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Obtenção de mutantes e competitividade de isolados de bactérias resistentes a antibióticos. - Portal Embrapa

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Academic year: 2021

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(1)

M é to d o s U tiliza d o s no

B io c o n tro /e d e F ito p a tó g e n o s

Métodos usados no ...

2007 L V - 2 0 0 8 .0 0 0 1 8

(2)

E m p re s a B ra s ile ira d e P e s q u is a A g r o p e c u á r ia E m b ra p a U v a e V in h o

M in is t é r io d a A g r ic u ltu r a , P e c u á r ia e A b a s te c im e n to

M é to d o s usados no

B iocontrole de F ito p ató g en o s

E d ito re s:

Rosa M a ria V a ld e b e n ito S a n h u e z a Ita m a r S o a re s de M e lo

Bento Gonçalves, RS 2007

(3)

Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na: E m b ra p a U v a s V in h o Rua Livramento, 515 Caixa Postal 130 Fone: (0xx)54 3455 8 0 0 0 Fax: (0xx)54 3451 2792 h ttp ://w w w .cn p u v.e m b ra p a.b r sac@cnpuv.embrapa.br C o m itê d e P u b lic a ç õ e s

Presidente: Lucas da Ressurreição Garrido Secretária-Executiva: Sandra de Souza Sebben

Membros: Luiz A n te n o r Rizzon, Kátia M id o ri Hiwatashi, Osmar Nickel. Viviane M aria Zanella Bello Fialho

Normalização bibliográfica: Kátia M id o ri Hiwatashi Elaboração da capa: Luciana Elena M endonça Prado

1a e d iç ã o

1* impressão (2007): 5 0 0 exemplares

T o do s os d ire ito s re s e r v a d o s .

A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei ns 9.610).

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Embrapa Uva e Vinho

M étodos usados no biocontrole de fitopatógenos/E ditado por Rosa Maria Valdebenito Sanhueza e Itamar Soares de Melo. - Bento Gonçalves: Embrapa Uva e Vinho. 2007.

141 p.

ISBN 978-85-89921-05-3

1. Doença de planta. 2. Antagonismo. 3. M icrorganismo. I. Valdebenito Sanhueza, Rosa Maria, ed. II. Melo, Itamar Soares de. ed.

CDD 579 ( 21. Ed.) © Embrapia, 2007

(4)

A p r e s e n ta ç ã o

Em consonância com a missão institucional da Embrapa Uva e Vinho, desde longa data vêm sendo desenvolvidas ações de pesquisa e desenvolvim ento que têm gerado im portantes resultados no tocante ao com ponente am biental. E isto ocorre porque é com provada a necessidade de buscar-se o desenvolvim ento sustentado do espaço rural, tendo-se em vista as exigências de m ercado, dos produtores e dos órgãos ambientais em reduzir-se o im pacto am biental da atividade produtiva.

E neste contexto que o controle biológico se insere. Ao m axim izar o uso de organism os naturais no m anejo de pragas e doenças, esta tecnologia contribui decisivam ente para que a produção se dê com reduzido im pacto, em benefício da alm ejada sustentabilidade. Esta publicação é resultante de estudos de pesquisadores da Embrapa Uva e Vinho e de outras Unidades da Embrapa, além de essenciais parceiros, os quais, em parceria, têm contribuído para a m elhoria do conhecim ento sobre esta im portante área.

Temos certeza que as inform ações aqui divulgadas servirão para o m aior conhecim ento e uso do controle biológico, bem com o de estím ulo e suporte para novas ações de pesquisa que resultem em tecnologias am bientalm ente lim pas e tecnicam ente viáveis.

Alexandre H offm ann Chefe-Geral Embrapa Uva e Vinho

(5)

S u m á rio

Isolam ento de antagonistas a pató ge n os que colonizam ferim entos de plantas

Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 9

O btenção de epífitas de frutos e seleção de antagonistas no controle de podridões de pós-colheita

Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 13

Isolam ento de colonizadores de clam idosporos de Fusarium oxysporum

Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 17

Isolam ento de bactérias do rizoplano e endorizosfera e seu efeito na colonização de raízes e na p ro m o ção do crescim ento de plantas

Ita m a r Soares de M e lo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 21

Isolam ento de antagonistas para controle de doenças vasculares

Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 27

A valiação do efeito p ro te to r e curativo de antagonistas a patógenos que colonizam folhas

Rosa M aria V aldebenito Sanhueza, M argareth Z am b on i-P in otti e A n a Elisa S ilveira Perez ... 31

M u ltip lica çã o de C lonostachys rosea

Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e Gilberto D ali O nder ... 35

Seleção de fungos e n d o fítico s em fruteiras e flores

Rosa M aria V aldebenito Sanhueza e M argareth Z am boni-P inoti ... 39

Isolam ento seletivo de bactérias ativas para nucleação de gelo

(6)

Isolam ento de fungos m icorrízicos

Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 45

Isolam ento seletivo de Bacillus

W agner B e ttio l ... 49

O btenção de m utantes e co m p etitivid ad e de isolados de bactérias resistentes a antibióticos

Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 53

O btenção de m utantes de Trichoderma spp. resistentes a fungicidas

Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 55

Identificação de bactérias por análise dos ácidos graxos

Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 59

Identificação de bactérias pelo seqüenciam ento de genes 16S ribossôm ico (16S rDNA)

Fernando D in i A n dre ote ... 67

Identificação e diferenciação de linhagens de leveduras antagônicas a fitopatógenos utilizando sondas convencionais com o indicadores na reação de polim erização em cadeia

Luis Fernando Revers e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 75

Produção de sideróforos por rizobactérias

Ita m ar Soares de M elo e Rosa M aria Valdebenito Sanhueza ... 79

Produção de a ntibióticos por m icrorganism os

(7)

Produção de bactérias para uso no controle biológico

Deise M aria Fontana C apalbo ... 97

Encapsulam ento de m icrorganism os

Rosa M aria Valdebenito Sanhueza e Ita m ar Soares de M elo ... 103

Roteiro para form ulação experim ental pó m olhável de biopesticida (sigla internacional WP)

Cláudia M ed ug no ... 109

Isolam ento de actinom icetos visando ao controle biológico de fitopatógenos

Joelm a M arcon. Jose A n to n io da Silva e M aria Carolina Quecine ... 117

Avaliação in vitro da colonização de raízes por rizobactérias

B rigida P. Vilar Queiroz e Ita m a r Soares de M elo ... 121

Seleção de rizobactérias capazes de form arem biofilm es

Francisco Eduardo de C. Costa e Ita m a r Soares de M elo ... 125

Avaliação ecotoxicológica de m icrorganism os em organism os não-alvo, organism os aquáticos e mamíferos

Vera Lúcia de Castro e Cláudio Jonsson ... 129

Apêndice

(8)

M étodos usados no Biocontrole de Fitopatógenos - 53

O b te n ç ã o

a

de

m u ta n te s

e

c o m p e titiv id a d e

de

isolados de

b a c té ria s resisten tes a an tib ió tico s

Itamar Soares de Melo 1 Rosa Maria Valdebenito Sanhueza 2

Rizobactérias prom otoras do crescim ento de plantas e antagônicas a fitopatógenos, quando introduzidas ao solo, devem colonizar o sistema radicular eficientem ente. Este é um pré-requisito fund am e nta l. Para avaliação da colonização, crescim ento e sobrevivência na rizosfera, necessário se faz identificar certas características da bactéria que a to rn e co nh ecida com segurança. Em geral, resistência aos antibióticos, p rin cip a lm e n te à rifam picina, é o m arcador mais com um ente utilizado. Contudo, deve-se levar em conta que resistência a a ntibiótico pode m udar características de interesse nas linhagens selecionadas, com o tam bém pode apresentar instab ilida d e sob certas condições de ambiente.

O b je tiv o

O bter mutantes de bactérias resistentes a rifam picina e /o u ácido nalidíxico e investigar a segurança de utilização desta característica para m onitoração da dinâm ica populacional de bactérias na rizosfera.

P ro to c o lo

P a rte I - S e le ç ã o d e m u ta n te s

1. Preparar meio King B c o n te n d o concentrações crescentes de rifam picina (50, 100. 150, 200, 250 p g /m L ).

2. Preparar uma suspensão bacteriana, fazer diluições até 10 1 e plaquear nas concentrações de rifa m p icin a acim a discrim inadas.

3. Incubar as culturas a 27°C por qua tro dias.

1 Eng. Agrôn., Doutor, Em brapa M e io A m b ie n te . Caixa Postal 69, 1 3 8 2 0 -0 0 0 Jaguariúna, SP 2 Eng Agrôn., Doutor, Em brapa Uva e Vinho, Caixa Postal 130, 9 5 7 0 0 -0 0 0 Bento Gonçalves, RS.

(9)

54 - Métodos usados no B ioco n tro le de Fito p a tó ge n o s

4. Observar o cre scim e n to de colônias nas diferentes concentrações, repicá- las para m eio KB c o n te n d o a concentração de rifam picina lim ite para o crescim ento.

5. S ubcultivar por, a p ro xim a d a m e n te dez vezes os m utantes Rifr. em m eio KB, e com parar o n úm ero de unidades form adoras de colônias (ufc) após diluição das suspensões nos m eios KB e KB com rifam picina.

6. Os m utantes devem ser arm azenados a 4 SC em m eio KB suplem entado com rifam picina (6 0 0 ppm ).

7. Com parar estes m uta ntes Rifr. co m a linhagem selvagem no que concerne à taxa de crescim ento, fluorescência, antagonism o in vitro, aspectos b ioquím icos, etc.

P a rte II - C o m p e tit iv id a d e e n tr e m u ta n te s R ifr. e lin h a g e m

s e lv a g e m

1. Cultivar 0,1 m L (1 0 9 u fc /m L ) da linhagem selvagem e dos m utantes Rifr. em 25 mL em KB.

2. Im ediatam ente após a rep ica g em e a intervalos de 6, 10 e 24 horas de incubação, am ostras são to m a d a s e diluições em série são plaqueadas em meio KB ágar c o n te n d o 0 ou 150 p g /m L de rifam picina, a fim de d ete rm ina r as densidades de p op ulaçã o da linhagem selvagem e dos m utantes Rifr. 3. A cada 24 horas, 0,1 m L da m istura de culturas é adicionada a 25 m L de

meio fresco, repetindo-se o processo por três vezes. Fazer três repetições por tratam en to .

4. Com parar o a n ta g o n ism o dos m utantes com o do isolado selvagem.

L ite ra tu ra C o n s u lta d a

HOM M A, Y.; SUZUI, T. Role o f a n tib io tic production in suppression o f radish d am pin g-off by seed b a cte riza tio n w ith Pseudomonas cepacia. A n n a ls o f th e

Referências

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Apn.ZAzn.ta-* ζ um hÍÁtÕAÍ.co taxonÕmico do gznzho Capinona, *inonÍmia completa, dz*- CKÍÇOZA, noma* va-tgaAZA ζ di*cu**õz* AZ^ΖΑζηΧ.ζΑ, tanto paAa o gznzAo, como