Desenvolvimento de um fungicida natural à partir de piperina / Development of a natural fungicide from piperina

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761

Desenvolvimento de um fungicida natural à partir de piperina

Development of a natural fungicide from piperina

DOI:10.34117/bjdv6n7-321

Recebimento dos originais: 10/06/2020 Aceitação para publicação: 14/07/2020

Kaique Grabauskas de Oliveira

Técnico em Química pela Etec Doutor Celso Giglio Instituição: Etec Doutor Celso Giglio - Centro Paula Souza

Endereço: Rua Pedro Rissato, 30 - Vila dos Remédios, Osasco - SP, Brasil e-mail: kaiquegrdeoliveira@outlook.com

Ellen Aparecida Batista

Técnica em Química pela Etec Doutor Celso Giglio Instituição: Etec Doutor Celso Giglio - Centro Paula Souza

Endereço: Rua Pedro Rissato, 30 - Vila dos Remédios, Osasco - SP, Brasil e-mail: ellenapba@gmail.com

Patrick da Silva Kraljic

Endereço: Rua Pedro Rissato, 30 - Vila dos Remédios, Osasco - SP, Brasil e-mail: patrickkraljick@gmail.com

Raquel Andrade da Matta

Técnica em Química pela Etec Doutor Celso Giglio Instituição: Etec Doutor Celso Giglio - Centro Paula Souza

Endereço: Rua Pedro Rissato, 30 - Vila dos Remédios, Osasco - SP, Brasil e-mail: raquelmatta913@gmail.com

Robert Monteiro Batista

Endereço: Rua Pedro Rissato, 30 - Vila dos Remédios, Osasco - SP, Brasil e-mail: robert-monteiro@hotmail.com

Vitor Amaral Sanches Lucas

Especialista em Microbiologia Industrial/Ambiental pela Sociedade Brasileira de Microbiologia Instituição: Etec Doutor Celso Giglio - Centro Paula Souza

Endereço:Rua Pedro Rissato, 30 - Vila dos Remédios, Osasco - SP, Brasil e-mail: vitor.lucas@etec.sp.gov.br

Silvia Helena Fernandes

Especialista em perícia, auditoria e gestão ambiental pela Faculdade Oswaldo Cruz Instituição: Etec Doutor Celso Giglio - Centro Paula Souza

Endereço: Rua Pedro Rissato, 30 - Vila dos Remédios, Osasco - SP, Brasil e-mail: siliahelena@uol.com.br

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 RESUMO

O intenso uso de agrotóxicos no Brasil tem sido uma pauta amplamente discutida nos últimos anos. Apesar de ser um recurso contra pragas que causam prejuízos na agricultura, sua utilização está intimamente ligada a inúmeras mortes humanas, além de provocar graves danos ambientais. Os defensivos agrícolas naturais surgem como uma alternativa para o controle de pragas sem representar ameaças à saúde humana e ao meio ambiente. A piperina, substância encontrada na pimenta-do-reino (Piper nigrum), foi selecionada como matéria-prima para o desenvolvimento de um fungicida natural a fim de combater o fungo da espécie Golovinomyces cichoracearum, que atinge exemplares da florífera Zinnia elegans, situada no jardim da Etec Doutor Celso Giglio. A fim de potencializar o efeito fungicida de piperina, utilizou-se como veículo leite cru de vaca azedo, leite UHT, leite de coco e óleo de cravo, separadamente para testar a eficiência antifúngica dessas substâncias combinadas com a piperina. Os testes antifúngicos foram realizados por meio do método de disco-difusão e diluição seriada, além de testar suas respectivas afinidades com a piperina por meio de teste de solubilidade. Entre todos os veículos testados, somente o óleo de cravo e a piperina obtiveram sucesso no teste de eficiência fungicida, assim como, apenas o óleo de cravo também foi capaz de solubilizar a piperina. O produto formado por essas substâncias também foi eficaz, embora tenha deixado manchas marrons à superfície foliar da planta devido a sua alta concentração.

Palavras-Chave: Fungicida, Natural, Oídio, Piperina, Leite. ABSTRACT

The intense use of pesticides in Brazil has been widely discussed in recent years. Despite being a resource against pests that causes damage to agriculture, its use is closely linked to human deaths, in addition to causing serious environmental damage. Natural pesticides appear as an alternative to control pests without threats to human health and the environment. The piperine, a substance found in black pepper (Piper nigrum), was selected as a raw material for the development of a natural fungicide in order to end of combat the powdery mildew of the species Golovinomyces cichoracearum, which hit the Zinnia elegans floriculture, located in Etec Doctor Celso Giglio's garden. In order to enhance the fungicidal effect of piperine, sour milk, UHT milk, coconut milk and clove oil was used as solvent to test the antifungal efficiency of these substances combined with piperine. The antifungal tests were performed using the disk diffusion and serial dilution method, in addition to testing their affinities with the piperine by means of the solubility test. Among all the solvents tested, only clove oil and piperine was successful in fungicidal efficiency test, as well as, only clove oil was also able to solubilize piperine. The product formed by these substances was also effective, although it left brown stains on the leaf surface of the plant due to its high concentration. Key-Words: Fungicide, Natural, Powdery mildew, Piperine, Milk.

1 INTRODUÇÃO

O sistema agrícola atual, próspero em produtividade dos alimentos, é altamente dependente de agrotóxicos que são cada vez mais utilizados tanto em volume absoluto quanto em quantidade de substância ativa por área. Embora haja vantagens na utilização desses insumos como previsibilidade, eliminação de pragas e linha de produção controlada, o seu uso exacerbado provoca diversos problemas ambientais e contaminação de alimentos (BETTIOL, 2013). Em contraposição aos problemas descritos, sistemas alternativos surgem focados em se aproveitar das interações de ocorrência natural e manejo dessas relações biológicas.

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 A utilização dos agrotóxicos convencionais é uma pauta cada vez mais discutida entre os cientistas, os ambientalistas e a sociedade civil, devido aos malefícios que o seu uso incorretos podem trazer, como por exemplo, a contaminação do meio ambiente (água, solo e ar), extermínio de polinizadores, como as abelhas, e doenças relacionadas à sua alta exposição (ANVISA, 2015; PEREIRA, 2019; SINITOX, 2017).

A piperina é um alcaloide encontrado em maior abundância na pimenta-do-reino (Piper nigrum), têm demonstrado características benéficas de interesse agronômico. Entre elas, podemos destacar: a sua ação amebicida, antifúngica, inseticida e inibição da resistência bacteriana (FERREIRA et al, 2012). O uso da piperina pode ser uma alternativa aos fungicidas convencionais por não ser tóxica aos manipuladores e ter ação efetiva contra fungos mesmo em baixas concentrações (CARDOSO, 2005; MARQUES, 2010).

O leite cru e os leites processados (pasteurizados, UHT), podem ser capazes de induzir a resistência natural das plantas quando aplicado sobre suas folhas e controlar diretamente os patógenos que atacam essas estruturas por possuírem propriedades germicidas que promovem a formação de um biofilme na superfície foliar, o que protege contra possíveis invasores microbianos(EMBRAPA, 2004).

O leite de coco é um produto de origem natural e renovável, com propriedades antioxidantes em doenças patógenas na qual existe o estresse causado pelo oxigênio (radical livre), além de ser antitóxico e servir como cofator para proteger as células contra os metais pesados, possuindo também propriedades altamente nutritivas (COELHO, 2009).

O cravo-da-Índia (Syzygium aromaticum), planta considerada como especiaria, apresenta boa atividade fungicida, antimicrobiana, antioxidante e anestésica, dependendo da sua concentração e tempo de exposição ao tecido, possui ,ainda, alta lipossolubilidade possibilitando fácil absorção pelas membranas lipídicasda células (PEREIRA et al, 2013).

O oídio é uma fitopatologia característica de espécies da família Erysiphaceae que forma uma camada esbranquiçada e pulverulenta de micélio na superfície foliar (TAKAMATSU; (ARAKAWA);

SHIROYA; KISS; HELUTA, 2015; BETTIOL, 2004). Por ser uma doença muito comum nas plantas,

está presente nos 5 continentes e ataca diversas culturas agrícolas. Tem como sintoma principal o enrugamento dos limbos foliares devido ao seu ataque às nervuras (EMBRAPA, 2001). Então, quando instalado em uma planta, nota-se que há uma queda de rendimento na produção agrícola, já que ela causa o subdesenvolvimento da planta e a queda prematura das folhas (IGARASHI et al, 2010).

O presente trabalho tem como objetivo desenvolver um fungicida natural eficiente no combate aos oídio tendo como princípio ativo a piperina misturada a um possível solvente natural também

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 com propriedades fungicidas a fim de potencializar seu efeito (MARQUES et al, 2010; CARDOSO et al, 2005; KUMAR et al, 2011).

2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 OBTENÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA

A pimenta-do-reino (Piper nigrum) moída, utilizada para obtenção da piperina, foi adquirida no comércio local à granel em feira livre. Os solventes naturais de interesse foram o leite cru de vaca fermentado naturalmente (com pH por volta de 4), leite de vaca integral UHT, o leite de coco e o óleo essencial de cravo. A coleta do leite de vaca foi obtida de um animal localizado no município de Itu cuja dieta se baseava em farelo, quirela, ração e capim. A amostra de 2 L de leite cru foi armazenada em garrafa PET descontaminada com hipoclorito a 2,5% por 15 minutos e lavada com água potável. Em seguida, foi deixada por um mês sob refrigeração (4°C) para que a fermentação ocorresse de forma natural, assim como, a sua acidificação. O leite UHT de vaca e o leite de coco foram comprados do varejo local. O óleo de cravo foi extraído do cravo-da-Índia também via Soxhlet, mas com álcool de cereal (96%), pois garante melhor extração do eugenol como mostra KOSHIMA et al (2014) e seguindo os métodos realizados por ALVES et al (2011).

2.2 EXTRAÇÃO DA PIPERINA

A piperina foi extraída da pimenta-do-reino moída via Soxhlet por meio de álcool etílico 99% (SANTOS, 2009) e a solução extraída (solução A) foi deixada por uma semana no laboratório à temperatura ambiente para a evaporação do solvente. Em seguida, foi adicionado à solução A, uma solução alcoólica de KOH 10%, para precipitação dos taninos e, posteriormente, a mistura foi deixada em descanso no laboratório à temperatura ambiente por mais uma semana para então ser realizada duas filtrações à vácuo com papel filtro qualitativo de 3 micras. Na primeira filtração foram separados os taninos precipitados e na segunda, com a adição de água em torno de 10ºC, foram retidos os cristais de piperina. Uma amostra dos cristais obtidos foi enviada para o laboratório da empresa “Controle Analítico e Análises Técnicas LTDA”, onde foi realizada uma análise com cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) para a confirmação da presença da piperina.

2.3 IDENTIFICAÇÃO DO FUNGO

O fungo alvo foi primeiramente identificado por análise direta e posteriormente por microcultivo em lâmina no Laboratório de Micologia (sala 247) - Departamento de Microbiologia do ICB-USP de coletas realizadas via swab da planta Zinnia elegans no jardim da Etec Dr. Celso Giglio.

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 A amostra coletada foi cultivada em placas com meio de cultura SDA (Sabouraud Dextrose Agar) e incubadas à 26ºC por uma semana.

2.4 TESTE DE DISCO-DIFUSÃO DAS SUBSTÂNCIAS

O teste de disco-difusão foi realizado com uma pastilha de papel filtro embebido com a solução de teste em meio SDA, adaptado de EUCAST (2017). A piperina foi testada em concentrações de 10, 50 e 100 mg de piperina em 1 mL de acetona, os leites foram testados em concentrações de 5, 10, 15 e 20% (v/v) e o óleo de cravo foi testado puro e diluído 2 vezes. Para efeito de comprovação do teste, foi realizada diluição seriada em meio SDA de 16 a 0,5 vezes de cada tipo de leite e da concentração de piperina, porém, dessa vez foi dissolvido 100 mg em álcool etílico 15% seguido de aquecimento em forno micro-ondas por 30 segundos.

2.5 TESTE DE DILUIÇÃO SERIADA

O teste de diluição seriada consiste em avaliar de modo mais rápido a eficiência microbicida de uma substância, desde a mais concentrada até a mais diluída. Para este caso, utilizou-se o meio de cultura SDA (previamente autoclavado à 121°C, 1 atm por 15 minutos) e fator de diluição 1:2 com primeira diluição do teste antifúngico de 1:10 (1 mL da substância isolada mais 9 mL de meio SDA) seguida de mais 5 diluições (Figura 1), adaptado de NCCLS (2002).

Figura 1: Esquema de preparação do teste de diluição seriada

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 Após a preparação das soluções e as diluições em série, adicionou-se 100 µL da solução de fragmentos do micélio do fungo isolado em meio salino (NaCl 0,85%) em cada tubo teste. O conjunto foi incubado a 35ºC por 48 horas analisado por leitura visual.

2.6 TESTES DE SOLUBILIDADE DA PIPERINA

Testes de solubilidade também foram realizados entre a piperina e os solventes/veículos escolhidos, no qual 100 mg de piperina foram submetidos a diluição em 1 mL de cada leite e óleo de cravo, adaptado de CARVALHO (2014).

2.7 TESTES DO PRODUTO FINAL

O veículo que apresentou melhor resultado contra o crescimento do fungo parasita e boa solubilidade foi misturado à concentração mais efetiva de piperina contra o fungo testado para, por fim, ter se realizado os testes de disco-difusão e testes in vivo com o produto final.

Após os testes de eficiência e de solubilidade da piperina, o melhor veículo foi misturado para formar uma solução com 10% (v/v) da piperina extraída. A solução então foi testada in vitro (disco-difusão) e in vivo aplicada de gota-a-gota na superfície foliar da planta infectada e após 5 dias verificou-se a ação do fungicida sobre as folhas.

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 EXTRAÇÃO DA PIPERINA

A Tabela 1 demonstra a quantidade e o rendimento obtido de cada extração da piperina da pimenta-do-reino. No total, foram necessárias 5 extrações para a obtenção da quantidade necessária para a realização de todos os testes.

Tabela 1 – Média do Rendimento das extrações da piperina pelo método soxhlet.

Fonte: Acervo pessoal (2019)

Foram realizadas extrações de piperina até que se atingisse em torno de 1500 mg, das quais uma amostra (130 mg) foi usada para análise qualitativa do método com o uso da cromatografia

Repetições Extração de Piperina Massa Inicial (g) Massa Final (g) Rendimento (%)

1 10,00 0,13 1,3 2 10,01 0,35 3,5 3 10,01 0,31 3,1 4 10,00 0,41 4,1 5 10,00 0,32 3,2 Média 3,04

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 gasosa acoplada a espectrômetro de massas (GC-MS) e o restante para serem utilizadas nos outros experimentos. O rendimento obtido foi dentro esperado, pois consta na literatura um rendimento de 3% a 7% de piperina da pimenta-do-reino (SANTOS, 2009), portando, o método utilizado foi eficaz e comprovado por GC-MS, visto que a análise resultou em 98% de probabilidade de ser a piperina na amostra enviada para o laboratório citado (Anexo).

3.2 IDENTIFICAÇÃO DO FUNGO PARASITA

Por meio da técnica de análise direta e comparações com outros trabalhos de identificação de fungos fitopatogênicos (EMBRAPA, 2013; BARGUIL, VIANA e SARAIVA, 2007) foi possível identificar uma espécie como suspeita de ser o fungo-alvo de oídio.

Dentre as características macroscópicas, a colônia do fungo isolado apresenta característica pulverulenta, com bordas rizoides e formato circular grande de cor branca na frente e com um anel amarronzado no verso (Figura 2). A imagem visualizada na lente de 40 vezes em microscópio ótico (Figura 3) foi semelhante aos resultados obtidos por Barguil, Viana e Saraiva (2007) ao estudar qual fungo estaria parasitando a planta de espécie Zinnia elegans e constataram que se tratava do fungo Oidium asteris-punicei (atualmente identificado como Golovinomyces cichoracearum), com “micélio hialino, conidióforos retos, cilíndricos, com 2 a 4 células; os conídios, também hialinos, 1 célula, formados em cadeias curtas, de formato elipsóides a ovais”; Constatando-se com outra microscopia na lente de 10 vezes (Figura 4).

3.3 TESTE DE DISCO-DIFUSÃO DAS SUBSTÂNCIAS

Após uma semana de incubação, não foram identificados halos de inibição dos leites de vaca cru (pH ácido), UHT e do leite de coco, pois o fungo cresceu uniformemente pela placa (Figura 5, 6

Figura 2: Fungo isolado frente

(A) e verso (B).

A B

Fonte: Acervo pessoal.

Figura 3: Esporos do fungo

isolado em lente de 40x.

Figura 4: Micélio do fungo

isolado em lente de 10x.

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 e 7). Porém, o contrário se observou com o óleo de cravo, visto que não houve crescimento do fungo pela placa (Figura 8). Quanto à piperina, todas as concentrações (10, 50 e 100 mg) foram capazes de inibir o crescimento do fungo, ao passo que o halo de inibição aumenta ligeiramente conforme se aumenta a concentração (Figura 9).

Em vista de que nenhum tipo de leite foi capaz de inibir o crescimento do oídio Golovinomyces cichoracearum em qualquer concentração, o mesmo, portanto, não possui caráter fungicida para o fungo testado. No entanto, o leite cru e UHT são capazes de induzir a resistência da planta por conta de seus e aminoácidos, assim como, no controle biológico por promover um filme microbiano na superfície foliar (BETTIOL, 2004). Para o leite de coco, não foram encontrados trabalhos que o testasse in vivo, contudo, ainda é de interesse visto que pode atuar como o leite cru por suas propriedades altamente nutritivas (CAPLIN e STEWARD, 1948) e pelo seu óleo ser microbicida (OSMAN, 2019).

O óleo de cravo é composto em sua maior parte pelo eugenol, composto fenólico natural que, embora não esteja tão esclarecido seu modo de ação, pode alterar a atividade enzimática dos fungos,

Figura 8: Teste com óleo de

cravo.

Figura 9: Teste com a piperina.

Fonte: Acervo pessoal. Figura 5: Teste com leite

UHT.

Figura 6: Teste com leite cru

azedo (pH entre 4 e 5).

Fonte: Acervo pessoal

Figura 7: Teste com leite de

coco.

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 interferir no material genético e ainda modificar o conteúdo celular de ácidos graxos (PEREIRA, 2006).

A placa com o teste de piperina sofreu contaminação e não se identificou o fungo alvo. Mas, ao analisar o organismo desenvolvido, percebe-se um ligeiro aumento da inibição do crescimento fúngico conforme se aumenta a concentração de piperina (10, 50 e 100 mg), com halos (em milímetros – mm) respectivamente de 0, 2 e 3.

3.4 TESTE DE DILUIÇÃO SERIADA

O teste de diluição seriada comprovou o mesmo efeito observado no teste de disco-difusão, pois houve crescimento do oídio em todas as concentrações dos leites e diminuição do crescimento fúngico conforme a maior concentração de piperina. Ainda assim, na última diluição (0,5x) do leite cru (Figura 10) e na primeira diluição (16x) da piperina (Figura 11) houve pouco crescimento do fungo. Quanto ao leite UHT e o leite de coco (Figura 12 e 13), houve crescimento normal, sendo que no leite de coco, o meio de cultura foi solidificado.

Figura 11: Primeira

diluição da piperina.

Fonte: Acervo pessoal. Figura 10: Diluição de 0,5x

do leite cru.

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3.5 TESTE DE SOLUBILIDADE

A Tabela 2 a seguir mostra os resultados de solubilização da piperina em relação a massa dissolvida por volume de solvente/veículo testado (% m/v).

Tabela 2 – Teste de solubilização de cristais de piperina em diferentes solventes/veículos testados.

Fonte: Acervo pessoal (2020).

Para cada 1 mL do veículo testado, verificou-se que a piperina possui afinidade somente com o óleo de cravo, no qual se dissolveu até 100 mg de piperina tanto no extrato alcoólico do óleo de cravo quanto no óleo de cravo destilado (puro), em que, inclusive, notou-se maior facilidade para dissolver a piperina devido à maior presença do eugenol, substância de caráter apolar (MORÉS, 2009). Em contrapartida, não foi possível solubilizar a piperina em nenhum tipo de leite (de vaca, UHT ou de coco), mesmo com teor de gordura significativo. Quanto aos leites de vaca, por mais que tenham quantidade de gordura de aproximadamente 3% (m/v), cerca de 80% é água (VENTURINI, SARCINELLI e SILVA, 2007), o que impossibilita dissolver a piperina. O leite de coco segue a tendência de possuir mais água do que tecido gorduroso (CARNEIRO et al, 2014), porém, notou-se também que sua alta viscosidade é mais um impeditivo para solubilizar a piperina.

Solventes / Veículos Testes Solubilização da Piperina (% m/v)

Leite cru azedo 0

Leite UHT 0

Leite de Coco 0

Óleo de Cravo 10

Figura 13: Diluição de 0,5x

do leite de coco.

Fonte: Acervo pessoal. Figura 12: Diluição de 0,5x

do leite UHT.

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3.6 TESTES DE EFICIÊNCIA DO PRODUTO FINAL

Para se comprovar a eficiência da piperina com o óleo de cravo (visto que foi o que apresentou melhor desempenho nos testes in vitro), realizou-se mais um teste de disco-difusão e aplicação direta na planta infectada.

No teste in vitro notou-se maior alcance da atividade fungicida (Figura 14), visto que o halo de inibição da mistura (0,7 cm) aumentou em relação ao teste com a piperina somente (Figura 9).

Novamente a placa sofreu contaminação e não se pode alegar que inibiu o crescimento do fungo Galovinomyces cichoracearum neste teste in vitro, no entanto, mostrou-se promissor no tente in vivo (aplicado direto nas folhas da planta), pois no local onde a mistura foi aplicada, houve a eliminação imediata do fungo e assim permaneceu após 5 dias, apesar de ter manchado a superfície foliar da Zinnia elegans (Figura 15).

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Após os procedimentos e análises realizadas, foi comprovada a eficácia do óleo de cravo tanto em sua atividade antifúngica quanto como um solvente da piperina. Nenhum tipo de leite demonstrou atividade fungicida in vitro contra o fungo Golovinomyces cichoracearum. Quanto à piperina, não se pode avaliar sua eficiência contra a espécie citada, pois houve contaminação no meio de cultura, no entanto, pode-se observar seu caráter fungicida conforme se aumenta sua concentração (em relação ao fungo contaminante). O produto final foi formado pela piperina dissolvia em óleo de cravo e demonstrou atividade antifúngica tanto no teste in vitro quanto in vivo, embora, devido à alta concentração utilizada, manchou a superfície foliar da planta Zinnia elegans.

Figura 14: Disco-difusão da piperina

com óleo de cravo a 10%.

Figura 15: Teste in vivo da mistura

de piperina com óleo de cravo.

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 Uma proposta futura para o trabalho seria a realização de novos testes com piperina diluída em outros solventes, como álcool ou extrato de outras plantas de caráter anfifílico, para avaliação do efeito fungicida contra espécies do tipo oídio.

REFERÊNCIAS

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Braz. J. of Develop., Curitiba, v. 6, n. 7, p. 46433-46447, jul. 2020. ISSN 2525-8761 ANEXO

Resultado da probabilidade de presença da piperina na amostra enviada (98,0%).