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Polimorfismo no gene da Ciclina D1 em neoplasias associadas a vírus

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Academic year: 2020

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(1)UNIVERSIDADE DO MINHO. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. Orientador: Prof. Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva Co-orientador: Prof. Doutora Margarida Paula Pedra Amorim Casal. RAQUEL JORGE FERREIRA CATARINO. Porto, 2005.

(2) DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU DE MESTRE APRESENTADA À UNIVERSIDADE DO MINHO.

(3) AGRADECIMENTOS Ao Professor Doutor Rui Medeiros, orientador deste trabalho, pela paciência, motivação e incentivo, sempre disposto a oferecer estímulos e ouvir com interesse e ânimo todas as questões, dúvidas e problemas e pela confiança depositada em mim e no meu trabalho.. À Doutora Margarida Casal, pelos comentários, observações e críticas construtivas a este trabalho e pelo empenho dedicado ao Mestrado de Genética Molecular.. Ao Núcleo Regional do Norte da Liga Portuguesa Contra o Cancro, em particular ao Dr. Cardoso da Silva e ao Dr. Vítor Veloso, por me concederem a bolsa que permitiu a realização deste trabalho.. Ao Professor Carlos Lopes, pela disponibilização dos meios necessários à realização deste projecto.. À Dra. Deolinda Pereira e ao Dr. Eduardo Breda, pelo apoio fundamental na parte clínica deste trabalho.. Aos meus colegas de trabalho, que apesar das dificuldades continuam a batalhar pela investigação básica. À Paula pelos momentos e desabafos de confidências, à Gui pelo constante sorriso e boa disposição, à Xaninha pelo carinho, à Dani e ao Hugo pelo incentivo e prestabilidade e à Ana, pela amizade e intervalos cúmplices.. V.

(4) Aos meus amigos, sempre interessados e solícitos em ajudar-me, por suportarem e perdoarem as minhas ausências. À Tânia pela amizade franca e incondicional, à Mafas pela partilha de choros e risos, ao Viet pela fraternidade, à Joaninha pela amizade para uma vida e à Vaninhas, que apesar de estar longe, está sempre presente quando é preciso…. Ao Joaquim Paulo, pela disponibilidade e paciência infinitas na elaboração da parte gráfica desta dissertação.. À minha madrinha, vítima desta doença e desde sempre razão motivadora para eu estudar Oncologia.. Ao Rui, sempre solícito, por toda a dedicação, paciência, amor e carinho e pelos pequenos grandes miminhos determinantes para o meu sorriso diário e fácil…. À minha família, pelo apoio incondicional. Aos meus pais, por terem suportado todos os meus encargos, pela confiança que me incutem e pela felicidade que sempre me proporcionam. Foi graças a todo o vosso apoio que tive oportunidade de estudar o que sempre gostei e de concluir esta dissertação, podendo retribuir um pouco do orgulho que sinto pelo dois. Ao meu irmão e à minha mana de sangue e sempre…. Ao meu avô, que sempre acreditou em mim…. VI.

(5) INDICE. Índice. RESUMO. IX. ABSTRACT. XV. INTRODUÇÃO. 1. BIOLOGIA MOLECULAR DO CANCRO. 3. VARIAÇÕES GENÉTICAS: POLIMORFISMOS. 8. CANCRO E CICLO CELULAR. 10. VÍRUS E CANCRO. 13. CICLINA D1 E CANCRO. 17. POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1. 21. CANCRO DO COLO DO ÚTERO. 23. CANCRO DA NASOFARINGE. 27. OBJECTIVOS. 31. MATERIAL E MÉTODOS. 35. POPULAÇÃO. 37. Indivíduos Controlo. 37. Pacientes com Cancro do Colo do Útero. 38. Pacientes com Cancro da Nasofaringe. 40. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS. 42. AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR PCR. 43. Identificação do fragmento do produto de PCR ANÁLISE DO POLIMORFISMO NO GENE CCND1 POR RFLP Identificação dos fragmentos obtidos por RFLP POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. VII. 44 44 45.

(6) INDICE ANÁLISE ESTATÍSTICA. 45 47. RESULTADOS AMPLIFICAÇÃO DO DNA. 49. ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1. 49. FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO A870G CCND1. 51. Indivíduos Controlo. 51. Pacientes com Lesões do Colo do Útero. 53. Pacientes com Cancro da Nasofaringe. 61. DISCUSSÃO. 69. SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DO COLO DO ÚTERO. 71. SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DA NASOFARINGE. 74. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS. 79. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 85. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. VIII.

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(8) RESUMO. A carcinogénese é um processo que envolve várias etapas e reflecte as alterações genéticas que promovem a transformação progressiva de células humanas normais em células altamente malignas.Nos últimos anos tem vindo a tornar-se clara a importância do estudo de genes de baixa penetrância, como os genes envolvidos na reparação de DNA e manutenção da integridade genómica, no controlo da proliferação e diferenciação celular ou no metabolismo de carcinogénios. A variação genética inter-individual pode constituir um factor importante na caracterização da susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro. Pensa-se que algumas destas variantes genéticas podem ser definidas como alelos de susceptibilidade de baixa penetrância, conferindo um risco alterado para desenvolver cancro. Têm sido descritos muitos estudos relativamente à epidemiologia do. cancro. e. aos. efeitos. carcinogénicos. de. microrganismos,. nomeadamente os vírus. No caso de vírus que possuem a capacidade de persistir nas células que infectam, pensa-se que o mecanismo mais frequente resulta da alteração do controlo do ciclo celular e predisposição para modificações mais alargadas na expressão genética das células. A proteína ciclina D1 (CCND1) parece ser muito importante na regulação do ciclo celular, particularmente no ponto de controlo G1/S do ciclo celular. O gene CCND1 é um proto-oncogene mapeado no cromossoma 11q13 muitas vezes alterado em diversos tipos de tumores. Foi identificado um polimorfismo no nucleótido 870 do gene CCND1, que. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. XI.

(9) RESUMO. consiste na transição das bases azotadas adenina e guanina no exão 4 do gene. Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do tipo caso-controlo, com os objectivos de analisar a frequência do polimorfismo A870G no gene da ciclina D1 (CCND1) num grupo de indivíduos sem qualquer patologia, em mulheres com carcinoma do colo do útero e indivíduos com carcinoma da nasofaringe e verificar e avaliar a existência de associações entre a frequência do polimorfismo estudado e susceptibilidade genética para carcinoma do colo do útero e nasofaringe. Foram. analisadas. amostras. de. DNA. correspondentes. a. quatrocentos e cinquenta e nove (459) indivíduos. O grupo de indivíduos controlo consistiu em cento e oitenta e sete (187) indivíduos normais sem patologia oncológica conhecida, constituído por cento e três (103) mulheres e oitenta e quatro (84) homens. Foram analisadas amostras de DNA de 178 mulheres com lesões colo do útero e 94 indivíduos com cancro da nasofaringe. A análise do polimorfismo e avaliação dos genótipos foi efectuada através da técnica PCR-RFLP. Através da análise dos resultados observou-se que mulheres portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67; 95% CI 1,45-9,31; p=0,007) e 3,24 vezes superior para o desenvolvimento de carcinoma espinocelular do colo do útero (OR=3,24; 95% CI 1,41-7,46;. p=0,006). Relativamente ao grupo de indivíduos com carcinoma da POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. XII.

(10) RESUMO. nasofaringe, a análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que indivíduos portadores do genótipo GG possuem um risco acrescido no desenvolvimento de cancro da nasofaringe (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98;. p=0,016) e um risco ainda superior quando analisados os resultados relativos ao tipo histológico indiferenciado (UCNT) em indivíduos portadores do genótipo GG (OR=2,32; 95% CI 1,20-4,17; p=0,018). Estes resultados podem ajudar na compreensão do papel e influência da ciclina D1 no cancro, dos mecanismos biológicos do cancro do colo uterino e da nasofaringe e na definição de um perfil genético para estas neoplasias.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. XIII.

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(12) ABSTRACT. Tumorigenesis in humans is a multistep process and these steps reflect genetic alterations that drive the progressive transformation of normal cells into highly malignant derivatives. In the last few years low penetrance genes have been intensely studied, namely genes involved in DNA repair, genomic integrity maintenance, cell cycle control and metabolism of carcinogens. The genetic variation between individuals may be important in the characterization of cancer susceptibility. Some of these genetic variations can be defined as low penetrance susceptibility alleles, conferring an altered risk in cancer development. Many important discoveries relating to cancer epidemiology and to the carcinogenic effects of micro-organisms, namely virus, have been reported. The mechanism likely to occur more frequently is the imprinting of modified cell cycle control and predisposition to more extensive changes in cellular gene expression in the case of viruses that persist in the cells they infect. Cyclin D1 (CCND1) is a protein very important in cell cycle regulation, particularly in the G1/S checkpoint of the cell cycle. CCND1 is a proto-oncogene located on human chromosome 11q13 often altered in many human tumors. A single nucleotide polymorphism at nucleotide 870 has been identified. We performed a case-control study, in order to analyze the frequency of the A870G CCND1 polymorphism in healthy individuals, women with lesions of the uterine cervix. and. individuals. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. XVII. with.

(13) ABSTRACT. nasopharyngeal carcinoma, and evaluate the possible associations between the frequency of the polymorphism and genetic susceptibility to cervical and nasopharyngeal cancers. We analysed DNA samples of 459 individuals: 178 women with cervical lesions and 94 individuals with nasopharyngeal cancer. The control group consisted of 187 healthy individuals, including 103 women and 84 men. The analysis of the A870G polymorphism was performed by PCRRFPL techniques. The GG genotype was associated with a 3,67 fold higher risk for the development of high-grade lesions of the cervix (OR=3,67; 95% CI 1,459,31; p=0,007) and a 3.24 fold increased risk for the development of squamous invasive cervical cancer (OR=3,24; 95% CI 1,41-7,46;. p=0,006). Concerning the nasopharyngeal cancer group, the analysis of the frequencies of CCND1 genotypes indicates that individuals carrying the GG genotype have a 2,17 fold increased risk for the development of nasopharyngeal cancer (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98; p=0,016) and a slightly higher susceptibility, with a risk of 2,32 fold (OR=2,32; 95% CI 1,20-4,17; p=0,018), when considering the undifferentiated histological type of nasopharyngeal carcinoma (UCNT). These results can lead to a better understanding of cyclin D1 influence in cancer, the biological mechanisms of cervical and nasopharyngeal cancers and in the definition of a genetic profile for these diseases.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. XVIII.

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(15) INTRODUÇÃO. Biologia Molecular do Cancro. O cancro constitui um importante problema de saúde pública a nível mundial, sendo detectados todos os anos cerca de 10 milhões de novos casos no mundo inteiro (Parkin 2001). Em Portugal, esta doença constitui a segunda causa de morte (Pinheiro et al. 2003). O cancro é uma doença que envolve alterações dinâmicas no genoma, que se encontra alterado em múltiplos locais nas células cancerígenas. A carcinogénese é um processo que envolve várias etapas e reflecte as alterações genéticas que promovem a transformação progressiva de células humanas normais em células altamente malignas (Hanahan e Weinberg 2000). Danos não letais no material genético são a base da carcinogénese, podendo ser herdados ou adquiridos ao longo da vida através da acção de agentes ambientais, nomeadamente compostos químicos, radiação e agentes infecciosos (Kumar et al. 2003). O número exacto de alterações necessárias ao desenvolvimento de neoplasias não é conhecido, variando provavelmente com o tipo de alteração e tipo de tumor. O objectivo da investigação oncológica consiste na definição destas alterações moleculares e no desenvolvimento de estratégias de prevenção e tratamento eficazes (Weber 2002). Um tumor maligno é então o resultado de uma série de alterações no DNA de uma única célula, ou clones desta célula, que originam perda das funções normais, crescimento celular descontrolado e, por vezes, metástases (dispersão de células malignas e crescimento neoplásico à POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 3.

(16) INTRODUÇÃO. distância do tumor primário). A progressão de uma célula normal até uma célula maligna é um processo lento e envolve a acumulação de mutações em genes determinantes, nomeadamente em proto-oncogenes (genes cuja função consiste na indução da proliferação celular), genes supressores tumorais (genes que codificam geralmente proteínas que inibem a divisão celular), genes associados à regulação da apoptose e genes envolvidos na reparação de DNA (Brennan 2002). Durante a carcinogénese, seis propriedades celulares essenciais são alteradas e adquiridas pelas células malignas, designadamente a autosuficiência em factores de crescimento, insensibilidade a sinais inibidores de. crescimento,. potencial. replicativo. ilimitado,. fuga. à. apoptose,. capacidade de invasão tecidular e metastização e angiogénese (figura 1).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 4.

(17) INTRODUÇÃO. Figura 1 – Alterações necessárias adquiridas pelas células malignas (adaptado de Hanahan e Weinberg 2000).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 5.

(18) INTRODUÇÃO. Os meios através dos quais estas alterações podem ser adquiridas variam no seu mecanismo e cronologia. O número de mutações necessárias para adquirir uma determinada propriedade é também variável conduzindo, no entanto, ao mesmo resultado (Weber 2002). Por outro lado, os mecanismos celulares que impedem a carcinogénese podem diferir entre indivíduos, devido à variabilidade populacional dos genes polimórficos que regulam estes processos (Brennan 2002). A variação genética inter-individual pode constituir um factor importante na caracterização da susceptibilidade para o desenvolvimento de cancro. Tem sido sugerido que os genes envolvidos na susceptibilidade para cancro podem ser considerados de acordo com a sua penetrância: o grupo de genes de susceptibilidade com elevada penetrância, como o caso dos genes BRCA1 e APC e o grupo de genes de susceptibilidade de baixa penetrância, que são genes comuns com uma interacção gene-ambiente e associação geralmente esporádica (Shields e Harris 1991). Nos últimos anos tem vindo a tornar-se clara a importância do estudo de genes de baixa penetrância, como os genes envolvidos na reparação de DNA e na manutenção da integridade genómica, no controlo da proliferação e diferenciação celular ou no metabolismo de carcinogénios. Embora estes genes tenham um menor impacto no risco individual para o cancro, podem ter relevância quando analisados em termos de risco atribuível na população. Estas descobertas podem ajudar na elaboração de estratégias de prevenção direccionadas para indivíduos de alto risco (Brennan 2002).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 6.

(19) INTRODUÇÃO. As causas de uma determinada neoplasia variam de indivíduo para indivíduo, tornando-se essencial compreender estas variantes genéticas de modo a definir grupos de indivíduos que sejam mais susceptíveis a uma determinada neoplasia. A epidemiologia molecular surge como a ciência que analisa a contribuição dos potenciais factores de risco genéticos e ambientais, identificados a nível molecular, para a etiologia, distribuição e prevenção da doença ao nível das populações.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 7.

(20) INTRODUÇÃO. Variações Genéticas: Polimorfismos. Polimorfismos são variações na sequência de DNA que existem em indivíduos normais de uma população, estando a variante menos frequente presente em pelo menos 1% da população (Brookes 1999). As variações de sequência mais comuns no genoma humano são single. nucleotide polymorphisms (SNPs), isto é, polimorfismos em que a variação ocorre num único nucleótido (Erichsen e Chanock 2004). Pensa-se que algumas destas variantes genéticas podem ser definidas como alelos de susceptibilidade de baixa penetrância, conferindo um risco alterado para desenvolver cancro. O risco para cancro parece ser influenciado pelos padrões de SNPs que o indivíduo possui em determinados genes chave de susceptibilidade (Brookes 1999). A avaliação do risco relativo (RR) estima a magnitude de uma associação entre o factor de exposição, como o polimorfismo, e a doença, constituindo uma indicação sobre a probabilidade de desenvolvimento da doença no grupo portador de uma das variantes desse polimorfismo comparativamente às restantes. Grande parte dos estudos realizados é do tipo caso-controlo, em que o risco relativo pode ser avaliado pela determinação do quociente OR (Odds Ratio). O Odds Ratio representa a magnitude desta associação e fornece informação que pode ser importante no julgamento da causalidade e na definição do risco atribuível, ou seja, a proporção de todos os casos da doença atribuível ao factor de risco (Knudsen et al. 2001). POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 8.

(21) INTRODUÇÃO. A análise de SNPs e haplótipos na pesquisa oncológica pode ajudar na determinação e elaboração de terapias para a intervenção e prevenção do cancro.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 9.

(22) INTRODUÇÃO. Cancro e Ciclo Celular. O cancro é, na sua essência, uma doença do ciclo celular (Pines 1995). Alterações no controlo de mecanismos e vias chave da regulação da. proliferação. celular. são. acontecimentos. necessários. para. o. estabelecimento de um tumor. O ciclo celular é constituído por quatro fases ou processos estritamente coordenados: fase M, fase G1, fase S e fase G2. Na fase M ocorre mitose (divisão celular), seguida da fase G1, que corresponde a um intervalo entre a mitose e o início da replicação do DNA. A fase G1 antecede a fase S, onde ocorre replicação do DNA, que por sua vez é seguida da fase G2, durante a qual a célula continua a crescer e a sintetizar proteínas na preparação para a mitose. A progressão das células através do ciclo celular é estritamente regulada por sinais extracelulares e internos que monitorizam e coordenam os vários processos que ocorrem durante as diferentes fases do ciclo celular. Esta coordenação entre fases é dependente de um sistema de checkpoints (pontos de controlo) e vias bioquímicas de transdução de sinal, que previnem a entrada numa nova fase até que os eventos que ocorrem na fase anterior sejam completados (Nurse 2002). Esta progressão ordenada é controlada por ciclinas, cinases dependentes de ciclinas (CDKs) e pelos seus inibidores. As CDKs promovem o ciclo celular através da fosforilação de proteínas alvo que são necessárias à progressão das células para uma nova fase do ciclo celular e POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 10.

(23) INTRODUÇÃO. são activadas por fosforilação após a ligação das ciclinas (subunidades reguladoras), formando-se um complexo ciclina-CDK (Kumar et al. 2003). Embora cada fase do ciclo celular seja estritamente regulada, a transição da fase G1 para a fase S constitui um ponto de controlo de extrema importância, pois após esta passagem as células são forçadas a progredir através da fase S (Sherr 1996). Quando a célula recebe sinais indutores de crescimento, a síntese de ciclinas D que complexam com as CDK4 e CDK6 e de ciclina E, que complexa com a CDK2, são estimuladas. Estes complexos fosforilam a proteína retinoblastoma (RB) e provocam a libertação dos factores de transcrição que vão activar a expressão de genes necessários à progressão através da fase S do ciclo celular (Sherr 1995; Sherr 1996) (figura 2). A ciclina D1 tem sido particularmente estudada, devido ao seu papel importante na promoção da carcinogénese.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 11.

(24) INTRODUÇÃO. Figura 2 – Ilustração esquemática do papel das ciclinas e cinases dependentes de ciclinas (CDKs) na regulação do ciclo celular (adaptado de Kumar et al. 2003).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 12.

(25) INTRODUÇÃO. Vírus e Cancro. Nos últimos anos têm sido descritos muitos estudos relativamente à epidemiologia do cancro e aos efeitos carcinogénicos de microrganismos. Agentes infecciosos, especialmente os vírus, contribuem para mais de 20% das neoplasias (quadro I). Aproximadamente um quinto de todos os carcinomas registados no mundo surgem no estômago (9%), fígado (6%) e colo do útero (5%) (Talbot e Crawford 2004). A replicação do genoma de muitos vírus de DNA encontra-se parcialmente dependente da célula hospedeira. Neste processo, podem alterar a expressão genética do hospedeiro para promoverem a síntese de DNA e a proliferação celular. No caso de vírus que possuem a capacidade de persistir nas células que infectam, pensa-se que o mecanismo mais frequente resulta da alteração do controlo do ciclo celular e da predisposição para modificações mais alargadas na expressão genética das células (Pagano et al. 2004).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 13.

(26) INTRODUÇÃO. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 14.

(27) INTRODUÇÃO. Papilomavirus Humano - HPV O HPV (Human Papillomavirus) é um vírus pequeno de DNA de cadeia dupla, pertencente à família Papovaviridae. Foram já catalogados mais de 120 tipos de HPVs, estabelecidos por homologia da sequência de DNA. Os tipos de HPV associados a risco para cancro incluem as variantes 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 (Duarte-Franco e Franco 2004). Dados epidemiológicos, moleculares e clínicos sugerem que os HPVs de alto risco, especialmente o HPV-16 e o HPV-18, desempenham o papel principal na etiologia do cancro do colo do útero. Mais de 90% dos carcinomas do colo uterino possuem DNA de HPV de alto risco (Bosch et. al. 2002). As proteínas virais E6 e E7 do HPV possuem propriedades oncogénicas, importantes para a imortalização celular, desregulação do ciclo celular e inibição da apoptose (Wolf et al. 2003).. Epstein-Barr vírus - EBV O EBV (Epstein-Barr Vírus) é um vírus de dupla cadeia de DNA, que pertence à família Herpesviridae e infecta principalmente linfócitos B (Kuppers 2003). O vírus foi originalmente isolado a partir de biópsias de Linfoma de Burkitt. Posteriormente, a infecção por EBV foi associada ao desenvolvimento do cancro da nasofaringe, linfomas pós-transplante, uma percentagem de linfomas não-Hodgkin e cancros gástricos e a raros exemplos de linfomas de células T (Young e Rickinson 2004). O EBV possui a capacidade de alterar a regulação do crescimento dos linfócitos B e de induzir a transformação de crescimento permanente. O genoma do POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 15.

(28) INTRODUÇÃO. EBV codifica diversas proteínas que alteram profundamente a expressão celular, nomeadamente o oncogene LMP1 (Latent Membrane Protein 1), essencial para a transformação dos linfócitos e juntamente com outro gene viral, o LMP2 (Latent Membrane Protein 2), contribui para a activação da expressão de genes celulares, principalmente através da activação do factor de transcrição NFkappaB (Nuclear Factor kappa B) (Pagano et al. 2004).. Outras neoplasias epiteliais, nomeadamente cancro do pulmão, do cólon, da bexiga e da próstata, são promovidas por imunossupressão, sugerindo que podem existir vírus ainda não identificados com um papel importante no desenvolvimento destas neoplasias (Talbot e Crawford 2004).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 16.

(29) INTRODUÇÃO. Ciclina D1 e Cancro. A ciclina D1 (CCND1) parece funcionar como um sensor chave na integração dos sinais extracelulares em células que se encontram no início da fase G1 do ciclo celular, mediando a sua função através da ligação às CDKs. A abundância de CCND1 é induzida por factores de crescimento, nomeadamente EGF (Endothelial Growth Factor) (Alisi et al. 2003), FGF2 (Fibroblast Growth Factor-2) (Holnthoner et al. 2002), aminoácidos (Nelsen et al. 2003), LPA (ácido lisofosfatídico) (Hu et al. 2003) e hormonas gástricas (Song et al. 2003; Pradeep et al. 2004), cada um regulando a expressão de CCND1 em tipos celulares específicos. Vários sinais oncogénicos induzem a expressão de CCND1, incluindo RAS (Albanese et al. 1995), Src (Lee et al. 1999), Neu (Lee et al. 2000) e βcatenina (Shtutman et al. 1999; Lin et al. 2000). O gene CCND1 é um proto-oncogene mapeado no cromossoma 11q13 (figura 3), que codifica uma proteína de 33.7 kDa (Bates e Peters 1995), sendo também designado de bcl-1 ou PRAD1. Foi originalmente isolado como um gene clonado, rearranjado e sobre-expresso em adenomas da paratiróide (Motokura et al. 1991).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 17.

(30) INTRODUÇÃO. A. B. Figura 3 – Localização do gene CCND1 no cromossoma 11 (A) e estrutura do transcrito (B).. O CCND1 é um proto-oncogene muitas vezes activado durante o desenvolvimento. de. tumores. através. de. vários. mecanismos,. nomeadamente por translocação e amplificação (figura 4). Em alguns adenomas da paratiróide ocorre inversão, envolvendo as regiões 11q13 e 11q15, o que resulta na expressão de CCND1 sob o controlo do promotor do gene da hormona paratiróide (Motokura et al. 1991). Em linfomas de células B, o gene CCND1 sofre translocação e fica sob o controlo do elemento regulador do gene da imunoglobulina no cromossoma 14q32 (de Boer et al. 1993). A activação do gene (devido a amplificação ou rearranjo cromossómico) e/ou sobre-expressão da proteína têm sido descritos em vários tipos de tumores, nomeadamente cólon (Palmqvist et al. 1998), POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 18.

(31) INTRODUÇÃO. mama (Marsh e Varley 1998), cabeça-pescoço (Callender et al. 1994), pulmão (Betticher et al. 1996), bexiga (Sgambato et al. 2002), fígado (Nishida et al. 1994) e próstata (Chen et al. 1998). A sobre-expressão de CCND1 tem também sido correlacionada com proliferação aumentada, podendo originar a passagem prematura da célula através do ponto de controlo G1/S, resultando na propagação de erros não reparados no DNA, acumulação de erros genéticos e numa vantagem selectiva de crescimento para as células alteradas (Quelle et al. 1993; Zheng et al. 2001).. Figura 4 – Mecanismos de activação de CCND1 em tumores humanos (adaptado de Bates e Peters 1995).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 19.

(32) INTRODUÇÃO. A amplificação do gene e a expressão desregulada de CCND1 em células tumorais têm também sido associadas a sobrevida livre de doença reduzida e mau prognóstico, apesar de haver alguma controvérsia nestas associações (McIntosh et al. 1995; Michalides et al. 1995; Betticher et al. 1996; Keum et al. 1999; Drobnjak et al. 2000).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 20.

(33) INTRODUÇÃO. Polimorfismo A870G no gene CCND1. Betticher e colaboradores identificaram um polimorfismo no nucleótido 870 do gene CCND1, que consiste na transição das bases azotadas adenina e guanina no exão 4 do gene. Este polimorfismo não origina uma mudança de aminoácido, no entanto, o nucleótido variante interfere com o splicing do exão 4 para o exão 5, dada a sua localização no splice donor site do exão 4 do gene CCND1. O RNAm pode sofrer. splicing alternativo e originar dois transcritos diferentes (a e b), que existem simultaneamente em diversos tecidos (figura 5). O transcrito a sofre splicing normal e o transcrito b é cortado no intrão 4 e não possui o as sequências existentes no exão 5 do gene. O alelo G está associado a ambos os transcritos, enquanto que o alelo A, que está apenas associado ao transcrito b, dá origem ao splicing alternativo, resultando numa proteína truncada que não possui as sequências envolvidas na degradação rápida e turnover da proteína codificadas no exão 5 do gene (Betticher et al. 1995).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 21.

(34) INTRODUÇÃO. Isoforma a. Figura 5 – Splicing normal e alternativo do gene CCND1 (adaptado de Fu et al. 2004).. Os diferentes genótipos têm sido significativamente associados à carcinogénese. e. prognóstico. clínico. em. diversas. neoplasias,. nomeadamente cancro da próstata (Wang et al. 2003), cabeça-pescoço, (Matthias et al. 1998; Matthias et al. 1999; Holley et al. 2001; Wang et al. 2002; Monteiro et al. 2004), bexiga (Wang et al. 2002) e colorectal (McKay et al. 2000).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 22.

(35) INTRODUÇÃO. Cancro do Colo do Útero. O tipo histológico mais comum de cancro do colo do útero é o carcinoma. espinocelular,. que. pode. ser. queratinizante. ou. não. queratinizante. Os adenocarcinomas são responsáveis por apenas 14% dos cancros do colo do útero. Os carcinomas adenoescamosos e de pequenas células são relativamente raros (Pazdur 1995). Nos últimos anos as taxas de incidência e mortalidade têm diminuído consideravelmente nos países desenvolvidos, provavelmente devido à aplicação de programas de rastreio citológico, nomeadamente o teste de Papanicolau. O cancro do colo do útero é um problema de saúde pública, com aproximadamente 500000 mulheres a desenvolverem a doença por ano, em todo o mundo. Em muitos países menos desenvolvidos constitui a causa mais comum de morte por cancro. O cancro do colo uterino ocupa o segundo lugar das neoplasias nas mulheres em todo o mundo, sendo que aproximadamente 80% dos casos surgem em países menos desenvolvidos (Waggoner 2003). Em Portugal, a taxa de incidência ajustada à idade de novos casos de cancro do colo uterino por ano é de 17,0 por cada 100 000 mulheres e na União Europeia, de 10,5 por cada 100 000 mulheres. A taxa de mortalidade anual ajustada à idade por cancro do colo do útero em cada 100 000 indivíduos é de 6,3 em Portugal e de 4,4 na União Europeia (Pinheiro et al. 2003) (figura 6).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 23.

(36) INTRODUÇÃO. Figura 6 – Incidência do cancro do colo do útero no mundo em 2000 (adaptado de Parkin 2001).. FACTORES DE RISCO A infecção por tipos de HPV de alto risco é presentemente aceite como o principal factor causal no desenvolvimento de cancro do colo do útero, sendo um factor necessário, mas não suficiente, para o desenvolvimento desta neoplasia. Grande parte das infecções provocadas pelo HPV é transiente e apenas uma porção se torna persistente. O risco para o desenvolvimento de lesões intra-epiteliais precursoras de cancro do colo do útero é substancialmente aumentado em mulheres que desenvolvem infecções persistentes com tipos de HPV oncogénicos (Bosch. et al. 2002). Outros factores de risco importantes incluem o número de parceiros sexuais, a idade de coitarca, outras infecções sexualmente transmissíveis e o fumo de cigarro. O número de partos tem também sido associado ao desenvolvimento de cancro do colo uterino, sendo que múltiplas gravidezes provocam um efeito traumático e imunossupressor POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 24.

(37) INTRODUÇÃO. cumulativo no colo do útero, podendo facilitar a infecção por HPV. Tem também sido descrita uma associação entre o uso prolongado de contraceptivos orais e risco aumentado para cancro do colo do útero. Relativamente a factores alimentares, a ingestão de frutas e vegetais que contêm carotenóides e vitaminas C, A e E parece reduzir o risco para cancro do colo uterino (Franco et al. 2001; Duarte-Franco e Franco 2004). Factores. genéticos,. como. haplótipos. HLA. específicos. e. polimorfismos em alguns genes envolvidos na regulação do ciclo celular e reparação do DNA têm sido associados ao desenvolvimento desta neoplasia (Hildesheim e Wang 2002a; Jee et al. 2004) (figura 7).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 25.

(38) INTRODUÇÃO. Figura 7 – Modelo etiológico da infecção por HPV e cancro do colo do útero e possível papel de outros co-factores na persistência da infecção e mediação da progressão das lesões (adaptado de Franco et al. 2001).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 26.

(39) INTRODUÇÃO. Cancro da Nasofaringe. O cancro da nasofaringe (NPC) constitui um tipo distinto de cancro da cabeça-pescoço. A classificação segundo a World Health Organization (WHO) distingue três tipos histológicos de NPC, baseada no grau de diferenciação. O carcinoma de células escamosas (SCC) queratinizante, pertence ao tipo I, semelhante a outros cancros da cabeça-pescoço. No tipo II agrupam-se os carcinomas não queratinizantes e no tipo III, mais comum,. os. carcinomas. indiferenciados. (UCNT. –. Undifferentiated. Carcinoma of the Nasopharyngeal Type). O carcinoma indiferenciado possui uma morfologia típica, com um infiltrado linfoplasmocítico proeminente, também denominado de linfoepitelioma (Pazdur 1995). Os diferentes tipos histológicos de NPC são encontrados em regiões endémicas e não endémicas. Em zonas endémicas, o tipo III é responsável por mais de 97% dos casos, enquanto que o SCC queratinizante é mais comum em países Ocidentais (75%) (Marks et al. 1998). O. cancro. da. nasofaringe. é. raro. na. maioria. dos. países,. especialmente na Europa e América do Norte, com incidência anual inferior a 1/100 000 indivíduos. Nestes países o tipo histológico mais comum é o indiferenciado, que está associado ao consumo de fumo de cigarro, com incidência de 0,5-2 em 100 000 indivíduos por ano. No entanto, a incidência de NPC é elevada em várias regiões no sul da China, nomeadamente na região de Cantão perto de Guangzhou, onde a POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 27.

(40) INTRODUÇÃO. incidência é aproximadamente de 30-80/100 000 indivíduos por ano. Outras áreas de elevada incidência incluem a Ilha Formosa, o Vietname e as Filipinas. Nestas áreas, é provável que a dieta desempenhe um papel importante na carcinogénese, dado que a dieta característica destas populações consiste em carne e peixe curados que quando cozinhados podem libertar nitrosaminas voláteis. Os países Arábia Saudita, Caraíbas e populações de Esquimós do Alasca e Gronelândia possuem uma incidência intermédia de NPC (Spano et al. 2003) (figura 8). Esta neoplasia possui uma distribuição diferente entre homens e mulheres, sendo que a taxa homem/mulher é normalmente de dois ou três homens para uma mulher (Spano et al. 2003). A distribuição do NPC de acordo com a idade não é idêntica no Sudeste Asiático e Norte de África. Na Ásia, a maioria dos casos surge na quinta ou sexta década de vida. No Norte de Africa, a distribuição parece ser bimodal, com um pico por volta dos cinquenta anos de idade e outro mais pequeno em indivíduos entre os 10 e 25 anos. Esta forma juvenil da doença é responsável por aproximadamente 20% dos pacientes e possui características clínicas e biológicas distintas (Spano et al. 2003). As taxas de sobrevida aos 5 anos variam de 30 a 60%, dependendo do estádio do tumor, da técnica de radiação utilizada e da percentagem de pacientes com linfoepitelioma.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 28.

(41) INTRODUÇÃO. Figura 8 – Incidência do cancro da nasofaringe no mundo em 2000 (adaptado de Parkin 2001).. FACTORES DE RISCO. Os. factores. etiológicos. que. parecem. ser. importantes. no. desenvolvimento do carcinoma da nasofaringe incluem susceptibilidade genética e factores ambientais, nomeadamente a dieta e infecção por Epstein-Barr vírus. A dieta é um factor de extrema relevância no desenvolvimento de NPC. Como foi referido anteriormente, a ingestão de peixe curado e outros alimentos preservados, tradicionais do sul da China, contêm nitrosaminas voláteis que são factores associados ao desenvolvimento de cancro da nasofaringe (Lo e Huang 2004). A infecção por EBV está fortemente associada ao NPC. Pensa-se que o EBV desempenha um papel crítico na transformação das células epiteliais na nasofaringe em cancro invasivo (Lo e Huang 2004). POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 29.

(42) INTRODUÇÃO. Relativamente aos factores genéticos, têm sido observadas perdas de material genético em alguns cromossomas, nomeadamente 3p, 9, 11q, 13q, 14q e 16q e ganho de material genético no cromossoma 12. Tem sido sugerido um papel importante dos haplótipos do HLA com o desenvolvimento de NPC, sendo que alguns antigénios do HLA possuem uma eficiência reduzida na activação da resposta imunológica à infecção por EBV (Hildesheim et al. 2002b). Alguns polimorfismos em genes envolvidos na metabolização de carcinogénios (CYP2E1) e reparação de DNA (XRCC1 e hOGG1) têm sido associados a risco aumentado para o desenvolvimento de NPC (Hildesheim et al. 1997; Nazar-Stewart et al. 1999; Cho et al. 2003). O cancro da nasofaringe envolve a acumulação de diversas alterações genéticas que resultam na modificação de vários mecanismos celulares, como a alteração de vias envolvidas na regulação do ciclo celular, nomeadamente as vias da TP53 e RB (Lo e Huang 2004).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 30.

(43)

(44) OBJECTIVOS. Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do tipo caso-controlo, com os objectivos de:. - Analisar a frequência do polimorfismo A870G no gene da ciclina D1 (CCND1) num grupo de indivíduos sem qualquer patologia, em mulheres com carcinoma do colo do útero e indivíduos com carcinoma da nasofaringe;. - Verificar e avaliar a existência de associações entre a frequência do polimorfismo estudado e susceptibilidade genética para carcinoma do colo do útero e da nasofaringe.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 33.

(45)

(46) MATERIAL E MÉTODOS. POPULAÇÃO. Neste trabalho foi realizado um estudo do tipo caso-controlo em quatrocentos e cinquenta e nove (459) indivíduos. Todas as amostras estudadas foram provenientes de indivíduos da região norte de Portugal.. INDIVÍDUOS CONTROLO. O grupo de indivíduos controlo consistiu em cento e oitenta e sete (187) indivíduos normais sem patologia oncológica conhecida, constituído por cento e três (103) mulheres e oitenta e quatro (84) homens, com uma idade média de 55,0 anos, desvio padrão (dp) de 16,8 e mediana de 55,0 anos. Relativamente ao sub-grupo controlo constituído pelos 84 homens, a média das idades foi de 54,5 anos, desvio padrão de 17,4 e mediana de 56,5 anos. O sub-grupo controlo constituído pelas 103 mulheres possui uma idade média de 46,7 anos, desvio padrão de 12,5 e mediana de 46,0 anos.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 37.

(47) MATERIAL E MÉTODOS. PACIENTES COM CANCRO DO COLO DO ÚTERO. Foram analisadas amostras referentes às primeiras amostras de cento e setenta e oito (178) mulheres com lesões colo do útero diagnosticado no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de Oncologia do Porto e que deram entrada no laboratório de Patologia Molecular entre 1997 e 2003. A idade média de diagnóstico foi de 46,6 anos (dp de 12,7) e a mediana de 46,0 anos. Aquando do diagnóstico foram analisadas as seguintes características clínico-patológicas: tipo e grau de lesão, de acordo com o recente sistema de classificação de Bethesda, tipo histológico do tumor e estádio, de acordo. a. FIGO. –. Federation. Interantionale. de. Gynecologie. et. d’Obstetrique e AJCC – American Joint Comittee on Cancer. Em alguns casos não foi possível a obtenção de informação relativamente ao estádio do tumor. Estes dados estão descritos no quadro II.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 38.

(48) MATERIAL E MÉTODOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 39.

(49) MATERIAL E MÉTODOS. PACIENTES COM CANCRO DA NASOFARINGE. Foram analisadas amostras referentes às primeiras amostras de noventa e quatro (94) indivíduos com cancro da nasofaringe diagnosticado no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de Oncologia do Porto e que deram entrada no laboratório de Patologia Molecular entre 2001 e 2004. A idade média de diagnóstico foi de 47,9 anos (dp de 14,5) e a mediana de 50,0 anos. Foram analisadas as seguintes características clínico-patológicas na altura do diagnóstico: tipo e grau histológico e estádio do tumor, de acordo a AJCC – American Joint. Comittee on Cancer. Não foi possível a obtenção de informação relativamente a estas características em alguns casos. Estes dados estão descritos no quadro III.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 40.

(50) MATERIAL E MÉTODOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 41.

(51) MATERIAL E MÉTODOS. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS. Foram recolhidos aproximadamente 8 ml de sangue periférico dos indivíduos atrás referidos, através de uma técnica padronizada de colheita intravenosa, para tubos contendo uma solução de EDTA. O isolamento de DNA genómico foi efectuado através da técnica mista salting-out-clorofórmio a partir de células nucleadas de sangue periférico (Mullenbach et al. 1989). Adicionou-se uma solução hipotónica (AKE) às amostras, de forma a provocar a lise dos eritrócitos e incubou-se a 4ºC durante 30 minutos. Centrifugou-se a 2000 rpm (rotações por minuto), durante 10 minutos a 4ºC e ressuspendeu-se o sedimento na solução hipotónica. Centrifugou-se novamente e ressuspendeu-se o sedimento em PBS, seguindo-se outra centrifugação a 2000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Após a obtenção do sedimento de células, desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em 4 ml de tampão SE, de modo a provocar a lise das células nucleadas. Adicionou-se SDS (dodecilsulfato de sódio, Gibco BRL 5525UA), promovendo a dissociação do. DNA. de. proteínas.. Adicionou-se. posteriormente. proteinase. K. (Boehringer Mannheim 745723), para uma concentração final de 200 µg/ml e incubou-se a 55ºC durante 12 horas para degradação proteica. Adicionou-se 1 ml de NaCl 6 M previamente aquecido (concentração final de 1,5 M), de forma a precipitar as proteínas (salting-out). A separação das proteínas foi realizada através da adição de igual volume POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 42.

(52) MATERIAL E MÉTODOS. de clorofórmio (Merck 1124451000) e agitação suave durante 30 a 60 minutos. De seguida, centrifugou-se a 2500 rpm, durante 10 minutos a 4ºC com o objectivo de separar a fase aquosa que contém o DNA, da fase orgânica, que contém as proteínas degradadas. Recolheu-se a fase aquosa e adicionou-se igual volume de isopropanol (Panreac cod131090), para precipitação do DNA. O DNA foi posteriormente lavado com etanol (Merck 1009831000) a 70% (p/v). Após evaporação do etanol, ressuspendeu-se o sedimento em água bidestilada. Armazenaram-se as amostras a 4ºC ou -20ºC, consoante o tempo de armazenamento previsto.. AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR PCR. A região do gene CCND1 pretendida foi amplificada através da técnica de Polimerase Chain Reaction (PCR), de forma a obter um fragmento de 167 pares de base (pb) (Betticher et al. 1995). A reacção foi efectuada num termociclador programável Biometra T-Gradient, num volume final de 50 µl, consistindo em aproximadamente 0,2 µg de DNA genómico, 1 U de Taq DNA polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e respectivo tampão de reacção 1×, 1,5 mM de MgCl2 (MBI Fermentas), 0,2 mM de desoxinucleosídeos trifosfato (dNTP) (MBI Fermentas, #R0192), e 30 ρmol de primers específicos para a região do gene pretendida (F: 5’ GTG AAG TTC ATT TCC AAT CCG C 3’ e R: 5’ GGG ACA TCA CCC TCA CCC POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 43.

(53) MATERIAL E MÉTODOS. TCA CTT AC 3’). As condições da reacção incluíram um passo de prédesnaturação a 95ºC durante 10 minutos para activar a enzima, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC durante 1 minuto, annealing a 55ºC durante 1 minuto e extensão a 72ºC durante 1 minuto, com um passo de extensão final durante 2 minutos a 72ºC.. IDENTIFICAÇÃO DO FRAGMENTO DO PRODUTO DE PCR. A. identificação. do. fragmento. de. DNA. foi. efectuada. por. electroforese em géis de agarose a 1.5% (p/v), corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz ultravioleta, num equipamento Image Master. VDS (Pharmacia Biotech).. ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1 POR RFLP. O. polimorfismo. estudado. foi. analisado. através. da. técnica. Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP). Cerca de 15 µl de produtos de PCR foram submetidos a digestão enzimática com 1U da enzima de restrição ScrF1 (Fermentas #ER1422) e respectivo tampão de reacção durante 4 horas a 37ºC.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 44.

(54) MATERIAL E MÉTODOS. IDENTIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS OBTIDOS POR RFLP. Os fragmentos obtidos por RFLP foram submetidos a electroforese em géis de agarose a 3% (p/v), corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz ultravioleta. O produto de PCR de 167 pb é cortado pela enzima, se o alelo G estiver presente, originando dois fragmentos de 145 e 22 pb.. ANÁLISE ESTATÍSTICA. A análise estatística dos resultados foi efectuada com auxílio do software estatístico SPSS (Versão 11,5, SPSS Inc., 2002) Epi Info (Versão 3,3, 2004). A análise do qui-quadrado foi utilizada para comparar variáveis categóricas, com um nível de significância de 5%. O valor de p foi obtido pelo teste de χ2 e considerado estatisticamente significativo quando inferior a 0,05. O valor Odds Ratio (OR) e o seu Intervalo de Confiança de 95% (95% CI) foram calculados como uma medida da associação entre os alelos e genótipos do gene CCND1 e o risco para cancro. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado através de um teste goodness of fit de Pearson, de forma a comparar as frequências observadas e esperadas. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 45.

(55) MATERIAL E MÉTODOS. Foi calculada a Proporção Atribuível (PA), fracção de doença atribuível a um dado factor de risco, através da fórmula: PA = PRF × 11/OR; PRF é a percentagem do factor de risco nos casos e OR é o Odds. Ratio.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 46.

(56)

(57) RESULTADOS. AMPLIFICAÇÃO DO DNA. A região do gene CCND1 pretendida foi amplificada por PCR, de forma a obter um fragmento de 167 pares de base (pb). Os produtos de PCR foram submetidos a electroforese em géis de agarose a 1,5 % (p/v), corados com brometo de etídeo, utilizando um marcador molecular de peso conhecido (marcador de 100 pb), de forma a verificar a amplificação do fragmento de DNA pretendido de 167 pb (figura 9).. Figura 9 – Análise da amplificação dos produtos de PCR em gel de agarose a 1,5 %, exemplificando o fragmento de 167 pb, correspondente à região de CCND1 amplificada (M – marcador molecular de 100 pb).. ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1. A técnica RFLP permitiu a visualização dos genótipos possíveis do polimorfismo A870G no gene CCND1. Após digestão enzimática, a enzima de restrição ScrF1 origina dois fragmentos de DNA quando o alelo G está. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 49.

(58) RESULTADOS. presente (145 e 22 pb) e apenas um, com peso de 167 pb, no caso de presença do alelo A. Através da visualização dos géis de agarose a 3% (figura 10), podemos observar três padrões de fragmentos possíveis: um único fragmento de 167 pb, correspondente ao genótipo homozigótico AA; um fragmento de 145 pb e outro de 167 pb, correspondente ao genótipo heterozigótico AG; ou um único fragmento de 145 pb, no caso de genótipo homozigótico GG. A banda de 22 pb não é visível nos géis de agarose, visto que possui um peso molecular muito baixo.. Figura 10 – Análise do polimorfismo A870G no gene CCND1 por RFLP em gel de agarose a 3%, exemplificando os três padrões de RFLP obtidos. M – marcador molecular de 100 pb; 1,3 e 7 – heterozigóticos AG; 2,4 e 5 – homozigóticos GG; 6 e 8 – homozigóticos AA.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 50.

(59) RESULTADOS. FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO A870G CCND1. INDIVÍDUOS CONTROLO. As frequências genotípicas do polimorfismo A870G no gene CCND1 nos indivíduos controlo estão descritas no quadro IV. O grupo de indivíduos controlo total, constituído por 187 indivíduos, dos quais 103 mulheres e 84 homens, possuiu frequências genotípicas de 28,9%, 56,1% e 15,0% relativamente aos genótipos AA, AG e GG, respectivamente. Relativamente ao modelo recessivo, as frequências obtidas foram de 85,0% para os genótipos AA/AG e de 15,0% para o genótipo homozigótico GG. O sub-grupo controlo constituído pelas 103 mulheres possuiu uma distribuição genotípica constituída por 37,9% relativamente ao genótipo AA, 53,4% relativamente ao genótipo AG e 8,7% relativamente ao genótipo GG. No modelo recessivo, a frequência dos genótipos AA/AG foi de 91,3% e 8,7% para o genótipo GG. Relativamente ao sub-grupo controlo constituído pelos 84 homens, as. frequências. dos. genótipos. AA,. AG. e. GG. observadas. foram. respectivamente 17,9%, 59,5% e 22,6%. No que respeita ao modelo recessivo, as frequências obtidas foram de 77,4% para os genótipos AA/AG e de 22,6% para o genótipo homozigótico GG.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 51.

(60) RESULTADOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 52.

(61) RESULTADOS. PACIENTES COM LESÕES DO COLO DO ÚTERO. A distribuição dos alelos e genótipos do polimorfismo A870G no gene CCND1 entre o grupo controlo e o grupo de pacientes com lesões do colo do útero (casos), incluindo lesões de alto grau (HSIL) e carcinoma espinocelular do colo do útero (ICC) está descrita no quadro V.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 53.

(62) RESULTADOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 54.

(63) RESULTADOS. A frequência do alelo G foi superior no grupo de pacientes com lesões do colo do útero (46,9%) relativamente ao grupo controlo (35,4%) e esta diferença é estatisticamente significativa (p=0,011). A frequência dos genótipos AA, AG e GG foi de 37,9, 53,4 e 8,7%, respectivamente, no grupo controlo e de 30,8, 44,7 e 24,5%, respectivamente, no grupo dos casos. A distribuição das frequências genotípicas de ambos os grupos está de acordo com o esperado segundo os princípios de Hardy-Weinberg para populações em equilíbrio (P=0,672 no grupo dos casos e P=0,461 no grupo controlo). A análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que mulheres portadoras do genótipo GG possuem um risco cerca de 3,4 vezes superior no desenvolvimento de lesões do colo do útero (OR=3,38; 95% CI 1,55-7,41; p=0,001). A estratificação da análise de acordo com a mediana das idades dos pacientes indicou que o grupo de mulheres com idade superior a 46 anos portadoras do genótipo GG, possui um risco aumentado de cerca de 3 vezes no desenvolvimento de lesões do colo do útero (OR=3,20; 95% CI 1,25-8,16; p=0,017).. No caso dos pacientes com carcinoma do colo do útero, a proporção de casos de cancro do colo uterino atribuível à influência do genótipo GG foi de 17,26%.. Na figura 11 estão representadas as distribuições genotípicas do polimorfismo A870G no gene CCND1 no grupo controlo e grupos de lesões POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 55.

(64) RESULTADOS. do colo uterino, incluindo lesões de alto grau (HSIL) e carcinoma espinocelular do colo do útero (ICC). As frequências genotípicas no grupo controlo, no grupo de pacientes com lesões de alto grau e carcinoma espinocelular do colo do útero e resultados da análise estatística tendo em conta o grau de lesão estão descritas no quadro VI.. 100. GG GG. 90. GG. 80. Percentagem. 70 60 50. GG. AA/AG AA/AG. 40. AA/AG. AA/AG. 30 20 10 0 Controlos. HSIL. ICC. Figura 11 – Representação gráfica da distribuição das frequências do polimorfismo A870G no gene CCND1 nos grupos controlo, pacientes com lesões de alto grau do colo uterino (HSIL) e no grupo de pacientes com carcinoma espinocelular do colo do útero (ICC).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 56.

(65) RESULTADOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 57.

(66) RESULTADOS. Através da análise dos resultados observou-se que mulheres portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67; 95% CI 1,45-9,31; p=0,007) e de 3,24 vezes superior para o desenvolvimento de carcinoma espinocelular do colo do útero (OR=3,24; 95% CI 1,417,46; p=0,006).. VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS. Foi analisado o estádio do tumor com o objectivo de avaliar a influência do polimorfismo A870G no na agressividade e progressão tumoral. Foi efectuada uma re-codificação do estádio, de forma a avaliar diferenciadamente os estádios menos agressivos (I, IIa) e os estádios mais agressivos com invasão e envolvimento dos paramétrios (IIb, III e IV). Na figura 12 está representada a distribuição dos genótipos CCND1 nos diferentes estádios dos casos de carcinoma espinocelular do colo uterino.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 58.

(67) RESULTADOS. 100 90 80. Percentagem. 70. GG. GG. 60. GG. 50. AA/AG. 40 30 20. AA/AG. AA/AG. 10 0. <II b. ≥ II b. Figura 12 – Representação gráfica da distribuição das frequências do polimorfismo A870G no gene CCND1 nos diferentes estádios tumorais.. No quadro VII estão descritos os resultados da análise estatística referente às frequências dos genótipos CCND1 nos diferentes estádios. Não. se. verificaram. diferenças. estatisticamente. significativas. frequências genotípicas nestes dois grupos de casos (p=0,49).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 59. nas.

(68) RESULTADOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 60.

(69) RESULTADOS. PACIENTES COM CANCRO DA NASOFARINGE. A distribuição dos alelos e genótipos do polimorfismo A870G no gene CCND1 entre o grupo controlo e o grupo de pacientes com cancro da nasofaringe está descrita no quadro VIII. No grupo de pacientes com carcinoma da nasofaringe, as frequências de ambos os alelos, A e G, foi de 50,0%. A frequência dos genótipos AA, AG e GG foi de 28,9, 56,1 e 15,0%, respectivamente no grupo controlo e 27,7, 44,6 e 27,7%, respectivamente no grupo dos pacientes com cancro da nasofaringe. A percentagem de indivíduos portadores do genótipo GG foi superior no grupo dos pacientes, relativamente ao grupo controlo (figura 13).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 61.

(70) RESULTADOS. 100 90. GG. GG. Percentagem. 80 70 60 GG. 50 40. AA/AG. AA/AG. AA/AG. 30 20 10 0 NPC. Controlos. Figura 13 - Representação gráfica da distribuição das frequências do polimorfismo A870G no gene CCND1 nos grupos controlo e pacientes com cancro da nasofaringe.. A distribuição das frequências genotípicas de ambos os grupos está de acordo com o esperado segundo os princípios de Hardy-Weinberg para populações em equilíbrio (P=0,804 no grupo dos casos e P=0,357 no grupo controlo). A análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que indivíduos portadores do genótipo GG possuem um risco acrescido no desenvolvimento de cancro da nasofaringe (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98;. p=0,016).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 62.

(71) RESULTADOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 63.

(72) RESULTADOS. No quadro IX estão descritas as frequências genotípicas no grupo controlo e no grupo de pacientes com carcinoma indiferenciado da nasofaringe (UCNT). A análise estatística dos resultados tendo em conta este. tipo. histológico. demonstra. um. risco. ainda. superior. no. desenvolvimento de UCNT em indivíduos portadores do genótipo GG (OR=2,32; 95% CI 1,20-4,17; p=0,018). A proporção de casos de cancro da nasofaringe atribuível à influência do genótipo GG foi de 14,94%.. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 64.

(73) RESULTADOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 65.

(74) RESULTADOS. VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS. O grupo de pacientes com cancro da nasofaringe foi estratificado de acordo com o estádio do tumor e presença/ausência de metástases ganglionares, com o intuito de analisar uma possível influência do polimorfismo A870G na agressividade tumoral. Na figura 14 estão representadas as distribuições dos genótipos. CCND1 nas diferentes variáveis clínico-patológicas analisadas no grupo de pacientes com cancro da nasofaringe. Novamente, foi efectuada uma recodificação do estádio do tumor, com o objectivo de comparar os estádios menos agressivos (I, II e III) e o estádio de maior agressividade (IV).. 100. 100. GG. GG. 90. 80. 80. 70. 70. 60. GG. 50 40. AA/AG. AA/AG. AA/AG. 30. Percentagem. Percentagem. 90. 60. GG. 50 40. AA/AG. AA/AG. Não. Sim. AA/AG. 30. 20. 20. 10. 10. 0. GG. GG. 0. I/II/III. IV. A. B. Figura 14 – Representação gráfica da distribuição das frequências do polimorfismo A870G no gene CCND1 nos diferentes estádios tumorais (A) e referente à presença/ausência de metastização ganglionar (B).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 66.

(75) RESULTADOS. No quadro X apresentam-se os resultados da análise estatística referente às distribuições dos genótipos CCND1 nos diferentes estádios e referentes à metastização ganglionar. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas nas frequências genotípicas dos sub-grupos definidos tendo em conta as variáveis clínico-patológicas analisadas (para a. variável. estádio. do. tumor,. p=0,795 e presença/ausência de. metastização ganglionar, p=0,788).. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 67.

(76) RESULTADOS. POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 68.

(77)

(78) DISCUSSÃO. Nos últimos anos a investigação oncológica tem demonstrado que o cancro é uma doença que envolve alterações dinâmicas no genoma. Alterações no controlo de mecanismos e vias chave da regulação da proliferação celular são eventos necessários para o estabelecimento de um tumor. O gene CCND1 é um proto-oncogene envolvido na regulação do ciclo celular e alterações neste gene têm sido descritas em vários tumores. O polimorfismo A870G no gene CCND1 tem sido analisado em alguns tipos de neoplasias, com resultados controversos. Os objectivos deste estudo consistiram na análise da frequência do polimorfismo no codão 870 no gene CCND1 em indivíduos sem qualquer patologia, em mulheres com lesões do colo uterino e indivíduos com cancro da nasofaringe e avaliar a existência de associações entre a frequência do polimorfismo estudado e a susceptibilidade para cancro do colo do útero e cancro da nasofaringe.. SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DO COLO DO ÚTERO. O cancro do colo do útero permanece um problema de saúde pública mundial, especialmente em países em vias de desenvolvimento. A infecção por estirpes de HPV de alto risco constitui o principal factor etiológico associado à carcinogénese do cancro do colo do uterino. No entanto, apenas uma percentagem das mulheres infectadas desenvolve POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 71.

(79) DISCUSSÃO. esta neoplasia. Pensa-se que factores genéticos individuais, em associação com a infecção, sejam responsáveis por uma maior susceptibilidade de determinadas mulheres para o desenvolvimento de cancro do colo uterino (Bosch et al. 2002). As oncoproteínas E6 e E7 do HPV são importantes na imortalização celular e alteram pontos de controlo do ciclo celular. A oncoproteína E7 possui a capacidade de ligação à proteína retinoblastoma (RB) tornando-a funcionalmente inactiva. Quando as células se aproximam da fase S do ciclo celular, a RB é fosforilada, originando a libertação dos factores de transcrição E2F e activando a expressão dos genes necessários à progressão através da fase S do ciclo celular. A oncoproteína E7 do HPV ultrapassa este controlo e liga-se directamente à RB, originando a libertação não fisiológica dos factores E2F. A acumulação de alterações genéticas como resultado de alterações no controlo de checkpoints do ciclo celular pode ser um mecanismo importante no processo de imortalização celular por estirpes de HPV de alto risco (Koromilas et al. 2001; Tindle 2002; Scheffner e Whitaker 2003). O gene CCND1 codifica a proteína ciclina D1, que é expressa em resposta a sinais mitogénicos e promove a transição através do ponto de controlo G1/S do ciclo celular. Southern e Herrington (Southern e Herrington 1998) descreveram a ausência de expressão de CCND1 na maioria das lesões de baixo grau do colo uterino infectadas por estirpes de HPV de alto risco e sobre-expressão de CCND1 na maior parte das lesões infectadas com estirpes de HPV de baixo risco. Estes resultados são POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 72.

(80) DISCUSSÃO. concordantes com as observações in vitro de que a sobre-expressão de CCND1 não é necessária à progressão através da fase G1 em linhas celulares de queratinócitos humanos que expressam as oncoproteínas E6 e E7 das estirpes de HPV de alto risco. A ligação da proteína E7 à RB faz com que a célula não necessite de CCND1 e assegura a libertação dos factores de transcrição E2F. Consequentemente, as células progridem para a fase S do ciclo celular e é induzida a expressão dos genes necessários à síntese celular e viral (Lukas et al. 1994). A proteína E7 do HPV 16 possui homologia com os locais de ligação à RB da CCND1, induzindo consequentemente a libertação dos factores de transcrição E2F (Cho et al. 2002). As ciclinas D ligam-se ao domínio hipofosforilado da RB através de sequências LXCXE, que são partilhadas com vários vírus de DNA associados a tumores (Dowdy et al. 1993). Um artigo publicado recentemente (Bae et al. 2001) indica que a expressão do RNAm e da proteína CCND1 é baixa em células malignas do colo uterino e sugere que a expressão da proteína é regulada a nível da transcrição.. Por. outro. lado,. a. expressão. de. CCND1. tem. sido. correlacionada com os genótipos do polimorfismo A870G no gene, sugerindo que o genótipo GG está associado a uma baixa expressão de CCND1 em carcinomas de células escamosas (Holley et al. 2001). Se a disponibilidade de CCND1 na célula é reduzida, é possível que os níveis reduzidos da proteína originem uma menor interacção com a RB de forma quantitativa. Dado que a proteína E7 do HPV possui homologia com os locais de ligação da CCND1 à RB, isto pode facilitar a interacção da POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS. 73.

Imagem

Figura 1 – Alterações necessárias adquiridas pelas células malignas (adaptado  de Hanahan e Weinberg 2000)
Figura 2 – Ilustração esquemática do papel das ciclinas e cinases dependentes  de ciclinas (CDKs) na regulação do ciclo celular (adaptado de Kumar  et al
Figura 4 – Mecanismos de activação de  CCND1  em tumores humanos (adaptado  de Bates e Peters 1995)
Figura 5 –  Splicing  normal e alternativo do gene  CCND1  (adaptado de Fu  et al.
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