Estudo de viabilidade de obtenção de cocristais de
rutina para aplicações em protetores solares e cremes
antioxidantes
Cocrystalization feasibility study of rutin for application
in sunscreens and antioxidant creams
Letícia de Freitas Santos, leticia.freitas@aluno.ufabc.edu.br Fabio Furlan Ferreira
Universidade Federal do ABC, Santo André, São Paulo
Submetido em 01/03/2017
Revisado em 01/03/2017 Aprovado em 02/05/2017
Resumo: A rutina é um flavonoide que possui ação antioxidante e vasoprotetora. Por ter baixa solubilidade em água, suas propriedades são mal aproveitadas no corpo humano. Por isso, a obtenção de cocristais de rutina pode ser uma alternativa para melhorar sua biodisponibilidade. Neste trabalho, nós utilizamos alguns solventes e coformadores na tentativa de obter os cocristais. Nós realizamos a caracterização estrutural dos compostos obtidos com o uso da difração de raios X por policristais.
Palavras chave: Rutina. Cocristal. Difração de raios X. Insumo farmacêutico ativo.
Abstract: Rutin is a flavonoid with antioxidant and vasoprotective properties. Due to its low solubility in water, its properties are poorly utilized in the human body. Therefore, obtaining cocrystals of rutin may be an alternative to improve its bioavailability. In this work, we used some solvents and coformers in the attempt to obtain the cocrystals. We carried out the structural characterization of the obtained compounds by means of X-ray powder diffraction.
Keywords: Rutin. Cocrystal. X-ray powder diffraction. Active pharmaceutical ingredient.
1. Introdução
Os flavonoides são compostos fenólicos com propriedades farmacológicas capazes de influenciar beneficamente o corpo humano1. Estes
compostos estão presentes em diversos alimentos pertencentes ao reino vegetal, tais como tomate, uva, maçã e trigo sarraceno2. O crescente interesse
científico é devido à relação entre uma dieta rica nesses alimentos e a diminuição do risco de muitas doenças3.
A rutina é um flavonoide com potencial terapêutico contra doenças de pele, fragilidade capilar5 e tem ação anti-inflamatória6 e antioxidante4 e pode ser
empregada em protetores solares e cremes antioxidantes. Por apresentar baixa solubilidade em meio aquoso, o aproveitamento das propriedades deste insumo farmacêutico ativo (IFA) pelos tecidos do corpo humano é o que caracteriza um componente com baixa biodisponibilidade.
Uma alternativa promissora e altamente relevante para melhorar a solubilidade da rutina em água é a obtenção de cocristais. Desta forma, o uso de cocristais na indústria farmacêutica tem sido empregado em formulações para a melhoria da solubilidade de insumos diversos. Um cocristal é a junção de dois ou mais componentes sólidos em temperatura ambiente7, com proporções bem
definidas8, através de ligações secundárias, principalmente por ligações de
hidrogênio. Ademais, um cocristal tem de ser um sólido cristalino estável, pois o fato de seus componentes não serem unidos por ligações primárias não altera seus constituintes e nem afeta negativamente a biodisponibilidade9 do insumo
farmacêutico ativo.
Neste trabalho, nós fizemos a identificação das estruturas cristalinas de possíveis cocristais formados a partir da rutina e um coformador, utilizando métodos de cristalização, com o auxílio da difração de raios X por policristais (DRXP). Esta técnica experimental é largamente utilizada na caracterização de estruturas cristalinas de insumos farmacêuticos, pois viabiliza a identificação de mais de uma fase em uma amostra, quando houver10. Nós utilizamos imagens
obtidas ao microscópio eletrônico de varredura na tentativa de identificarmos diferenças nas morfologias das diversas amostras.
2. Metodologia 2.1. Amostras
Os compostos utilizados foram a rutina trihidratada (Sigma-Aldrich) e os coformadores ácido ferúlico, ácido oxálico e ácido mercaptossuccínico (MSA). Os solventes empregados no auxílio das metodologias foram etanol, tolueno e água.
2.2. Sínteses
A rutina é um insumo farmacêutico com baixa solubilidade em água (0,125 g.L-1), e é ligeiramente solúvel em metanol e etanol. As sínteses
realizadas entre a rutina e os coformadores e solventes utilizados estão listadas na Tabela 1. Em todas elas, as proporções molares foram devidamente calculadas.
Tabela 1 - Sínteses e métodos utilizados na tentativa de obtenção de cocristais de rutina.
IFA Coformador Solvente Proporção Molar
Método
Utilizado Duração Total
Rutina Ácido ferúlico --- 1:10 Moagem a seco 40 min --- Etanol 1:500 Moagem assistida por líquido 35 min --- Tolueno 1:100 Moagem assistida por líquido 30 min Ácido oxálico Etanol 1:2 Moagem assistida por líquido 1 h
MSA Etanol, água 1:2
Precipitação + Evaporação lenta 18 h + 24 h para evaporação
Fonte: Elaborada pela autora.
Para a síntese em que o coformador utilizado foi o MSA, partiu-se da temperatura de 70 °C no método de evaporação lenta em virtude da temperatura
de ebulição do etanol ser de 78 °C. Nos casos em que não foram utilizados coformadores, a proporção molar é devida à rutina e ao solvente em questão.
2.2.1. Métodos de cristalização
Os cocristais podem ser obtidos por diferentes métodos de (co)cristalização. Os testes realizados para a sua obtenção (Tabela 1) foram feitos a partir das técnicas a seguir:
I. Evaporação lenta (slow evaporation): consiste na evaporação lenta ou controlada de uma solução com o insumo mais coformador e solvente comum a ambos ou insumo mais coformador e dois solventes miscíveis respectivos a cada um.
II. Precipitação (anti-solvent addition): adição de antissolvente em uma solução do insumo mais solvente ou em uma solução de insumo mais coformador e solvente comum a ambos.
III. Moagem a seco (wet grinding): mecanossíntese do insumo mais coformador.
IV. Moagem assistida por líquido (solvent-drop grinding):
mecanossíntese do insumo mais coformador com pequena quantidade de solvente comum a ambos, que deve ser cuidadosamente pipetado gota a gota.
As moagens a seco e assistida por líquido foram realizadas com auxílio de almofariz e pistilo de ágata.
2.3. Difração de raios X
Depois do processo de cristalização, as amostras foram devidamente dispostas entre duas folhas de acetato-celulose em porta-amostras apropriados ou em capilares de vidro especial de 0,3 ou 0,5 mm de diâmetro para medidas de difração de raios X. Em todos os casos foi imprescindível manter o porta-amostras em rotação durante a aquisição de dados para que um maior número de cristalitos possível – com o aumento do volume banhado pelo feixe de raios X – fosse considerado. Os dados de difração de raios X das amostras foram obtidos em um difratômetro de raios X por policristais STADI-P, da Stoe®,
utilizando tensão de 40 kV, corrente de 40 mA e radiação monocromática filtrada por um monocromador de Ge(111) (CuK1 = 1,05456 Å). As contagens foram
faixa angular entre 3º e 60º (2), com passo angular de 0,015º coletados a cada 1,05º durante 180 s. O equipamento está localizado no Laboratório de Cristalografia e Caracterização Estrutural de Materiais (LCCEM) do CCNH-UFABC.
2.4. Microscopia Eletrônica de Varredura
As imagens de microscopia eletrônica de varredura foram obtidas em um microscópio eletrônico de varredura (MEV) JCM-6000, da Jeol®, localizado no
Laboratório de Física II L403-3, na UFABC para visualizar a aparência microestrutural do IFA e das sínteses realizadas. As amostras foram devidamente preparadas e acondicionadas em alto vácuo, com tensão aceleradora de 5 e 15 kV.
3. Resultados
A rutina foi delicadamente triturada com o auxílio de almofariz e pistilo de ágata para que as partículas fossem uniformizadas e, então, acondicionada entre duas folhas de acetato-celulose para medidas de DRXP. Na Figura 1 nós apresentamos o difratograma de raios X da rutina triturada e na Figura 2, as micrografias obtidas no MEV.
Fonte: Elaborada pela autora.
Figura 2 – Micrografias da rutina triturada obtidas no MEV. (a) magnificação de 2200 vezes e (b) 70 vezes.
Fonte: Elaborada pela autora.
Os difratogramas de raios X dos cristais obtidos a partir das sínteses realizadas (Tabela 1) são apresentados a seguir, bem como as respectivas micrografias. Para efeitos comparativos, os difratogramas de raios X da rutina e dos coformadores utilizados conforme o caso foram deslocados verticalmente e são apresentados junto com o da síntese.
1) Rutina e ácido ferúlico
Figura 3 – Difratogramas de raios X da síntese entre rutina e ácido ferúlico, da rutina triturada, do ácido ferúlico.
Fonte: Elaborada pela autora.
Figura 4 – Micrografias do (a) ácido ferúlico e (b) e (c) da síntese entre rutina e ácido ferúlico.
2) Rutina e etanol
Figura 5 – Difratogramas de raios X da síntese entre rutina e etanol e da rutina triturada.
Fonte: Elaborada pela autora.
Os difratogramas mostrados na Figura 5 foram normalizados para corrigir a discrepância das intensidades entre eles e foram deslocados verticalmente para melhor sua visualização.
Figura 6 – (a), (b) Micrografias da síntese entre rutina e etanol obtidas no MEV.
3) Rutina e tolueno
Figura 7 – Difratogramas de raios X da síntese entre rutina e tolueno e da rutina triturada
Fonte: Elaborada pela autora.
Assim como na Figura 5
,
na Figura 7 nós mostramos os difratogramas normalizados.Figura 8 – (a), (b) Micrografias da síntese entre rutina e tolueno obtidas no MEV.
4) Rutina, ácido oxálico e etanol
Figura 9 – Difratogramas de raios X da síntese entre rutina, ácido oxálico e etanol, da rutina triturada e do ácido oxálico.
Fonte: Elaborada pela autora.
Figura 10 – (a), (b) Micrografias da síntese entre rutina, ácido oxálico e etanol obtidas no MEV.
5) Rutina, MSA, água e etanol
Figura 11 – Difratogramas de raios X da síntese entre rutina, MAS, água e etanol, da rutina triturada e do MSA.
Fonte: Elaborada pela autora.
Figura 12 – (a), (b) Micrografias da síntese entre rutina, MSA, água e etanol obtidas no MEV.
4. Discussão
O padrão de difração de raios X de uma dada substância sólida existente na natureza é único. Não existe difratograma que apresente todos os picos coincidentes para substâncias diferentes. Substâncias cristalinas apresentam picos bastante definidos, enquanto as amorfas apresentam picos muito largos devido às interferências destrutivas causadas pela desordem na sua estrutura. A evidência de que um cocristal – ou até mesmo um sal – foi formado a partir das sínteses realizadas por diferentes metodologias é a obtenção de um difratograma único que indique uma estrutura cristalina diferente do IFA e do coformador, conforme o caso. Picos coincidentes podem indicar uma mistura física.
1) Rutina e ácido ferúlico
Na Figura 3 nós apresentamos os difratogramas tanto da rutina como do ácido ferúlico e da síntese realizada entre eles. Este último, na cor azul, evidencia a coincidência de picos referentes ao difratograma do ácido ferúlico, em preto e com alguns da rutina, em vermelho. Entretanto, os picos do ácido ferúlico são muito mais intensos que o da síntese.
A coincidência dos picos pode indicar na síntese uma mistura física na qual houve perda das características estruturais da rutina (tendência à formação de um sistema amorfo), por apresentar os picos que coincidem com os da rutina mais alargados. Comparando as micrografias, na Figura 4b e na Figura 4c podemos observar que os cristais formados têm um caráter morfológico granular desordenado com bastonetes, enquanto que na Figura 2a, a rutina tem aparência granular e na Figura 4b, o ácido ferúlico mostra-se em formato de bastonete.
O método de moagem a seco para este caso não trouxe bons resultados, pois não fez com que cocristais de rutina fossem formados. Ainda assim, para que pudéssemos inferir se o tempo de moagem poderia ter afetado a formação dos cristais, sua variação pode ser considerada. Outras alternativas que poderiam ser empregadas é a moagem assistida por líquido ou outra metodologia envolvendo soluções, como a evaporação lenta.
2) Rutina e etanol
Os picos observados nos difratogramas mostrados na Figura 5, referentes à síntese entre rutina e etanol são, em sua maioria, coincidentes com os da rutina. Isto pode ser observado mesmo com a baixa estatística de contagens no difratograma da síntese, em vermelho, causada pela quantidade reduzida de material para realização das medidas de DRXP. Com isso, podemos inferir que não houve formação de cocristais. Isto pode estar relacionado com a quantidade de solvente utilizado, bem como com a solubilidade da rutina no mesmo, ou seja, a proporção molar dos componentes para este caso pode não ter sido adequada para a obtenção de cocristais. Na Figura 6 nós apresentamos as micrografias da síntese que aparenta ser um material bastante poroso.
3) Rutina e tolueno
O difratograma de raios X mostrado na Figura 7, referente à síntese entre rutina e tolueno é típico de uma substância amorfa. A volatilidade do tolueno pode ter contribuído para a amorfização da rutina. Como nós mostramos na Figura 8, a síntese entre rutina e tolueno aparenta ter formado um conjunto de aglomerados, mas que não é idêntico à aparência microestrutural da rutina, como na Figura 2.
4) Rutina, ácido oxálico e etanol
O difratogramas apresentado na Figura 9, referente à síntese entre rutina, ácido oxálico e etanol, em azul, apresenta a maioria de seus picos coincidentes com o difratograma do ácido oxálico mas com perda de intensidade e picos mais alargados, sendo que a minoria dos picos da rutina, em vermelho, são coincidentes. Portanto o método de moagem assistida por líquido pode não ter sido o mais adequado para este caso porque o etanol pode ter interagido melhor com o ácido oxálico do que com a rutina, não favorecendo a interação entre os dois. As micrografias da síntese mostradas na Figura 10 apresentam um produto em forma de placas, diferente da rutina triturada.
5) Rutina, MSA, água e etanol
Os picos do difratograma mostrado na Figura 11, da síntese entre rutina, MSA, água e etanol, em azul, são coincidentes com os da rutina, em vermelho, embora apresentem menor intensidade. Ainda que as posições dos picos do MSA, em preto, sejam próximas aos dos da rutina, a síntese aparentemente tem poucos picos coincidentes com os do MSA e com intensidade muito reduzida. Pela grande semelhança entre os difratogramas da rutina e da síntese, pode-se inferir que não houve formação de cocristais de rutina. O produto formado a partir da síntese realizada tem aparência microestrutural fibrosa como mostrado na Figura 12.
5. Considerações finais
A obtenção de cocristais de rutina para todos os casos discutidos não foi bem sucedida. Os métodos de cristalização empregados são bastante promissores e podem conduzir pesquisas a grandes resultados, como se vê na literatura. Entretanto, a proporção molar, volatilidade do solvente, solubilidade do IFA e do coformador no solvente, tempo de moagem, tempo de evaporação, pureza das amostras são condições muito importantes e determinantes para a obtenção de cocristais.
É importante salientar que não houve alteração de coloração nos produtos finais das sínteses, isto é, todas apresentaram a cor da rutina (amarelo-esverdeada), não importando a cor do coformador e nem o solvente utilizado.
6. Agradecimentos
Os autores agradecem o auxílio financeiro da FAPESP (proc. n° 2015/26233-7) e do CNPq (proc. n° 307664/2015-5, 456277/2014-5 e 101457/2016-2).
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