UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE BIOLOGIA
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Estabelecimento e calogênese in vitro de Lippia
alba (Mill) N. E. Brown (Verbenaceae)
LUCAS SÁ TELES DOS ANJOS
Monografia apresentada ao Instituto de
Biologia da Universidade Federal Bahia como exigência para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas
Salvador 2013
Banca Examinadora
Dra. Moema Cortizo Bellintani
Universidade Federal da Bahia – Instituto de Biologia
Dra. Sheila Vitoria Resende
Universidade Federal da Bahia – Instituto de Biologia
Dra. Alone Lima Brito
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RESUMO
Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae), popularmente conhecida como
erva-cidreira, é uma planta medicinal cujos extratos são utilizados para o tratamento das mais variadas enfermidades, como resfriados, bronquites, asma, febre, insônia, dores abdominais dentre outras. As atividades medicinais e aromáticas presentes em plantas devem-se, principalmente, à síntese de substâncias através do seu metabolismo secundário. Estas vias metabólicas podem ser ativadas através de interações entre as plantas e o meio ambiente, inclusive estresses nutricionais. Além das influências ambientais, a composição de substâncias do óleo essencial produzido (buquê) pode variar de acordo com o tecido vegetal, o estágio de desenvolvimento em que este se apresenta e o caráter genético dos indivíduos utilizados. A utilização de plantas como matéria prima para a produção em larga escala de medicamentos está vinculada a algumas problemáticas, como baixas concentrações de metabólitos produzidos em condições naturais e erosão genética decorrente do extrativismo predatório. Como ferramenta biotecnológica, a cultura de tecidos vegetais oferece técnicas úteis às pesquisas destinadas a melhoria na produção e obtenção final de metabólitos secundários; tanto pela propagação em massa do material vegetal utilizado e produção de metabólitos secundários in vitro, quanto pela seleção e conservação de germoplasma de interesse. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo elaborar um protocolo eficiente para o estabelecimento e calogênese in vitro de Lippia alba (Mill) N. E. Brown, contribuindo para a obtenção de material vegetal destinado à micropropagação e extração de óleos essenciais. Foi avaliada a influência dos meios MS e MS/2, com e sem carvão ativado, na germinação e crescimento in vitro de L. alba. Foi testada a influência da citocinina BAP (1 e 5 µM) e das auxinas ANA (5 e 10 µM) e 2,4-D (1 e 5 µM) em combinação fatorial citocinina X auxina (8 tratamentos), bem como dos explantes disco foliar, nó e entrenó na calogênese in vitro de L. alba. O meio MS/2 mostrou-se o mais indicado para a germinação e crescimento, sugerindo-se a adição de carvão ativado para a germinação. Para calogênese, recomenda-se a utilização do explante entrenó em quaisquer tratamentos. Foi observada a brotação e enraizamento dos calos produzidos.
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ABSTRACT
Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae), popularly known as erva cidreira, is a medicinal plant whose extracts are used for treatment of various illnesses, such as colds, bronchitis, asthma, fever, insomnia, abdominal pain, among others. The medicinal and aromatic activities present in plants are due mainly to the synthesis of substances through its secondary metabolism. These metabolic pathways can be activated through interactions between plants and the environment, including nutritional stress. In addition to the environmental influences, the substance composition of the essential oil produced (bouquet) may vary with the plant tissue, the stage of development in which it presents and the genetic character of the individuals used. The use of plants as a feedstock for the large scale production of drugs bound to some problems, such as low concentrations of metabolites produced under natural conditions and genetic erosion linked to the predatory extraction. As biotechnological tool, plant tissue culture offers useful techniques for research to improve the production of secondary metabolites, both for mass propagation of plant material and in vitro production of secondary metabolites, as for the selection and conservation of germplasm of interest. Thus, this study aims to develop an efficient protocol for in vitro callus formation and establishment of Lippia alba (Mill) N. E. Brown, contributing to obtain plant material for the micropropagation and extraction of essential oils. The influence of the MS and MS/2 media, with or without activated charcoal, where tested in in vitro germination and growth of L. alba. We tested the influence of the cytokinin BAP (1 and 5 µM) and the auxin NAA (5 and 10 µM) and 2,4-D (1 and 5 µM) in factorial combination Cytokinin X Auxin (8 treatments), as well as explant leaf, nodal and intermodal sections in in vitro callus formation L. alba. The MS/2 medium proved to be the most suitable for germination and growth, suggesting the addition of activated charcoal for germination. For callus induction, it is recommended to use the internodal section explant in any treatments. It was observed sprouting and rooting of callus produced.
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Dedico este trabalho ao meu amado avô Otávio (in memorian), humano e imperfeito, mas ainda assim, o maior exemplo de retidão e caráter que eu poderia desejar.
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeço a Universidade Federal da Bahia e a todo o corpo docente e de funcionários que por ventura estiveram envolvidos na minha formação ao longo do período de graduação.
Ao CNPQ pela concessão e renovação da bolsa de iniciação científica que resultou nos dados obtidos para a realização deste trabalho.
A professora Dra. Moema Cortizo Bellintani pela orientação, não só neste trabalho, mas também no meu amadurecimento profissional como biólogo.
A professora Dra. Sheila Vitoria Resende pelas contribuições durante todo o meu período de formação e, em especial, pelo estímulo durante a produção deste trabalho.
A todo o grupo do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da UFBA, pela contribuição intelectual nos trabalhos produzidos ao longo do período de estágio, pelo companheirismo, amizade e momentos de diversão vividos em ambiente intra e extracurriculares. Agradeço especialmente a Tiago Vieira pelas aulas de surf.
À minha família, especialmente a minha mãe Telma, meu irmão Leonardo e minha avó Ana, pela contribuição na minha formação como ser humano e pelo suporte incondicional nas escolhas que fiz até então.
À Msc. Brisa Mascarenhas Cruz, pela contribuição intelectual em muitos projetos realizados durante o período de graduação. Pelo afeto, carinho, dedicação e por, simplesmente, estar ao meu lado nos bons e maus momentos, eu agradeço.
Agradeço a todos os amigos e colegas que estiveram e/ou estão presentes no meu dia-a-dia, especialmente a Cássia Marques, Danilo Meireles, Bianca Topázio, Rafael Santiago, Leonardo Santana, Alex de Souza e João Paulo Lobo. Obrigado pelos momentos felizes que vocês me proporcionaram, bem como pelos puxões de orelha pertinentes.
v SUMÁRIO RESUMO...(i) ABSTRACT...(ii) DEDICATÓRIA...(iii) AGRADECIMENTOS...(iv) ÍNDICE...(v) 1. INTRODUÇÃO...1 1.1 Família Verbenaceae...1 1.2 Gênero Lippia...1
1.3 Lippia alba (Mill) N. E. Brown...3
1.4 Plantas medicinais...4 1.5 Cultura de tecidos...6 1.5.1 Meios de cultura...6 1.5.2 Reguladores vegetais...7 1.5.3 Germinação in vitro...8 1.5.4 Micropropagação...9 1.5.5 Calogênese...11
1.6 Cultura de tecidos e plantas medicinais...12
1.7 Objetivos...13
2. MATERIAL E MÉTODOS...14
2.1 Experimento 01 – Germinação e Crescimento in vitro...14
2.2 Experimento 02 – Calogênese in vitro...14
2.3 Análise estatística...15
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO...16
3.1 Consideração Inicial...16
3.2 Experimento 01 – Germinação e Crescimento in vitro...16
3.3 Experimento 02 – Calogênese in vitro...19
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS...25
1. INTRODUÇÃO
1.1. FAMÍLIA VERBENACEAE
A família Verbenaceae é tradicionalmente compreendida em duas subfamílias: Verbenoideae e Viticoideae. Entretanto, estudos recentes a cerca de caracteres morfológicos e filogenéticos sugerem que a subfamília Viticoideae seria parte integrante da família Lamiaceae. Desta forma, a família Verbenaceae limita-se aos indivíduos pertencentes à subfamília Verbenoideae, apresentando cerca de 100 gêneros e 2000 espécies distribuídas em zonas tropicais, subtropicais e temperadas do hemisfério sul. Alguns de seus representantes são encontrados em zonas temperadas do hemisfério norte e, no Brasil, estima-se a ocorrência de 22 gêneros e 296 espécies (ROTMAN & MÚLGURA, 1999).
Esta família agrupa indivíduos de diversos portes, desde o subarbustivo até o arbóreo, apresentando folhas opostas ou verticiladas, simples ou compostas e sem estípulas. Suas flores podem ser monoclinas ou diclinas, apresentam ovário súpero e são reunidas em inflorescências racemosas ou cimosas. Frequentemente, seus frutos são do tipo esquizocárpico, entretanto algumas espécies podem apresentar frutos drupáceos. Os indivíduos pertencentes à família Verbenaceae apresentam aplicações comerciais variadas, sendo importantes no ramo ornamental, madeireiro e medicinal (MELO et al, 2010).
1.2. GÊNERO Lippia
Lippia é um dos gêneros da família Verbenaceae que apresenta atividade
medicinal. Este táxon possui cerca de 200 espécies, distribuídas majoritariamente no Brasil, Paraguai e Argentina. No Brasil, existem dois grandes centros de diversidade biológica deste gênero, localizados na Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais e na Chapa Diamantina na Bahia, onde a utilização indiscriminada de espécies ameaçadas para fins medicinais é constante (PEIXOTO et al, 2006; FAVORITO, 2009).
O gênero Lippia é caracterizado por apresentar indivíduos de porte subarbustivo e arbustivo e folhas decussadas, geralmente com indumento glandular. Suas flores são sésseis, apresentando cálice comprimido e alado, corola hipocrateriforme 4-5 lobada, quatro estames, estigma lateral e ovário monocarpelar. Quando maduros, os frutos são divididos em dois mericarpos (Figura 1) (PEIXOTO et al, 2006; FAVORITO, 2009).
Figura 1: Prancha esquemática representante do gênero Lippia, com a planta
Lippia mínima Salimena. 1. hábito, 2. fruto, 3. folha (face adaxial), 4. folha (face
1.3. Lippia alba (MILL) N. E. BROWN
A espécie Lippia alba, amplamente utilizada na medicina popular brasileira, distribui-se naturalmente pelo continente latino-americano. No Brasil, esta planta está presente em quase todas as regiões (Figura 02), sendo popularmente conhecida como erva-cidreira (COSTA et al, 2004; JANNUZZI et al, 2011).
L. alba é uma planta anual que possui hábito arbustivo e ramificado, podendo
atingir até 2 metros de altura. Esta planta pode ser encontrada em solos arenosos e úmidos, às margens de rios, lagos e açudes, em locais de clima tropical ou temperado. Sua reprodução é, predominantemente, por alogamia, resultando em frutos esquizocárpicos (STEFANINI et al, 2002).
Na medicina popular, os extratos de L. alba são utilizados para o tratamento das mais variadas enfermidades, como resfriados, bronquites, asma, febre, insônia, dores abdominais dentre outras. Em geral, os extratos são preparados a partir da infusão de tecidos provenientes da parte aérea da planta, como folhas e flores, sendo administrados na forma de chás (FORMOLO, 2009; REIS et al, 2010).
Alguns estudos já demonstraram a eficácia medicinal de L. alba no combate a cepas microbianas. Segundo Sena Filho et al (2006), extratos de acetato de etila e metanol apresentam atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Klebsiella
Figura 02: Lippia alba (Mill) N. E. Brown a) hábito; b) folhas; c) inflorescência. a)
b)
pneumonia. Ainda nesta temática, Aguiar et al (2008) demonstraram a atividade
bactericida de extratos brutos de L. alba em S. aureus e outras cinco cepas bacterianas. Em estudos a cerca da atividade citotóxica de extratos brutos de raiz, caule e folha de L.
alba, Costa et al (2004) demonstraram a eficácia dos extratos etanólicos e clorofórmicos
contra células carcinogênicas do trato respiratório humano (NCI-H292 e HEp-2).
1.4. PLANTAS MEDICINAIS
As atividades medicinais e aromáticas presentes em plantas devem-se, principalmente, à síntese de substâncias por meio do seu metabolismo secundário, responsável pela adaptação desses indivíduos a situações ambientais adversas. Estas vias metabólicas podem ser ativadas por intermédio de interações animal, planta-planta e estresses nutricionais diversos. Geralmente, estas substâncias são produzidas em forma de óleo e apresentam caráter volátil, sendo secretadas por células do parênquima clorofiliano e tricomas glandulares. Além das influências genéticas e ambientais, a composição de substâncias do óleo essencial produzido (buquê) pode variar de acordo com o tecido ou estágio de desenvolvimento em que o indivíduo se encontra (YAMAMOTO, 2006; CASTRO et al, 2009).
Segundo Peres (2013), os metabólitos secundários vegetais podem ser compreendidos em três grandes grupos: os compostos fenólicos, originados dos ácidos chiquímico ou mevalônico; os terpenos, originados do ácido mevalônico ou do piruvato e 3-fosfoglicerato e os alcaloides, derivados de aminoácidos aromáticos, como triptofano e tirosina.
Os compostos fenólicos são os principais responsáveis pelas características atrativas das plantas, como coloração, sabor e odor, apresentando importância na indústria alimentícia como a produção de essências e flavorizantes e na ecologia na atração de organismos dispersores de frutos/semente e polinizadores. Alguns compostos fenólicos apresentam ação alelopática, impedindo o crescimento de outras plantas entorno do indivíduo produtor, como os ácidos caféico (C9H804) e ferúlico (C10H10O4). Além disso, os compostos fenólicos estão presentes na sustentação das plantas por meio da lignina, dando rigidez aos vasos do sistema vascular vegetal (SIMÕES et al, 2008; SILVEIRA et al, 2009; PERES, 2013).
Os terpenos são substâncias originadas do ácido mevalônico que apresentam caráter similar aos polímeros, sendo formados por uma subunidade composta de cinco carbonos denominada isopreno, presentes em cadeias laterais das citocininas. Os compostos formados pela superposição do isopreno podem possuir dez (monoterpeno), quinze (sesquiterpeno), vinte (diterpeno), trinta (triterpeno), quarenta (tetraterpeno) ou “N” (poliisopreno) carbonos, apresentando diferentes propriedades (PERES, 2013).
Segundo Tavares et al (2005), existem três quimiotipos distintos de L. alba classificados a partir da análise dos óleos essenciais extraídos das folhas e dos seus metabólitos secundários produzidos. O quimiotipo 1 possui maior concentração de citral (C10H16O), o quimiotipo 2 de carvona (C10H14O) e o quimiotipo 3 de linalol (C10H18O). Estas substâncias são monoterpenos, compostos de baixo peso molecular e caráter volátil, presentes na composição dos óleos essências. O citral é utilizado tanto na indústria alimentícia quanto cosmética devido ao seu forte odor cítrico (limão), além de apresentar atividade antimicrobiana e atuar como feromônio sexual em Itoplectis
conquisitor, uma espécie de vespa. A carvona apresenta odor acentuado de menta e é
utilizada na industria alimentícia, principalmente, na fabricação de gomas de mascar. Este monoterpeno apresenta ação inseticida, atuando no combate de larvas de Drosophila
melanogaster. O linalol é um importante fixador de aromas utilizado na indústria de
cosméticos, além de apresentar atividades antimicrobiana e antileishmanial (SIMAS, 2004; GONÇALVES, 2005; SOUZA, 2006; SCHRFFLER, 2008; FREITAS, 2009; ONAWUNMI, 2013; PERES, 2013; ROBACKER & HENDRY, 2013).
Os alcaloides são compostos orgânicos nitrogenados e cíclicos que, geralmente, apresentam caráter básico. Essas substâncias são conhecidas pela forte ação no sistema nervoso animal, sendo utilizadas na produção de drogas lícitas, como a morfina e a nicotina, e ilícitas, com a cocaína (PERES, 2013).
Apesar de apresentarem propriedades medicinais, a utilização de plantas como matéria prima para a produção em larga escala de medicamentos está vinculada a algumas problemáticas. Em certas espécies, as concentrações dos metabólitos produzidos em condições normais são insuficientes para atender a demanda comercial. Este é um dos motivos que levam algumas espécies ao quadro de erosão genética, principalmente pela coleta em excesso destes indivíduos no meio visando compensar as baixas taxas de produção metabólica. Além disso, as padronizações qualitativa e quantitativa dos óleos extraídos são dificultadas, tanto pela diversidade de estímulos que
interferem naturalmente no metabolismo secundário, quanto pela grande variabilidade genética apresentada por algumas espécies (CAMILLO, 2009; VICENTE, 2009; PEREIRA, 2011).
1.5. CULTURA DE TECIDOS
Em geral, as técnicas de cultura de tecidos de plantas visam o cultivo isolado, controlado e asséptico de indivíduos ou partes destes (explantes), sendo o material resultante utilizado para regeneração da planta de interesse. Este tipo de cultivo é denominado in vitro e se baseia na capacidade de totipotência apresentada pelos tecidos de origem vegetal. Para isso, são utilizados meios de cultura que são base nutritiva para o crescimento e modulação do desenvolvimento do material cultivado. Os meios de cultura podem ser suplementados com reguladores vegetais e carvão ativado, entre outras substâncias. O material vegetal é submetido a um controle específico das condições de cultura, principalmente temperatura e luminosidade, e os instrumentos utilizados nestas técnicas são esterilizados (PEREIRA, 2009; MORAIS, 2012).
1.5.1. MEIOS DE CULTURA
Em geral, os meios de cultura são compostos por água, soluções de micro e macronutrientes, carboidrato, vitaminas, reguladores vegetais e outras substâncias necessárias para a nutrição da planta cultivada (CALDAS, 1998).
A água é o componente mais abundante do meio de cultura e sua qualidade é imprescindível para a viabilidade das culturas realizadas. A presença de impurezas, como fungos, bactérias e compostos orgânicos voláteis, resistentes ao processo de destilação, podem resultar na perda total do material vegetal utilizado na cultura. Por tanto, a água utilizada passa por sistemas de destilação e/ou de filtragem tipo “Milli-Q” e “osmose reversa”, além de esterilização por autoclave (CALDAS, 1998).
A solução de macronutrientes é composta pelos elementos minerais exigidos em maiores quantidades pelo metabolismo vegetal, podendo ser suplementada com nitrogênio e enxofre por meio de moléculas orgânicas. Em geral, estão presentes fósforo, potássio, cálcio, magnésio e ferro. A solução de micronutrientes foi inicialmente proposta por Murashige & Skoog (1962), incluindo os elementos atualmente tidos como essenciais
para plantas clorofiladas, sendo estes o manganês, zinco, boro, cobre, cloro e molibdênio (CALDAS, 1998).
Devido a algumas características do cultivo, como luminosidade e disponibilidade de gás carbônico (CO2), e até mesmo baixos teores de clorofila sintetizada, as plantas ou
explantes submetidos ao regime in vitro apresentam baixas taxas de fotossíntese, tornando-se necessária a adição de fontes de carbono. O carboidrato mais utilizado para esta finalidade é a sacarose, uma vez que este açúcar suporta as melhores taxas de crescimento na maioria das espécies. Desta forma, a adição de fontes de carbono ao meio de cultura funciona como aporte energético e sustenta a biossíntese de compostos orgânicos essenciais ao crescimento das plantas (CALDAS, 1998).
A suplementação vitamínica dos meios de cultura pode variar entre espécies. Geralmente, a composição desta solução gira em torno das concentrações de tiamina, ácido nicotínico e piridoxina, sendo estas utilizadas nos primeiros estudos voltados à cultura de raízes (CALDAS, 1998).
1.5.2. REGULADORES VEGETAIS
Os reguladores vegetais são substâncias sintéticas, não produzidas naturalmente, que apresentam funções similares aos hormônios vegetais. Aplicadas em dosagens controladas, essas substâncias podem estimular, inibir ou modificar o crescimento e desenvolvimento das plantas. Atualmente, existem seis classes de hormônios/reguladores amplamente conhecidos: as auxinas, citocininas, giberelinas, o ácido abscísico, etileno e os brassinoesteroides (TORRES et al, 2000; FREITAS, 2009).
As auxinas são hormônios/reguladores responsáveis pelo alongamento celular e por favorecer a calogênese e a rizogenese em tecidos vegetais. Segundo Gueye et al (2009), a resposta demonstrada pelo explante não depende apenas de suas características, sendo cruciais as influências, tanto do tipo, quanto da dosagem do regulador vegetal utilizado no meio de cultura. Dentre as auxinas, as mais conhecidas são o Ácido 3-Indolilacético (AIA), sintetizado naturalmente em plantas, o Ácido α-naftalenoacético (ANA), o Ácido indolbutírico (AIB) e o Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). O AIA é considerado uma auxina relativamente “fraca”, pois é facilmente degradada pela luz e por microorganismos, tornando-se rapidamente indisponível para o metabolismo celular, o que diminui a eficiência desta sobre os tecidos em cultura.
Entretanto, sua síntese acontece naturalmente nas plantas, em regiões que se apresentam em fase de crescimento, evidenciando a importância desta auxina no metabolismo vegetal. Enquanto o AIB é a auxina mais utilizada como agente indutor de enraizamento, o 2,4-D apresenta forte influência sobre a indução da formação de calos em culturas in vitro, sendo este regulador normalmente vinculado a protocolos de micropropagação por vias indiretas. O ANA é o análogo químico sintético do AIA, sendo esta uma das auxinas mais utilizadas em cultura de tecidos in vitro. Suas aplicações variam desde a indução da rizogênese à indução de calogênese in vitro. Geralmente, o ANA é utilizado em experimentos como classe de comparação para outras auxinas, podendo apresentar resultados melhores que estas, dependendo das concentrações utilizadas e espécies trabalhadas (CALDAS, 1998; FREITAS, 2009).
As citocininas são substâncias que apresentam a função de induzir a expansão celular por meio da multiplicação de células vegetais. Dentre estas, as mais conhecidas são a 6-Benzilaminopurina (BAP) e a Cinetina (KIN). O BAP é forte indutor de brotação, enquanto a KIN geralmente possibilita apenas o crescimento celular sem brotação (FREITAS, 2009; ASMAR, 2011).
Segundo Taiz & Zeiger (2004), a presença de auxinas e citocininas é condição indispensável à sobrevivência das plantas, não sendo encontrados, até então, indivíduos incapazes de sintetizar estas duas substâncias. O balanço fisiológico entre estas duas classes de hormônios vegetais está diretamente atrelado ao crescimento e desenvolvimento em culturas in vitro de plantas.
1.5.3. GERMINAÇÃO IN VITRO
A germinação é o processo de retomada do crescimento e desenvolvimento embrionário, que pode ser compreendido em três etapas: embebição da semente, mobilização das reservas e alongamento do eixo embrionário (BEWLEY & BLACK, 1994). A primeira etapa é caracterizada pela absorção de água pela semente, orientada pelo gradiente de concentração de água entre esta e o meio externo. A segunda etapa é definida pela redução da absorção de água e reativação do metabolismo do embrião, que irá consumir as reservas nutritivas da semente e garantir o seu desenvolvimento inicial. Na terceira etapa, ocorre o aumento de massa fresca, ocasionada pela absorção de água, o início da multiplicação celular e a emissão da radícula, evento este que conclui o
processo germinativo (BEWLEY & BLACK, 1994; FERREIRA & BORGHETTI, 2004). A duração das etapas, bem como de todo o processo de germinação, pode variar de acordo com características morfofisiológicas das sementes, aumentando a complexidade deste processo em certas espécies (RAVEN, 2001; TAIZ & ZEIGER, 2004).
A germinação in vitro é utilizada, principalmente, em espécies cujas taxas de germinação em condições naturais são insuficientes para a obtenção de material vegetal destinado à experimentação e/ou atendimento a demandas comerciais. A dormência de sementes é um fator que pode diminuir estas taxas, dificultando o estabelecimento de culturas in vitro. Além disso, existem plantas cujas sementes são desprovidas de endosperma, necessitando de associações com outros organismos para a nutrição inicial do embrião e prosseguimento da sucessão dos eventos metabólicos associados à germinação (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998; COUTO, 2004).
A contaminação por microorganismos nos sistemas de cultura de tecidos in vitro pode resultar na competição por nutrientes entre a planta e o infectante. Além disso, a colonização dos tecidos vegetais e/ou a eliminação de metabólitos no meio de cultura pelo patógeno podem causar danos irreversíveis aos indivíduos cultivados, bem como alterar a expressão metabólica destes. A grande dificuldade na desinfestação do material vegetal é obtê-lo sadio e vivo, em boas condições de uso. Para tanto, diferentes substâncias tem sido utilizadas, como etanol (70%) e compostos a base de cloro, como hipoclorito de sódio (NaOCl) e de cálcio (CaOCl2). As substâncias utilizadas, suas
concentrações, e o tempo de exposição do tecido, podem variar entre espécies, dificultando a padronização de protocolos de desinfestação (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Segundo Mercier & Nievola (2003), a germinação de sementes in vitro é uma alternativa viável para a obtenção de plantas livres de patógenos que, posteriormente, podem ser utilizadas para obtenção de explantes de interesse.
1.5.4. MICROPROPAGAÇÃO
A micropropagação é uma das técnicas de maior destaque na cultura de tecidos de plantas e seus benefícios são utilizados, também, para a melhoria nos sistemas de cultivo de plantas medicinais. A partir desta técnica, é possível obter plantas livres de vírus e com boas condições fitossanitárias e fisiológicas. Segundo Murashige (1974), o sistema de micropropagação em plantas pode ser dividido em três estágios específicos. O primeiro
passo consiste na seleção do explante, sua desinfestação e as seleções dos meios de cultura e condições de cultivo a serem empregados. Em seguida, deve ser realizada a multiplicação dos propágulos por meio de subculturas sucessivas em meio adequado. Por fim, os propágulos produzidos devem ser inoculados em meios de cultura que estimulem o enraizamento para posterior transplante no substrato ou em ambiente ex vitro (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Dentre os fatores que influenciam o sucesso da micropropagação, destacam-se as seleções do explante, bem como dos meios de cultura e reguladores vegetais utilizados. Dependendo do explante utilizado, as vias de morfogênese podem ser de três tipos: proliferação de gemas axilares, indução de gemas adventícias por organogênese (direta ou indireta) e embriogênese somática (direta ou indireta) (DESCHAMPS, 1993; GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998; KOMALAVALLI & RAO, 2000).
A micropropagação por proliferação de gemas axilares é a mais empregada em sistemas in vitro de cultivo de plantas. Neste método, órgãos meristemáticos preexistentes (gemas axilares) são isolados e estimulados a crescer com o uso de reguladores vegetais. Desta forma, são formados aglomerados de partes aéreas que, por sua vez, são subdivididos, formando novos indivíduos. Na organogênese direta, são utilizadas gemas adventícias, ou seja, partes da planta que apresentam potencial morfogenético para a produção de novos tecidos, mas que não o fazem na ausência de estímulos exógenos, como o dos reguladores vegetais. Normalmente, este tipo de gema está presente em tecidos do câmbio vascular, pecíolo e bases de folhas, escamas de bulbos e segmentos radiculares. A organogênese indireta ocorre a partir da formação de gemas adventícias em tecidos que não as apresentam em condições normais. Para tanto, o explante utilizado deve ser submetido à desdiferenciação celular, formando uma estrutura denominada calo. Como a organogênese, a embriogênese somática também pode ser direta ou indireta, sendo a segunda a forma mais comumente observada. A utilização desta técnica para a regeneração de plantas é altamente desejada, uma vez que apresenta altas taxas de multiplicação e resulta em embriões individualizados que se desenvolvem diretamente em novas plantas. Além disso, a manutenção de sistemas de suspensões celulares embriogênicas necessita de pouco espaço e manipulação humana mínima, tornando esta metodologia interessante do ponto de vista comercial. Entretanto, os altos níveis de auxinas normalmente utilizadas nestes tipos de protocolo de regeneração podem ocasionar variação somaclonal. Neste caso, as plantas obtidas
podem apresentar variações genéticas em relação ao explante utilizado inicialmente (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998; MORAIS, 2012).
Em estudos com Ocimum selloi (Lamiaceae), utilizado popularmente no combate a sintomas de mau funcionamento do trato intestinal, Monforte et al (2012) demonstraram o efeito de BAP sobre a indução de brotação em segmentos apicais e nodais. O aumento das concentrações de BAP mostrou-se favorável à razão brotos/explante, aumentando o número final de brotos obtidos. Entretanto, estes apresentaram tamanho reduzido e menores valores de massa seca e fresca comparados aos brotos obtidos em menores concentrações de BAP. Além disso, o explante de origem apical mostrou-se pouco responsivo aos tratamentos.
Além das justificativas ortodoxas para a utilização da micropropagação, alguns estudos indicam que esta técnica é um modo eficiente de induzir o aumento da produção de metabólitos secundários, não apenas pela multiplicação das plantas utilizadas nos protocolos de extração, mas pelo aumento das taxas de produção de metabólitos nos brotos (ARIKAT, 2004; SOARES, 2010).
1.5.5. CALOGÊNESE
A calogênese é uma técnica da cultura de tecidos de plantas que visa a desdiferenciação de células, formando agregados celulares que recuperam a atividade meristemática (TORRES, 2000). Qualquer tecido de origem vegetal pode ser utilizado como explante para a formação de calos, entretanto, aqueles que apresentam maiores quantidades de células meristemáticas, menores quantidades de lignina e apresentam-se em estágios juvenis de desenvolvimento, são os mais indicados para este procedimento (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Segundo Cerqueira et al (2002), são muitos os fatores que interferem na calogênese: tamanho do explante, composição dos meios de cultura, reguladores vegetais exógenos, órgão fornecedor do explante, idade e época do ano em que este foi seccionado, bem como o genótipo da planta doadora. Uma vez estabelecida, a cultura de calos pode ser multiplicada por meio da sucessão de subculturas, bem como ser mantida na condição in vitro por períodos que variam entre as espécies (RODRIGUES et al, 2010).
Do ponto de vista da cultura de tecidos de plantas medicinais, a calogênese apresenta três funções de grande importância: fornecer material vegetal para a
micropropagação por meio de vias indiretas de organogênese ou embriogênese, para o emprego da técnica de suspensão celular e para a indução de variação somaclonal (PIERIK, 2012). Entretanto, existem estudos que indicam a eficiência da técnica de calogênese como fator influenciador/otimizador na produção de metabólitos secundários (CASTRO, 2009; SOARES, 2010).
1.5.6. CULTURA DE TECIDOS EM PLANTAS MEDICINAIS
Como ferramenta biotecnológica, a cultura de tecidos de plantas oferece um conjunto de técnicas que podem ser utilizadas com o intuito de combater os problemas relacionados ao uso industrial de material vegetal medicinal. Algumas técnicas desempenham papéis de destaque no cultivo inicial destas plantas, como a germinação e o crescimento in vitro, micropropagação, bancos de germoplasma e calogênese in vitro podendo auxiliar tanto na obtenção de material vegetal quanto na indução/melhoria da produção de metabólitos secundários (PEREIRA, 2011).
Com o objetivo de conservar permanente espécies de plantas com importância medicinal, bem como fomentar estudos voltados ao melhoramento genético destas, Pires & Gripp (1988) iniciaram um banco ativo de espécies medicinais, contando, na época, com mais de 200 acessos de 100 espécies, em uma área de 6.000 m² localizada em Brasília.
Em estudo com Pfaffia glomerata (Amaranthaceae), cujas raízes são utilizadas popularmente como tônico, afrodisíaco e no combate à diabetes, Alves et al (2010) testaram a influência de diferentes meios de cultura no crescimento in vitro, visando a conservação da espécie em questão através do estabelecimento de um banco de germoplasma in vitro.
Segundo Arikat et al (2004) em estudos com Salvia fruticosa (Lamiaceae), os teores de óleos essenciais, canfora e ácido bornílico (utilizado em perfumaria) foram maiores em plântulas propagadas in vitro que em plantas cultivadas em casa de vegetação. Neste trabalho, foram avaliadas as influências dos meios MS, Nitch & Nitch (NN) e B5 suplementados com BAP, TDZ e cinetina.
Em estudos com a Lamiaceae Plectranthus ornatus, Soares (2010) estabeleceu um protocolo de cultivo e micropropagação in vitro, bem como avaliou os perfis dos compostos orgânicos voláteis (COV) nas plantas propagadas e em calos induzidos sob
diferentes concentrações de ANA e 2,4-D. Os resultados obtidos evidenciaram a influência dos reguladores vegetais no aspecto, coloração, consistência e, principalmente, no perfil dos COV em calos de P. ornatus, corroborando a influência destas substâncias no buque dos óleos essenciais extraídos sob condições de cultura.
Castro et al (2009) testaram a influência dos reguladores 2,4-D e BAP na produção de fenóis e taninos em calos de Stryphnodendron adstringens (Fabaceae), popularmente utilizada como cicatrizante e anti-inflamatório. Este estudo mostrou que, quando utilizado 2,4-D, os maiores valores de matérias fresca e seca de calos e teores de fenóis totais foram observados em meios com 9,05 µM e 18,10 µM deste regulador, na presença e ausência de luz. Já na presença de BAP, a calogênese ocorreu na ausência de luz, com maiores teores de fenóis totais em calos crescidos em meios suplementados com 4,44 e 17,75 µM desse regulador. Não se detectaram taninos, independente do regulador empregado.
1.6. OBJETIVO
O presente trabalho tem como objetivo elaborar um protocolo eficiente para o estabelecimento e calogênese in vitro de Lippia alba (Mill) N. E. Brown, contribuindo para a obtenção de material vegetal destinado à micropropagação e extração de óleos essenciais.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. EXPERIMENTO 01 – GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO in vitro
O experimento foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal da Bahia.
Foram utilizadas sementes produzidas pelo distribuidor FELTRIN® (lote 6080709 ORD-252846, previamente tratadas com 0,15% de Captan 75). As sementes foram desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5%) por 10 minutos e posteriormente lavadas três vezes com água estéril.
Para avaliar a germinação e crescimento in vitro, foram utilizados os meios de cultura Murashige & Skoog (1962) (MS) e o meio MS com metade das concentrações de sais (MS/2). Os meios foram gelificados com 7,0 g L-1 de ágar e tiveram o pH ajustado a 5,7 ± 1. O efeito da presença de carvão ativado (CA) foi testado, sendo adicionados 2,0 g L-1 deste a parte dos meios de cultura. Aos 30 dias, foram avaliados a Germinabilidade (%G), Índice de Velocidade de Germinação (IVG) e o Tempo Médio de Germinação (TM). Aos 70 dias, foram avaliados comprimento da parte aérea (CPA), matéria seca da parte aérea (MSPA) e matéria seca do sistema radicular (MSSR). A matéria seca foi determinada após secagem em estufa com ventilação forçada a 60ºC por 72 horas.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2x2 (concentrações de sais do meio MS x presença e ausência de CA) Para a análise da germinação, foram utilizadas sete repetições com 20 sementes e, para a análise do crescimento, foram utilizadas quatro repetições com 20 plantas.
2.2. EXPERIMENTO 02 – INDUÇÃO DE CALOGÊNESE in vitro
O experimento foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal da Bahia.
Sementes comercializadas pelo distribuidor FELTRIN® foram germinadas em meio MS/2 e, aos 75 dias de cultivo, as plantas obtidas foram utilizadas como fonte dos explantes disco foliar, nó e entrenó.
Para avaliar os tipos de explantes, reguladores vegetais e suas concentrações na calogênese in vitro de L. alba, os explantes foram inoculados individualmente em tubos de
ensaio contendo 10ml do meio MS/2 acrescidos das auxinas ANA (5µM e 10µM) e 2,4D (1µM e 5µM) com a citocinina BAP (1µM e 5µM). Além da variável calogênese, foi avaliada a responsividade dos explantes quanto à brotação (%) e enraizamento (%).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 3x2x2 e 3x2x2, sendo três tipos de explantes, duas concentrações de BAP e duas concentrações de ANA e de 2,4 D, resultando em oito tratamentos com 19 repetições.
2.3. MANUTENÇÃO DOS EXPERIMENTOS
Os experimentos foram mantidos em sala de crescimento sob temperatura de de 25 ± 2 ºC e fotoperíodo de 16 horas/luz.
2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram submetidos à análise fatorial de variância pelo programa estatístico SISVAR e para comparação entre as médias dos tratamentos foi realizado o teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. EXPERIMENTO 01 – GERMINAÇÃO E CRESCIMENTO in vitro
GERMINAÇÃO
A germinação in vitro de L. alba foi observada nos meios de cultura na presença e na ausência do carvão ativado (CA). A análise fatorial dos dados obtidos não mostrou interação aparente entre as variáveis Meio de Cultura e CA, entretanto, houve diferença estatística na análise individual de ambas as variáveis (Tabela I).
Meio de cultura S/ CA C/ CA Médias S/ CA C/ CA Médias S/ CA C/ CA Médias MS 67,14 Aa 77,14 Aa 72,14 A 1,25 Bb 1,86 Ba 1,56 B 12,48 Bb 10,41 Aa 11,45 B MS/2 72,85 Aa 82,14 Aa 77,49 A 1,68 Ab 2,39 Aa 2,03 A 10,40 Ab 8,87 Aa 9,64 A Médias 69, 99 b 79, 64 a 1,47 b 2,13 a 11,44 b 9,64 a
%G IVG TM
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma linha e maiúscula na mesma coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5%.
Tabela I: Influência dos diferentes meios de cultura na presença e ausência de carvão ativado (CA) na germinabilidade (G%), índice de velocidade de germinação (IVG) e tempo médio de germinação (TM) de L. alba aos 30 dias de inoculação.
A análise da %G demonstra a influência positiva da adição do CA nos meios de cultura testados (79,64%). Entretanto, a variação das concentrações salinas nos meios de cultura não proporcionou discrepância significativa entre as médias amostradas (72,12% e 77,49%). De maneira similar, a análise do IVG aponta, mais uma vez, o caráter benéfico da adição de CA aos meios de cultura (2,13). Porém, desta vez, o índice analisado sugere a influência positiva da redução das concentrações salinas do meio testado (2,03). Os resultados observados para TM corroboram os visto para o IVG, sendo tanto a presença do CA quando a utilização do meio MS/2 benéficos para a germinação in vitro de L. alba, uma vez que estes tratamentos promovem a germinação mais rápida das sementes dessa espécie.
Os resultados observados por Schneiders et al (2012) mostram que a presença de CA (2,5 g.L-1) teve efeito positivo na germinação in vitro de Cattleya forbesii em meio de cultura MS, aumentando a germinabilidade de 45% (na ausência de CA) para 90%. No presente trabalho, apesar de não ter sido observado um aumento significativo da germinabilidade na presença de CA, foi possível verificar um efeito positivo do CA na
germinação de L. alba, já que na presença dessa substância o IVG aumentou e o TM foi reduzido.
Segundo Thomas (2008) e Chagas (2005), dentre os produtos que podem ser acrescentados nos meios de cultura, o CA pode auxiliar o desenvolvimento de embriões vegetais. De acordo com estes autores, a adição de CA nos meios de cultura cria uma rede de poros com grande superfície interna que, por sua vez, pode atuar adsorvendo substâncias de caráter tóxico e/ou inibitório.
Em estudo com Amburana acreana (Fabaceae), Fermino Junior (2012) avaliou a eficácia dos meios MS e WPM, com 100%, 50% e 25% das concentrações salinas, na germinação in vitro. Os resultados obtidos indicam o meio MS/2 como mais adequado para a germinação desta espécie, apresentando 86,7% de germinação; 23,7% a mais que o observado por Albrecht (1986) (Apud FERMINO JUNIOR, 2012) em estudo sobre germinação ex vitro com a mesma espécie. Segundo Fermino Junior (2012), na germinação in vitro, além de funcionar como fonte nutritiva para o explante, a concentração de nutrientes do meio de cultura pode influenciar na capacidade de embebição da semente. A embebição é um fenômeno físico crucial para a reativação metabólica do embrião que culminará com a germinação da semente. Segundo Taiz & Zeiger (2004), altas pressões osmóticas limitam a absorção de água, sendo que a diluição aumenta a disponibilidade de água para a semente. Desta forma, pode-se concluir que, em geral, meios de cultura com menores concentrações salinas favorecem a germinação
in vitro.
CRESCIMENTO
A análise fatorial dos dados de CPA indicou interação significativa entre as variáveis analisadas. A ausência do CA no meio de cultura MS/2 proporcionou, em média, a obtenção dos maiores indivíduos cultivados in vitro ao final de 70 dias. Para os dados de MSPA e MSSR, apenas a influência do meio de cultura mostrou-se estatisticamente relevante, sendo o meio de cultura MS/2 o mais indicado para o ganho de massa (mg) nos eixos caulinar e radicular da planta. Contrastando com os resultados obtidos na germinação in vitro, a adição de CA não influencia o crescimento da planta (Tabela II).
Tratamento S/ CA C/ CA Médias S/ CA C/ CA Média S/ CA C/ CA Médias MS 15,39 Ba 20,05 Ba 17,72 B 0,39 Ba 0,35 Ba 0,37 B 0,03 Ba 0,06 Aa 0,05 B MS/2 60,46 Aa 43,10 Ab 51,78 A 1,14 Aa 0,80 Aa 0,97 A 0,16 Aa 0,12 Aa 0,14 A Médias 37,93 a 31,57 a 0,76 a 0,57 a 0,10 a 0,09 a
Tabela II: Influência dos diferentes meios de cultura na presença e ausência de carvão ativado (CA) no crescimento da parte aérea (CPA), massa seca da parte aérea (MSPA) e massa seca do sistema radicular (MSSR) de L. alba aos 70 dias de inoculação.
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma linha e maiúscula na mesma coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5%.
CPA (mm) MSPA (mg) MSSR (mg)
Resultados semelhantes foram observados por Unemoto et al (2006) em estudo sobre o crescimento in vitro de Sinningia leucotricha (Gesneriaceae). Neste estudo, o meio MS foi testado com 50%, 100% e 200% de concentrações salinas, na presença (1,0 g.L-1) e ausência de CA. Após 120 dias de semeadura, foram avaliados: altura da parte aérea, comprimento da maior raiz, massa fresca total e número de brotações e, segundo o autor, as maiores médias foram observadas em meio MS/2.
Resultados contrários aos observados no presente trabalho foram obtidos por Schneiders et al (2012) em seu estudo com o crescimento in vitro de Cattleya
harrisoniana. Neste experimento, foram testados os meios MS e MS/2, ambos na
presença e ausência de CA, e segundo o autor, o meio de cultura que melhor proporcionou o crescimento da planta testada ao final de 240 dias foi o MS com adição de CA, apresentando média final de CPA equivalente a 6,62 cm.
Segundo Pasqual et al (2001), a adsorção de substâncias indesejadas no meio de cultura pode contribuir para a diferença da altura média de plântulas submetidas a influência de CA. De acordo com estes autores, isso seria possível pela manutenção do pH ótimo para a morfogênese das plântulas. Entretanto, segundo Thomas et al (2008), o CA pode atuar na adsorção de vitaminas, íons metálicos e até reguladores vegetais presentes no meio, reduzindo a disponibilidade destes para as plantas em cultura.
Desta forma, entende-se que o caráter positivo ou negativo da influência do CA no crescimento in vitro de plantas pode depender, sobretudo, das necessidades específicas de cada espécie.
3.2. EXPERIMENTO 02: CALOGÊNESE in vitro
A formação de calos em L. alba, foi observada em todos os tratamentos testados, e os três diferentes explantes apresentaram altas taxas de calogênese aos 30 (entre 68% e 100%) e 60 dias (entre 84% e 100%) (Tabelas III e IV). A análise estatística realizada aos 30 dias (Tabela III) evidencia a forte influência individual das variáveis nos dados obtidos, entretanto, a interação entre estas é quase inexistente (α = 0,0444). Esta observação é corroborada pela análise dos dados aos 60 dias (Tabela IV), em que não há significância estatística para a interação das variáveis, nem para as variações nas concentrações dos reguladores vegetais.
A influência do tipo de explante na calogênese in vitro de L. alba apresentou o mesmo comportamento nos dois períodos analisados, indicando maior responsividade dos explantes disco foliar e nó em comparação ao explante entrenó aos 30 e 60 dias. Entretanto, as médias gerais obtidas em cada explante, em ambos os períodos analisados, mesmo apresentando diferença estatística, não são discrepantes ao ponto de inviabilizar a utilização das secções internodais. A fonte de material vegetal utilizada para este experimento, aos 75 dias de cultura, apresenta em média quatro nós e oito folhas, sendo maior parte da planta composta de região de entrenó, disponibilizando cerca de 15 explantes por planta. A utilização deste tipo de explante reduziria a quantidade de plantas necessárias para a obtenção de calos, e consequentemente diminuiria o consumo de reagentes na produção de meio de cultura e o espaço físico necessário para a manutenção das culturas por 75 dias. Além disso, os calos obtidos a partir de secções internodais aparentam, visualmente, ser menos compactos que os calos originados dos outros explantes, indicando capacidade organogência (Figuras 03 e 04).
2
1
Folha Nó Entrenó Médias Folha Nó Entrenó Médias Folha Nó Entrenó Médias 1 ANA 5µM 100 Aa 100 Aa 84 ABa 95 A 0 Ab 84 Aa 0 Ab 28 A 0 Ab 32 Aa 0 Ab 10 A 2 ANA 10µM 95 Aa 100 Aa 84 ABa 93 AB 0 Ab 58 Ba 0 Ab 19 AB 0 Aa 0 Ba 0 Aa 0 B 3 2,4D 1µM 100 Aa 100 Aa 95 ABa 98 A 0 Ab 53 Ba 0 Ab 17 ABC 0 Aa 0 Ba 0 Aa 0 B 4 2,4D 5µM 100 Aa 100 Aa 84 ABa 95 A 0 Aa 10 Ca 0 Aa 3 C 0 Aa 0 Ba 0 Aa 0 B 5 ANA 5µM 95 Aa 100 Aa 95 ABa 96 A 0 Ab 74 ABa 0 Ab 24 A 0 Aa 0 Ba 0 Aa 0 B 6 ANA 10µM 68 Bb 100 Aa 74 Bb 81 A 0 Ab 53 Ba 0 Ab 17 ABC 0 Aa 0 Ba 0 Aa 0 B 7 2,4D 1µM 100 Aa 100 Aa 100 Aa 100 A 0 Ab 26 Ca 0 Ab 9 BC 0 Aa 0 Ba 0 Aa 0 B 8 2,4D 5µM 100 Aa 100 Aa 79 ABb 93 AB 0 Ab 26 Ca 0 Ab 9 BC 0 Aa 0 Ba 0 Aa 0 B Médias 95 a 100 a 87 b - 0 b 48 a 0 b - 0 b 4 a 0 b -BAP 1µM BAP 5µM Reguladores vegetais
Tabela III: Influência das diferentes concentrações de BAP, ANA e 2,4-D e dos explantes disco foliar (Folha), secção nodal (Nó) e secção internodal (Entrenó) na calogênese (%), brotação (%) e enraizamento (%) de L. alba aos 30 dias.
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma linha e maiúscula na mesma coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5%. Brotação (%)
Calogênese (%) Enraizamento (%)
Folha Nó Entrenó Médias Folha Nó Entrenó Médias Folha Nó Entrenó Médias 1 ANA 5µM 100 Aa 100 Aa 89 Aa 96 A 0 Bb 84 Aa 0 Bb 28 A 16 Ab 53 Aa 0 Ac 23 A 2 ANA 10µM 100 Aa 100 Aa 84 Ab 95 A 0 Bb 58 Aa 0 Bb 19 ABC 0 Ba 10 Ba 0 Aa 3 B 3 2,4D 1µM 100 Aa 100 Aa 95 Aa 98 A 0 Bb 26 Aa 0 Bb 9 CD 0 Ba 5 Ba 0 Aa 2 B 4 2,4D 5µM 100 Aa 100 Aa 84 Ab 95 A 0 Aa 5 Aa 0 Aa 2 D 0 Ba 0 Ba 0 Aa 0 B 5 ANA 5µM 95 Aa 100 Aa 95 Aa 96 A 0 Bb 68 Aa 0 Bb 23 AB 0 Ba 0 Ba 0 Aa 0 B 6 ANA 10µM 100 Aa 100 Aa 84 Ab 95 A 0 Bb 42 Aa 0 Bb 14 BCD 0 Ba 5 Ba 0 Aa 2B 7 2,4D 1µM 100 Aa 100 Aa 100 Aa 100 A 0 Aa 16 Aa 0 Aa 5 D 0 Ba 0 Ba 0 Aa 0 B 8 2,4D 5µM 100 Aa 100 Aa 95 Aa 98 A 0 Aa 5 Aa 0 Aa 2 D 0 Ba 0 Ba 0 Aa 0 B Médias 99 a 100 a 91 b - 0 b 38 a 0 b - 2 b 9 a 0 b -Reguladores vegetais Calogênese (%) BAP 1µM BAP 5µM
Tabela IV: Influência das diferentes concentrações de BAP, ANA e 2,4-D e dos explantes disco foliar (Folha), secção nodal (Nó) e secção internodal (Entrenó) na calogênese (%), brotação (%) e enraizamento (%) de L. alba aos 60 dias.
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma linha e maiúscula na mesma coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5%.
Enraizamento (%) Brotação (%)
c4) b4) a4) c1) a1) b1) c2) b2) a2) b3) c3) a3) FOLHA NÓ ENTRENÓ B A P 1 µ M A N A 5 µ M A N A 1 0 µ M 2 ,4 -D 1 µ M 2 ,4 -D 5 µ M
Figura 03: Calogênese in vitro de Lippia alba em diferentes explantes, de T1 a T4,
aos 30 dias. a1) T1 – folha; b1) T1 – nó; c1) T1 – entrenó; a2) T2 – folha; b2) T2 – nó; c2) T2 – entrenó; a3) T3 – folha; b3) T3 – nó; c3) T3 – entrenó; a4) T4 – folha; b4) T4 – nó; c4) T4 – entrenó.
a1) b1) c1) a2) b2) c2) a3) b3) c3) a4) b4) c4) FOLHA NÓ ENTRENÓ B A P 5 µ M A N A 5 µ M A N A 1 0 µ M 2 ,4 -D 1 µ M 2 ,4 -D 5 µ M
Figura 04: Calogênese in vitro de Lippia alba em diferentes explantes, de T5 à T8,
aos 30 dias. a1) T5 – folha; b1) T5 – nó; c1) T5 – entrenó; a2) T6 – folha; b2) T6 – nó; c2) T6 – entrenó; a3) T7 – folha; b3) T7 – nó; c3) T7 – entrenó; a4) T8 – folha; b4) T8 – nó; c4) T8 – entrenó.
Resultados similares sobre os explantes secções foliar e entrenó foram obtidos por Cerqueira et al (2002) em estudo com Tridax procumbens (Asteraceae). Para as diferentes concentrações dos reguladores vegetais ANA, AIB, 2,4-D (1,0; 2,0; e 4,0mg.L-1) e BAP (2,0 mg.L-1), os resultados obtidos indicaram maior responsividade do explante disco foliar. Em estudos a cerca da atividade citotóxica de extratos aquosos de calos de
Lantana camara (Verbenaceae), Srivastava et al (2009) utilizaram discos foliares
cultivados em meio MS suplementados com 5µM de BAP, 1µM de 2,4-D e 1µM de ANA para obtenção e manutenção de calos.
No decorrer dos 30 dias iniciais de experimento, foi observada a ocorrência de brotações nos calos produzidos. Assim sendo, foi analisada a responsividade dos explantes à brotação aos 30 e 60 dias de cultura.
A análise fatorial dos dados para brotação evidenciou uma forte interação entre as variáveis testadas (α = 0). A brotação in vitro em L. alba foi observada apenas no explante nó ao final dos 30 (Tabela III) e 60 dias (Tabela IV). As concentrações de BAP não demonstraram influenciar diretamente a porcentagem de brotação. Entretanto, o aumento das concentrações das auxinas testadas mostrou-se inibitório à indução de brotação. Além disso, a manutenção dos calos obtidos a 60 dias resultou na morte tecidual em alguns calos que apresentaram brotação. Desta forma, os melhores resultados foram observados nos tratamentos T1 e T5, em meios de cultura suplementados com 5µM de ANA e 1 e 5µM de BAP, respectivamente aos 30 dias.
Em estudo sobre a micropropagação de L. alba, os resultados obtidos por Gupta et al (2001) corroboram em parte aos observados no presente trabalho. Foi observada a proliferação de brotos apenas no explantes nó, cultivados em meio MS suplementado com 2,21 µM de BAP. Além disso, houve formação de calos em explantes disco foliar e entrenó cultivados em meio MS, suplementado com ANA e/ou BAP. Entretanto, o aumento das concentrações de BAP no meio de cultura MS (2,21; 4,43; 8,87 e 22,17µM) promoveram o aumento dos percentuais de brotação em ápices caulinares (86,7%; 93,3%; 93,3% e 96,7%, respectivamente). Em combinação com BAP a 8,87µM, o aumento das concentrações de ANA (0,5; 2,1 e 5,4µM) apresentou comportamento similar, aumentando o percentual de brotação observado (78,3%; 80% e 85%).
Segundo Grattapaglia & Machado (1998), a utilização de ápices caulinares, gemas axilares, bem como outras fontes de tecidos meristemáticos, é indicada para a micropropagação. Além disso, o meio MS e suas diluições têm apresentado bons
resultados para o início do cultivo in vitro de várias espécies. Apesar das semelhanças observadas entre o presente trabalho e o realizado por Gupta et al (2001), diferenças nos delineamentos propostos podem ter resultado em algumas das respostas divergentes, sobretudo quanto às concentrações dos reguladores vegetais utilizados.
De maneira similar à brotação, foi observada a ocorrência de enraizamento nos calos produzidos. Desta forma, foi analisada a responsividade dos calos na rizogênese de
L. alba aos 30 e 60 dias de cultura.
A análise estatística do percentual de enraizamento in vitro exibiu interação significativa entre as variáveis “tipos de explante” e “reguladores vegetais”. Ao final dos 30 dias de cultivo, foi observado enraizamento apenas no explante nó inoculado em T1 (1,0µM BAP, 5µM ANA) (Tabela III). Entretanto, ao final de 60 dias de cultura, a emissão de raízes também foi observada, no referido explante, em T2 (1µM BAP, 10µM ANA), T3 (1µM BAP, 1µM 2,4-D) e T6 (5µM BAP, 10µM ANA) (Tabela IV). No mesmo período de análise, pôde ser observado o enraizamento do explante disco foliar em T1. Os melhores resultados foram obtidos com a utilização do explante nó inoculado em T1 (Tabela III).
Resultados melhores foram exibidos pelos brotos obtidos nos experimentos de micropropagação em L. alba conduzidos por Gupta et al (2001). Neste estudo os autores demonstraram que o enraizamento desta espécie não depende da presença de reguladores vegetais, apresentando 100% de enraizamento em meio MS na ausência de reguladores vegetais. Além disso, a adição e o aumento das concentrações de ANA apresentou efeito inibitório sobre o enraizamento dos brotos.
Segundo Gueye et al (2009), a adição de auxinas exógenas no cultivo in vitro pode induzir tanto a calogênese quanto a rizogênese, dependendo da concentração do regulador vegetais utilizados. Segundo o autor, estes fenômenos são possíveis graças a totipotência apresentada por células somáticas vegetais, conferindo flexibilidade ao programa ontogenênico. A composição e concentração de reguladores vegetais, no meio de cultura, são fatores imperativos na determinação dos padrões de crescimento e desenvolvimento em sistemas de cultura de tecidos in vitro (CALDAS, 1998).
A manutenção dos calos obtidos em meios de cultura suplementados com reguladores vegetais pode ter inibido a rizogênese em L. alba, o que sugere que esta planta pode apresentar enraizamento independente da adição de auxinas exógenas também por vias indiretas de propagação.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O meio de cultura Murashige & Skoog (1962) com metade das concentrações salinas (MS/2) é o mais indicado para o estabelecimento in vitro de Lippia alba por meio de semeadura, sendo sugerida a suplementação deste com carvão ativado para a germinação;
Os resultados do presente trabalho sugerem a utilização do entrenó, independentemente da concentração e do tipo de regulador utilizado, para a indução da calogênese in vitro de Lippia alba, devido à sua abundância nas plântulas utilizadas como fonte de material vegetal, bem como pelas características visuais apresentadas pelos calos formados;
Lippia alba mostrou-se sensível ao estímulo de reguladores vegetais na indução de
calogênese in vitro. Desta forma, são necessários estudos adicionais a fim de averiguar as concentrações mínimas dos reguladores necessários para a formação de calos nesta espécie;
A comparação entre os resultados obtidos e os presentes na literatura da espécie sugerem a realização de novos estudos voltados a micropropagação em Lippia alba, a fim de averiguar a influência dos reguladores vegetais na brotação in vitro da espécie;
Os resultados obtidos sugerem a utilização do nó como explante dirigido a micropropagação in vitro de Lippia alba, inoculado em meio MS/2 suplementado com 1µM BAP e 5µM ANA;
O percentual de enraizamento observado neste trabalho é inferior ao obtido em estudos presentes na literatura atual. Desta forma, sugere-se a utilização de meio MS para o enraizamento de brotos de L. alba.
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