Realização: IES parceiras:
TÍTULO: EFEITO DA ARRABIDAEA CHICA VERLOT EM CÉLULAS TUBULARES HUMANAS EM CULTURA
CATEGORIA: EM ANDAMENTO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: Medicina
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL - UNICSUL
AUTOR(ES): LUCAS CAUÊ DA SILVA GOMES
ORIENTADOR(ES): FERNANDA TEIXEIRA BORGES
COLABORADOR(ES): BIANCA CASTINO, RAFAELA CASTINO, MÁRCIA BASTOS CONVENTO, FERNANDA TEIXEIRA BORGES
Projeto de Pesquisa
Efeito da Arrabidaea chica Verlot em células tubulares humanas em cultura
Effect of Arrabidaea chica Verlot on cultured human tubular cells
Aluno: Lucas Cauê da Silva Gomes
Orientadora: Dra Fernanda Teixeira Borges
São Paulo 2020
Resumo
O tecido renal é bastante susceptível a substâncias lesivas como isquemia, medicamentos, substâncias exógenas, ao lipopolissacarídeo de bactérias gram negativas etc. Já os extratos aquosos da parte aérea de plantas, como as folhas e caules, são ricas fontes de agentes antioxidantes e anti-inflamatórios. A Arrabidaea chica Verlot (ACV), também conhecida como “crajiru” apresenta atividade anti-inflamatória, cicatrizante, antimicrobiana, antioxidante, anti-hipertensiva, hepatoprotetora e antibacteriana. A ACV possui grande potencial medicinal, porém trabalhos associando-a com tecido renal, são inexistentes. Desta forma, este trabalho tem como objetivo esclarecer se o tratamento com ACV confere proteção, ou não, a substâncias nefrotóxicas em células de túbulo proximal de rim humano (HK-2). Para tanto células HK-2 serão subdivididas nos grupos controle, estimuladas com antibiótico nefrotóxico gentamicina, as células serão tratadas com Genta e concomitantemente com a ACV (raiz, parte aérea e planta inteira), e somente tratadas com a ACV (raiz, parte aérea e planta inteira), durante 24 h. Será avaliada a proliferação e viabilidade pelo ensaio de MTT, a viabilidade celular através de necrose e apoptose, será avaliada, respectivamente, pelos corantes Acridina Orange/Brometo de Etídeo e Hoescht 33342, e seu possível ou não efeito antioxidante, pelo método de MDA e FOX-2.
Abstract
Renal tissue is particularly susceptible to toxic injury ischemia, medications, exogenous substances, to the lipopolysaccharide of gram-negative bacteria, among others. Already the aqueous extracts from the aerial part of plants, such as leaves and stems, are rich sources of antioxidants and anti-inflammatory agents. Arrabidaea chica Verlot (ACV), also known as "crajiru", has anti-inflammatory, wound healing, antimicrobial, antioxidant, antihypertensive, hepatoprotective and antibacterial activities. ACV has great medicinal potential, but studies associating ACV with renal tissue are non-existent. Thus, this study aims to clarify if the treatment with ACV provides protection, or not, to nephrotoxic substances in human renal proximal tubule cells (HK-2). Therefore, HK-2 cells will be subdivided into control groups, treated with nephrotoxic antibiotic gentamicin, the cells will be treated with Genta and concomitantly with the LCA (root, aerial part, and whole plant), and only treated with the LCA (root, aerial part) and whole plant, for 24 h. The MTT assay will evaluate proliferation and viability, cell viability through necrosis, and apoptosis, respectively, by the Acridine Orange/Etho Bromide and Hoescht 33342, and it possible or not antioxidant effect, by the MDA and FOX-2 methods.
1. Introdução
O tecido renal é bastante susceptível a substâncias lesivas como isquemia1, medicamentos2, substâncias exógenas, ao lipopolissacarídeo de
bactérias gram negativas3 etc.
Os estudos sobre nefrotoxicidade, geralmente utilizam modelos “in vivo” de ratos, camundongos e animais maiores como coelhos4. No entanto, estes
modelos consomem tempo e dinheiro na criação das espécies animais, na manutenção dos animais durante os protocolos experimentais, no tratamento e m si, pois a quantidade de princípios ativos utilizadas é maior, além da preocupação com questões éticas nos protocolos experimentais.
É sabido que no néfron, a principal região sujeita a lesão é o seguimento tubular proximal. Ela é caracterizada por células ricas em mitocôndrias que fornecem a energia necessária para os diversos mecanismos de transporte de solutos através da célula tubular, além de membrana apical rica em microvilosidades que aumentam sua área de reabsorção e secreção4. Ela é o
sítio inicial da lesão renal aguda e se correlaciona com a proteinúria5. Por isso,
uma opção aos modelos “in vivo”, tem sido os modelos “in vitro”, utilizando células tubulares proximais imortalizadas em cultura.
As vantagens incluem pouco gasto com manutenção, uso de quantidades pequenas de princípios ativos, boa reprodutibilidade devido ao uso de condições experimentais isoladas. Entretanto, existem críticas como a célula não reproduzir as condições observadas no organismo animal, à variação observada com um mesmo tipo celular mantido em cultura por longo tempo, dentre outros.
Extratos aquosos da parte aérea de plantas, como as folhas e caules, são ricas fontes de agentes antioxidantes e anti-inflamatórios, entretanto seu efeito benéfico é dependente muitas vezes do método de extração, concentração do princípio ativo, entre outros fatores.
A Arrabidaea chica Verlot (ACV), também conhecida como “crajiru” é utilizada popularmente no tratamento das enfermidades da pele, do intestino, anemia e inflamação uterina. Apresenta atividade anti-inflamatória, cicatrizante, antimicrobiana, antibacteriana, antioxidante, anti-hipertensiva, hepatoprotetora, com grande potencial medicinal6, 7, 8, 9.
É uma planta arbustiva brasileira, originária da Floresta Amazônica e da Mata Atlântica. Pertence à família Bignoniaceae, da ordem das Lamiales. Estudos de genotoxicidade sugerem que a ACV, é segura, um estudo10 que
avaliou os flavonoides extraídos desta planta, apontou que não há toxicidade em doses de até 1g/kg, entretanto nenhum estudo avaliou por meio de curvas dose-resposta sua possível toxicidade no tecido renal. Adicionalmente, embora um de seus usos populares seja no tratamento da albuminúria, não foram detectados na literatura científica trabalhos que demonstrem o efeito da ACV no tecido renal. Medeiros11 et al utilizou concentrações crescentes da ACV (300-600
mg/kg) durante 7 dias em ratos Wistar, e mostrou seu efeito em bloquear a toxicidade induzida por tetracloreto de amônio, através da redução na atividade das enzimas hepática TGO/TGP e níveis plasmáticos da bilirrubina.
Já no rim de ratos, Amaral12 et al, mostrou sua atividade diurética
comparando-a ao diurético de alça furosemida, possivelmente decorrente do flavonoide diurético luteolina presente na ACV. Os extratos alcoólicos e a
luteolina foram administrados em doses crescentes de 25-200 mg/kg. O volume urinário foi medido após 6h e a luteolina foi capaz de aumentar a diurese em 94%, enquanto o extrato em 79%.
Ribeiro CM13 mostrou sua atividade antibacteriana contra S. aureus (62,5
mg/ml) e contra E. coli (250 mg/ml), e sua ação antifúngica frente à levedura C. albicans (500 mg/ml). Sugerindo que a ACV pode ser útil no tratamento, como adjuvante, de infecções por bactérias gram negativas, onde o antibiótico aminoglicosídeo é indicado, porém o mesmo ocasiona importante nefrotoxicidade.
Assim este trabalho tem como objetivo esclarecer se o tratamento com Arrabidaea chica Verlot confere proteção, ou não, a substâncias nefrotóxicas, em células epiteliais tubulares proximais humanas em cultura.
2. Cronograma de trabalho
1º Ano
Cultura de células tubulares proximais humanas (HK-2);
Exposição da HK-2 ao antibiótico nefrotóxico gentamicina por 24h;
Exposição da HK-2 aos tratamentos com a ACV (raiz, parte aérea e planta inteira) por 24h;
Exposição da HK-2 ao antibiótico gentamicina concomitante aos tratamentos com a ACV (raiz, parte aérea e planta inteira) por 24h;
Avaliação da proliferação e viabilidade pelo ensaio de MTT;
Avaliação da viabilidade, através de necrose e apoptose, pelo método de exclusão do corante fluorescente (Acridina Orange/Brometo de Edídio);
Avaliação do efeito antioxidante pelo ensaio de MDA e FOX-2;
Relatório e elaboração do artigo científico para fins de publicação.
3. Materiais e Métodos
3.1 Formação dos extratos e cultura celular
Células epiteliais tubulares proximais humanas (HK-2), obtidas na American type of culture collection (ATCC), serão cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm2, em placas de 6 poços, ou em placas de 96 poços, de acordo com o
protocolo experimental, em meio Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM/F12) suplementado com soro fetal bovino (SFB 5% v/v), bicarbonato de sódio (NaHCO3) 2,0 g/l HEPES 2,6 g/l, penicilina 10 000 IU/l, estreptomicina 50 mg/l e mantidas na incubadora a 37º Celsius (C).
Ao atingirem 80% de confluência, as células serão destacadas da placa de cultura por tripsinização e a atividade da tripsina será neutralizada com DMEM/f12 contendo 5% de soro fetal bovino (SFB). As células serão utilizadas na manutenção das culturas ou na realização dos protocolos experimentais, sendo que cada protocolo será repetido ao menos 3 vezes.
Os extratos liofilizados de Arrabidaea chica Verlot (ACV), serão cedidos pela Fiocruz/ Laboratório Farmacêutico Federal Farmanguinhos, Laboratório Oficial do Ministério da Saúde. Os extratos liofilizados das amostras serão separadamente analisados, quanto à raiz (RI), parte aérea (EA) e planta inteira (EE) e serão utilizados no tratamento das células HK-2 na concentração de 35 µg/ml, durante 24h.
A indução da nefrotoxicidade em células HK-2 será com a administração de antibiótico aminoglicosídeo gentamicina (GENTA), na concentração de 2 mM, durante 24 h.
3.2 Grupos experimentais
Células HK-2 ao atingirem 80% de confluência, serão subdivididas nos seguintes grupos experimentais:
Grupo controle (CTL): células KH-2 serão mantidas em meio de cultura DMEM/F12 com 5% SFB, durante 24h.
Grupo antibiótico aminoglicosídeo gentamicina (Genta): células HK-2 serão expostas a genta (2 mM), durante 24h.
Grupo ACV da parte aérea (EA): células KH-2 serão tratadas com os extratos liofilizados da parte área da ACV (35 µg/ml), durante 24h.
Grupo ACV da raiz (RI): células KH-2 serão tratadas com os extratos liofilizados da raiz da ACV (35 µg/ml), durante 24h.
Grupo da planta ACV inteira (EE): células KH-2 serão tratadas com os extratos liofilizados da planta ACV inteira (35 µg/ml), durante 24h.
Grupo ACV da parte aérea + antibiótico aminoglicosídeo
gentamicina (EA+Genta): células KH-2 serão tratadas com os
extratos liofilizados da parte área da ACV (35 µg/ml) e concomitantemente expostas a genta (2 mM), durante 24h.
Grupo ACV da raiz + antibiótico aminoglicosídeo gentamicina
(RI+Genta): células KH-2 serão tratadas com os extratos liofilizados
da raiz da ACV (35 µg/ml) e concomitantemente expostas a genta (2 mM), durante 24h.
Grupo da planta ACV inteira + antibiótico aminoglicosídeo
gentamicina (EE+Genta): células KH-2 serão tratadas com os
extratos liofilizados da planta ACV inteira (35 µg/ml) e concomitantemente expostas a genta (2 mM), durante 24h.
3.3 Avaliação da proliferação e viabilidade pelo ensaio de MTT
O ensaio de MTT14 é um ensaio colorimétrico para medir a atividade das
enzimas que reduzem o corante MTT a um precipitado de cor púrpura. Permite avaliar a viabilidade e a proliferação celular durante o período de 24, 36, 72, 96 e 120h.
As células HK-2 serão plaqueadas em placas de 96 poços, submetidas aos tratamentos citados anteriormente. O MTT (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio, 5mg/ml) será adicionado à placa de 96 poços tratadas 1 vez ao dia, durante 5 dias. Durante o período de 3 às 4h após a exposição, o MTT é reduzido em um precipitado de cor púrpura em células vivas. Uma solução de sulfóxido de dimetilo (DMSO, 100 µl) será adicionada para dissolver o produto insolúvel púrpura em uma solução de cor. A absorbância desta solução colorida será quantificada em comprimento de onda 500 a 600 nanômetros (nm) em um espectrofotômetro. Os resultados serão expressos como densidade óptica (DO).
3.4 Avaliação da viabilidade celular – Necrose e Apoptose
A morte celular por necrose será avaliada utilizando dois corantes fluorescentes através do método de exclusão. Será adicionado 0,3 µL de uma solução contendo acridina-orange e brometo de etídeo (100 µg/ml) a 10 µL de cada suspensão de células. O brometo de etídio penetra na célula e liga-se a dupla fita de DNA, emitindo uma fluorescência verde. O acridina-orange, que penetra nas células quando a membrana esta permeável, ou seja, inviável, se liga à dupla fita de DNA emitindo uma fluorescência abóbora-avermelhada15.
A morte celular por apoptose será avaliada através do corante fluorescente HOESCHT 33342, que se liga a dupla fita de DNA. As células marcadas com pontos fluorescentes (corpos apoptóticos) serão consideradas inviáveis. As suspensões de células serão observadas com microscópio de fluorescência (Leica), sob aumento de 40X e as células serão contadas.
Os resultados serão expressos em porcentagem de células viáveis ou não viáveis, ou apoptóticas.
3.5 Avaliação do efeito antioxidante pelo ensaio de MDA e FOX-2
Os níveis de peroxidação lipídica através do malondialdeído (MDA) serão determinados pela medição de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA). O MDA combina com o ácido tiobarbitúrico (TBA), formando um composto vermelho, cuja concentração é determinada por espectrofotometria, com leitura a 535 nanômetros (nm)16.
O extrato celular e o meio de cultura dos grupos experimentais serão coletados, e será adicionado uma solução com 0,375% de TBA, 15% de ácido tricloroacético (TCA) e 0,25 µl de ácido clorídrico (HCl). Os tubos serão mantidos em agitação contínua, aquecido a 95ºC durante 20 minutos e, posteriormente, resfriado a temperatura ambiente. Os valores serão estabilizados por gramas de proteína17 e expressos em µM/mg de proteína.
Os peróxidos urinários serão determinados pelo método xilenol laranja versão-2 (FOX-2) no extrato celular e o meio de cultura dos grupos experimentais, que consiste na determinação dos níveis de peróxido através do ferro-xilenol laranja18. O ferro ferroso é oxidado em ferro férrico pelos peróxidos
contidos nas amostras. O reagente xilenol laranja mostra alta seletividade para o íon Fe3+, produzindo um complexo azul-arroxeado cuja absorbância pode ser medida a 560 nm. O seguinte reagente será preparado: 90 ml de metanol; 10 ml de água destilada dupla; laranja de xilenol 100 µM; hidroxitolueno butilado 4 mM (BHT); ácido sulfúrico 25 mM e sulfato de amônio ferroso 250 µM. Na amostra de tecido renal (100 µl) será adicionado 900 µl de reagente FOX-2, agitado em vórtex e incubado por 30 minutos em temperatura ambiente. As soluções serão então centrifugadas a 15.000 g por 10 min a 4ºC. Os valores serão estabilizados por gramas de proteína17 e expressos em µM/mg de proteína.
3.6 Análise Estatística
A análise estatística descritiva dos dados será processada pelo software Action Stat para Windows (versão 3.3.2), considerando-se um nível de significância de 5% (p<0,05). Os dados serão analisados pelo teste de normalidade Shapiro-Wilk. Dados com distribuição normal serão analisados pelo teste two-way ANOVA, seguido pelo teste post-hoc de Teste de Tukey ou teste Student-Newman-Keuls; enquanto dados com outra distribuição serão analisados pelo teste de Kruskal Wallis, seguido de teste post-hoc de Tukey.
4. Referências Bibliográficas
1. Gong L, He J, Sun X, Li L, Zhang X, Gan H. Activation of sirtuin1 protects against ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury. Biomed Pharmacother. 2020;125:110021. doi:10.1016/j.biopha.2020.110021.
2. Jin F, Chen X, Yan H, Xu Z, Yang B, Luo P, He Q. Bisdemethoxycurcumin attenuates cisplatin-induced renal injury through apoptosis, anti-oxidant and anti-inflammatory. Eur J Pharmacol. 2020;874:173026.
https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2020.173026
3. Cunha MA, Schor N. Effects of gentamicin, lipopolysaccharide, and contrast media on immortalized proximal tubular cells. Ren Fail. 2002;24(6):687-90. doi: 10.1081/jdi-120015662
4. Gozalpour E, Fenner KS. Current State of In vitro Cell-Based Renal
Models. Curr Drug Metab. 2018;19(4):310-326. doi:
10.2174/1389200219666180119115133
5. Mantula PS, Outinen TK, Clement JPG, Huhtala HSA, Pörsti IH, Vaheri A, Mustonen JT, Mäkelä SM. Glomerular Proteinuria Predicts the Severity of Acute Kidney Injury in Puumala Hantavirus-Induced Tubulointerstitial Nephritis.. Nephron. 2017;136(3):193-201. doi: 10.1159/000459634
6. Jorge MP, Madjarof C, Gois Ruiz AL, Fernandes AT, Ferreira Rodrigues RA, de Oliveira Sousa IM, Foglio MA, de Carvalho JE. Evaluation of wound healing properties of Arrabidaea chica Verlot extract. J Ethnopharmacol. 2008;118(3):361-6. doi: 10.1016/j.jep.2008.04.024
7. Vasconcelos CC, Lopes AJO, Sousa ELF, Camelo DS, Lima FCVM, Rocha CQD, Silva GEB, Garcia JBS, Cartágenes MDSS. Effects of Extract of Arrabidaea chica Verlot on an Experimental Model of Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2019;20(19): E4717. doi: 10.3390/ijms20194717.
8. Queiroz NCA, Jorge MP, Sousa IMO, Lima CSP, Matias MCM, Dal Rio AC, Pereira EB, Galassi VHK, de Carvalho JE, Galvao TF, Foglio MA. Arrabidaea chica for oral mucositis in patients with head and neck cancer: a protocol of a randomised clinical trial. BMJ Open. 2018;8(10):e019505.
doi: 10.1136/bmjopen-2017-019505,
9. BarbosaI WLR, Pinto LN, Quignard E, Vieira JMS, Silva Jr JOC, Albuquerque S. Arrabidaea chica (HBK) Verlot: phytochemical approach, antifungal and trypanocidal activities. Rev bras farmacogn. 2008;18(4):544-548. https://doi.org/10.1590/S0102-695X2008000400008
10. Gemelli TF, Prado Lda S, Santos FS, de Souza AP, Guecheva TN, Henriques JA, Ferraz Ade B, Corrêa DS, Dihl RR, Picada JN. Evaluation of Safety of Arrabidaea chica Verlot (Bignoniaceae), a Plant with Healing Properties J Toxicol Environ Health A. 2015;78(18):1170-80. doi: 10.1080/15287394.2015.1072070
11. Medeiros BJL, Costa KS, Ribeiro JFA, Silva JOC, Barbosa WLR, Carvalho JC. Liver protective activity of a hydroethanolic extract of Arrabidaea chica (Humb. and Bonpl.) B. Verl. (pariri). Pharmacognosy Res. 201;3(2):79-84. doi: 10.4103/0974-8490.81954.
12. Amaral RR, Santos AAD, Saravia A, Botas G. Biological activities of Arrabidaea chica (Bonpl.) B. Verl. leaves. Latin American Journal of Pharmacy. 2012;31(3):451- 455.
13. Ribeiro CM. Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas medicinais. Dissertação de Mestrado. Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará, UFPA, 2008.
14. Riss TL, Moravec RA, Niles AL, et al. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2013.
15. Reis LA, Mouro MG, Rodrigues AM, Schor N, Simoes MJ, Higa EMS. The pharmacological preconditioning (PC) with gentamicin (G) attenuated the nitric oxide (NO) reduction in renal vascular smooth muscle cells (rVSMC) and acute tubular necrosis in rats exposed to G. Renal Week: American Society of Nephrology Annual Meeting, 2007.
16. Beuge JA, Aust S. The thiobarbituric acid assay. Method Enzym. 1978;52: 306-307.
17. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL RR. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem.1951;193: 265–275.
18. Wolff SP. Ferrous ion oxidation in presence of ferric ion indicator xylenol orange for mensurament of hydroperoxides. Method Enzym. 1994;233: 182-189.
