GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO

SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA- PPG Biotecnologia Industrial

Tese de Doutorado

AVALIAÇÃO DE UM SISTEMA CONTÍNUO COMPOSTO POR

COLUNAS DE CARVÃO ATIVO E RESINAS DE TROCA IÔNICA

PARA O TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO

DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

José Marcelo Marton

Lorena – SP – Brasil

2005

Ficha Catalográfica

Elaborada pela Biblioteca Universitária - FAENQUIL

Marton, José Marcelo

M367a Avaliação de um sistema contínuo composto por colunas de carvão ativo e resinas de troca iônica para o tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar / José Marcelo Marton. Lorena 2005.

131f. : il.

Tese (Doutorado) – Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Biotecnologia.

Orientador: Maria das Graças de Almeida Felipe

1. Biotecnologia 2. Bagaço de cana de açúcar 3. Xilitol 4. Hidrolisado hemicelulósico 5. Carvão ativo 6. Resinas de troca iônica. I. Felipe, Maria das Graças de Almeida, orient. II. Título.

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

AVALIAÇÃO DE UM SISTEMA CONTÍNUO COMPOSTO POR

COLUNAS DE CARVÃO ATIVO E RESINAS DE TROCA IÔNICA

PARA O TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO

DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Tese de Doutorado apresentada como parte

das exigências para a obtenção do título de

Doutor em Biotecnologia Industrial.

Banca Examinadora:

Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe (presidente) -DEBIQ/FAENQUIL

Dr. João Batista de Almeida e Silva – DEBIQ/FAENQUIL

Dra. Inês Conceição Roberto – DEBIQ/FAENQUIL

Dra. Luciane Sene - UNIOESTE

Dr. Alfredo Eduardo Maiorano – (IPT)

Estudante:

José Marcelo Marton

Lorena - SP - Brasil

2005

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

AVALIAÇÃO DE UM SISTEMA CONTÍNUO COMPOSTO POR

COLUNAS DE CARVÃO ATIVO E RESINAS DE TROCA IÔNICA

PARA O TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO

DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR

Este exemplar corresponde à versão final da tese

de doutorado aprovada pela banca examinadora.

_____________________________________

Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe

Orientadora e Presidente da Banca Examinadora

Lorena - SP - Brasil

2005

AGRADECIMENTOS

À Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe pela confiança, amizade, dedicação e

paciência com as quais me orientou durante todo o desenvolvimento deste trabalho.

Ao Dr. João Batista pelo valioso auxílio na análise estatística dos resultados.

Ao Digníssimo Doutor Promotor de Justiça José Carlos Sampaio pelos

esclarecimentos jurídicos oferecidos durante o período de seleção para ingresso no

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial.

À minha irmã e advogada Rosilene Aparecida Marton pelo imprescindível apoio

pessoal e profissional.

Aos alunos Rymenes e Ciro pelo precioso auxílio durante a realização de todo

este trabalho.

Ao Consenho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico (CNPq),

pela bolsa e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),

pelo apoio financeiro na aquisição de equipamentos.

Aos funcionários, Djalma, Zé Carlos, Ludmila, Cristina, André Prado, Isnaldi,

Terezinha, em especial à Rita, Nicamor e Paulo Roberto pela cooperação imprescindível

durante todo o trabalho.

BIOGRAFIA

JOSÉ MARCELO MARTON, brasileiro, filho de Neuza Aparecida de Oliveira e

José Atílio Marton, nasceu em Lorena-SP, a 01 de Julho de 1975.

Em 1993 formou-se em Técnico em Informática Industrial, pelo Colégio

Técnico Industrial da Universidade Julio de Mesquita Filho – UNESP em

Guaratinguetá.

Em dezembro de 1999 graduou-se em Engenharia Industrial Química pela

Faculdade de Engenharia Química de Lorena, Lorena-SP.

Em abril de 2002 obteve o título de Mestre em Biotecnologia Industrial com a

apresentação da dissertação “AVALIAÇÃO DE DIFERENTES CARVÕES

ATIVOS E DAS CONDIÇÕES DE ADSORÇÃO NO TRATAMENTO DO

HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA PARA OBTENÇÃO

BIOTECNOLÓGICA DE XILITOL”, cujos trabalhos técnico-científicos foram todos

realizados no Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia

Química de Lorena – FAENQUIL.

Em junho de 2002 iniciou o curso de pós-graduação em Biotecnologia Industrial,

em nível de doutorado, no Departamento de Biotecnologia da Faculdade de

Engenharia Química de Lorena – FAENQUIL.

RESUMO

Avaliação de um Sistema Contínuo Composto por Colunas de Carvão Ativo e Resinas de Troca Iônica para o Tratamento do Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana-de-Açúcar. José Marcelo Marton. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP.116, 12608-970, Lorena-SP, Brasil). Banca examinadora: Dra. Luciane Sene, Dr. Alfredo Eduardo Maiorano, Dra. Inês Conceição Roberto, Dr. João Batista de Almeida e Silva, outubro, 2005.

As leveduras que assimilam D-xilose em processos fermentativos, como as do gênero Cândida, são capazes de produzir xilitol, um poliol de sabor doce que atualmente é comercialmente produzido por processo químico. O xilitol é amplamente aplicado nas indústrias farmacêutica, odontológica e alimentícia, devido as suas propriedades peculiares como a atincariogenicidade, o seu metabolismo insulino-independente e suas atuações na prevenção da osteoporose e no tratamento de doenças respiratórias. Durante a hidrólise ácida do bagaço de cana, etapa necessária para a liberação dos açúcares da fração hemicelulósica, compostos tóxicos para as leveduras, como fenóis, ácido acético, furfural ,5-hidroximetilfufural e metais, também são liberados. A toxicidade destes compostos, principalmente quanto à inibição da atividade fermentativa, é atribuída principalmente pelas suas concentrações no meio de fermentação, bem como devido ao efeito sinergístico quando estes compostos estão presentes em baixas concentrações. No presente trabalho, o principal objetivo foi avaliar o desenvolvimento de um sistema contínuo de tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de açúcar envolvendo carvão ativo e resinas de troca iônica para aplicação deste hidrolisado na produção biotecnológica de xilitol por Cândida guilliermondii. A sistemática contínua de tratamento apresentou-se promissora quando o hidrolisado neutralizado foi percolado ao fluxo de 2,1 VL/h através das colunas de carvão ativo (Alfa LU) e resinas de troca iônica (A-860S, A-500PS e C-150) aquecidas a 30 ºC. Nestas condições além das reduções nas concentrações de fenóis (99,87%), ácido acético (48,57%), furfural (100%), 5-hidroximetilfurfural (100%), a cor do hidrolisado também foi reduzida em 91,97%. Entretanto, as concentrações de metais remanescentes no hidrolisado tratado ainda foram suficientes para interferir negativamente na melhoria da bioconversão de D-xilose em xilitol, mesmo na fermentação utilizando inóculo adaptado.

ABSTRACT

The yeasts that assimilate D-xilose in fermentative processes, such as those from Candida species, are able to produce xylitol, a polyol of sweet taste commercially produced by chemical process. The xylitol is widely applied in the pharmaceutical, odontological and food industries, due to its peculiar properties like its anticariogenicity, insulin-independent metabolism, prevention of osteoporosis and treatment of respiratory diseases. During the bagasse acid hydrolysis necessary to the sugars release from its hemicellulosic fraction, toxic compounds to the yeasts are also released, such as phenols, acetic acid, furfural, 5-hydroxymethylfurfural and metals. The toxicity of these compounds to the yeasts such as inhibition of fermentative activity is mainly attributed to their concentration in the fermentation medium, as well as to their synergistic effect when present in the medium even in low concentrations. In the present work, the main objective was to evaluate the combined system of sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate treatment with active charcoal and ion exchange resins for its use in the biotechnological xylitol production by Candida guilliermondii. The treatment continuous procedure showed to be promising when the neutralized hydrolysate was passed througer flow rate of 2.1 bed vol/h into columns with active charcoal (Alfa LU) and ion exchange resins (A-860S, A-500PS and C-150) heated at 30ºC. Under these conditions, besides the reduction in the concentrations of phenols (99.87%), acetc acid (48,57%), furfural (100%), 5-hydroxymethylfurfural (100%), the color of the hydrolysate was also reduced in 91,97%. However, the metals concentrations remained in the treated hydrolysate were still sufficient to interfere negativity in the improvement of D-xylose into xilitol bioconversion, even in the fermentation using adapted inoculum.

SUMÁRIO

N.º Pág.

1

_I

_NTRODUÇÃO

...

1

2

_R

_EVISÃO

_B

_{IBLIOGRÁFICA}

...

3

2.1 XILITOL... 3

2.2 MÉTODOS DE OBTENÇÃO DO XILITOL... 7

2.2.1 PROCESSO COMERCIAL: VIA QUÍMICA... 7

2.2.2 PROCESSO ALTERNATIVO: VIA BIOTECNOLÓGICA... 7

2.3 MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS... 9

2.3.2 DEGRADAÇÃO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS... 10

2.3.3INFLUÊNCIA DA COMPOSIÇÃO DOS HIDROLISADOS NA UTILIZAÇÃO BIOTECNOLÓGICA... 11

2.3.4 DETOXIFICAÇÃO DOS HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS... 13

2.3.4.1 CARVÃO ATIVO... 14

2.3.4.2 RESINAS DE TROCA IÔNICA... 18

3

_O

_BJETIVOS

...

25

3.1 OBJETIVO GERAL... 25

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 25

4

_M

_{ATERIAL E}

_M

_ÉTODOS

...

26

4.1 OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA... 26

4.1.1 MATÉRIA-PRIMA... 26

4.1.2 HIDRÓLISE ÁCIDA DO BAGAÇO... 26

4.1.3 CONCENTRAÇÃO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA... 28

4.1.4 TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA... 28

4.1.4.1 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE DE TROCA MÁXIMA DAS RESINAS IÔNICAS... 35

4.2 FERMENTAÇÃO... 35

4.2.1 MICRORGANISMO E PREPARO DOS INÓCULOS... 35

4.2.2 MEIO DE FERMENTAÇÃO... 37

4.2.3 CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO... 37

4.3 MÉTODOS ANALÍTICOS... 37

4.3.1 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR... 37

4.3.2 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS (ºBRIX)... 37

4.3.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES E ÁCIDO ACÉTICO... 37

4.3.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FURFURAL E 5-HIDROXIMETILFURFURAL... 38

4.3.5 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS... 38

4.3.6 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS ELEMENTOS METÁLICOS... 39

4.3.7 DETERMINAÇÃO DO PH... 39

4.3.8 MICROGRAFIAS DAS RESINAS DE TROCA IÔNICA... 39

4.4 METODOLOGIA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS... 40

4.4.1 DETERMINAÇÃO DA REMOÇÃO DE AÇÚCARES E COMPOSTOS TÓXICOS... 40

4.4.2 DETERMINAÇÃO DA REMOÇÃO DE COLORAÇÃO DO HIDROLISADO... 40

4.4.3 DETERMINAÇÃO DOS PARÃMETROS FERMENTATIVOS... 42

4.4.4 METODOLOGIA ESTATÍSTICA... 42

5

_R

_ESULTADOS

_E

_D

_ISCUSSÃO

_...

44

5.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO HIDROLISADO... 44

5.2

TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA... 46

5.2.1 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE DE TROCA MÁXIMA DAS RESINAS IÔNICAS... 47

5.2.2 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE MÁXIMA DE ADSORÇÃO DO CARVÃO ATIVO... 49

5.2.3 DETERMINAÇÃO DO VOLUME INICIAL DE HIDROLISADO PARA O TRATAMENTO... 50

5.2.5.1 AVALIAÇÃO DA REMOÇÃO DE AÇÚCARES, COMPOSTOS TÓXICOS E COR... 55

5.2.6 AVALIAÇÃO DAS REMOÇÕES OCORRIDAS NA NEUTRALIZAÇÃO E SISTEMA COMBINADO... 66

5.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 68

5.3.1 ANÁLISE DOS EFEITOS DA TEMPERATURA, FLUXO DE ALIMENTAÇÃO E POSIÇÃO DA COLUNA DE CARVÃO ATIVO... 68

5.3.2 ANÁLISE DA FUNCIONALIDADE DAS COLUNAS NO SISTEMA DE TRATAMENTO... 84

5.3.3 DETERMINAÇÃO DAS CONDIÇÕES OTIMIZADAS... 91

5.3.3.1 MODELAGEM MATEMÁTICA PARA AS REMOÇÕES OBTIDA ATÉ A COLUNA C-150... 95

5.3.2.2 ANÁLISE DA CONDIÇÃO OTIMIZADA... 108

5.4 ANÁLISE FOTOGRÁFICA DAS RESINAS DE TROCA IÔNICA... 114

5.5 FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO TRATADO... 119

6

_C

_{ONCLUSÕES... 125}

7

_S

_{UGESTÕES PARA}

_F

_UTUROS

_T

_{RABALHOS... 126}

8

_R

_EFERÊNCIA

_B

_{IBLIOGRÁFICA... 127}

1. I

NTRODUÇÃO

As pesquisas biotecnológicas para a obtenção de xilitol a partir do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar têm evidenciado que a fermentação do hidrolisado é influenciada por compostos tóxicos como fenóis, ácido acético, furfural e 5-hidroximetilfurfural, em função de suas concentrações aliado a outros fatores como pH e disponibilidade de oxigênio. Esses compostos tóxicos são originados durante a hidrólise ácida do bagaço e têm sido responsáveis pela baixa produtividade do xilitol obtido neste bioprocesso. Com o objetivo de reduzir as suas concentrações ou até eliminá-los, vários tratamentos vêm sendo empregados aos hidrolisados a fim de alcançar condições que proporcionem sua melhor fermentabilidade. Pesquisas recentes conduzidas pelo Departamento de Biotecnologia da FAENQUIL (DEBIQ) demonstraram que as características físico-químicas do carvão ativo associadas às condições de adsorção influenciaram no tratamento descontínuo do hidrolisado de bagaço, uma vez que foi alcançada melhoria da produtividade de xilitol por Candida guilliermondii quando as condições empregadas no tratamento com carvão foram as estabelecidas como as mais adequadas. Os resultados permitiram identificar o perfil adequado do carvão ativo, quanto às características físico-químicas oferecidas pelo fabricante, e os parâmetros mais significativos para remoção dos compostos tóxicos de forma a minimizar a perda de açúcares. Estas informações permitem o avanço do sistema de tratamento para a forma contínua que utiliza-se de carvão ativo do tipo granular disposto em coluna. Além de ser mais simples de operar, este sistema é, para muitos casos reconhecido industrialmente como o mais eficiente além de possuir diversas vantagens em

relação ao sistema descontínuo: (1) tratamento de maiores volumes sem necessidade de grandes tanques e de sistemas de filtros, proporcionando redução no número de equipamentos (melhor aproveitamento do espaço físico) e menor consumo de água, pois não há necessidade de limpeza dos filtros; (2) utilização mais eficiente do carvão ativo, uma vez que mais impurezas são adsorvidas por grama de carvão, reduzindo o gasto; (3) reativação industrial do carvão ativo granular, minimizando perdas desnecessárias e reduzindo custos.

Estudo em paralelo, realizado no DEBIQ, demonstrou que o emprego de diferentes resinas de troca iônica (aniônicas e catiônicas) porém em sistema descontínuo, são eficazes no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Foi constatado que a seqüência envolvendo as resinas aniônicas (A-860S e A-500PS), catiônica (C-150) e aniônica (A-103S), proporcionou maior remoção de compostos tóxicos do hidrolisado em relação às pesquisas anteriormente feitas com carvão ativo pulverizado em condição de sistema descontínuo. Assim, espera-se que a utilização da combinação de carvão ativo granular (Alfa LU) selecionado em função das características que permitem o emprego em sistema contínuo associado à resinas de troca iônica, propicie maior remoção de compostos tóxicos, e clarificação do hidrolisado além de agilizar a sistemática de tratamento que vem sendo empregada e aumentar a produtividade deste bioprocesso. Além disto, espera-se que o estabelecimento desta metodologia contribua para a etapa futura de recuperação do xilitol do meio fermentado de modo a se obter em um curto espaço de tempo o domínio da tecnologia de obtenção deste adoçante por processo biotecnológico.

2. R

EVISÃO

B

IBLIOGRÁFICA

2.1

X

ILITOL

O xilitol é um álcool pentahidroxilado (152,15g/mol), encontrado em cogumelos, frutas e legumes, e também, como intermediário do catabolismo de carboidratos no metabolismo humano e animal (MANZ et al.,1973). No Brasil, em 1980 o xilitol foi aprovado como produto dietético pela Divisão Nacional de Vigilância Sanitária de Medicamentos do Ministério da Saúde (DIMED).

O xilitol apresenta propriedades alimentícia, odontológica e farmacológica que garante-lhe importância econômica e social crescentes, e como conseqüência, o constante estudo para o desenvolvimento de novas formas de obtenção deste insumo de ampla aplicação. O emprego do xilitol em alimentos se deve ao fato deste não possuir grupos aldeído e cetônico em sua molécula, pois assim não provoca aos alimentos reações de escurecimento do tipo Maillard (MANZ et al.,1973). Aliado a esta caracaterística, está o seu elevado poder adoçante (HYVÖNEN et al., 1982), comparável ao da sacarose e superior ao do sorbitol e manitol (BAR,1986), proporcionando o emprego deste poliol nas indústrias alimentícias.

As propriedades odontológicas do xilitol são a atuação anticariogênica e a indução da remineralização do esmalte dos dentes (Figura 2.1). A propriedade anticariogênica deve-se ao fato deste não ser fonte de carbono para microrganismos da flora bucal, em particular a bactéria Streptococcus mutans, responsável pela formação de ácidos que atacam o esmalte dos dentes (MAKINEN et al., 1976; ASSEV et al., 1983; UHARI et al.,2001).

TABELA 2.1 - Propriedades Físico-químicas do xilitol (MANZ et al., 1973; HYVÖNEN et al., 1982; BAR, 1986).

Modelo Molecular de Stuart

Fórmula e Modelos Moleculares

C5H12O5

Modelo Molecular Simples

Massa molar (g/mol) 152,15

Sabor Doce Odor Inodoro Ponto de fusão (ºC) 92 – 96

Ponto de ebulição (ºC) 216

Viscosidade a 20ºC (cP) A 10% : 1,23 ; a 60% : 20,63 Solubilidade a 30ºC 68g/100g solução, igual à sacarose Densidade (g/cm3_{) A 10% : 1,03 ; a 60% : 1,23}

Calor de dissolução +34,8 cal/g (efeito “refrescante”) Poder adoçante Igual a sacarose, superior ao

sorbitol e manitol Valor calórico (Kcal/g) 4,06

Estabilidade Estável a 120ºC e sob condições normais de processamento de alimentos. A caramelização ocorre se aquecido por vários minutos próximo ao ponto de ebulição.

Higroscopicidade Tem umidade relativa alta, o xilitol é mais higroscópico que a sacarose mas menos que o sorbitol

O

H OH

OH OH

FIGURA 2.1 Mecanismos da cárie e de atuação de xilitol.

Segundo UHARI et al. (2001) o xilitol inibe o crescimento desta bactéria devido à ausência do sistema fosfotransferase neste microrganismo. A indução da remineralização do esmalte dos dentes, ocorre pela reversão de lesões recém formadas, já que a composição química da saliva é favoravelmente afetada por este poliol, devido ao aumento significativo de íons cálcio e fosfato (MAKINEN et al., 1976). Estas propriedades, aliadas às alimentícias têm favorecido as indústrias do segmento alimentício e odontológico a utilizarem o xilitol em produtos como, balas, gomas de

- Mecanismo da cárie

- Mecanismo de atuação do Xilitol

Açúcar

(carboidrato fermentecível) ÁCIDOS

pH

diminui DESMINERALIZAÇÃO

XILITOL _ÁcidosSEM pH

aumenta REMINERALIZAÇÃO

Bactérias

[não ocorre fermentação]

perda de Ca2+ _{e PO} 4 3- _{do esmalte do dente} Ca2+ PO₄ 3-Bactérias deposição de Ca2+ _{e PO} 4

3- _{(da saliva) no esmalte do dente}

Ca2+

3-mascar, pastilhas e cremes dentais (PEPPER & OLINGER,1988), sendo estes produtos já comercializados no Brasil.

Como propriedades clínicas têm-se a utilização do xilitol nos casos de diabete, obesos, osteoporose, fibrose cística e otite. O uso de xilitol na dieta de diabéticos é permitido por ele não requerer insulina para seu metabolismo (MAKINEN et al., 1976), além de exercer pequena contribuição para a formação de tecidos gordurosos quando comparado a outros açúcares (YLIKAHRI, 1979). No caso da osteoporose, MATILLA et al. (1998) observaram em experimentos com ratos que a administração oral de xilitol impediu a progressão desta doença proporcionando aumentos da massa óssea e das propriedades bioquímicas de ossos enfraquecidos. Assim, segundo estes autores, a utilização de xilitol torna-se uma nova alternativa que amplia a forma de tratamentos clínicos de prevenção desta doença. Em relação à fibrose cística, doença genética que afeta principalmente os pulmões e o sistema digestivo, ZABNER et al. (2000) constataram que o uso inalatório do xilitol em “spray” reduziu o número de Staphylococcus coagulase na cavidade nasal de voluntários, diminuindo o risco de infecções bacterianas pulmonares. O xilitol tem a sua eficácia também comprovada no tratamento de pacientes com otite pelo fato deste inibir o crescimento de S. pneumoniae impedindo a ligação desta bactéria sobre as células nasofaringeais, esta propriedade foi observada em experimentos clínicos em crianças, onde o xilitol mostrou-se eficiente para prevenir o desenvolvimento de otite com uma dose variando entre 8,4 a 10 g/dia dividida em cinco doses (UHARI et al., 2001; TAPIAINEN et al., 2002). Nestes experimentos obteveram-se eficácias de 40% e 30%, quando o xilitol foi empregado na forma de goma de mascar e xarope, respectivamente. UHARI et al. (2001) observaram ainda que o uso de xilitol na prevenção de otite reduziu consideravelmente a utilização de antibióticos empregados durante o tratamento, contribuindo para a redução de um problema mundial, que é a resistência de bactérias à agentes antimicrobianos causada justamente pelo uso descontrolado dos mesmos.

2.2 MÉTODOS DE OBTENÇÃO DO XILITOL

Em escala comercial, o xilitol é convencionalmente produzido por processo químico, porém para este processo necessita-se de uma solução de D-xilose com um grau de pureza elevado e rigorosa purificação do xilitol (MELAJA & HÄMÄLÄINEN, 1977). Dessa forma, estudos vem sendo realizados para o desenvolvimento de uma tecnologia alternativa de produção de xilitol como a via biotecnológica.

2.2.1 PROCESSO COMERCIAL : VIA QUÍMICA

A produção comercial de xilitol por processo químico consiste na hidrogenação catalítica da xilose pura obtida através da hidrólise de materiais lignocelulósicos (MELAJA & HÄMÄLÄINEN, 1977). De modo geral, são necessárias quatro etapas básicas para realização do processo químico. A primeira etapa, consiste na desintegração de materiais lignocelulósicos ricos em xilana ([C5H8O4]n) através de hidrólise ácida enquanto a segunda, trata-se da separação da xilose (C5H10O5) do hidrolisado por cromatografia líquida, visando obter uma solução de xilose pura. Na terceira etapa ocorre a conversão catalítica da xilose pura em xilitol na presença de níquel como catalisador, e na quarta o xilitol é cristalizado na forma ortorrômbica. O rendimento deste processo, bem como a qualidade do xilitol estão intimamente relacionados com a pureza da solução inicial de xilose, visto que a presença de impurezas interfere no processo de catálise. Além disso, a produção de xilitol por via química requer várias etapas de purificação para a remoção de resíduos do catalisador (níquel), o qual é um metal tóxico e prejudicial à saúde humana, e de subprodutos originados durante o processo de hidrogenação, ocasionando aumento do tempo de processo e encarecimento do produto (MELAJA & HÄMÄLÄINEN, 1977).

2.2.2 PROCESSO ALTERNATIVO : VIA BIOTECNOLÓGICA

A via biotecnológica de obtenção de xilitol passou a ser uma alternativa ao processo químico a partir da descoberta por ONISH e SUZUKI (1966), de leveduras fermentadoras de

xilose. Segundo HAHN-HÄGERDAL et al.(1994), o metabolismo de D-xilose inicia-se com seu transporte pela membrana celular por diferentes mecanismos como o transporte de baixa afinidade é compartilhado entre D-xilose e D-glicose, enquanto que o transporte de alta afinidade é inibido por D-glicose. Porém, em Candida shehatae, o transporte de D-xilose realiza-se tanto por simporte de prótons como também por difusão facilitada. No interior da célula, a xilose é reduzida em xilitol em uma reação catalisada pela enzima xilose redutase (E.C. 1.1.1.21) que cataliza a redução da xilose em xilitol na presença dos cofatores NAD(P)H ou NADH. Posteriormente, o xilitol é oxidado em xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (E.C. 1.1.1.9), que emprega NAD+ _{ou NAD(P)}+ _{como cofator. A xilulose é então fosforilada a xilulose-5-fosfato, que,} na via das fosfopentoses, é convertida em frutose-fosfato. A frutose-fosfato pode ser convertida em piruvato, através da conexão com a via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), ou retornar à via das fosfopentoses (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994). Em C. guilliermondii FTI 20037 foi observado que a enzima xilose redutase é NADPH-dependente e a enzima xilitol desidrogenase é NAD+ _{ou NADP}+_{-dependente (SILVA et al., 1996). Segundo GONG et al. (1983) a redução de} xilose em xilitol e a ativação da via das fosfopentoses em leveduras são controladas pela disponibilidade de NADP+ _{e NADPH, pois a geração de NADP}+ _{durante a redução de D-xilose} pode estimular a atividade da enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase a qual estimula a ativação da via das fosfopentoses. BRUIENBERG et al. (1984) e BARBOSA et al. (1988) constataram que o acúmulo de xilitol na célula e a sua posterior excreção para o meio estão relacionados à regeneração de NADPH.

Várias pesquisas vêm sendo conduzidas para o conhecimento dos fatores reguladores da bioconversão D-xilose em xilitol por C. guilliermondii tanto em meios sintéticos como em hidrolisados hemicelulósicos, dentre estes fatores, descam-se o pH (FELIPE et al.,1997b), concentração do inóculo e temperatura (FELIPE et al.,1997a), concentração inicial de xilose (ROSA et al.,1998) e baixo nível de aeração (ACOSTA et al., 2000). Além destes fatores, compostos tóxicos como fenóis, acido acético, furfural e 5-hidroximetilfurfural presentes nos hidrolisados hemicelulósicos podem inibir a bioconversão de D-xilose em xilitol por C.guilliermondii em função da concentração em que se encontram no meio, requerendo assim a destoxificação

destes (ALVES et al.,1998; CONVERTI et al., 2000; LARSSON et al.,2000; PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL, 2000a; NILVEBRANT et al., 2001, RODRIGUES et al., 2001, VIÑALS, 2001, MARTON et.al., 1998, 2000, 2001a e b, 2002a e b, DANNER et al.,2003).

2.3

M

ATERIAIS

L

IGNOCELULÓSICOS

Dentre os materiais lignocelulósicos utilizados para obtenção de hidrolisados hemicelulósicos, como a palha de arroz (ROBERTO et al., 1994 e 1995), cavacos de eucalipto (PARAJÓ et al., 1996,1997 e 1998) e a palha de trigo (CANILHA, 2002), o bagaço de cana-de-açúcar (FELIPE et al., 1996a e b, 1997a e b; DOMINGUEZ et al., 1996; ALVES et al., 1998; RODRIGUES et al., 2001; VIÑALS, 2001; MARTON, 2002b) destaca-se por apresentar, além da capacidade de regeneração anual, o maior rendimento (aproximadamente 80t/ha), enquanto que trigo, outros subprodutos e árvores geram 1, 2 e 20t/ha, respectivamente (PANDEY et al., 2000).

O bagaço de cana-de-açúcar consiste aproximadamente de 40% de celulose, 35% de hemicelulose e 15% de lignina. A celulose é um polímero linear constituído por unidades de D-glicose unidas por ligaçoes glicosídicas β-1D4. A hemicelulose é um heteropolímero composto

predominantemente por hexoses e pentoses com curtas ramificações tais como D-xilose, D-glicose, L-arabinose e D-galactose, enquanto que a lignina é uma macromolécula polifenólica. (TSAO, 1986). O elevado teor de xilose na fração hemicelulósica do bagaço, o que corresponde em até 80% do total de açúcar nesta fração, é um dos principais fatores que impulsionam o aproveitamento do bagaço em diferentes processos de bioconversão (LADISCH et al.,1983).

Em virtude do momento de crise energética no Brasil, o setor sucroalcooleiro que utilizava-se da queima do bagaço de cana-de-açúcar com o objetivo principal de sua eliminação e conseqüente redução do impacto ambiental, está hoje empregando o bagaço para co-geração de energia elétrica (OSAVA, 2001). Independente deste fato, segundo PANDEY et al., (2000) os processos biotecnológicos de obtenção de etanol, proteínas, enzimas, xilitol que utilizam-se deste material lignocelulósico não requerem grandes quantidades, e portanto permanecem alvo de constantes pesquisas (RODRIGUES et al.,2001; VIÑALS, 2001; MARTON et al., 2002b).

2.3.2 DEGRADAÇÃO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

Segundo PALMQVIST & HANHN-HÄGERDAL, (2000a) as técnicas mais estudadas para degradação destes materiais são a hidrólise enzimática e a ácida. BIELY (1985) relata que um sistema xilanolítico para degradação da fracão hemicelulósica deverá ser constituído das enzimas endo-1,4-β-xilanase, β-xilosidase, α-glucuronidase, α-L-arabinofuranosidase e acetilesterase econtrando-se maiores rendimentos em monossacarídeos do que a hidrólise ácida, porém apresenta maior custo comparado ao da hidrólise ácida (PALMQVIST & HANHN-HÄGERDAL, 2000a).

A hidrólise ácida, a qual envolve o tratamento do material lignocelulósico sob altas temperaturas e condições ácidas é rápida, porém apresenta incovenientes como a não-seletividade, geração de subprodutos (Figura 2.2) e liberação de íons metálicos pesados oriundos da corrosão dos equipamentos (CHUNG, LEE, 1985). Quando a fração hemicelulósica é degradada são liberados os compostos D-xilose , L-arabinose, ácido acético (PARAJÓ et al.,1996, 1997,1998) e metilglucurônico (BIELY, 1985), enquanto que a degradação da celulose resulta em D-glicose (PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, 2000b). Durante a hidrólise ácida ocorre também à degradação dos açúcares gerados e de segmentos da lignina. Segundo PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL (2000b), a hidrólise ácida faz com que D-xilose seja degradada em furfural da mesma forma que 5-hidroximetilfurfural (5-HMF) é formado da degradação de hexoses, como D-glicose, enquanto que ainda há a formação de ácido fórmico pela degradação dos derivados de furano (furfural ou 5-HMF) e ácido levulínico, porém o levulínico ocorre somente pela degradação de 5-HMF. Entre os ácidos alifáticos, o ácido acético proveniente dos agrupamentos acetil da xilana, tem-se destacado por estar presente em maior concentração (RODRIGUES et al.,2001). Além disso, a degradação parcial da lignina resulta na liberação de compostos aromáticos denominados produtos derivados da lignina (PDL) (PARAJÓ et al. ,1996,1997,1998). Entre estes compostos estão ácidos, quinonas, aldeídos e compostos fenólicos, sendo esta última classe formada também pela degradação de carboidratos (LARSSON et al.,2000). Com vistas ao aproveitamento do alto teor de D-xilose presente na fração hemicelulósica, os hidrolisados hemicelulósicos obtidos por hidrólise ácida vem sendo

empregados em pesquisas biotecnológicas para obtenção de vários produtos dentre os quais podemos destacar o xilitol (LADISCH et al.,1983; RODRIGUES et al., 2001). Assim, vários trabalhos têm sido conduzidos para avaliar a influência dos PDL, ácidos alifáticos de cadeia curta e compostos derivados de furano em bioprocessos (PARAJÓ et al.,1996 ,1997,1998; LARSSON et al.,2000; PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL, 2000b; VIRGÍNIO DA SILVA, 2001).

2.3.3 INFLUÊNCIA DA COMPOSIÇÃO DOS HIDROLISADOS NA UTILIZAÇÃO BIOTECNOLÓGICA

Resultados de várias pesquisas confirmam a toxicidade dos compostos fenólicos (PARAJÓ et al. 1996, 1997,1998; LARSSON et al.,2000; DANNER et al.,2003), dos ácidos acético (FELIPE et al.,1995,1997b; ALVES et al., 1998; RODRIGUES et al., 2001; VIRGÍNIO DA SILVA, 2001) e fórmico (LARSSON et al., 1999), dos derivados de furano (furfural e 5-HMF) (LOHMEIER-VOGEL et al., 1998; LARSSON et al., 1999; PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL, 2000b), e dos íons metálicos (PARAJÓ et al., 1998) aos microrganismos. Além disso, a presença de alguns destes compostos, mesmo em baixas concentrações, pode dificultar a utilização biotecnológica dos hidrolisados hemicelulósicos obtidos por hidrólise ácida devido os efeitos tóxicos destes compostos serem potencializados pela atuação conjunta destes sobre a atividade microbiana (RODRIGUES et al., 2001).

Segundo PARAJÓ et al. (1997), os compostos fenólicos são não-voláteis e têm suas concentrações aumentadas durante o processo de concentração dos hidrolisados hemicelulósicos, necessário para aumentar o teor de xilose nestes, resultando em queda na produtividadde de xilitol. PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL (2000a) relataram que o fato da remoção de compostos fenólicos reduzir consideravelmente a inibição da atividade fermentativa, implica que estes compostos são os mais tóxicos presentes nos hidrolisados hemicelulósicos. Para esta afirmação estes autores utilizaram como suporte o estudo de LARSSON et al. (1998), que observaram ser o hidrolisado hemicelulósico de madeira consideravelmente mais inibidor do que um meio de fermentação contendo correspondentes concentrações de ácidos alifáticos, furfural e 5-HMF, porém sem compostos fenólicos. Estes mesmos autores, atribuiram a falta de maior esclarecimento do mecanismo de inibição dos compostos fenólicos à necessidade

de análises quantitativas e qualitativas mais precisas (PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL, 2000b). Conforme HEIPIEPER et al. (1994) citado por PALMQVIST & HAHN-HÄGERDAL, (2000b), os compostos fenólicos atuam a nível de membrana plasmática causando alterações em sua integridade e conseqüentemente a perda de sua propriedade de barreira seletiva.

No que diz respeito à atuação do ácido acético, MAIORELLA et al. (1983) observaram que este inibe o metabolismo de leveduras por interferência química com o transporte de fosfato na membrana, que ocorre por transporte ativo dependente de ATP. Segundo estes autores, a interferência deste ácido está relacionada ao aumento na demanda de ATP para manter esta função, bem como aos efeitos de interferência química quando na presença de baixas concentrações do ácido, o que acarreta a alteração da morfologia celular. VIRGÍNIO DA SILVA, (2001) avaliando o efeito do ácido acético sobre a bioconversão xilose em xilitol por C. guilliermondii em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana constatou que a atuação inibitória deste ácido é dependente não só da sua concentração mas da fase de crescimento da levedura. Segundo a autora, maior efeito tóxico do ácido acético (5,0 g/L) ocorreu quando a exposição destas células ao ácido ocorreu após 12 horas de cultivo, o que correspondeu à fase de máxima atividade metabólica da levedura. A autora atribuiu esta toxicidade a uma possível interação do efeito do ácido com outros compostos tóxicos como furfural, 5-HMF e fenóis, uma vez que maiores valores de rendimento e produtividade de xilitol foram obtidos com a utilização de meio simulando a composição em açúcares do hidrolisado, e apenas o ácido acético como composto tóxico. Em relação ao ácido fórmico, LARSSON et al. (1999) relataram que este é formado da desintegração do furfural quando a hidrólise ocorre sob condições ácidas e elevadas temperaturas, e que possuimaior potencial inibidor sobre a atividade fermentativa de S. cerevisiae que aos ácidos acético e levulínico. Segundo esses autores uma possível explicação para este fato está relacionado com o menor tamanho da molécula de ácido fórmico, o que facilita sua difusão através da membrana celular e resulta em maior toxicidade, enquanto que o ácido levulínico pode ser levemente mais tóxico que o acético devido sua molécula ser mais lipofílica que a molécula do ácido acético, facilitando sua difusão através da membrana celular.

Com relação à toxicidade do furfural, PALMQVIST et al. (2000a) explica por duas suposições: (1ª) a redução de furfural para álcool furfurílico por uma desidrogenase dependente de NADH que possui maior afinidade em realizar a redução de dihidroxicetona-fosfato para glicerol e (2ª) furfural causa inativação da replicação celular. Recentemente, foi proposto para 5-HMF um mecanismo semelhante ao descrito para furfural, visto que a principal conversão deste é para álcool 5-hidroximetil furfurílico, porém em menor velocidade do que furfural, que segundo PALMQVIST e HAHN-HÄGERDAL, (2000b) ocorre provavelmente devido à sua maior dificuldade em ser transportado para o interior da célula. Poucos estudos existem na literatura sobre o efeito dos cátions metálicos no metabolismo de leveduras. WATSON et al. (1996) citados por PARAJÓ et al. (1998) observaram que a presença dos cátions cobre e cromo em concentrações até 0,004g/L e até 0,10g/L, respectivamente, no meio de cultivo sintético de Candida tropicalis, não reduziu a velocidade específica de crescimento máximo (_µmáx), porém quando níquel esteve presente na concentração de 0,10g/L a redução de µmáx foi de 60%.

2.3.4 DETOXIFICAÇÃO DOS HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS

Vários tipos de tratamentos vêm sendo empregados com o objetivo de reduzir as concentrações dos compostos tóxicos presentes nos hidrolisados ou até eliminá-los para a melhoria da fermentabilidade dos hidrolisados de forma ampliar as suas aplicações biotecnológicas. Estes tratamentos podem ser classificados em função da forma de realização (individual ou combinado) e natureza dos agentes empregados (biológico, físico e químico) (Tabela II.1). Entre os tratamentos empregados, a técnica de adsorção em carvão ativo (CONVERTI et al., 2000; GINORIS, 2001; RODRIGUES et al., 2001; MARTON, 2002b; DANNER et al., 2003) e o emprego de resinas de troca iônica (DOMINGUEZ et al.,1996; KULKARNI et al.,1998; NILVEBRANT et al., 2001; VIÑALS, 2001), vêm sendo os procedimentos mais utilizados para destoxificação dos hidrolisados hemicelulósicos.

2.3.4.1 CARVÃO ATIVO

É uma estrutura carbônica a qual é submetida a processos de ativação para adquirir principalmente a melhoria da propriedade de adsorção causada pelo enorme aumento da área superficial de suas partículas, podendo chegar de 600 a 1200m2_{/g (CARBOMAFRA, s.d.). Sua} produção pode ocorrer por processo físico ou químico. Estas denominações estão diretamente ligadas à forma de ativação a qual o material carbonizado é submetido.

O

processo físico de ativação é o mais empregado, e neste caso o carvão produzido passará a exercer a atividade de adsorção física. Esta atividade baseia-se nas forças de Van der Waals, mais precisamente na força de interação intermolecular existente entre todas as moléculas, polar e não polar, a qual foi descoberta no carvão por Fritz London em 1931, denominando-se força London (GREENBANK & SPOTTS,1995). Segundo SWIATKOWSKI (1999) a estrutura interna do carvão ativo, também

FIGURA 2.2 - Grupos funcionais ativos presentes na superfície do carvão ativo (detectados por análise espectrofotométricas de Infra-vermelho e raio-X), (a) aromático, (b) e (c) carboxil-carbonatos, (d) ácido carboxílico, (e) e (f) lactonas cíclicas, (g) e (h) éteres cíclicos, (i) e (j) anidridos cíclicos, (k) quinona, (l) fenol, (m) álcool e (n) cetona (SWIATKOWSKI,1999). O O C OH C O O C O C O C OH O C O O C O O C C C O O O O O O O O OH (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (k) (l) (m) (n)

conhecida como “esqueleto do carvão”, é formada por associações de anéis aromáticos, heterocíclicos e outros grupos funcionais, predominantemente formados por carbono, oxigênio e hidrogênio (Figura 2.2).

Aliado aos fatores relevantes na atividade de adsorção física (temperatura, tempo de contato, agitação, pH e concentração de carvão) as características físico-químicas intrínsecas do carvão, obtidas no processo de fabricação, são determinantes para sua adequada performance (CARBOMAFRA, s.d.; BRASILAC s.d.).

Para adequada aplicação do carvão ativado, existem fatores que devem ser levados em consideração na seleção do tipo mais indicado. Inicialmente se deve definir quanto à forma física do carvão, ou seja, se será o pulverizado ou o granulado. Os carvões ativados pulverizados, devido à sua versatilidade, podem ser usados na maioria das aplicações em fase líquida e necessitam de equipamentos simples. Os carvões pulverizados são mais indicados para casos em que dosagens variadas são requeridas, ou existem dificuldades operacionais para a utilização em colunas, ou ainda a regeneração não é indicada. As condições e uso do carvão ativado pulverizado para o processo a que se destina são determinadas através de testes práticos, através dos quais são obtidos importantes parâmetros, como dosagem do carvão ativado, tempo de contato necessário, temperatura adequada. Já os carvões ativados granulados são indicados para aplicações em fase líquida ou gasosa, sendo que para a fase líquida os de menores granulometrias são preferidos por favorecerem a uniformidade do fluxo, ganhando-se em eficiência. Os granulados são empregados onde existe a necessidade de produção contínua, e a regeneração é um fator de economia que favorece o seu uso. Os carvões ativos granulados são produzidos a partir de matérias-primas duras e processo controlado, resultando em um produto de rígida estrutura e alta dureza, permitindo regenerações sucessivas e reduzindo os custos dos processos que operam em leitos. Quando os carvões ativados granulados são utilizados em colunas, estas podem ser verticais ou horizontais, com operação em série ou paralelo, com fluxo ascendente ou descendente, e o leito pode ser fixo ou pulsante (móvel), cujas combinações de uso serão definidas conforme cada processo (BRASILAC, s.d. ; CARBOMAFRA, s.d.).

É importante considerar que quando é empregado o sistema em colunas em fase líquida, deve ser utilizado fluxo ascendente principalmente quando o líquido apresenta sólidos em suspensão. A obtenção de elevado tempo de residência, pode ser conseguida com adição de mais uma coluna em série, empregando-se sistema de troca tipo cascata, prevendo-se sempre uma coluna em substituição. Este procedimento permite maior garantia para a purificação, uma vez que a última coluna pela qual o fluido passa sempre conterá o carvão ativado mais novo. Quando a vazão é muito elevada, pode-se exigir colunas de tamanhos construtivos e operacionais inadequados, sendo possível então, dividir o fluxo em duas ou mais colunas, fazendo a operação em paralelo. Para sistemas de vazões menores, duas colunas bem dimensionadas atendem perfeitamente às necessidades, pois enquanto uma coluna está adsorvendo, a outra está sendo recuperada, de modo a não prejudicar a continuidade do processo. Contudo, deve-se ter bem definida a principal finalidade do uso do carvão ativado granulado, pois nos casos em que a presença de materiais em suspensão é significativa, a adsorção destes ficará prejudicada devido a obstrução dos poros, podendo ocorrer a saturação (“breaksthrough”) prematura do carvão (CARBOMAFRA ,s.d.).

Com relação à obtenção de máxima eficiência do uso do carvão ativado granulado é importante estabelecer principalmente os parâmetros temperatura e vazão do fluxo de alimentação. A temperatura por influir na solubilidade das substâncias de interesse e a vazão de operação por ser o parâmetro que irá garantir que a coluna não opere com tempo de contato insuficiente e assim, proporcione uma adsorção incompleta. Além do mais, a vazão acima do valor suportado pelo leito, favorece a formação de caminhos preferenciais e quando isto ocorre, parte do fluido passa pela coluna de modo desuniforme, sem tempo para adsorção, prejudicando o bom desempenho do sistema (CARBOMAFRA ,s.d.).

Nas diferentes pesquisas para destoxificação de hidrolisados, a utilização de carvão ativo na forma pulverizada tem sido amplamente empregada. Segundo ALVES et al. (1998) o tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana pela alteração do pH inicial com diferentes ácidos e bases foi melhorado com a utilização de carvão ativo pulverizado SYNHT (2,4%,p/v) o que propiciou a melhoria da produtividade de xilitol por C. guilliermondii. Para o hidrolisado

de eucalipto, CONVERTI et al. (2000) também definiram como melhor condição a alteração de pH, porém seguido do aquecimento a 100ºC e adsorção em carvão ativo pulverizado PROBUS para remoção dos compostos derivados da lignina. Já GINORIZ (2001) encontrou como melhor condição de tratamento do hidrolisado hemicelulósico de eucalipto para obtenção de xilitol, a elevação do pH deste para 3,5 seguido, também, da adsorção em carvão ativo pulverizado SYNTH (2,4%, p/v).

Recentemente, RODRIGUES et al. (2001) estabeleceram o pH 1,0 e temperatura de 70ºC como adequados para a etapa de concentração do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, etapa necessária para aumentar o teor de açúcares no hidrolisado. Os autores observaram que a adsorção em carvão ativo (SYNTH 2,4%) após esta etapa, favoreceu a remoção tanto de ácido acético como de compostos fenólicos, favorecendo a produção de xilitol.

Uma vez que há vários tipos de carvões disponíveis no mercado, pesquisas foram feitas para avaliar quatro marcas de carvões ativos pulverizados nacionais (SYNTH, BRASILAC, CARBOMAFRA e CARVORITE) no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Nesta pesquisa, MARTON (2002b) avaliou os parâmetros temperatura (T), tempo de contato (tc), agitação (A), pH e concentração de carvão (CC), e não foram observadas diferenças significativas em relação à produtividade volumétrica de xilitol (QP) para os diferentes carvões usados no tratamento. Porém, o carvão ativo CDA da BRASILAC foi selecionado entre os carvões avaliados por apresentar a maior relação (área superficial (m2_{/g) /custo por kilo (R$/kg)). A condição} estabelecida de tratamento (T=60ºC, tc=30min, A=100rpm, pH 2,5 e CC=1%) permitiu remoção

média de 44,18% de ácido acético, 76,22% de fenóis, 58,27% de furfural e 59,69% de 5-hidroximetilfurfural. A fermentação deste hidrolisado, após 64 horas, resultou em um consumo

de 94,14% de D-xilose, fator de conversão de D-xilose em xilitol de 0,66g/g e produtividade volumétrica de xilitol de 0,51g/L.h, embora esta produtividade ser ainda considerada baixa em relação à desejada em processos de bioconversão.

2.3.4.2 RESINAS DE TROCA IÔNICA

Entende-se, em geral, por troca iônica a troca de íons de mesmo sinal entre uma solução e um corpo sólido muito insolúvel, em contato com ela. O sólido (trocador de íons) deve conter seus próprios íons para que a troca processe com rapidez, e na extenção suficiente para ter interesse prático, o sólido deve ter uma estrutura molecular aberta, permeável, de modo que os íons e as moléculas da solução possam mover-se para dentro e para fora da estrutura. Os trocadores de íons têm uma natureza complexa e são, na realidade, polímeros. A Figura 2.3 apresenta a estrutura superficial e interna de uma resina aniônica com estrutura macroporosa de poliestireno.

FIGURA 2.3 – Estrutura superficial e interna de uma resina aniônica.

O polímero é portador de uma carga elétrica que é exatamente neutralizada por cargas dos contra-íons. Estes contra-íons são cátions, num trocador de cátions, e ânions, num trocador de ânions. Assim, um trocador de cátions é constituído por um ânion polimérico e cátions ativos, enquanto um trocador de ânions é um cátion polimérico com ânions ativos (VOGEL, 1992).

. Nas estruturas poliméricas estão presentes ligações cruzadas (reticulações) que são responsáveis pela rigidez do polímero, mantendo ligada uma cadeia do polímero e suas vizinhas,

+ -+ + + + + -+ -+ -+ -+ + -+ - + -+ -+ -+ -+ + + -+ -+ -+ -+ + -+ -Íon fixo Contra-íon Estireno Ligações cruzadas Água de hidratação

e os grupos de troca iônica que são suportados pela estrutura polimérica. As propriedades físicas são determinadas, em grande parte, pela densidade de ligações cruzadas, porém não se pode medir diretamente na resina esta densidade, a qual é especificada pela porcentagem do agente de reticulação (divinilbenzeno) na mistura polimerizada. As resinas com muitas ligações cruzadas são em geral mais duras e mais impermeáveis do que os materiais com poucas ligações cruzadas, influenciando a preferência da resina por um íon ao invés de outro (VOGEL, 1992).

Quando os grânulos da resina sólida são colocados em água, há inchamento e a formação de uma estrutura gelificada, mas o inchamento é limitado pela reticulação das ligações cruzadas. A função das unidades de divinilbenzeno é “soldar” as cadeias de poliestireno umas às outras e impedir o inchamento indefinido e a dispersão das cadeias, permitindo que a estrutura resultante torne-se um grande reticulado esponjoso com seus cátions ou ânions ativos firmemente ancorados à estrutura polimérica. Desta forma, pode-se definir uma resina trocadora de cátions como um polímero reticulado, de alto peso molecular contendo grupos sulfônicos, carboxílicos e outros, como parte integrante da resina e um número equivalente de cátions enquanto que uma resina trocadora de ânions é também um polímero reticulado de alto peso molecular porém contendo grupos amina (ou amônio quaternário) como parte integral da rede do polímero e um número equivalente de ânions, como os íons cloreto, hidroxilia e outros (VOGEL, 1992).

Segundo VOGEL (1992), as exigências fundamentais para uma resina útil são:

A resina deve ser suficientemente reticulada para que sua solubilidade seja desprezível A resina deve ser suficientemente hidrofílica para permitir a difusão dos íons através da estrutura, a uma velocidade finita e praticamente utilizável

A resina deve conter um número de grupos trocadores de íons acessíveis e deve ser quimicamente estável

A resina inchada deve ser mais densa que a água.

As resinas de troca iônica permitem trocar os íons não desejáveis da solução problema por aqueles que se encontram saturando os grupos funcionais da resina. Este processo de equilíbrio pode ser representado pela seguinte forma: RA + B B RB + A, onde RA e RB representam as resinas na forma A e B respectivamente e A e B, os íons trocados. As reações de troca iônica são

estequiométricas, reversíveis e possíveis com qualquer composto ionizável. A natureza reversível da reação permite o repetido uso de resinas desde que estas não sofram mudanças substanciais da estrutura e a velocidade da reação depende da seletividade da resina (DECHOW, 1989). Como características principais das resinas encontram-se a não-solubilidade em água e em solventes orgânicos e inorgânicos mais comuns. Em geral as resinas de troca iônica possuem uma estrutura hidrofílica de forma regular e reproduzível, rápida velocidade de troca e estabilidade física em termos de força mecânica e resistência a atrição (HARLAND, 1994).

As resinas de troca iônica são classificadas segundo os grupos ativos em catiônica ácido forte (fortemente ácidas), catiônicas ácido fraco (fracamente ácidas), aniônicas base forte (fortemente básicas) e aniônicas base fraca (fracamente básicas) (Tabela 2.2), e segundo a estrutura polimérica, as resinas podem se classificar em estirênicas ou acrílicas.

TABELA 2.2 - Classificação das resinas de troca iônica

Classificação Grupo funcional Forma iônica Catiônica ácido forte -SO3- -SO3-H+; -SO3-Na+

Catiônica ácido fraco -COO- -COO-H+

Aniônica base forte Tipo1 -CH2N(CH3)3+ -CH2N(CH3)3+Cl- Aniônica base forte Tipo2 CH2N(CH3)2(CH2CH2OH)+ -CH2N(CH3)2(CH2CH2OH)+Cl- Aniônica base fraca -CH2NH(CH3)2+ -CH2NH(CH3)2+Cl-

A capacidade de troca máxima das resinas é um parâmetro importante no processo de troca iônica e varia segundo as características das resinas, relacionando o tamanho dos poros e a área superficial com as características das soluções a serem tratadas (densidade e viscosidade). Esta capacidade é influenciada também pelos canais preferências que podem formar-se no leito das

resinas, pelo fluxo de alimentação empregado, pelas obstruções e pela eficiência da regeneração (VIÑALS, 2001).

A seletividade das resinas depende de fatores como a valência e o tamanho do íon trocado, a forma iônica da resina, a força iônica total da solução, entrecruzamento das resinas, o tipo de grupo funcional e a natureza dos íons não trocados. A seguinte seqüência representa a ordem de afinidade de diferentes resinas por íons que se encontram em soluções diluídas segundo HARLAND (1994):

Resina catiônica ácido forte (estirênica-sulfonato):

Ag

+

> Cs

+

> K

+

> NH

4+

> Na

+

> H

+

>

Li

+

, Ba

2+

> Pb

2+

> Ag

2+

> Sr

2+

> Ca

2+

> Ni

2+

> Cd

2+

> Cu

2+

> Co

2+

> Zn

2+

> Mg

2+

Resina catiônica ácido fraco (acrílicas-carboxilato):

H

+

>> Cu

2+

> Pb

2+

> Ni

2+

> Co

2+

>

Fe

2+

> Ca

2+

> Mg

2+

> Na

+

> K

+

> Cs

+

Resinas aniônicas base forte tipo 1 (estirênica-amônio quaternário):

SO

42-

> HSO

4-

> I

-> NO

3-

> Br

-

> Cl

-

> HCO

3-

> HSiO

3-

> F

-

> HO

-

, SO

42-

> ClO

4-

> ClO

-

> NO

3

-Resinas aniônicas base forte tipo 2 (estirênica-amônio quaternário):

SO

42-

> HSO

4-

> I

-> NO

3-

> Br

-

> Cl

-

> HCO

3-

> HO

-

> HSiO

3-

> F

-

, SO

42-

> ClO

4-

> ClO

-

> NO

3

-Resinas aniônicas base fraca (estirênicas-amina):

OH

-

_{>> SO}

42-

> HSO

4-

> I

-

> NO

3-

>

Br

-

> Cl

-

> F

-Devido às resinas de troca iônica removerem impurezas ácidas presentes nos hidrolisados hemicelulósicos, principalmente o ácido mineral usado no processo de hidrólise através de resina aniônica base fraca trocando os íons Cl- _{e SO}

compostos como corantes, taninos, furanos, ácidos orgânicos, compostos nitrogenados complexos, e inorgânicos como silicatos, cinzas e nitrogenados, elas vêm sendo empregadas para purificação dos diferentes hidrolisados hemicelulósicos (PARAJÓ et al.,1996 e1998).

DOMINGUEZ et al. (1996) avaliaram a combinação de resina catiônica (DOWEX 50WX4) e neutralização com CaCO3 no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana com vista à obtenção de xilitol a partir da levedura mutante Candida sp 11-2. Os resultados demonstraram que o tratamento minimizou a toxicidade do hidrolisado à levedura e favoreceu a formação de xilitol uma vez que foi observado após 96 horas aumento de 10g/L para 28g/L quando comparado ao tratamento em que foi utilizado somente o CaCO3.

KULKARNI et al. (1998a) utilizaram resinas da DUOLITE, catiônica C-20 (H+_{) e aniônica} A-368 (OH-_{), para purificação de xarope de D-xilose obtido de casca de algodão em rama,} empregando-se colunas de vidro encamisadas de 140cm de comprimento por 1,05cm de diâmetro interno, sob diferentes condições de temperatura (30, 40 e 50ºC) e fluxo de alimentação (5, 10 e 15VL/h, VL/h: volume de leito por hora). Observou-se que a temperatura de 30ºC e fluxo de alimentação de 10VL/h com a resina C-20 combinada com a resina A-368 a 40ºC e fluxo de alimentação de 15VL/h, resultou na remoção de 93,6% de fenóis e 100% da coloração. Segundo os autores o fluxo de alimentação influencia na difusão das moléculas, porém a remoção dos fenóis permaneceu com valores de 89,93, 90,97 e 92,97% para os respectivos fluxos de 5, 10 e 15 VL/h.

Em estudo posterior, KULKARNI et al. (1998b) avaliaram a purificação do hidrolisado de casca de algodão através de um tratamento combinado envolvendo carvão ativo pulverizado e as resinas de troca iônica avaliadas no primeiro estudo (C-20 (H+_{) e A-368 (OH}-_{)). O resultado do} pré-tratamento do hidrolisado por carvão ativo favoreceu a remoção de cor em até 75%, entretanto quando este pré-tratamento foi seguido por tratamento com resinas catiônica e aniônica as remoções das concentrações de nitrogênio e fenóis reduziram apenas 0,72 e 0,98%, resultando em 97,3 e 93,6%, respectivamente. Segundo os autores estes resultados demonstram que os compostos removidos pelo carvão ativo, os quais são principalmente complexos colorantes de alto peso molecular, não proporcionam influencias sobre a difusão de compostos nitrogenados

e fenólicos nos leitos das resinas de troca iônica, e, portanto, não favorecem a remoção destes compostos.

NIVELBRANT et al. (2001) estudando a utilização de resinas de troca iônica, aniônica base forte (AG 1-X8, na forma OH-_{), catiônica (AG50W-X8, na forma Na}+_{) e a resina sem grupo} trocador XAD-8, para o tratamento do hidrolisado de madeira, constataram que a remoção dos compostos fenólicos e ácidos alifáticos (acidos fórmico, acético, lático, oxálico e levulínico) está correlacionada com o pH do hidrolisado. A maior remoção de ácidos alifáticos (91%) ocorreu em pH 5,5, e segundo os autores esta remoção foi muito eficiente devido à maioria dos ácidos encontrarem-se na forma ionizada neste pH. Ao aumentar o pH do hidrolisado a remoção diminuiu para 38% devido aos grupos fenólicos encontrarem-se ionizados, e contribuirem aumentando a competição com os ácidos alifáticos pelos sítios catiônicos e, conseqüentemente, a retenção destes ácidos é menor pelo trocador aniônico forte.

VIÑALS (2001) utilizando diferentes resinas de troca iônica (PUROLITE 860S, 500, A-510 na forma Cl-_{, C-155S e C-150 na forma H}+_{, A-103S e resina QUIMCAGUA A-39RAD na forma} OH-_{) no tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana para obtenção} biotecnológica de xilitol, encontrou máxima produtividade volumétrica (0,679 g/L.h) quando o tratamento ocorreu com a seqüência formada pelas resinas aniônicas A-860S e A-500, seguida da catiônica C-150 e finalizada com a resina aniônica fraca A-103S. Para esta condição de melhor produtividade, obteve-se 100% na remoção de ácido acético, 100% na remoção de furfural, 100% na remoção de 5-hidroximetilfurfural, 86,44% na remoção de fenóis e 97,48% na remoção de cor.

Entre as várias aplicações para as resinas de troca iônica, recentemente, pesquisadores brasileiros do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA) da USP, desenvolveram um sistema de produção de água desionizada através de resinas trocadoras de íons como alternativa ao uso de equipamentos de destilação. O sistema desenvolvido por Tavares et al. (2004) é composto pela resina catiônica Amberjet 1200 Na e a aniônica Amberlite IRA 410, em três pares de colunas de acrílico (aniônica e catiônica – separadas) que possuem 1800 mm de comprimento e 183, 152 e 100 mm de diâmetro, denominados respectivamente sistemas 1, 2 e 3. Para garantir a pureza microbiológica da água após a purificação química, foi instalado um equipamento de

desinfecção com ultra-violeta no sistema de produção. Considerando os três sistemas em plena capacidade de operação, pode-se produzir 5 m³/dia de água desmineralizada. Os autores ainda complementam informando que a substituição completa dos destiladores da Instituição dever gerar economia da ordem de R$ 140.000,00 e que atualmente, a economia de água e energia já atinge R$ 75.0000,00/ano.

3. O

BJETIVOS

3.1

O

BJETIVO

G

ERAL

Contribuir para o desenvolvimento de uma sistemática contínua de tratamento do hidrolisado hemicelulósico de bagaço cana que proporcione, além de avanços operacionais, a redução dos compostos tóxicos que interferem na obtenção biotecnológica de xilitol.

3.2

O

BJETIVOS

E

SPECÍFICOS

Avaliar as condições de tratamento do sistema contínuo quanto aos parâmetros temperatura (ºC), fluxo de alimentação (VL/h) e posição da coluna de carvão ativo (CBT) empregando como respostas as remoções de cor e compostos tóxicos (ácido acético, fenóis, furfural e 5-hidroximetilfurfural).

Obter os modelos matemáticos que descrevam a influência das condições operacionais definidas pelos parâmetros temperatura (ºC), fluxo de alimentação (VL/h) e posição da coluna de carvão ativo, nas respostas de remoção de cor e compostos tóxicos.

Avaliar a funcionalidade das colunas do sistema de tratamento quanto as suas capacidades de remoção de cor e compostos tóxicos.

Realizar ensaios de fermentação empregando o hidrolisado tratado pela condição otimizada do sistema de tratamento.

4. M

ATERIAL

E

M

ÉTODOS

4.1

O

BTENÇÃO E

P

REPARO DO

H

IDROLISADO

H

EMICELULÓSICO DE

B

AGAÇO DE

C

ANA 4.1.1 MATÉRIA-PRIMA

O bagaço cana-de-açúcar utilizado foi proveniente da Usina Guarani de Olímpia-SP.

4.1.2 HIDRÓLISE ÁCIDA DO BAGAÇO

Anterior à hidrólise, amostras de bagaço de cana foram secas sob infra-vermelho a 100 ºC, até peso constante, a fim de se determinar o seu teor de umidade. A hidrólise ácida foi realizada na planta piloto do Departamento de Engenharia Química da FAENQUIL em reator de aço inox (AISI 316) equipado com camisa de óleo térmico para aquecimento indireto por resistência elétrica (Figura 4.1). A hidrólise foi realizada conforme metodologia estabelecida por PESSOA JUNIOR et. al., (1997) de acordo com as seguintes condições: temperatura de 121 ºC, por 10 minutos, empregando 100 mg de H2SO4 concentrado por 1 g de matéria seca e uma relação final matéria seca - solução ácida de 1:10. No caso do presente trabalho o reator utilizado foi de maior escala (350 litros) enquanto as condições foram estabelecidas em reator de 25 litros. O hidrolisado obtido foi primeiramente filtrado a vácuo em filtro de porcelana com papel qualitativo, para remoção de massa residual de sólidos (celulose, lignina), e armazenado em câmara fria para posterior caracterização, concentração e tratamento.

FIGURA 4.1 Reator de hidrólise ácida com capacidade volumétrica total de 350 L, equipado com camisa de óleo térmico para aquecimento indireto por resistência elétrica.

4.1.3 CONCENTRAÇÃO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA

O hidrolisado foi concentrado até um fator de concentração (FC) de quatro vezes com a finalidade de elevar a concentração inicial de D-xilose e, como conseqüência, favorecer a bioconversão de D-xilose em xilitol. O procedimento de concentração ocorreu em evaporador a vácuo de 4 litros de capacidade útil a 70 ± 5 ºC (RODRIGUES et al., 2001).

4.1.4 TRATAMENTO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA

O hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana foi tratado empregando a combinação de agente químico com agentes físicos com o objetivo de reduzir ou até eliminar dos composto tóxicos e, como conseqüência, favorecer a bioconversão de D-xilose em xilitol. Esta sistemática de tratamento ocorreu em duas etapas, sendo a primeira a etapa de neutralização com hidróxido de sódio (agente químico) e a segunda definida por um sistema em colunas que associa carvão ativo e resinas de troca iônica (agentes físicos):

AGENTE QUÍMICO: NEUTRALIZAÇÃO

A etapa de neutralização consistiu em elevar o pH inicial do hidrolisado de bagaço de cana para pH 7,0 com hidróxido de sódio (micro-pérolas). Após a neutralização o hidrolisado foi resfriado a 4 ºC por 24 hs, e centrifugado a 2000xg por 30 minutos para remoção do precipitado.

AGENTES FÍSICOS: CARVÃO ATIVO + RESINAS DE TROCA IÔNICA

O sistema que associa carvão ativo e resinas de troca iônica, foi formado por colunas de vidro encamisadas medindo 60 cm de altura por 3,8 cm de diâmetro interno (volume total de 680 mL) com 2 cm de camisa, em sentido vertical, empregando o mesmo volume de leito (VL= 400 mL) em todas as colunas (Figura 4.2). O sistema foi alimentado com fluxo no sentido descendente e com controle de vazão realizado por bomba dosadora digital (Gamma/L, PROMINENT) de alta precisão (Figura 4.3 (A)) e a temperatura das colunas do sistema foi controlada através da recirculação de água empregando banho termostático digital com circulação externa, modelo SP-281 da SPPENCER (Figura 4.3 (B)).

FIGURA 4.2 Sistema formado por carvão ativo e resinas de troca iônica para tratamento do hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana. (Sistema disposto na seqüência inicianda com a coluna de carvão ativo, e seguido pelas resinas 860S, A-500PS, C-150 e A-103S).

FIGURA 4.3 Bomba dosadora digital, modelo Gamma/L, da PROMINET (A) e banho termostático digital com circulação externa de água (SP-281, SPPENCER) (B).

O carvão ativo utilizado foi o carvão granulado Alfa LU (BRASILAC) de granulometria 10x30, o qual foi definido em função do estudo realizado por MARTON (2002). Neste estudo, o autor estudou carvões ativos de diferentes marcas e diferentes propriedades físico-químicas com o objetivo de identificar o carvão mais adequado para tratar o hidrolisado de bagaço de cana. Entre os carvões estudados, foi definido o carvão denominado carbonato delta A (CDA) da BRASILAC. Entretanto, não foi possível utilizar o carvão CDA uma vez que a matéria-prima utilizada na sua produção não garante a dureza suficiente para sua obtenção na forma granular. Desta forma, foi sugerido pela própria empresa produtora dos carvões, BRASILAC Indústrias Químicas, a utilização do carvão ativo Alfa LU por apresentar-se na forma granular e possuir propriedades físico-químicas semelhantes ao do carvão CDA.

As resinas de troca iônica utilizadas foram as fabricadas pela PUROLITE e empregou-se a seqüência definida no estudo de VIÑALS (2001). Após a avaliação de várias resinas em diferentes seqüências, este autor definiu que a seqüência iniciada com as aniônicas base forte tipo 1 A-860S e A-500PS na forma Cl-_{, seguida por uma catiônica, C-150 na forma H}+_{, e} terminando com outra aniônica A-103S na forma OH-_{. A seqüência de resinas de troca iônica} deste trabalho foi definida com a mesma finalidade executada por VIÑALS (2001):

(a) descoloração do hidrolisado com resina aniônica forte A-860S tipo 1, que apresenta estrutura a base de copolímero acrílico e divinilbenzeno, tipo macroporoso, com excepcional capacidade de adsorção de complexos colorantes de alto peso molecular, como os que são encontrados em xaropes de açúcar. A resina A-860S foi especialmente desenvolvida para dar ótima adsorção tanto durante o processo quanto durante a regeneração, de uma vasta gama de complexos colorantes tipicamente encontradas em açúcar como daqueles produzidos pela reação de Maillard ou do regenerante. A eficiência do processo de adsorção é função da porosidade e da estrutura interna da resina, conseqüentemente o processo é melhorado pelo uso de uma resina que é mais resistente à contaminação de orgânicos de alto peso molecular, como a A-860S. Quando um leito de resina poliestirênica macroporosa A-860S, é