses microrganismos fixadores de N2, possuem a enzima nitrogenase, caracterizada como um complexo enzimático responsável pela quebra da ligação tripla do N2 usando energia celular na forma de adenosina trifosfato (ATP). A enzima, ou o complexo enzimático, é composta de duas unidades: a dinitrogenase redutase (também chamada de componente II ou Fe-proteína) e a dinitrogenase (ou componente I ou MoFe-proteína). Nesse complexo enzimático, essas unidades interagem cooperativamente durante o processo de FBN. Esses autores também afirmaram que são conhecidos três tipos de nitrogenase: uma que possui molibdênio (Mo, nitrogenase-1) e ferro (Fe); outra em que o vanádio (V) substitui o Mo (nitrogenase-2); e uma terceira, que só tem ferro (nitrogenase-3).
A FBN tem se mostrado uma ferramenta importante para a produção vegetal, uma vez que o manejo da adubação nitrogenada é complexo em virtudes de perdas de N por volatilização, lixiviação, além dos riscos de contaminação ambiental em decorrência de altos teores de NO3-em fontes de água para o consumo humano (BARBOSA; CONSALTER;
MOTTA, 2012).
2.3 Fatores que afetam a FBN em leguminosas
Diferentes fatores químicos, físicos, bióticos e abióticos podem interferir no processo de simbiose. Dentre os fatores abióticos que podem atuar sobre a bactéria e/ou o hospedeiro pode-se destacar o pH do solo, temperaturas elevadas e salinidade.
O pH do solo afeta a simbiose tanto se for abaixo ou acima do desejável. A acidez do solo afeta aspectos nutricionais, como redução dos teores de fósforo, cálcio e magnésio, bem como teores excessivos de alumínio e manganês, assim como, alguns efeitos secundários como a redução no desenvolvimento radicular em função da toxidez por alumínio (FIGUEIREDO et al.,2008). Em relação a nodulação, a etapa mais sensível a acidez do solo é
14 a sua fase inicial, incluindo a fase em que ocorre a comunicação entre os parceiros, exudação de flavonoides e síntese dos fatores Nod (FERNANDES JUNIOR; REIS, 2008).
Em relação a temperatura, esse fator pode afetar etapas de infecção, colonização da raiz, formação e função dos nódulos (CARDOSO; ANDREOTE, 2016). No caso das bactérias, a temperatura afeta os plasmídeos que carregam os genes simbióticos que podem ser perdidos ou sofrer rearranjos genéticos (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
No que diz respeito a salinidade, quando se compara a sensibilidade da bactéria e da planta, as bactérias conseguem sobreviver em níveis salinos inibitórios para o hospedeiro. No entanto o aumento da salinidade pode ocasionar redução do peso da parte aérea da planta, na nodulação radicular e na atividade da enzima nitrogenase (FIGUEIREDO et al., 2008; MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Nesse sentido, a tolerância a altos níveis de sal, pH e temperatura pode ser importante na sobrevivência, multiplicação e disseminação desses microrganismos nos solos (KULKARNI; SURANGE; NAUTIYAL, 2000).
2.4 Rizóbios
O termo “rizóbio” aplica-se a bactérias do solo que são capazes de fixar nitrogênio atmosférico em simbiosecom plantas, das quaisa maioria são leguminosas (AZEVEDO et al., 2015). São bactérias Gram-negativas e pertencem ao filo Proteobactérias (IYER; RAJKUMAR, 2018).
A simbiose entre leguminosas e rizóbios é caracterizada pela especificidade, devido a moleculas sinalizadoras presentes na raiz, exsudados que permitem o reconhecimento do simbionte e o desenvolvimento da simbiose. Os rizóbios são capazes de detectar metabólitos secundários específicos, chamados de flavonóides, que são secretados pela raiz da planta hospedeira (CHECCUCCI; BAZZICALUPO; MENGONI, 2017). Esses flavonóides são capazes de induzir a expressão de genes do rizóbio necessários para o processo de nodulação (nod, nol e noe). O produto enzimático da ativação desses genes leva a síntese e a secreção dos fatores Nod, que são lipo-quito-olgossacarídeos, que influenciam a deformação e o enrolamento do pelos radiculares, alcalinização do meio extrarradicular, oscilação na concentração de Ca+, formação do cordão de infecção e do primórdio nodular (CARDOSO; ANDREOTE, 2016; EHRHARDT et al., 1992; SANTOS; REIS, 2008). As bactérias são liberadas no citoplasma das células desses primórdios quecontinuam crescendo
e, por último,diferenciam-se em bacteróides capazes defixar N2(VINCENT, 1980; HUNGRIA, 1994; MERCANTE et al., 2002).
Dentre os gêneros de rizóbios mais estudados estão: Azorhizobium,
Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium (Tabela 1) (CHECCUCCI;
BAZZICALUPO; MENGONI, 2017). Esses gêneros podem ser diferenciados com base em
características culturais e morfológicas em meio 79 (extrato de levedura, manitol, sais e ágar), conhecido como YMA (VINCENT, 1970; MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Tabela 1 –Características de alguns gêneros de rizóbios
Rhizobium e
Sinorhizobium Mesorhizobium Azorhizobium Bradyrhizobium
Diâmetro colônia (mm) 2 a 4 2 a 4 0,5 ≤ 1 Produção de polissacarídeos extracelulares (PSE)
Intensa intensa Muito pouca Pouco a
abundante Tempo de aparecimento de colônias isoladas (TACI) (dias) 2 a 3 3 a 5 3 a 4 6 a mais de 10 pH do meio com indicador de pH azul bromotimol
Ácido Ácido Alcalina Alcalina
Fonte:Adaptado (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
As bactérias que fixam nitrogênio são exploradas na agricultura e na silvicultura para produção e aplicação de inoculantesrizobianos que reduzem os custos e os impactos ambientais da produção vegetal, além do aumento na produtividade (HUNGRIA et al., 2015; RODRIGUES et al., 2018).
16 3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção, isolamento e purificação das colônias
Foram coletadas de solo do Perímetro Irrigado Baixo Acaraú (PIBAU), na Fazenda Duvalle Frutas (3°06’22°S 40°07’15W), no município de Marco-CE. Adotou-se o método de caminhamento em ziguezague, coletando-se amostras compostas de solo na profundidade de 0-20 cm usando uma enxada como ferramenta de acordo com ARRUDA; MOREIRA; PEREIRA (2014).
Nas amostras de solo, foram cultivadas sementes de feijão-caupi (Vigna
unguiculata (L.) Walp) cv “Setentão” como planta-isca para a obtenção dos isolados. O
plantio ocorreu em triplicata, usando recipientes de 300 mL. Antes da semeadura houve a desinfestação das sementes, mergulhando-as em etanol 95% por um período de 30 segundos, posteriormente foram imersas em hipoclorito de sódio 5% (NaClO) durante 5 minutos, e lavadas seis vezes em água destilada estéril.
Plantou-se três sementes em cada recipiente, decorridos sete dias após o plantio, realizou-se o desbaste mantendo uma planta por recipiente. Transcorrido 40 dias retirou-se os nódulos radiculares e acondicionou-os em frascos contendo sílica.
Os nódulos colhidos foram reidratados em água destilada durante uma hora, logo depois desinfestados com etanol absoluto durante 30 segundos seguido de NaClO 5% por três minutos, posteriormente lavados cinco vezes em água destilada estéril. Seguida a desinfestação, os nódulos foram macerados com uma pinça em placas de Petri com meio YMA (VINCENT, 1970) mais o corante vermelho congo, e incubados em estufa do tipo
Biochemistry Oxigen Demand (B.O.D.) a 28°C por sete dias. Posteriormente efetuou-se a
purificação dos isolados, por meio da seleção de colônias com aspecto arredondado e que não absorveram o corante. Essas colônias foram repicadas sucessivamente até obtenção da cultura pura dos isolados.
3.2 Autenticação dos isolados
A autenticação dos isolados ocorreu através da observação da capacidade nodulífera por meio do plantio e inoculação em feijão-caupi. O substrato empregado foi constituído por areia e vermiculita (2:1) o qual foi autoclavado a 121ºC por uma hora. A semeadura ocorreu em recipientes de 300 mL aplicando-se três repetições por isolados e utilizando sementes de feijão-caupi cv. Setentão. Plantou-se três sementes em cada recipiente, sendo o desbaste realizado depois de sete dias, mantendo uma planta por recipiente.
Decorrido três dias do plantio adicionou-se 3 mL do inóculo por recipiente contendo uma planta de feijão-caupi e aos 35 dias foram examinadas as raízes para observar a existência de nódulos, bem como, a cor avermelhada dentro dos mesmos, indicando a atividade da leghemoglobina. Para a preparação do inóculo foi colocado 100 mL do meio extrato de levedura e manitol (YM), segundo Vincent, 1970, em Erlenmeyer, seguida de inclusão da cultura mantendo-a sob agitação orbital a 150 rpm no intervalo de três a seis dias até o crescimento da cultura, constatado pelo turvamento do meio.
As estirpes autenticadas são mantidas na coleção de culturas de bactérias diazotróficas do Laboratório de Microbiologia Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).
3.3 Caracterização cultural
Na caracterização cultural, utilizou-se as estirpes autenticadas, as quais foram repicadas em placas de Petri com o meio de cultura YMA (extrato de levedura -manitol-ágar) contendo o indicador de pH, o corante azul de bromotimol, conforme Hungria; Araújo (1994). As características verificadas foram: velocidade de crescimento, modificação de pH do meio, produção de muco e diâmetro das colônias.
Estirpes que exibiram crescimento moderado a abundante em até três dias de incubação foram classificadas como de crescimento rápido e as que exibiram pouco crescimento em um período maior que três dias de incubação, lento. Em relação à modificação do pH do meio depois de crescerem, aquelas em que o meio de cultura, contendo o indicador de pH, assumiu a cor amarela foram qualificadas como acidificantes e as que o meio assumiu cor azul, alcalinizantes. Quanto a formação do muco, as estirpes foram categorizadas como viscosa, seca, gomosa e butírica. Sobre o diâmetro das colônias, as mesmas foram identificadas como puntiforme, quando demonstraram diâmetro inferior a 0,5 mm, inferior a 1 mm, igual a 1 mm, maior que 1mm, inferior a 2 mm, e superior a 2 mm (MARTINS et al., 1997).
É importante salientar que a leitura de pH não foi realizada uma vez que, a alteração do pH do meio é uma característica qualitativa. O meio foi usado apenas como indicador de pH, que adquire cor amarela quando fica ácido e cor azul quando alcalino, cor verde quando permanece neutro.
18 3.4 Tolerância a pH extremos in vitro
A avaliação da tolerância das estirpes a valores extremos de pH foi realizada em triplicata, usando o meio YM modificado, com pH ajustado para 4 adicionando ácido clorídrico (HCl) e pH 10 adicionando hidróxido de sódio (NaOH). As estirpes permaneceram sob a agitação a 150 rpm em temperatura ambiente.
A avaliação do crescimento foi realizada sete dias após a incubação. Tubos que apresentaram turbidez no caldo, comparado ao controle negativo, foram classificados como resultado positivo para o crescimento da cultura e os que não apresentaram turbidez, como resultado negativo (PINHEIRO et al., 2014).
3.5 Teste de resistência a elevadas temperaturas in vitro
Para avaliar a capacidade das estirpes de rizóbio em crescer sob diferentes temperaturas, as mesmas foram inoculadas em placas de Petri contendo meio de cultura YMA, cada teste foi realizado em triplicata, e em seguida incubadas em B.O.D. por uma semana, sendo o controle incubado a 28° C por uma semana. As temperaturas utilizadas no experimento foram: 39°, 41°, 43º e 45° C. Após esse período foi observado a presença ou ausência de crescimento.
3.6 Tolerância à salinidade in vitro
As estirpes foram cultivadas em tubos rosqueados contendo caldo YM, que permaneceram em agitação orbital por sete dias, a 125 rpm. Após esse período foi retirado 1 mL do caldo com suspensão de células dos tubos e transferidos para microtubos estéreis. Os microtubos foram centrifugados por quatro minutos a 8000 rpm e em seguida, descartado o sobrenadante. As células foram ressuspensas em solução salina 0,85%. O processo de centrifugação e ressuspensão de células foi repetido três vezes (TRANNIN et al., 2001). O objetivo foi a remoção de resíduos do meio de cultura do inóculo que poderia resultar num falso crescimento positivo (NÓBREGA et al., 2004b). Após esse procedimento foi retirado 0,1 mL do microtubo contendo células em solução salina e inoculados em placas de Petri contendo meio YMA modificado com adição de cloreto de sódio (NaCl).
As concentrações utilizadas em cada tratamento foram 1; 2; 2,5; 3; 10; 20; 30 e 50 g de NaCl L-1. Foram utilizadas placas com meio YMA sem alteração na sua composição como controle. Adotou-se três repetições para cada tratamento.
As placas inoculadas foram incubadas por 10 dias em estufas incubadoras B.O.D. a 28 °C. Em seguida avaliou-se a intensidade do crescimento das estirpes em cada tratamento e comparados com a intensidade de crescimento das estirpes cultivadas no meio sem alteração da composição.
3.7 Análise estatística
Estirpes padrão, foram utilizadas como referência para os testes realizados: BR3471 (Cupriavidus taiwanensis), BR 3486 (Burkholderia phymatum), INPA 0311B
-Bradyrhizobium sp (BR 3301), UFLA 03-84--Bradyrhizobium sp. (BR 3302), BR
3267(Bradyrhizobium sp), BR 3262 (Bradyrhizobium sp), BR 2003 (Bradyrhizobium elkanii). Os resultados foram transformados em uma matriz binária de dados, onde “1” é crescimento positivo e “0” crescimento negativo. Os dados foram empregados para criar uma matriz de similaridade para a elaboração do dendrograma por meio do software
Paleontological Statistics Software Package for Educationand Data Analysis. (PAST), o que possibilitou o agrupamento das estirpes similares. Adotou-se o algorismo contido no
Unweighted Pair Group Methodizing Arithmetic Averages (UPGMA). Os testes fenotípicos
analisados nesse experimento geraram variáveis qualitativas binárias, determinadas pelo aparecimento ou não de uma certa característica, após as análises laboratoriais. Os microrganismos que apresentam maior coincidência de existência e/ou inexistência de certas características são julgados mais similares entre si. O coeficiente de Jaccard foi adotado para a determinação de similaridade (CALVACANTE, 2015).
20 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Autenticação dos isolados
A partir das amostras de solo obteve-se 24 isolados, destes, 19 conseguiram formar nódulos radiculares, sendo certificados como estirpes de rizóbio, enquanto cinco não nodularam.
4.2 Caracterização cultural
Das 19 estirpes, somente a estirpe LAMAB 127 alcalinizou o pH do meio, nas demais o pH permanecendo neutro. Todas as estirpes exibiram crescimento lento, com consistência do muco butírica. No que se refere ao diâmetro médio das colônias, uma (5,26%) é puntiforme (LAMAB 125), 15 (quinze) (78,94%) tem diâmetro inferior a 1 mm e três delas (15,78%) o diâmetro é superior a 1 mm.
Quanto as sete estirpes padrão, quatro (57,14%) tornaram o meio da cultura ácido, uma (14,28%) o meio tornou-se alcalino e duas (28,57%) não alteraram o pH do mesmo. Seis estirpes (87,71%) demonstraram crescimento lento e uma (14,28%) apresentou crescimento rápido. Quanto ao diâmetro das colônias, duas (28,57%) apresentaram diâmetro superior a 1 mm, e cinco (71,42%) diâmetro superior a 2 mm. No tocante a consistência do muco, três estirpes (14,85%) exibiram colônias com muco viscoso e quatro (57,14%) butírico.
Esses resultados se assemelham aos de Calazans et al. (2016), que caracterizando estirpes de rizóbios que se associam a Cratylia argentea no cerrado brasileiro, observaram que 48% exibiram crescimento lento e 58% mantiveram o pH do meio neutro. Por outro lado, Medeiros et al. (2009), caracterizando a diversidade cultural de rizóbios do Estado de Rio Grande do Norte, obtiveram 304 isolados onde cerca de 90% acidificaram o pH do meio de cultura, apresentaram velocidade de crescimento rápida e colônias de diâmetro classificado como puntiforme. Silva et al. (2014), estudando estirpes de rizóbios do Parque Nacional de Ubajara no Ceará, obtiveram como resultados 27,58% das estirpes não modificaram o pH do meio permanecendo neutro e 37,93% das estirpes apresentaram um crescimento lento.
Segundo Norris (1965) os rizóbios que apresentam crescimento lento e alcalinizam o meio são uma forma ancestral e estão associados a leguminosas tropicais que exibem baixa eficiência simbiótica e habitam solos ácidos de baixa fertilidade, por outro lado, rizóbios de crescimento rápido, que acidificam o meio, são mais eficientes e apresentam maior especificidade hospedeira, colonizam solos neutros a alcalinos.
A modificação de pH em meio de cultura YMA, é frequentemente uma característica para distinção dos gêneros Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium que possuem a propriedade de tornar o meio de cultura ácido, enquanto que Azorhizobium e
Bradyrhizobium tornam o meio alcalino (LIMA et al., 2012). Todas as amostras avaliadas são
oriundas do Nordeste e segundo Martins et al. (1995) estirpes que não alteram o pH do meio são mais frequentes no sertão nordestino, em locais em que os solos são geralmente neutros ou alcalinos.
Esta alteração de pH promovida pelo rizóbio no meio YMA pode ser em decorrência do uso preferencial de açúcares, como a galactose, pelos rizóbios de crescimento rápido, acompanhada da excreção de ácidos orgânicos e compostos nitrogenados pelos rizóbios de crescimento lento, resultando na liberação de cátions (COUTINHO et al., 1999; MARTINS et al., 1997).
4.2 Tolerância a pH extremos in vitro
No que se refere a tolerância a pH extremos, todas as estirpes nativas cresceram apenas no pH alcalino (pH 10), não tolerando o meio ácido (pH 4). Em relação as estirpes padrão, das sete testadas, 5 toleraram as duas faixas de pH avaliados e 2 toleraram somente o pH alcalino. Feitoza et al. (2015) testando estirpes de rizóbios provenientes do semiárido, mostraram que 25 das 28 estirpes testadas manifestaram tolerância ao meio ácido (pH 4), 24 toleraram o meio básico (pH 10) e 21 toleraram ambos os valores de pH avaliados.
Stefan et al. (2018) trabalhando com 60 estirpes isoladas da Romênia, mostraram que todas cresceram em pH entre 4,8 e 7,8, contudo 50% não foram capazes de tolerar pH de 8,8. Tais autores relatam que a acidez do solo pode influenciar o crescimento dos rizóbios, além do efeito direto da acidez, pela liberação de compostos tóxicos como metais pesados e outras partículas. Hungria et al. (2001) caracterizando estirpes de rizóbios isoladas de nódulos de soja no Brasil, observaram que 60% das estirpes cresceram em pH 9,5.
O pH do solo afeta a simbiose de várias maneiras, na exsudação de isoflavonóides, causa inativação de alguns genes de nodulação, incluindo nodA, como também a produção e a excreção dos fatores Nod são reduzidas em solos ácidos (MCKAY; DJORDJEVIC, 1993; LIRA JUNIOR; NASCIMENTO; FRACETTO, 2015). Em solos ácidos também ocorre a inibição da iniciação e formação de nódulos radiculares, além disso, afeta o
22 crescimento das plantas e causa falhas nas colheitas devido à alta concentração de prótons e baixa concentração de cálcio e fosfato em solos ácidos (GOPALAKRISHNAN et al.,2014)
4.3 Teste de resistência a elevadas temperaturas in vitro
A partir do segundo e do terceiro tratamento, no qual a temperatura de incubação foi de 42°C e 43°C, respectivamente, observou-se uma redução do crescimento das estirpes nativas, entretanto, todas foram capazes de crescer nessas temperaturas. Já, na temperatura de 45°C, toda as estirpes demostraram crescimento, com exceção da LAMAB 117.
Para as estirpes padrão, 71% delas foram capazes de crescer partir do primeiro tratamento, em que a temperatura de incubação foi de 39° C. Nas temperaturas de 41°C e 43°C houve o crescimento de 57% das estirpes em ambos os tratamentos, sendo que essa porcentagem reduziu para 29% aos 45°C (Gráfico 3).
Gráfico 3 – Porcentagem de estirpes resistentes a diferentes temperaturas
Fonte: Cunha (2018)
A temperatura ótima para o crescimento de rizóbios se encontra na faixa de 28 a 31°C (GOPALAKRISHNAN et al., 2014). Benidire et al. (2018), caracterizaram 106 estirpes de rizóbios isoladas de várias regiões de Marrocos, 65% das estirpes foram capazes de tolerar a temperatura de 38°C e somente 5% toleraram a temperatura de 44°C. No trabalho de Pinheiro et. al. (2014) com36 estirpes provenientes do estado do Ceará e Rio Grande do Norte, 32 cresceram a temperatura de 39°C, sendo esse número reduzido para 11 quando
100% 100% 100% 95% 71% 57% 57% 29% 3 9 ° C 4 1 ° C 4 3 ° C 4 5 ° C PO R CE N TA G EM DE E ST IR PE S R ES IS TE N TE S TEMPERATURA LAMAB Padrão
submetidas a 45°C. Em 20 estirpes nativas noduladoras de soja no Egito, Youseif et al. (2014), relataram que 16 foram capazes de crescer a temperatura de 40°C e quatro cresceram na temperatura de 42°C.
A adaptação de microrganismos ao estresse é um processo regulatório complexo, que envolve o uso de proteínas e lipopolissacarídeos, como demostrado por Nandal et al. (2005) que ao expor Rhizobium sp ao calor de 30°C e 43°C o mesmo sofreu alterações na superfície celular, incluindo exopolissacarídeos, lipopolissacarídeos e proteínas.
Temperaturas acima de 40°C são comuns nos solos tropicais brasileiros (Rodrigues et al., 2018). A avaliação da capacidade de tolerância bacteriana in vitro a estas condições é útil para selecionar estirpes com maior resistência a condições adversas de campo.
4.4 Tolerância à salinidade in vitro
Todas as estirpes cresceram com a concentração de NaCl até 3g L-1 e foram susceptíveis à salinidade em meios com concentrações a partir de 10 g L-1, crescendo apenas as estirpes LAMAB 112, LAMAB 113, LAMAB 115, LAMAB 116, LAMAB 118, LAMAB 122, LAMAB 125 e LAMAB 130 nessa concentração. A partir de 20 g L-1 não houve mais crescimento das culturas.
As estirpes padrão apresentaram crescimento similar apresentando susceptibilidade na concentração de 10 g L-1. Das sete estirpes padrão utilizadas, três cresceram em 1% (10 g L-1) de NaCl (BR 3486, BR3471 e BR 3302) e uma (BR 3471) em meio com 2% (20 g L-1) de NaCl (Gráfico 4).
Dekak et al. (2018) caracterizando rizóbios em condições de aridez na Argélia observaram que 84% das estirpes toleraram a concentração de até 5%. Cavalcante et al. (2015), ao estudarem estirpes oriundas do semiárido do Ceará mostraram que 48% e 6% das estirpes foram capazes de tolerar com concentrações de 10 g L-1 e 20 g L-1, respectivamente. Silva et al. (2014) trabalhando com estirpes nativas do Ceará observaram uma tolerância a níveis maiores de sais com 10,35% 30 g NaCl L-1e 6,89% das estirpes conseguiram crescer na concentração de 50 g de NaCl L-1. Rizóbios nativos de solos salinos em áreas do semiárido de Pernambuco cresceram rapidamente até o nível de 12 g L-1 de sal. A sensibilidade ao sal foi verificada a partir da adição de 16 g L (FREITAS et al., 2007).
24 Estudos preliminares in vitro quanto a tolerância a salinidade, auxiliam na escolha das estirpes para estudos em campo afim de selecionar as mais eficientes para obtenção de inoculantes para leguminosas cultivadas em solos salinos (NÓBREGA et al.,2004).
Os rizóbios desenvolvem estratégias para lidar com o estresse salino, como por exemplo o acúmulo de potássio e a produção intracelular de compostos orgânicos, tais como prolina, trealose, glicina betaína e poliaminas. Estes compostosprotegem as células da dessecação e do estresse osmótico, estabilizando a conformação de proteínas emembranas biológicas (DONG et al., 2017)
Gráfico 4 – Porcentagem de estirpes que cresceram nas diferentes concentrações de NaCl.
Fonte: Cunha (2018)
Em solos salinos o processo de infecção bacteriana é afetado uma vez que há diminuição no número e na deformação dos pelos radiculares. O crescimento e funcionamento dos nódulos é afetado, com da limitação de produtos fotossintéticos, assim com a FBN com a redução do metabolismo dos nódulos, do teor de leghemoglobina e a difusão do nitrogênio atmosférico (GOPALAKRISHNAN et al., 2014).
Estima-se que cerca de 7,0% da superfície terrestre apresenta-se salinizada seja, devido a processos naturais ou por atividades antrópicas (PEDROTTI et al., 2015). No Nordeste brasileiro, cerca de 30% das áreas irrigadas apresentam problemas de salinização
100% 100% 100% 42% 0% 100% 100% 100% 43% 14% 1 g 2 g 3 g 1 0 g 2 0 g PO R CE N TA G EM DE E ST IR PE S Q UE CR ES CE R A M CONCENTRAÇÃO NaCl L-1 LAMAB Padrões
(LOPES; ANDRADE; CHAVES, 2008). Nesse sentido, a seleção de estirpes tolerantes e eficientes é de suma importância para regiões que se enquadram nesse contexto.
4.5 Análise estatística
A partir dos dados referentes às características culturais e fisiológicas obteve-se um dendrograma de similaridade. Foi verificado a formação de três grupos principais ao nível de 72% de similaridade (Figura 1).
Dentre as estirpes testadas não houve variação quanto a velocidade de crescimento, alteração de pH do meio e a resistência a elevadas temperaturas, com exceção da LAMAB 117. Sendo assim, só foram observadas diferenças apenas no diâmetro das colônias, na tolerância aos níveis de salinidade. Portanto, o grupo I é formado por estirpes com diâmetro de colônias maior que 1mm, e tolerância a concentração de 20g NaCl L-1. Os grupos II e III se diferem apenas na tolerância aos níveis de salinidade, pois ambos são constituídos de estirpes com diâmetro de colônia menor que 1mm. Nos grupos II e III a concentração de NaCl tolerada foi de 3g L-1 e 10g L-1, respectivamente. Esses três grupos apresentam uma maior similaridade com a estirpe padrão BR 3267 (Bradyrhizobium sp.).
Rizóbios pertencentes ao gênero Bradyrhizobium spp, geralmente apresentam velocidade de crescimento lento e são capazes de alcalinizar o meio de cultura. Os que alcalinizam o meio representam uma forma menos evoluída do que aqueles que acidificam. De modo geral, os rizóbios que alcalinizam o meio e apresentam crescimento lento, parecem ter co-evoluído com leguminosas de origem tropical. Solos tropicais são mais ácidos e possivelmente a habilidade de alcalinizar o meio represente uma vantagem seletiva (MARTINS et al., 1997).
De acordo com Elsheikh (1998), em geral, espécies de rizóbio de crescimento rápido, do gênero Rhizobium, são mais tolerantes a altas concentrações salinas em meio de cultura, quando comparadas a espécies de crescimento lento, como as do gênero
Bradyrhizobium, pois produzem mais polissacarídeos extracelulares, que envolvem as células
bacterianas, diminuindo o contato da superfície celular com o meio salino, proporcionando assim, maior resistência da célula bacteriana ao efeito osmótico.
Estudos como o de Youseif et al. (2014), indicaram que estirpes de crescimento lento toleram níveis de NaCl menores quando comparadas as de crescimento rápido. No entanto, Nóbrega et al. (2009) e Rodrigues et al. (2018) mostram que há variações de tolerância a salinidade entre estirpes de crescimento rápido e lento
26
Figura 1- Dendrograma das características culturais e de tolerância à pH extremos das 19 estirpes e 7 padrões. A linha vertical aponta grupos com 72% de similaridade Fonte: Cunha (2018) . GRUPO I GRUPO II GRUPO III
Pinheiro et al. (2014) mostraram que 12 das 30 das estirpes estudadas, oriundas dos Estados do Ceará e do Rio Grande do Norte, apresentaram reação de pH do meio neutra e velocidade de crescimento lenta. Em seu trabalho, Lima et al. (2017) identificaram que 3 dessas estirpes pertencem ao gênero Bradyrhizobium.
Pode-se inferir baseado nos resultados desse estudo que as estirpes da região do Baixo Acaraú pertencem ao gênero Bradyrhizobium devido as semelhanças de suas características, sendo necessários estudos complementares, como a caracterização genética desses isolados a fim de confirmar essa classificação.
5 CONCLUSÕES
As estirpes estudadas não mostraram significativas variações nas características culturais e apresentaram tolerância somente ao pH alcalino. No teste de resistência, somente a estipe LAMAB 117 cresceu a 45°C. Contudo, as estirpes LAMAB 112, LAMAB 113, LAMAB 115, LAMAB 116, LAMAB 118, LAMAB 122, LAMAB 125 e LAMAB 130 foram capazes de resistir a concentração de NaCl 10g L-1. As estirpes da região do Baixo Acaraú pertencem ao gênero Bradyrhizobium devido as semelhanças de suas características, no entanto são necessários estudos complementares que confirmem essa classificação.
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