M é to d o s U tiliza d o s no
B io c o n tro /e d e F ito p a tó g e n o s
Métodos usados no ...
2007 L V - 2 0 0 8 .0 0 0 1 8
E m p re s a B ra s ile ira d e P e s q u is a A g r o p e c u á r ia E m b ra p a U v a e V in h o
M in is t é r io d a A g r ic u ltu r a , P e c u á r ia e A b a s te c im e n to
M é to d o s usados no
B iocontrole de F ito p ató g en o s
E d ito re s:
Rosa M a ria V a ld e b e n ito S a n h u e z a Ita m a r S o a re s de M e lo
Bento Gonçalves, RS 2007
Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na: E m b ra p a U v a s V in h o Rua Livramento, 515 Caixa Postal 130 Fone: (0xx)54 3455 8 0 0 0 Fax: (0xx)54 3451 2792 h ttp ://w w w .cn p u v.e m b ra p a.b r sac@cnpuv.embrapa.br C o m itê d e P u b lic a ç õ e s
Presidente: Lucas da Ressurreição Garrido Secretária-Executiva: Sandra de Souza Sebben
Membros: Luiz A n te n o r Rizzon, Kátia M id o ri Hiwatashi, Osmar Nickel. Viviane M aria Zanella Bello Fialho
Normalização bibliográfica: Kátia M id o ri Hiwatashi Elaboração da capa: Luciana Elena M endonça Prado
1a e d iç ã o
1* impressão (2007): 5 0 0 exemplares
T o do s os d ire ito s re s e r v a d o s .
A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei ns 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Embrapa Uva e Vinho
M étodos usados no biocontrole de fitopatógenos/E ditado por Rosa Maria Valdebenito Sanhueza e Itamar Soares de Melo. - Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho. 2007.
141 p.
ISBN 978-85-89921-05-3
1. Doença de planta. 2. Antagonismo. 3. M icrorganismo. I. Valdebenito Sanhueza, Rosa Maria, ed. II. Melo, Itamar Soares de. ed.
CDD 579 ( 21. Ed.) © Embrapia, 2007
A p r e s e n ta ç ã o
Em consonância com a missão institucional da Embrapa Uva e Vinho, desde longa data vêm sendo desenvolvidas ações de pesquisa e desenvolvim ento que têm gerado im portantes resultados no tocante ao com ponente am biental. E isto ocorre porque é com provada a necessidade de buscar-se o desenvolvim ento sustentado do espaço rural, tendo-se em vista as exigências de m ercado, dos produtores e dos órgãos ambientais em reduzir-se o im pacto am biental da atividade produtiva.
E neste contexto que o controle biológico se insere. Ao m axim izar o uso de organism os naturais no m anejo de pragas e doenças, esta tecnologia contribui decisivam ente para que a produção se dê com reduzido im pacto, em benefício da alm ejada sustentabilidade. Esta publicação é resultante de estudos de pesquisadores da Embrapa Uva e Vinho e de outras Unidades da Embrapa, além de essenciais parceiros, os quais, em parceria, têm contribuído para a m elhoria do conhecim ento sobre esta im portante área.
Temos certeza que as inform ações aqui divulgadas servirão para o m aior conhecim ento e uso do controle biológico, bem com o de estím ulo e suporte para novas ações de pesquisa que resultem em tecnologias am bientalm ente lim pas e tecnicam ente viáveis.
Alexandre H offm ann Chefe-Geral Embrapa Uva e Vinho
S u m á rio
Isolam ento de antagonistas a pató ge n os que colonizam ferim entos de plantas
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 9
O btenção de epífitas de frutos e seleção de antagonistas no controle de podridões de pós-colheita
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 13
Isolam ento de colonizadores de clam idosporos de Fusarium oxysporum
Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 17
Isolam ento de bactérias do rizoplano e endorizosfera e seu efeito na colonização de raízes e na p ro m o ção do crescim ento de plantas
Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 21
Isolam ento de antagonistas para controle de doenças vasculares
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 27
A valiação do efeito p ro te to r e curativo de antagonistas a patógenos que colonizam folhas
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza, M argareth Z am b on i-P in otti e A n a Elisa S ilveira Perez ... 31
M u ltip lica çã o de C lonostachys rosea
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Gilberto D ali O nder ... 35
Seleção de fungos e n d o fítico s em fruteiras e flores
Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e M argareth Z am boni-P inoti ... 39
Isolam ento seletivo de bactérias ativas para nucleação de gelo
Isolam ento de fungos m icorrízicos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 45
Isolam ento seletivo de Bacillus
W agner B e ttio l ... 49
O btenção de m utantes e co m p etitivid ad e de isolados de bactérias resistentes a antibióticos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 53
O btenção de m utantes de Trichoderma spp. resistentes a fungicidas
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 55
Identificação de bactérias por análise dos ácidos graxos
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 59
Identificação de bactérias pelo seqüenciam ento de genes 16S ribossôm ico (16S rDNA)
Fernando D in i A n dre ote ... 67
Identificação e diferenciação de linhagens de leveduras antagônicas a fitopatógenos utilizando sondas convencionais com o indicadores na reação de polim erização em cadeia
Luis Fernando Revers e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 75
Produção de sideróforos por rizobactérias
Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 79
Produção de a ntibióticos por m icrorganism os
Produção de bactérias para uso no controle biológico
Deise M aria Fontana C apalbo ... 97
Encapsulam ento de m icrorganism os
Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 103
Roteiro para form ulação experim ental pó m olhável de biopesticida (sigla internacional WP)
Cláudia M ed ug no ... 109
Isolam ento de actinom icetos visando ao controle biológico de fitopatógenos
Joelm a M arcon. Jose A n to n io da Silva e M aria Carolina Quecine ... 117
Avaliação in vitro da colonização de raízes por rizobactérias
B rigida P. Vilar Queiroz e Ita m a r Soares de M elo ... 121
Seleção de rizobactérias capazes de form arem biofilm es
Francisco Eduardo de C. Costa e Ita m a r Soares de M elo ... 125
Avaliação ecotoxicológica de m icrorganism os em organism os não-alvo, organism os aquáticos e mamíferos
Vera Lúcia de Castro e Cláudio Jonsson ... 129
Apêndice
M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 53
O b te n ç ã o
ade
m u ta n te s
e
c o m p e titiv id a d e
de
isolados de
b a c té ria s resisten tes a an tib ió tico s
Itamar Soares de Melo 1 Rosa Maria Valdebenito Sanhueza 2
Rizobactérias prom otoras do crescim ento de plantas e antagônicas a fitopatógenos, quando introduzidas ao solo, devem colonizar o sistema radicular eficientem ente. Este é um pré-requisito fund am e nta l. Para avaliação da colonização, crescim ento e sobrevivência na rizosfera, necessário se faz identificar certas características da bactéria que a to rn e co nh ecida com segurança. Em geral, resistência aos antibióticos, p rin cip a lm e n te à rifam picina, é o m arcador mais com um ente utilizado. Contudo, deve-se levar em conta que resistência a a ntibiótico pode m udar características de interesse nas linhagens selecionadas, com o tam bém pode apresentar instab ilida d e sob certas condições de ambiente.
O b je tiv o
O bter mutantes de bactérias resistentes a rifam picina e /o u ácido nalidíxico e investigar a segurança de utilização desta característica para m onitoração da dinâm ica populacional de bactérias na rizosfera.
P ro to c o lo
P a rte I - S e le ç ã o d e m u ta n te s
1. Preparar meio King B c o n te n d o concentrações crescentes de rifam picina (50, 100. 150, 200, 250 p g /m L ).
2. Preparar uma suspensão bacteriana, fazer diluições até 10 1 e plaquear nas concentrações de rifa m p icin a acim a discrim inadas.
3. Incubar as culturas a 27°C por qua tro dias.
1 Eng. Agrôn., Doutor, Em brapa M e io A m b ie n te . Caixa Postal 69, 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna, SP 2 Eng Agrôn., Doutor, Em brapa Uva e Vinho, Caixa Postal 130, 9 5 7 0 0 -0 0 0 Bento Gonçalves, RS.
54 - Métodos usados no B ioco n tro le de Fito p a tó ge n o s
4. Observar o cre scim e n to de colônias nas diferentes concentrações, repicá- las para m eio KB c o n te n d o a concentração de rifam picina lim ite para o crescim ento.
5. S ubcultivar por, a p ro xim a d a m e n te dez vezes os m utantes Rifr. em m eio KB, e com parar o n úm ero de unidades form adoras de colônias (ufc) após diluição das suspensões nos m eios KB e KB com rifam picina.
6. Os m utantes devem ser arm azenados a 4 SC em m eio KB suplem entado com rifam picina (6 0 0 ppm ).
7. Com parar estes m uta ntes Rifr. co m a linhagem selvagem no que concerne à taxa de crescim ento, fluorescência, antagonism o in vitro, aspectos b ioquím icos, etc.
P a rte II - C o m p e tit iv id a d e e n tr e m u ta n te s R ifr. e lin h a g e m
s e lv a g e m
1. Cultivar 0,1 m L (1 0 9 u fc /m L ) da linhagem selvagem e dos m utantes Rifr. em 25 mL em KB.
2. Im ediatam ente após a rep ica g em e a intervalos de 6, 10 e 24 horas de incubação, am ostras são to m a d a s e diluições em série são plaqueadas em meio KB ágar c o n te n d o 0 ou 150 p g /m L de rifam picina, a fim de d ete rm ina r as densidades de p op ulaçã o da linhagem selvagem e dos m utantes Rifr. 3. A cada 24 horas, 0,1 m L da m istura de culturas é adicionada a 25 m L de
meio fresco, repetindo-se o processo por três vezes. Fazer três repetições por tratam en to .
4. Com parar o a n ta g o n ism o dos m utantes com o do isolado selvagem.
L ite ra tu ra C o n s u lta d a
HOM M A, Y.; SUZUI, T. Role o f a n tib io tic production in suppression o f radish d am pin g-off by seed b a cte riza tio n w ith Pseudomonas cepacia. A n n a ls o f th e