UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E ANTIPROLIFERATIVA DA ESPÉCIE

Luehea candicans MART et ZUCC. (TILIACEAE)

Dissertação apresentada por Dioni

Antunes da Silva ao Programa de

Pós-Graduação em Química do Departamento de Química do Centro de Ciências Exatas da Universidade Estadual de Maringá, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química.

“Quanto a você, porém, permaneça nas coisas que aprendeu e das quais tem convicção, pois você sabe de quem aprendeu. Porque desde criança você conhece as Sagradas letras, que são capazes de torná-lo sábio para salvação

Agradecimentos

- À Professora Doutora Cleuza Conceição da Silva pela orientação, paciência e dedicação.

- À Professora Doutora Maria Conceição de Souza, Departamento de Biologia, pela coleta e identificação da planta.

- Aos Professores Doutores Celso Vataru Nakamura e Benedito Prado Dias Filho, Departamento de Análises Clínicas, pela realização dos ensaios de atividade antibacteriano e antifúngico.

- Ao Doutor João Ernesto de Carvalho, Instituto CPQBA (UNICAMP), pela realização dos ensaios de atividade antiproliferativa.

- Aos professores do curso de mestrado em Química Aplicada pela formação.

- À professora Doutora Silvana Maria de Oliveira Santin pela orientação na realização do estágio docência.

- Aos colegas da Universidade Estadual de Maringá, pelos inúmeros serviços prestados, em particular ao Cláudio, Ana e Claudemir.

- À Ivânia pela valiosa contribuição e também pela obtenção dos espectros.

- Aos acadêmicos e amigos Vanessa, Anelise, Júlio, Anderson, Conceição, Fábio, Isis e Lílian.

- A todos os professores, funcionários e amigos pela convivência durante este período.

- Ao CNPq, pelo suporte financeiro e à CAPES pela bolsa concedida para realização deste trabalho.

- Finalmente, ao Sivaldo pela compreensão, paciência e presença nos momentos difíceis.

SUMÁRIO 1 – Introdução e objetivo 1 1.1 – Introdução 1 1.2 – Objetivos 4 2 – Revisão Bibliográfica 5 1.3 – Família Tiliaceae 5 1.4 – Gênero Luehea 11 3 – Parte Experimental 13 3.1 – Matérias e métodos 13

3.2 – Estudo químico de Luehea candicans 14 3.2.1 – Coleta e secagem do material botânico 14 3.2.2 - Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de

Luehea candicans 14

3.2.2.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos 14 3.2.2.2 – Tratamento da fração LCG-4 (fração clorofórmica) 15 3.2.2.3 - Tratamento da fração LCG-5 (fração CHCl3/MeOH 25%) 17

3.2.2.4 – Tratamento da fração LCG-6 (fração CHCl3/MeOH 50%) 18

3.2.2.5 – Tratamento da fração LCG-7 (fração CHCl3/MeOH 75%) 19

3.2.3 - Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de

Luehea candicans 20

3.2.3.1 - Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas 20 3.2.3.2 - Tratamento da fração LCF-2 (fração clorofórmica) 21 3.2.3.3 - Tratamento da fração LCF-3 (fração acetato de etila) 23 3.2.3.4 - Tratamento da fração LCF-4 (fração metanólica) 24

4 – Resultados e Discussão 29

4.1 – Método de extração e isolamento dos constituintes

químicos de L. candicans 29

4.2 – Determinação estrutural dos compostos isolados 31

4.2.1 – Substância LC-1 31

4.2.3 – Substância LC-3 49

4.2.4 – Substância LC-4 58

4.2.5 – Substância LC-5 63

4.2.6 – Substância LC-6 69

4.2.7 – Substância LC-7 80

4.3 – Dados espectroscópicos das substâncias isoladas 86 4.3.1 - Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol 86

4.3.2 - Substância LC-2 : Mistura dos compostos: LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol, LC-2(II)24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol, LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol 87 4.3.3 – Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene 88 4.3.4 – Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol 89 4.3.5 – Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H- benzopiran-3,5,7-triol 90 4.3.6 – Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O- bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo) 91 4.3.7 – Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi- 2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona 91

5 – Estudo da atividade biológica 94 5.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e do extrato bruto das folhas 94 5.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos e substâncias isoladas 94 5.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa 95

5.3.1 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto das folhas e frações Hexano, CHCl3, AcOEt e MeOH 96 5.3.2 – Avaliação da atividade antiproliferativa do extrato bruto dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH (50%) e MeOH 99

6 – Conclusões 103

INDICE DE ESQUEMAS

ESQUEMA 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o isolamento de seus principais constituintes químicos

15

ESQUEMA 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o isolamento de seus principais constituintes químicos

21

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1: Luehea candicans – árvore 3

FIGURA 2: Luehea candicans – flores 3

FIGURA 3: Espectro no IV de LC-1 31

FIGURA 4: Espectro de massas (70 eV) de LC-1 32 FIGURA 5: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-1 35

FIGURA 6: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-1 37

FIGURA 7: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-1

39

FIGURA 8: Mapa de contornos HETCOR (13C x 1H, CDCl3) de LC-1 40

FIGURA 9: Cromatograma da mistura LC-2 42

FIGURA 10: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(I) 42 FIGURA 11: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(II) 43 FIGURA 12: Espectro de massas (70 eV) de LC-2(III) 43 FIGURA 13: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-2 44

FIGURA 14: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-2

45

FIGURA 15: Espectro no IV de LC-3 49

FIGURA 16: Espectro de massas (70 eV) de LC-3 50 FIGURA 17: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-3 52

FIGURA 18: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, CDCl3) de LC-3 53

FIGURA 19: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-3

56

FIGURA 20: Mapa de contornos HETCOR (13C x 1H, CDCl3) de LC-3 57

FIGURA 21: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) de LC-4 59

FIGURA 22: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CDCl3) de

LC-4

61

FIGURA 23: Espectro no IV de LC-5 63

FIGURA 24: Espectro de massas (70 eV) de LC-5 64 FIGURA 25: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CD3OD) de LC-5 67

FIGURA 26: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, CD3OD) de

LC-5

68

FIGURA 27: Espectro de massas (70 eV) de LC-6 69 FIGURA 28: Espectro de RMN 1H (300 MHz, D2O) de LC-6 71

FIGURA 29: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, D2O) de

LC-6

72

FIGURA 30: Mapa de contornos HMQC (75 MHz, D2O) de LC-6 73

FIGURA 31: Mapa de contornos 1Hx1H COSY (300 MHz, D2O) de LC-6 74

FIGURA 32a: Mapa de contornos NOESY (300 MHz, D2O) de LC-6 75

FIGURA 32b: Mapa de contornos NOESY de LC-6 (expansão) 76 FIGURA 33: Mapa de contornos HMBC (300 MHz, D2O) de LC-6 77

FIGURA 34: Correlações de HMBC de LC-6 78

FIGURA 35: Espectro no IV de LC-7 81

FIGURA 36: Espectro de massas (70 eV) de LC-7 82 FIGURA 37: Espectro de RMN 1H (300 MHz, DMSO) de LC-7 84 FIGURA 38: Espectro de RMN 13C e DEPT 90o e135o (75 MHz, DMSO) de

LC-7

85

FIGURA 39: Doxorrubicina – Controle positivo do teste antiproliferativo 97 FIGURA 40: Teste antiproliferativo do extrato bruto das folhas de L.

candicans

97

FIGURA 41: Teste antiproliferativo da fração hexano (folhas) 98 FIGURA 42: Teste antiproliferativo da fração CHCl3 (folhas) 98

FIGURA 43: Teste antiproliferativo da fração MeOH (folhas) 98 FIGURA 44: Teste antiproliferativo da fração AcOEt (folhas) 99 FIGURA 45: Teste antiproliferativo do extrato bruto dos galhos de L.

candicans

100

FIGURA 46: Teste antiproliferativo da fração hexano (galhos) 101 FIGURA 47: Teste antiproliferativo da fração CHCl3/MeOH (50%) (galhos) 101

FIGURA 48: Teste antiproliferativo da fração CHCl3 (galhos) 102

INDICE DE TABELAS

TABELA 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos 15 TABELA 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4 16 TABELA 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5 17 TABELA 4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6 18 TABELA 5: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7 19 TABELA 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7.9 20 TABELA 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas 21 TABELA 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2 22 TABELA 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6 22 TABELA 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6.3 23 TABELA 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4 24 TABELA 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade

antiproliferativa 28

TABELA 13: Dados de RMN 1H de LC-1 e do lupeol 34 TABELA 14: Correlações observadas nos espectros HETCOR (13C x 1H) e

COSY (1H x 1H) de LC-1 36

TABELA 15: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-1 e do lupeol 38 TABELA 16: Dados de RMN 13_{C/DEPT da mistura LC-2 e da mistura 24α –}

etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24α – etil- colesta- 5, 22- dienol (estigmasterol) e 24ξ – metil- colest- 5 enol

46

TABELA 17: Dados de RMN 1H para os metilas de LC-2(I) e do 24α – metil- colest- 5 enol(campesterol) e 24β – metil- colest- 5 enol(22,23 diidrobrassicasterol)

47

TABELA 18: Dados de RMN 1_{H para os metilas de LC-2(II) e do 24α – etil-}

colest- 5,22- dienol(estigmasterol) e 24β – etil colest 5,22 -dienol(poriferasterol)

47

colest- 5 enol(sitosterol) e 24β – etil- colest- 5 enol(clionasterol)

48

TABELA 20: Dados de RMN 1H de LC-3 e da betulina 51 TABELA 21: Correlações observadas nos espectros HETCOR (13C x 1H) e

COSY (1H x 1H) de LC-3 54

TABELA 22: Dados de RMN 13_{C/DEPT de LC-3 e da betulina}

55 TABELA 23: Dados de RMN 1H de LC-4 e do glicopiranositosterol 60 TABELA 24: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-4 e do glicopiranositosterol 62 TABELA 25: Dados de RMN 1H de LC-5 e da (−)-epicatequina 65 TABELA 26: Dados de RMN 13C / DEPT de LC-5 e da (−)-epicatequina 66 TABELA 27: Correlações observadas nos mapas de contornos (13_{C x} 1_H)

HMQC, (1_{H x} 1_{H) COSY e NOESY da substância LC-6}

78 TABELA 28 Correlações observadas no mapa de contornos HMBC da

substância LC-6 79

TABELA 29: Dados de RMN 1H de LC-6 e da liriodendrina 79 TABELA 30: Dados de RMN 13_{C/DEPT de LC-6 e da liriodendrina}

80 TABELA 31: Dados de RMN 1_{H de LC-7 e da vitexina}

83 TABELA 32: Dados de RMN 13C/DEPT de LC-7 e da vitexina 86 TABELA 33: Atividade antibactriana do extrato bruto das folhas e galhos de

L. candicans 94

TABELA 34: Atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos de L. candicans

95

TABELA 35: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos brutos das folhas e das frações Hexano, CHCl3, AcOEt e

MeOH de L. candicans

96

TABELA 36: Atividade antiproliferativa ( efeito citostático) dos extratos brutos dos galhos e frações Hexano, CHCl3, CHCl3/ MeOH

(50%) e MeOH de L. candicans

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ATCC American Type Culture Collection

CC Cromatografia em coluna

CCD Cromatografia em camada delgada

COSY 1H-1H Correlation Spectroscopy

D Dubleto

Dd Duplo Dubleto

Dl Dubleto Largo

DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer DMSO Dimetilssulfóxido

EM Espectro de massas

EV Elétron Volt

HETCOR Heteronuclear Correlation Spectroscopy HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMQC Heteronuclear Multiple Quantun Coherence

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento, em Hertz

M Multipleto

M.+ Íon molecular

m/e Relação massa/carga

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

Ppm Partes por milhão

Q Quarteto

S Singleto

Sl Singleto largo

T Tripleto

TMS Tetrametilsilano

UFC Unidade Formadora de Colônia

UV Ultravioleta

RESUMO

A espécie Luehea candicans Mart. et Zucc., (Tiliaceae), conhecida popularmente como ‘’mutamba-preta” e “açoita cavalo”, está distribuida nos Estados de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e floresta latifoliada semidecídua da bacia do Paraná. Pouco se conhece a respeito dos constituintes químicos presentes no gênero Luehea, e o único estudo químico descrito na literatura para espécie do gênero, o qual foi realizado anteriormente em nosso laboratório de pesquisa, relata o isolamento de um triterpeno, da classe dos ursenos e outro dos oleanenos, da espécie Luehea divaricata, da qual também foram obtidos uma flavona e um flavonol.

O presente estudo envolveu a extração, isolamento, identificação dos constituintes químicos dos galhos e folhas de L. candicans, e ainda ensaios biológicos para avaliação da atividade antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas.

Do extrato bruto metanólico dos galhos foram isolados dois triterpenos pertencentes à classe dos lupanos, o lup-20(29)-en-3β-ol (lupeol) e o 3β,28-diidróxilup-20(29)-eno (betulina), a mistura dos esteróides 24ξ- etil- colest- 5 enol (sitosterol), 24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol (estigmasterol) e 24ξ- metil- colest- 5 enol, o esteróide glicosilado 3-β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5-enol (3-O-β -D-glicopiranosilsitosterol), o flavan-3-ol, 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran-3,5,7-triol [(-)-epicatequina] e a lignana (+)-siringaresinol di-O-β-D-glicopiranosídeo (liriodendrina).

Do extrato bruto metanólico das folhas foi isolada a flavona C-glicosilada 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona (vitexina).

Os extratos brutos dos galhos e folhas tiveram suas atividades antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa testadas. Nenhum dos extratos apresentou atividade antibacteriana através da metodologia

empregada. O extrato bruto das folhas apresentou atividade antifúngica contra a cepa Candida krusei. O extrato bruto das folhas de L. candicans apresentou atividade antiproliferativa, com efeito citostático de 85% (25μg/mL) e efeito citocida em 25%, na maior concentração utilizada, para células de câncer de rim. As frações hexano, CHCl3 e MeOH

apresentaram efeito citastático em 100%, na maior concentração utilizada, também para células de câncer de rim. O extrato bruto dos galhos apresentou atividade antiproliferativa concentração dependente com efeito citostático e pequena seletividade entre as linhagens estudadas.

A atividade antifúngica dos triterpenos, esteróides e flavonóides isolados foi testada, e nenhuma das substâncias foi ativa através da metodologia empregada.

Palavras-chave: Luehea candicans; triterpenos; flavonóides; lignana; atividade biológica

ABSTRACT

The species Luehea candicans Mart. et Zucc., ( Tiliaceae), popularly known as “mutamba- preta” and “açoita cavalo”, it is found in the states of Minas Gerais, Mato Grosso do Sul and forests of Paraná’s basin. Little is known about the chemical components presented in the genus Luehea, and the only chemical research described in the literature for the species of the genus, which was made in our laboratory of research previously, reports the isolation of a triterpene, of the class of the ursenes and another of the oleanenes, of the species Luehea divaricata, from which was obtained also a flavone and a flavonol.

The following study involved the extraction, isolation, identification of the chemical components of the branches and leaves of the L. candicans, besides biological essays to evaluate the antibacterial, antifungal and antiproliferative activity of the crude extracts, fractions and isolated substances.

From the crude methanolic extract of the branches were isolated two triterpenes belonging to the class of the lupanes , the lup- 20 (29)- en- 3ß -ol (lupeol) and the 3ß, 28- dihydroxylup-20 (29)-ene (betulin), the mixture of the steroid ethylcholest-5-enol ( sitosterol), 24ξ-ethylcholesta-5,22-dienol (stigmasterol) and 24ξ-methylcholest-5-enol, the glucosiled steroid 3-ß-O-glucopyranosyl-24ξ-ethylcholest-5-enol (3-O-ß-D-glucopyranosylsitosterol), the flavan-3-ol, 2-(3,4-dihydroxyphenil)-3,4-dihydro-1-2H-benzopyran-3,5,7- triol [(-)-epicatechin] and the lignan (+)- syringaresinol di-O-ß-D-glucopyranoside (liriodendrin) .

From the crude methanolic extract of the leaves it was isolated the (-glucoside 8- ß-D-Glucopyranosyl-5, flavone 7- dihydroxy-2-(4-hydroxyphenil)-4-H-benzopyran-4-one (vitexin).

The crude extracts of the branches and leaves had their antibacterial, antifungal and antiproliferative activities tested. None of the extracts presented antibacterial activity through the methodology

employed. The crude extract of the leaves presented antifungal activity against Candida Krusei. The crude extract of the leaves of L. candicans

presented antiproliferative activity with inhibition of growth of 85% (25μg/mL) and cellular death in 25%, in the major concentration utilized,

to cells of cancer of kidney. The fractions hexane, CHCl3 and MeOH

presented inhibition of growth in 100%, in the major concentration utilized, also, to the cells of kidney’s cancer.

The crude extract of the branches presented anticancer activity, dependent concentrations with inhibition of growth and small selectivity between the lineages studied.

The antifungal activity of the triterpenes, steroids and isolated flavonoids it was tested, and none of the substances tested presented any activity.

Key words: Luehea candicans; triterpenes; flavonoids; lignan; biological activity

1 – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

1.1 – INTRODUÇÃO

Há cerca de 15 anos o grupo de pesquisa do Nupélia/UEM iniciou o levantamento florístico direcionado às espécies nativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná, região considerada como área de preservação ecológica do Estado. Esta região abriga uma grande diversidade de ambientes, incluindo florestas do tipo estacional semidecídua, submontana e mata ciliar. Existem ainda, várzeas paludícula e aquática em áreas alagadas das lagoas temporárias ou permanentes.

Um dos objetivos deste levantamento é apresentar uma listagem das espécies presentes nesta área e correlacioná-las com sua distribuição na América do Sul, acompanhando principalmente a vegetação que segue o leito do rio Paraná, através de outros estados brasileiros e outros países como Argentina e Paraguai.

Muitas espécies mapeadas nesta região não possuem estudo químico e/ou de atividade biológica descritos na literatura e algumas já estão incluídas entre as ameaçadas de extinção no Estado do Paraná, sendo que dentre estas encontra -se a espécie Luehea candicans (Vazzoler e col.1997).

Este levantamento tem ainda o objetivo de contribuir para a ampliação do conhecimento do potencial químico e farmacológico de tais espécies, bem como dar suporte à classificação botânica das mesmas, com base em estudos qimiotaxonômicos.

Desta forma, considerando que alguns estudos químicos de plantas bioativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná, estão sendo desenvolvidos de forma interdisciplinar entre pesquisadores do NUPÉLIA, Biologia, do grupo de Produtos Naturais (DQI) e Análises Clínicas, optou-se pelo estudo químico de Luehea candicans, o qual se somará ao estudo da espécie L. divaricata, realizado em nosso laboratório de pesquisa, sendo este o primeiro no gênero.

Pertencente à família Tiliaceae, a qual compreende aproximadamente cerca de 35 gêneros e 370 espécies e tem o sul da África e o Brasil como os dois principais centros de dispersão, sendo que no Brasil encontra-se cerca de 13 gêneros e de 55 a 60 espécies (Barroso e col., 1978), a espécie L. candicans (Figuras 1 e 2) conhecida popularmente como ‘’mutamba-preta” e “açoita-cavalo”, ocorre também nos Estados de Minas Gerais e Mato Grosso do Sul (Lorenzi,1998).

Na classificação botânica segundo Cronquist (1988), a espécie Luehea candicans pertence à seguinte posição sistemática:

Divisão: Magnoliophyta Classe: Magnoliopsida Sublcasse: Dilleniidae Ordem: Malvales Família: Tiliaceae

Tribo: Tilieae (segundo Angely – 1965) Gênero: Luehea

Espécie: Luehea candicans

E segundo Lorenzi (1992) seus dados botânicos são: Nome científico: Luehea candicans Mart. et Zucc.

Nomes populares: mutamba-preta, açoita-cavalo.

Características morfológicas: árvore com altura de 8-12 m, com tronco de 30-50 cm de diâmetro. Folhas simples, de coloração prateada.

Ocorrência: São Paulo, Minas Gerais e Mato Grosso do Sul, floresta latifoliada semidecídua da bacia do Paraná.

Utilidade: a madeira é empregada na confecção de cadeiras, cangas de boi, saltos de calçados, ripas, caibros, etc.

Informações ecológicas: planta decídua, heliófita, seletiva higrófita, exclusiva da floresta semidecídua do rio Paraná. Planta rara e de dispersão descontínua.

Fenologia: floresce durante os meses de novembro-dezembro. A maturação dos frutos ocorre durante os meses de julho-agosto.

FIGURA 1 – Luehea candicans : Árvore

1.2 – OBJETIVOS

O estudo de L. candicans visa ampliar o conhecimento químico e biológico do gênero Luehea que iniciou-se com o estudo da espécie L. divaricata. E ainda, o estudo químico e a avaliação da atividade biológica sevirão de auxílio, contribuição e suporte para a confirmação da classificação botânica desta espécie. Desta forma, considerando que tais informações também poderão contribuir para ampliar o conhecimento do potencial químico e farmacológico das espécies nativas presentes na planície de inundação do alto rio Paraná e com isto, assegurar a preservação de espécies com potencial biológico ainda desconhecidos, este trabalho tem por objetivo:

♦ Estudar fitoquimicamente a espécie L. candicans visando isolar e identificar os principais metabólitos secundários presentes nos galhos e folhas.

♦ Avaliar a atividade biológica (antibacteriana, antifúngica e antiproliferativa) dos extratos brutos, frações e substâncias isoladas.

2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – Família Tiliaceae

Na família Tiliaceae poucas espécies, pertencentes a apenas três dos 35 gêneros, foram estudadas quimicamente, sendo que a maioria dos estudos são com espécies do gênero Corchorus, relatando principalmente o isolamento de cardenolídeos glicosilados. Da espécie C. olitorius foram isolados os cardenolídeos glicosilados (1,2,3,4,5,6,7,8)(Nakamura e col., 1998).

a O H O H O H O O H O O O H C H3 C H3 O O H O H O H O H O O H O b C H3 O O H c _{H O} d O O H H O C H3 C H3 O O H O H O H O H O O H O e O H O H O O H O O O R₂ CH₃ OH R₃

(1) R1=a, R2=CHO, R3=OH

(2) R1=c, R2=CHO, R3=OH (3) R1=d, R2=CHO, R3=OH (4) R1=b, R2=CH2OH, R3=H (5) R1=e, R2=CH3, R3=H (6) R1=b, R2=CH3, R3=H (7) R1=a, R2=CH3, R3=H (8) R1=c, R2=CH3, R3=H R₁O

Venkata (1975) isolou quatro cardenolídeos glicosilados (9), (10), (11), (12), da espécie C. trilocularis. (9) R=β-D-boivonosil (10) R=H (11) R=OMe (12) R=α-L-raminosil

Ahmad e colaboradores (1998) isolaram os triterpenos cicloartanos glicosilados (13) e (14), enquanto que Khan e colaboradores (1991) obtiveram os derivados da α-amirina (15), (16) e (17) da espécie C. depressus.

RO

OH

O OH O OH (13) Glc

(15) (16) OH CO2H HO2C HO HO OH CO2H GlcO2C HO HO O OAc O OH (14) Glc

(17)

Os triterpenos glicosilados (18) e (19), juntamente com os triterpenos (20), (21) e (22) foram isolados da espécie C. acutangulus por Mahato e col. (1988).

C O ₂H

H O 2 C

H O H O

Das folhas da espécie C. capsularis foram obtidos os triterpenos (23), (24), (25) e (26) por C. M. Hasan e col. (1984) .

CH

OR

R

O

OR

(23) R1=R2=R3=H

(24) R1=R2=Ac, R3=H

(25) R1=R2=R3=Ac

(26) R1= Glc, R2=R3=H

Do gênero Microcos foram isolados alcalóides piperidínicos, sendo a micropina (27) isolada da espécie M. philippinensis por Aguinaldo (1990) e a piperidina (28) isolada da espécie M. paniculata por Bandara e col. (2000).

N OH CH2OH Me (27) R1O O R3 CH2OR2 H O OH H

No gênero Grewia, Rosler e colaboradores (1978) isolaram o alcalóide 6-hidróxi-1-metil-β-carbolina (29) das raízes de Grewia mollis e Lakshmi e colaboradores (1976) obtiveram uma δ-lactona (30) das flores de Grewia asiatica.

(29) (30) N OMe Me Me (28) O O OH

N

H

N

HO

CH

2.2 – Gênero Luehea

No gênero Luehea, algumas espécies são usadas na medicina popular como diuréticas e antinflamatórias (Alice e col.,1985). Braga (1976), assinalou como adstringentes as cascas de L. speciosa Willd. (sinônimo botânico de L. divaricata), e registrou também a presença das espécies L. candicans Mart. et Zucc. (Luehea uniflora St. Hil.) e L. paniculata Mart., assinalando-as como tendo o mesmo uso da primeira. A atividade antifúngica de L. divaricata foi avaliada por Zacchino e colaboradores (1998), obtendo como resultado a ação moderada do extrato diclorometânico na inibição do crescimento de hifas de fungos dermatófitos.

Sáens e Nassar (1968) constataram a presença, em pequena quantidade, de alcalóides na espécie L. candida (DC) Mart. Flavonóides, taninos, saponinas e triterpenos/esteróides foram detectados em triagem fitoquímica dos extratos etanólicos das folhas e caules de L. divaricata (Alice e col.,1985), cujo estudo químico foi realizado em nosso laboratório de pesquisa. No trabalho citado, foram isolados de L. divaricata o triterpeno inédito ácido 3β-p-hidroxibenzoil tormêntico (ácido 3β-p-hidroxibenzoil, 2α,19α-di-hidroxiurs-12-en-28-óico) (31); uma mistura de triterpenos cujo constituinte majoritário é o ácido 2α, 3β-dihidroxiolean-12-en-28-óico (ácido maslínico), um derivado 2,3 diidroxilado de β-amirina (32) (Tanaka e col., 2003). Além dos triterpenos, foi isolado uma flavona, a vitexina (33) e a (-)-epicatequina (34), um flavonóide pertencente à classe dos flavan-3-ol (Tanaka, 2002). Este foi o primeiro relato de estudo fitoquímico no genêro Luehea.

(31) COOH OH HO H H O O HO

(32) (33) (34) H H HO HO COOH O O OH HO HO OH O HO HO OH O OH HO OH OH OH

3 – PARTE EXPERIMENTAL

3.1 – Materiais e métodos

Os espectros de massas de baixa resolução foram obtidos em um equipamento GC/MS SHIMADZU a 70 eV, modelo QP 2000A, com sonda para sólidos.

Os espectros de absorção na região do IV foram registrados em um espectrofotômetro FTIR-BOMEM MB-100, na região de 400 a 4000 cm-1. Utilizou-se a absorção em 1601 cm-1 _{de um filme de poliestireno como referência.}

Os espectros de RMN de 1H e de 13C foram obtidos em espectrômetro VARIAN, modelo Gemini 2000 BB e Mercury Plus BB (300,6 MHz para 1H e 75,45 MHz para 13C). Os deslocamentos químicos foram obtidos em ppm, tendo como referência interna o TMS (δ = 0,0 ppm). Os solventes deuterados utilizados foram DMSO-d6, CDCl3, CD3OD, Aldrich ou Isotec.

As técnicas unidimensionais de RMN utilizadas na obtenção dos dados experimentais visando a elucidação estrutural das substâncias obtidas foram RMN de 1H, RMN de 13C, DEPT 90o e 135o. Foram também utilizadas em alguns casos, as técnicas bidimensionais COSY 45o, HETCOR, NOESY, HMQC e HMBC.

As cromatografias em coluna foram feitas utilizando sílica gel 60 [(0,063 – 0,200 mm) (70-230 mesh ASTM)] ou [(0,2 - 0,5 mm) (35-70 mesh ASTM)] da Merck ou Fluka e o monitoramento das frações foi realizado através de cromatografia em camada delgada analítica (CCDA).

A espessura da camada de sílica gel (silica gel GF254 - Merck) usada na

confecção das placas de vidro para cromatografia em camada delgada analítica (CCDA) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) foram de 0,25 mm (20x5 cm) e 1,00 mm (20x20 cm).

Os solventes utilizados nas CC, CCDP, CCDA e recristalizações apresentavam grau de pureza P.A. ou foram tratados e destilados quando necessário.

As substâncias foram visualizadas nas placas de CCDA utilizando reveladores como H2SO4/MeOH (1:1), iodo e anisaldeído para terpenos

(4-metóxi-benzaldeído, ácido acético, ácido sulfúrico, / 1,0 : 48,5 : 0,5). As substâncias fluorescentes foram visualizadas sob luz UV nos comprimentos de onda de 254 e 366 nm.

3.2 – Estudo químico de Luehea candicans

3.2.1 – Coleta e secagem do material botânico

A planta foi coletada no entardecer do dia 12 de outubro de 2000, na região de Porto Rico, Estado do Paraná, reserva ecológica do NUPÉLIA (UEM). A coleta e identificação do material botânico foi feito pela Profa Dra Maria Conceição de Souza. Uma excicata da planta em estudo foi depositada no Herbário do Departamento de Biologia da Universidade Estadual de Maringá, sob número 9326. O material foi seco ao ar e pulverizado em moinho, obtendo-se 345,0g das folhas e 432,5g dos galhos.

3.2.2 – Isolamento dos principais constituintes químicos dos galhos de

Luehea candicans

3.2.2.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto dos galhos

O material botânico dos galhos foi submetido ao processo de remaceração exaustiva com metanol (20x 500mL), a temperatura ambiente e concentrado a pressão reduzida em evaporador rotativo (40o) obtendo-se 49,0g de extrato bruto.

Parte do extrato bruto, 20,0 g, foi adsorvido em sílica gel (31,0g) e submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o sistema de eluentes conforme Tabela 1. O procedimento geral do fracionamento dos galhos está representado no Esquema 1.

Tabela 1: Fracionamento preliminar do extrato bruto dos galhos

Fração(%) Volume(mL) Massa(g) Código

Hexano 1500 0,0151 LCG-1 Hex./Clorofórmio 50 700 0,0415 LCG-2 Hex./Clorofórmio 75 700 0,0730 LCG-3 Clorofórmio 1400 0,7020 LCG-4 CHCl3/Metanol 25 700 0,8979 LCG-5 CHCl3/Metanol 50 700 2,7527 LCG-6 CHCl3/Metanol 75 700 7,9094 LCG-7 Metanol 1300 7,1133 LCG-8

Esquema 1: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto dos galhos e para o isolamento de seus principais constituintes químicos EXTRATO BRUTO 20,0g LCG-1 LC-6 4,3mg LC-7.9 LCG-2 LCG-4 LCG-6 LCG-7 LCG-8 LC-5 9mg LC-3 12mg LC-2 12mg LC-1 16mg LCG-5 LC-4 18mg CC sílica gel CC sílica gel CC sílica gel CC sílica gel CC sílica gel PRÉ-FRACIONAMENTO CC SILICA GEL HEXANO HEX./CHCl3 50% CHCl3 CHCl3/MeOH 25% CHCl_50%3/MeOH CHCl3/MeOH 75% MeOH GALHOS (430,0g) ↓ EXTRATO BRUTO ( 49,0g) ↓

3.2.2.2 – Tratamento da fração LCG-4 (Fração clorofórmica)

Parte da fração LCG-4 (620,0 mg) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60(∅= 1,0 cm e msi = 8,6g) empacotada com hexano e eluída com

hexano/ acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 125 frações de 10,0mL cada, reunidas em 14 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 2.

Tabela 2: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-4

Frações reunidas

Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância Isolada 1-5 Hexano/AcOEt 2,5 0,1 LCG-4.1 6 Hexano/ AcOEt 2,5 19,0 LCG-4.2 7 Hexano/ AcOEt 2,5 0,1 LCG-4.3 8-12 Hexano/ AcOEt 5,0 18,1 LCG-4.4 LC-1 (16,0mg) 13-14 Hexano/ AcOEt 5,0 1,0 LCG-4.5 15-16 Hexano/ AcOEt 5,0 29,3 LCG-4.6 LC-2 (12,0mg) 17-20 Hexano/ AcOEt 5,0 2,0 LCG-4.7 21-23 Hexano/ AcOEt 7,0 19,7 LCG-4.8 24-37 Hexano/ AcOEt 10,0 31,0 LCG-4.9 38-40 Hexano/ AcOEt 10,0 10,0 LCG-4.10 41-54 Hexano/ AcOEt 15,0 70,4 LCG-4.11 LC-3 (12,0mg) 55-65 Hexano/ AcOEt 20,0 32,0 LCG-4.12 66-93 Hexano/ AcOEt 50,0 28,0 LCG-4.13 925 Hexano/ AcOEt 75,0 13,0 LCG-4.14

Na fração LCG-4.4 formou-se um sólido branco, o qual foi lavado com hexano para remoção de impurezas. A análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de um triterpeno, o qual foi denominado de LC-1.

A fração LCG-4.6 também apresentou uma única mancha em CCDA e seus dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram tratar-se de mistura de esteróides, denominada de LC-2. Esta fração também foi purificada com hexano.

Da fração LCG-11 as impurezas foram retiradas utilizando-se acetona, isolando-se também um sólido branco solúvel em clorofórmio. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram que esta substância também tratava-se de um triterpeno, a qual foi denominada de LC-3. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por conterem pouca massa.

3.2.2.3 – Tratamento da fração LCG-5 (Fração CHCl3/MeOH 25%)

Parte da fração LCG-5 (700,0mg) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 (∅= 1,5cm e msi = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída

com clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Desta coluna foram coletadas 103 frações de 10,0mL cada, reunidas em 15 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 3.

Tabela 3: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-5

Frações

Reunidas Eluente(%)

Massa(mg) Denominação Substância Isolada 1-2 CHCl3/AcOEt 2,5 0,1 LCG-5.1 3-4 CHCl3/ AcOEt 2,5 19,9 LCG-5.2 5-9 CHCl3/ AcOEt 2,5 61,7 LCG-5.3 10-12 CHCl3/ AcOEt 5,0 23,9 LCG-5.4 13-18 CHCl3/ AcOEt 10,0 96,1 LCG-5.5 19-30 CHCl3/ AcOEt 10,0 37,8 LCG-5.6 31-37 CHCl3/ AcOEt 25,0 12,0 LCG-5.7 38-42 CHCl3/ AcOEt 25,0 85,4 LCG-5.8 LC-4 (10,0mg) 43-54 CHCl3/ AcOEt 50,0 68,7 LCG-5.9 LC-4 (8,0mg) 55-60 CHCl3/ AcOEt 75,0 19,1 LCG-5.10 61-72 AcOEt 89,6 LCG-5.11 73-78 AcOEt 25,5 LCG-5.12 79-91 AcOEt/MeOH 20,0 10,6 LCG-5.13 92-96 MeOH 10,6 LCC-5.14 97-103 MeOH 92,6 LCG-5.15

Nas frações LCG-5.8 e LCG-5.9 formou-se um precipitado branco, cuja a análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados obtidos nos

espectros de RMN dede 1_{H e de} 13_{C demonstraram tratar-se de um esteróide}

(LC-4). As frações LCG-5.5 e LCG-5.15 foram estudadas não tendo sido obtido resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por apreapresentarem-sentarem pouca massa.

3.2.2.4 – Tratamento da fração LCG-6 (Fração CHCl3/MeOH 50%)

Parte da fração LCG-6 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 38,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com

clorofórmio/acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 123 frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 4.

Tabela4: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-6

Frações

reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação

Substância Isolada 1-61 CHCl3/AcOEt 5,0-50,0 25,6 LCG-6.1 62-64 AcOEt 28,9 LCG-6.2 LC-5 (9,0mg) 65-70 AcOEt 42,8 LCG-6.3 71-84 AcOEt /MeOH 10,0 616,3 LCG-6.4 85-87 AcOEt /MeOH 25,0 103,4 LCG-6.5 88-90 AcOEt /MeOH 25,0 249,1 LCG-6.6 91-96 AcOEt /MeOH 25,0 399,5 LCG-6.7 97-100 AcOEt /MeOH 50,0 197,2 LCG-6.8 101-107 AcOEt /MeOH 50,0 116,3 LCG-6.9 108-112 MeOH 193,8 LCG-6.10 113-123 MeOH 42,0 LCG-6.11

Na fração LCG-6.2, formou-se um sólido levemente marrom, solúvel em metanol, o qual foi purificado utilizando-se clorofórmio. A análise por CCDA apresentou uma única mancha. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram que a substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a qual foi denominada de LC-5. A fração LCC-6.4 foi estudada, não tendo sido obtido

resultado satisfatório. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por apreapresentarem-sentarem pouca massa.

3.2.2.5 – Tratamento da fração LCG-7 (Fração CHCl3/MeOH 75%)

Parte da fração LCG-7 (5,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 60,0g) empacotada com acetato de etila e eluída

com acetato de etila/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 95 frações de 10,0mL cada, reunidas em 11 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 5.

Tabela 5: Cromatografia em coluna da fração LCG-7

Frações

reunidas Eluente(%) Massa(g) Denominação Substância isolada

1-6 AcOEt 0,074 LCG-7.1 LC-5 7 AcOEt 0,455 LCG-7.2 8-10 AcOEt 0,227 LCG-7.3 11-27 AcOEt/MeOH 10,0 0,130 LCG-7.4 28-32 AcOEt /MeOH 20,0 0,180 LCG-7.5 LC-5 33-41 AcOEt/MeOH 20,0 0,712 LCG-7.6 42-51 AcOEt/MeOH 20,0-30,0 0,953 LCG-7.7 52-59 AcOEt/MeOH 30,0 0,334 LCG-7.8 60-67 AcOEt/MeOH 30,0-40,0 1,000 LCG-7.9 68-75 AcOEt/MeOH 50,0 0,515 LCG-7.10 76-95 AcOEt/MeOH 75,0 0,199 LCG-7.11

Nas frações LCG-7.1 a LCG-7.5 foi detectado a presença de LC-5. As frações LCG-7.6 a LCG-7.8 foram reunidas por apresentarem flurescência semelhante sob luz ultravioleta, no comprimento de onda λ = 366 nm, e submetidas a uma coluna cromatográfica em silica gel onde nenhum resultado satisfatório foi obtido.

A fração LCG-7.9 (1,0g), por apresentar perfil cromatográfico menos complexo, foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 12,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em

polaridade crescente. Foram coletadas 40 frações de 15,0mL cada, reunidas em 6 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 6.

Tabela 6: Dados da cromatografia em coluna da fração LCG-7.9

Frações

reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação

Substância Isolada 1-6 CHCl3/MeOH 5,0 18,3 LCG-7.9.1 7-14 CHCl3/MeOH 7,0-10,0 1,7 LCG-7.9.2 15-18 CHCl3/MeOH 15,0 4,3 LCG-7.9.3 LC-6 (4,3mg) 19-20 CHCl3/MeOH 20,0 2,9 LCG-7.9.4 21-30 CHCl3/MeOH 25,0-50,0 177,0 LCG-7.9.5 31-40 CHCl3/MeOH 75,0 728,0 LCG-7.9.6

Na fração LCG-7.9.3 precipitou um sólido branco(4,0mg) solúvel em H2O,

denominado LC-6. As demais frações não foram estudadas por apresentarem-se como misturas complexas ou por apresentarem pouca massa.

As frações LCG-1, LCG-2 e LCG-3 não foram estudadas por apresentarem perfil muito complexo e massa insuficiente para dar continuidade aos trabalhos.

A fração LCG-8 não foi estudada por apresentar muita quantidade de taninos, visualizados através de cromatografia em camada delgada (MeOH/ H2O –

50%) que dificultaram o trabalho.

3.2.3 – Isolamento dos principais constituintes químicos das folhas de

Luehea candicans

3.2.3.1 – Preparação e fracionamento do extrato bruto das folhas

As folhas foram submetidas ao processo de remaceração exaustiva com metanol (26x500mL) à temperatura ambiente, concentrado à pressão reduzida em evaporador rotativo (40o) obtendo-se 61,0g de extrato bruto.

Parte do extrato bruto obtido, 40,0 g, foi adsorvido em silica gel (40,0g) e submetido a uma separação preliminar em coluna cromatográfica utilizando o sistema de eluentes conforme Tabela 7. O procedimento geral do fracionamento das folhas está representado no Esquema 2.

Tabela 7: Dados do fracionamento do extrato bruto das folhas

Fração Volume(L) Massa(g) Código Hexânica 2,2 0,286 LCF-1

Clorofórmica 2,0 2,789 LCF-2

Acetato de etila 2,0 1,597 LCF-3

Metanólica 2,5 23,855 LCF-4

Esquema 2: Procedimento usado para a separação preliminar em coluna cromatográfica do extrato bruto das folhas e para o isolamento de seus principais constituintes químicos EXTRATO BRUTO 40,0g LCF-1 LC-1 LC-7 8,0 mg LCF-3p

CC sílica gel CC sílica gel

PRÉ-FRACIONAMENTO CC SILICA GEL HEXANO CHCl3 MeOH FOLHAS (345,0g) ↓ EXTRATO BRUTO ( 60,0g) ↓ LCF-2 LCF-3 LCF-4 AcOEt LC-7 4,0 mg LC-4 11,0 mg Ppt CHCl3 / H2O (sucessivas lavagens)

3.2.3.2 – Tratamento da fração LCF-2 (Fração clorofórmica)

Parte da fração LCF-2 (2,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de sílica gel 60 (∅= 2,0cm e msi = 20,0g) empacotada com hexano e eluída com

hexano/acetato de etila em polaridade crescente. Foram coletadas 64 frações de 15,0mL cada, reunidas em 8 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 8.

Tabela 8: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2

Frações reunidas

Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância isolada 1-14 Hexano/AcOEt 2,5-7,0 173,6 LCF-2.1 15-22 Hexano AcOEt 10,0 114,8 LCF-2.2 LC-1 23-27 Hexano/ AcOEt 10,0 160,0 LCF-2.3 28-34 Hexano/ AcOEt 15,0 106,3 LCF-2.4 LC-2 35-44 Hexano/ AcOEt 20,0-25,0 220,8 LCF-2.5 45-53 Hexano/ AcOEt 50,0-75,0 215,4 LCF-2.6 54-55 AcOEt 49,1 LCF-2.7 56-64 AcOEt 42,7 LCF-2.8

Na fração LCF-2.2 foi detectada a presença de LC-1 e na fração LCF-2.4 LC-2. As frações LCF-2.6 e LCF-2.7 foram reunidas por apresentarem semelhanças. Esta fração foi denominada LCF-2.6 (264,0mg), e foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 10,0g) empacotada

com clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 55 frações de 15,0mL cada, reunidas em 5 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 9.

Tabela 9: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6

Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação

1-8 CHCl3 88,0 LCF-2.6.1

9-17 CHCl3/MeOH 2,5 160,0 LCF-2.6.2

18-24 CHCl3/MeOH 2,5-5,0 4,0 LCF-2.6.3

25-48 CHCl3/MeOH 7,0-40,0 2,3 LCF-2.6.4

49-55 CHCl3/MeOH 40,0-80,0 1,0 LCF-2.6.5

A fração LCF-2.6.2 (160,0mg), por apresentar fluorescência sob luz ultravioleta no comprimento de onda λ = 254 nm, foi submetida a uma coluna cromatográfica em silica gel 60 (∅= 1,0cm e msi = 8,0g) empacotada com

clorofórmio e eluída com clorofórmio/metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 43 frações de 15,0mL cada, reunidas em 4 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 10.

Tabela 10: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-2.6.3

Frações reunidas Eluente(%) Massa(mg) Denominação

1-11 CHCl3 14,0 LCF-2.6.3 a

12-18 CHCl3/MeOH 1,0 76,0 LCF-2.6.3 b

19-38 CHCl3/MeOH 1,5-2,5 52,6 LCF-2.6.3 c

38-43 CHCl3/MeOH 5,0 3,0 LCF-2.6.3 d

A fração LCF-2.6.3b (76,0mg), por apresentar perfil cromatográfico menos complexo foi submetida a uma cromatografia em camada delgada preparativa(CCDP). Foram retiradas quatro faixas sendo que apenas uma apresentou quantidade de massa suficiente para análises espectroscópicas, sendo denominada LCF-2.6b (4,0mg).

3.2.3.3 – Tratamento da fração LCF-3 (Fração acetato de etila)

A fração LCF-3 foi evaporada à secura e ao ser solubilizada em metanol ,para removê-la do balão, houve a formação de um precipitado de coloração

amarela. A análise por CCDA apresentou duas manchas com rfs diferentes, uma

de cor amarela e outra de cor violeta sob luz visível. As substâncias foram separadas utilizando-se clorofórmio e água. Os dados de RMN de 1H e de 13C demonstraram que uma substância isolada pertencia à classe dos flavonóides, a qual foi denominada de LC-7 (8,0 mg) e a outra substância era o esteróide já isolado (LC-4) (11,0 mg). Optou-se por não fazer coluna cromatográfica da fração LCF-3 por apresentar perfil intermediário entre a fração clorofórmica(LCF-2) e a fração metanólica(LCF-4).

3.2.3.4 – Tratamento da fração LCF-4 (Fração metanólica)

Parte da fração LCF-4 (4,0g) foi submetida à cromatografia em coluna de silica gel 60 (∅= 2,5cm e msi = 50,0g) empacotada com clorofórmio e eluída com

clorofórmio/acetato de etila/ metanol em polaridade crescente. Foram coletadas 72 frações de 15,0mL cada, reunidas em 7 novas frações de acordo com as semelhanças observadas por CCDA, conforme Tabela 11.

Tabela 11: Dados da cromatografia em coluna da fração LCF-4

Frações reunidas

Eluente(%) Massa(mg) Denominação Substância isolada 1-33 CHCl3/ AcOEt 10,0-50,0 42,5 LCF-4.1 34-40 AcOEt /MeOH 5,0-10,0 104,8 LCF-4.2 41-50 AcOEt /MeOH 20,0 84,6 LCF-4.3 LC-7 51-52 AcOEt /MeOH 30,0 45,0 LCF-4.4 53-57 AcOEt /MeOH 50,0 87,2 LCF-4.5 58-64 AcOEt /MeOH 50,0-75,0 104,8 LCF-4.6 65-72 MeOH 178,0 LCF-4.7

Na fração LCF-4.2 foi detectado através de CCDA, uma mancha de coloração amarela sob luz visível. Esta fração foi purificada com acetato de etila

não tendo sido obtido quantidade de massa suficiente para as análises espectroscópicas. Na fração LCF-4.3 foi isolada mais quantidade da substância LC-7 (4,0 mg). As demais frações não foram estudadas por apresentarem um perfil cromatográfico muito complexo.

A fração LCF-1 não foi estudada por apresentar pouca massa e perfil cromatográfico muito complexo.

3.3 – Estudo de atividade biológica

Os testes de atividade antifúngica e antibacteriana foram realizados no Departamento de Análises Clínicas da Universidade Estadual de Maringá, sob coordenação do professor Dr. Benedito Dias Prado Filho e professor Dr. Celso Nakamura. O método usado nos testes foi o da microdiluição descrito por Woods (1995).

A avaliação da atividade antiproliferativa foi realizada no CPQBA (UNICAMP), sob responsabilidade do professor Dr. João Ernesto de Carvalho. Os testes de atividade foram realizados segundo método descrito por Skehan e col. (1990) e Monks e col. (1991).

3.3.1 – Avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto dos galhos e das folhas

A avaliação da atividade antibacteriana foi feita através do teste de susceptibilidade antibacteriana pelo método de microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas três placas para verificar a atividade antibacteriana, uma para cada espécie de bactéria, juntamente com os respectivos antibacterianos padrões descritos pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μL de caldo de cultura Müller-Hinton para crescimento bacteriano. As drogas utilizadas (padrões e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/mL. Após sucessivas diluições do extrato e das frações em meio de

cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/mL. A partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μL e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a 100 μL para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/mL, o segundo com 500 μg/mL, o terceiro com 250 μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com 62,5 μg/mL, o sexto com 31,75 μg/mL e o último com aproximadamente 15,85 μg/mL. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento bacteriano.

A concentração mínima bactericida foi determinada retirando uma alíquota de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de cultura ágar Mueller Hinton, devidamente identificadas. A Concentração Mínima Bactericida (CMB) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo.

Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente as bactérias Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus subtilis ATCC 6623 e Escherichia coli ATCC 25922, utilizando-se como padrões os antibacterianos penicilina, vancomicina e tetraciclina, respectivamente.

3.3.2 – Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos das folhas e dos galhos

A avaliação utilizou o teste de susceptibilidade antifúngica pelo método de microdiluição. Este método utiliza placas contendo 96 compartimentos, sendo cada compartimento denominado well (poço). Foram utilizadas quatro placas para verificar a atividade antifúngica, uma para cada espécie de fungo, juntamente com

o antifúngico padrão descrito pela literatura. Cada poço continha aproximadamente 10 μL de caldo de cultura RPMI-1640 da Sigma® _para

crescimento fúngico. As drogas utilizadas (padrão e testes) foram diluídas em dimetilssulfóxido (DMSO), na concentração de 20 mg/mL. Após sucessivas diluições do extrato em meio de cultura (caldo Müller-Hinton) estéril obteve-se concentração de 2000 μg/mL. A partir dessa concentração foi retirada uma alíquota de 100 μL e iniciou-se a inoculação da droga em sucessivos compartimentos com meio de cultura. As diluições ocorreram no sentido das colunas, uma para cada droga. Ao ser adicionada em um compartimento este era homogeneizado com a mesma pipeta, sendo transferida uma quantidade igual a 100 μL para o poço seguinte. Dessa forma, cada compartimento anterior tinha o dobro da concentração do posterior. O primeiro poço da primeira coluna, portanto, ficou com a primeira droga teste numa concentração de 1000 μg/mL, o segundo com 500 μg/mL, o terceiro com 250 μg/mL, o quarto com 125 μg/mL, o quinto com 62,5 μg/mL, o sexto com 31,75 μg/mL e o último com aproximadamente 15,85 μg/mL. As placas de microdiluição foram incubadas em estufa Bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi feita, considerando o CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico.

A concentração mínima fungicida (CMF) foi determinada retirando uma alíquota de 10 μL (alça de semeadura calibrada) do conteúdo de cada poço com a droga, mas isento de crescimento e dos controles para placas de petri com meio de cultura ágar Sabourand, devidamente identificadas. A concentração mínima fungicida (CMF) foi lida, considerando-a como a menor concentração da droga que impediu o crescimento visível do subcultivo.

A droga padrão foi a micostatina e a incubação foi realizada em estufa bacteriológica a 37º C por 24 horas. A leitura foi realizada considerando a CMI a menor concentração capaz de inibir o crescimento fúngico.

Os extratos brutos das folhas e dos galhos foram avaliados frente aos fungos Candida albicans, C. parapsilosis, C. krusei e C. tropicalis utilizando-se como antifúngico padrão a micostatina.

3.3.3 – Avaliação da atividade antiproliferativa dos extratos brutos das folhas e suas frações, do extrato bruto dos galhos e suas frações

As linhagens celulares cedidas pelo National Cancer Institute (NCI) dos Estados Unidos da América, e utilizadas na triagem da atividade antiproliferativa foram diluídas em dimetilsulfóxido de sódio (DMSO) na concentração de 1g/mL resultando em soluções estoques.

Para o teste de atividade, foram plaqueados 100 μl de células em meio RPMI/SFB/ gentamicina, nas suas respectivas densidades de inoculação, em placas de 96 compartimentos. As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido, para readaptação ao ambiente. Após

esse período uma placa controle foi fixada através da adição de ácido tricloroacético para determinação da quantidade de células no momento da adição das drogas. Nas demais placas foram adicionadas as drogas nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 ug/mL e incubadas por 48 horas, centrifugadas por 3 minutos a 2000 rpm, e fixadas com 50 μl de ácido tricloroacético a 50% (TCA) para as células aderidas e 80% para as células em suspensão (leucemia). Para completar a fixação celular, as placas foram incubadas por 1 hora a 4ºC, submetidas a quatro lavagens com água destilada para a remoção dos resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários e mantidas em temperatura ambiente até a secagem completa. As placas foram coradas pela adição de 50μl do corante proteico sulforrodamina B (SRB) a 0,4 % (peso/volume), dissolvido em ácido acético a 1 %, e incubadas a 4 ºC, durante 30 minutos e lavadas por 4 vezes com uma solução de ácido acético 1%. O resíduo da solução de lavagem foi removido das placas, as quais foram secas à temperatura ambiente. O corante ligado às proteínas celulares foi solubilizado com uma solução de Trizma Base na concentração de 10μM e pH 10,5 por 5 minutos em ultra-som. A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 560 nm em um leitor de microplacas. Para análise dos resultados, foram calculadas as médias das absorbâncias descontadas de seus respectivos brancos, e calculada a porcentagem de inibição de crescimento. Com os dados obtidos, foram construídos gráficos relacionando a porcentagem de inibição de crescimento com

a concentração da substância teste. Como controle positivo foi padronizado o quimioterápico doxorrubicina Os testes foram realizados com os extratos brutos das folhas e galhos e frações, avaliados frente a um painel de células tumorais humanas composto pelas linhagens apresentadas na Tabela 12. O quimioterápico utilizado como controle foi a doxorrubicina.

Tabela 12: Linhagens de células tumorais utilizadas no teste de atividade antiproliferativa

Código Tipo de célula tumoral

K-562 Leucemia linfóide

UACC-62 Melanoma NCI-460 Pulmão tipo não pequenas células

MCF-7 Mama NCI-ADR Mama que expressa o fenótipo de

resistência MDR

HT-29 Cólon OVCAR-3 Ovário

786-0 Rim PCO-3 Próstata

3.4 – Dados espectroscópicos das substâncias isoladas 3.4.1 – Substância LC-1: lup-20(29)-en-3β-ol Fórmula molecular: C30H50O IV νKBr cm-1, (FIGURA 3) max 3324 (O-H), 2917 – 2849 (C-H), 1472 – 1462 (CH2).

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 4)

[M.+ _{] 426 (14,4); 411 (8,3); 281 (9,9); 219 (11,5); 218 (24,4); 208 (18,1); 207} (52,5); 203 (21,6); 191 (21,8); 190 (20,6); 189 (43,2); 176 (7,8); 175 (18,0); 173 (10,9); 163 (16,1); 162 (10,0); 161 (19,4); 149 (21,3); 148 (16,9); 147 (27,3); 145 (9,6); 137 (13,2); 136 (21,9); 135 (45,4); 134 (16,7); 133 (24,6); 123 (33,4); 122 ( 21,8); 121 (47,5); 119 (32,3); 109 ( 58,9); 108 (36,0); 107 ( 55,0); 105 (31,3); 97 (16,4); 96 (18,5); 95 (78,1); 93 (62,0); 91 (29,8); 83 (23,8); 81 (79,4); 79 (44,6); 71 (24,4); 69 (73,7); 68 ( 29,7); 67 (55,1); 57 ( 32,4); 55 (87,6); 53 (16,6); 43 ( 100,0); 41 (81,5); 40 (47,2); 39 (11,0).

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 5)

4,69 (H-29; d;zsHz 2,4; 1H); 4,56 (H-29; m; 1H); 3,19 (H-3; dd;zsHz 10,8 e 5,4; 1H); 2,39 (H-19; spt; 1H); 1,91 (H-21; m; 1H); 1,88 (H-15; t;2,4; 1H); 1,68 30; s; 3H); 1,66 13; t; 3,0; 1H); 1,65 1; 1H); 1,62 12; 1H); 1,54 (H-2; 2H); 1,49 (H-16; 2H); 1,41 (H-7; 2H); 1,41 (H-2(H-2; 1H); 1,38 (H-11; d; 1,5; 1H); 1,36 (H-18; 1H); 1,35 (H-21; m; 1H); 1,28 (H-9; 1H); 1,20 (H-11; 1H); 1,20 (H-22; m; 1H); 1,07 (H-12; 1H); 1,03 (H-26;s; 3H); 0,99 (H-15; d; 2,1; 1H);0,97 (H-23; s; 3H); 0,94 (H-27; s; 3H); 0,88 (H-1; 1H); 0,83 (H-25; s; 3H); 0,79 (H-28; s; 3H); 0,76 (H-24; s; 3H); 0,70 (H-5; 1H).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 7) 38,6 (C-1, CH2); 27,3 (C-2, CH2); 79,0 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH); 18,2 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,7 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C); 20,8 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,9 (C-13, CH); 42,7 (C-14, C); 27,3 (C-15, CH2); 35,5 (C-16, CH2); 42,9 (C-17, C); 48,2 (C-18, CH); 47,9 (C-19, CH); 151,1 (C-20, C); 29,7 (C-21, CH2); 39,9 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3); 16,0 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,4 (C-27, CH3); 17,8 (C-28, CH3); 109,3 (C-29, CH2); 19,2 (C-30 CH3).

3.4.2 – Substância LC-2: Mistura dos compostos:

LC-2(I) 24ξ- etil- colest- 5 enol

LC-2(II)24ξ- etil- colesta- 5, 22- dienol LC-2(III) 24ξ- metil- colest- 5 enol EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(I) (FIGURA 10)

[M.+ _{] 400 (28,2); 367 (19,0); 207 (41,6); 145 (42,2); 133 (22,0); 119 (20,3); 107}

(29,7); 105 (26,2); 95 (28,5); 93 (25,9); 91 (28,6); 81 (35,4); 79 (25,8); 73 (23,3); 71 (29,1); 69 (31,9); 67 (28,6); 57 (44,6); 55 (60,7); 43 (100,0); 41 (56,9); 40 (45,0). EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(II) (FIGURA 11)

[M.+ _{] 412 (23,7); 281 (27,0); 255 (23,0); 207 (50,0); 159 (21,7); 145 (21,8); 133}

(30,1); 119 (19,8); 109 (21,8); 107 (25,2); 105 (25,7); 97 (29,4); 95 (28,8); 93 (27,5); 91 (28,1); 83 (52,1); 81 (47,9); 79 (30,5); 73 (23,9); 71 (20,6); 69 (57,5); 67 (32,7); 57 (28,8); 55 (100,0); 43 (69,0); 41 (63,8).

EM (70 eV), [m/e (%)], LC-2(III) (FIGURA 12)

[M.+ ] 414 (23,6); 213 (16,7); 145 (21,0); 133 (15,7); 119 (18,0); 107 (28,9); 105 (25,6); 95 (30,1); 93 (24,3); 91 (24,8); 85 (16,1); 81 (33,7); 79 (24,7); 71 (22,8); 69 (31,8); 67 (25,7); 57 (52,2); 55 (58,7); 43 (100,0); 41 (48,9).

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), Mistura LC-2 (FIGURA

13)

0,68 (H-18, 3H, LC-2 (I) e (III)); 0,69 (H-18, 3H, LC-2 (II)); 1,01 (H-19, 3H, LC-2 (I) e (III)); 1,03 19, 3H, LC-2 (II)); 0,91 21, 3H, d, 6,3, LC-2 (I) e (III)); 1,03 (H-21, 3H, LC-2 (II)); 0,85 (H-26, 3H, LC-2 (I) e (II)); 0,83 (H-26, 3H, LC-2 (III)); 0,80 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,79 (H-27, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,83 (H-27, 3H, d, 6,3, LC-2 (III)); 0,77 (H-28, 3H, d, 6,6, LC-2 (I)); 0,80 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (II)); 0,85 (H-29, 3H, d, 6,6, LC-2 (III)).

RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), Mistura LC-2 (FIGURA 14)

37,18(C-1, CH2); 31,58(C-2, CH2); 71,79(C-3, CH); 42,25(C-4, CH2); 140,88(C-5,

C); 121,80(C-6, CH); 31,82(C-7, CH2); 31,82(C-8, CH); 50,08(C-9, CH);

36,43(C-10, C); 20,97(C-11, CH2); 39,70(C-12, CH2); 42,25(C-13, C); 56,72(C-14, CH);

24,20(C-15, CH2); 28,15(C-16, CH2); 56,01(C-17, CH); 11,84(C-18, CH3);

19,28(C-19, CH3); 40,20(C-20, CH); 18,92(C-21, CH3, LC-2(I) e(III)); 21,11(C-21, CH3,

LC-2(II)); 33,85(C-22, CH2, LC-2(I) e (III)); 138,42(C-22, CH, LC-2(II)); 39,70(C-23,

CH2, LC-2(I)); 129,36(C-23, CH, LC-2(II)); 28,81(C-23, CH2, LC-2(III)); 45,77(C-24,

CH, LC-2(I)); 51,19(C-24, CH, LC-2(II)); 56,01(C-24, CH, LC-2(III)); 26,00(C-25, CH, LC-2(I)); 31,82(C-25, CH, LC-2(II)); 29,06(C-25, CH, LC-2(III)); 18,66(C-26, CH3, LC-2(I) e (III)); 19,22(C-26, CH3, LC-2(II)); 19,70(C-27, CH3, LC-2(I) e (III));

19,22(C-27, CH3, LC-2(II)); 22,95(C-28, CH3, LC-2(I)); 25,30(C-28, CH2, LC-2(II));

18,66(C-28, CH2, LC-2(III)); 11,72(C-29, CH3, LC-2(I)); 12,12(C-29, CH3, LC-2(II)).

3.4.3 – Substância LC-3: 3β,28-diidróxilup-20(29)-ene Fórmula molecular: C30H50O2

IV νKBr cm-1, (FIGURA 15) max

3407 e 3076 (O-H), 2942 – 2869 (C-H), 1455 (CH2), 1375 (CH3), 1106 – 1033

(=C-H).

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 16)

[M.+ ] 456 (7,2); 411 (12,5); 248 (31,0); 234 (19,6); 220 (18,3); 207 (100,0); 203 (24,1); 190 (9,6); 189 (42,8); 175 (18,1); 147 (17,3); 137 (13,2); 135 (47,4); 123 (35,4); 122 ( 24,8); 119 (33,3); 109 ( 58,9); 107 ( 54,0); 95 (78,6); 83 (23,2); 81 (80,2); 79 (43,5); 69 (72,8); 68 ( 31,1); 57 ( 31,8); 55 (89,3); 53 (17,3); 40 (56,2); 39 (7,0).

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 17)

4,68 (H-29;zsHz 1H); 4,58 29; 1H); 3,78 28; dd; 10,2; 1H); 3,31 28; dd; 10,8; 1H); 3,18 (H-3; dd;zsHz 10,8 e 5,1; 1H); 2,38 19; m; 1H); 1,95 21; m; 1H); 1,92 16; 1H); 1,84 (H-22; 1H); 1,68 (H-30; s; 3H); 1,68 (H-15; 1H); 1,64 (H-1; 1H); 1,63 (H-12; 1H); 1,62 (H-13; 1H); 1,58 (H-2; 2H); 1,57 (H-18; 1H); 1,42 (H-11; m; 1H); 1,39 (H-7; 2H); 1,26 (H-9; 1H); 1,20 (H-16; d; 2,4; 1H); 1,18 (H-11; d; 4,2; 1H); 1,05 (H-12; 1H); 1,04 (H-15; d; 2,7; 1H); 1,02 (H-22; 1H); 1,02 (H-26; s; 3H); 0,98 (H-27; s; 3H); 0,97 23; s; 3H); 0,89 1; 1H); 0,82 25; s; 3H); 0,76 24; s; 3H); 0,67 (H-5; 1H). RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 19) 38,6 (C-1, CH2); 27,2 (C-2, CH2); 78,9 (C-3, CH); 38,7 (C-4, C); 55,2 (C-5, CH); 18,1 (C-6, CH2); 34,1 (C-7, CH2); 40,8 (C-8, C); 50,3 (C-9, CH); 37,0 (C-10, C); 20,7 (C-11, CH2); 25,0 (C-12, CH2); 37,2 (C-13, CH); 42,6 (C-14, C); 26,9 (C-15, CH2); 26,9 (C-16, CH2); 47,7 (C-17, C); 48,6 (C-18, CH); 47,7 (C-19, CH); 150,6 (C-20, C); 29,6 (C-21, CH2); 39,8 (C-22, CH2); 27,8 (C-23, CH3); 15,2 (C-24, CH3); 15,9 (C-25, CH3); 15,8 (C-26, CH3); 14,6 (C-27, CH3); 60,5 (C-28, CH2); 109,7 (C-29, CH2); 18,9 (C-30 CH3).

3.4.4 – Substância LC-4: 3β-O-glicopiranosídeo-24ξ-etil-colest-5enol Fórmula molecular: C35H60O6

RMN 1H (CDCl3, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 21)

5,35 (H-6; d;zsHz 1H); 5,07 (H-1’; d ; 7,8; 1H); 4,56 (H-3’; dl; 9,3; 1H); 4,45 - 4,25 (H-6’b, H-4’, H-2’; m; 3H); 4,09 - 3,91 (H-6’a, H-5’, H-3α; m; 3H); 0,92 (H-19; s; 3H); 0,64 (H-18; s; 3H). RMN 13C (CDCl3, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 22 ) 37,3 (C-1, CH2); 30,0 (C-2, CH2); 78,4 (C-3, CH); 39,1 (C-4, CH2); 140,9 (C-5, C); 121,8 (C-6, CH); 31,9 (C-7, CH2); 31,8 (C-8, CH); 50,1 (C-9, CH); 36,7 (C-10, C); 21,0 (C-11, CH2); 39,7 (C-12, CH2); 42,3 (C-13, C); 56,6 (C-14, CH); 24,3 (C-15, CH2); 28,3 (C-16, CH2); 56,0 (C-17, CH); 11,7 (C-18, CH3); 19,2 (C-19, CH3); 36,2 (C-20, CH); 18,9 (C-21, CH3); 34,0 (C-22, CH2); 26,1 (C-23, CH2); 45,8 (C-24, CH); 29,2 (C-25, CH); 18,7 (C-26, CH3); 19,7 (C-27, CH3); 23,1 (C-28, CH2); 11,9 (C-29, CH3); 102,5 (C-1' CH); 75,2 (C-2’, CH); 77,9 (C-3’, CH); 71,5 (C-4’, CH); 78,3 (C-5’, CH); 62,6 (C-6’, CH2). 3.4.5 – Substância LC-5: 2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-1-2H-benzopiran-3,5,7-triol. Fórmula molecular: C15H14O6 IV νKBr cm-1, (FIGURA 23) max 3324 (O-H), 1628 (C = C), 1148 (C-O)

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 24)

[M.+ ] 290 (14,0); 272 (44,2); 258 ( 17,0); 164 ( 45,3); 152 (36,4); 139 (100,0); 123 (45,4); 110 (6,6); 64 (13,6); 44 (17,6);39 (6,7).

RMN 1H (CD3OD, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 25)

6,96 (H-2’; d;zsHz

1,8; 1H); 6,80 (H-6’; dd; 1,8; 1H); 6,76 (H-5’; d; 1H); 5,91 (H-6; d; 2,1; 1H); 5,93 (H-8; d; 2,4; 1H); 4,80 (H-2; m;zsHz

1H); 4,17 (H-3; m; 1H); 2,69 (H-4b; dd; 16,8 e 3,0; 1H); 2,87 (H-4a; dd; 16,8 e 4,5; 1H).

RMN 13C (CD3OD, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURAS 26)

79,9 (C-2, CH); 67,5 (C-3, CH); 29,2 (C-4a e C-4b, CH2); 157,8 (C-5, C); 96,4 (C-6, CH); 158,2 (C-7, C); 95,9 (C-8, CH); 157,5 (C-9, C); 100,1 (C-10, C); 132,2 (C-1’, C); 115,4 (C-2’, CH); 145,9 (C-3’, C); 146,1 (C-4’, C); 116,0 (C-5’, CH); 119,5 (C-6’, CH). 3.4.6 – Substância LC-6: (siringaresinol-(2,6-Bis(4’,4’-O-bis-β-D-glicosídeo-3’,5’-dimetoxi-fenil)-3,7-dioxabiciclo). Fórmula molecular:

EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 27)

135 (36,5); 76 (19,2); 75 (100,0); 73 (82,7); 69 (12,2); 60 (84m0); 57 (36,1); 45 (48,2); 44 (47,2); 43 (55,5); 42 (18,0); 41 (11,4).

RMN 1H (D2O, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 28)

6,82 (H-2 e H-6; s;zsHz

2H); 4,90 (H-7; d; 5,1; 1H); 3,32 (H-8, m; 1H); 4,34 (H-9; m; 1Hb); 3,99 (H-9; dd;

dd; 12,0 e 6,0; 1Hb); 3,73 (H-5’; dd; 12,6 e 5,4; 1Ha); 3,57 (H-2’; d; 1,8; 1H); 3,54 (H-4’; 1H); 3,36 (H-3’; d; 1H). RMN 13C (D2O, 75,5 MHz), δ (C, DEPT), (FIGURA 29) 141,1 (C-1; C); 106,9 (C-2 e C-6; CH); 155,9 (C-3 e C-5; C); 136,0 (C-4; C); 88,7 (C-7; CH); 56,2 (C-8; CH); 74,7 (C-9; CH2); 72,3 (C-10; CH); 103,1 (C-11; C); 59,2 (2x OCH3); 105,9 ( C-1’; CH); 79,3 (C-4’; CH); 78,7 (C-3’; CH); 76,4 (C-2’; CH); 63,5 (C-5’; CH2). 3.4.7 – Substância LC-7: 8-β-D-Glicopiranosil-5,7-dihidroxi-2-(4-hidroxifenil)-4-H-benzopiran-4-ona Fórmula molecular: C21H20O10 IV νKBr cm-1, (FIGURA 35) max

3381 e 3237 (O-H), 1652 (C=O), 1614 (C = C), 1189 (C -O) EM (70 eV), [m/e (%)], (FIGURA 36)

[M.+ ] 432 (0,6); 414 (12,1); 378 (6,7); 342 ( 6,0); 324 (5,9); 323 (5,7); 312 (6,3); 310 (6,6); 294 ( 8,3); 284 ( 19,7); 283 (100,0); 270 (18,0); 254 (7,7); 165 (37,6); 123 (7,6); 121 (13,4); 119 (7,1); 118 (12,6); 93 (7,7); 89 (7,8); 69 (24,9); 65 (8,9); 63 (8,6); 61 (12,3); 60 (11,8); 55 (17,3); 53 (10,4); 51 (8,5); 44 (14,7); 43 (33,2); 42 (12,1); 39 (13,9).

RMN 1H (DMSO, 300 MHz), δ (H, mult., J em Hz, int.), (FIGURA 37)

8,02 (H-2’e H-6’; d;zsHz

8,4; 2H); 6,89 (H-3’ e H-5’; d; 8,4; 2H); 6,77 (H-3, s; 1H); 6,26 (H-6; s; 1H); 4,69 (H-1”; d; 9,9; 1H); 3,78 (H-2”; nd; 1H).