CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS
EVERTON OLIVEIRA DE QUEIROZ
Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais
de Coriandrum sativum L. (coentro) e Foeniculum
vulgare Mill. (funcho) sobre cepas de
Cryptococcus neoformans
EVERTON OLIVEIRA DE QUEIROZ
Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais
de Coriandrum sativum L. (coentro) e Foeniculum
vulgare Mill. (funcho) sobre cepas de
Cryptococcus neoformans
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento aos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de concentração: Farmacologia.
Orientadora:
Prof
a. Dr
a. Edeltrudes de Oliveira Lima
Q3a Queiroz, Everton Oliveira de.
Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais de Coriandrum sativum L. (coentro) e Foeniculum vulgare Mill. (funcho) sobre cepas de Cryptococcus neoformans / Everton Oliveira de Queiroz.-- João Pessoa, 2012.
43f.
Ao Ser criador de tudo que existe, que me inspira cada dia a querer viver mais e descobrir novos horizontes e possibilidades. A Ele sou grato por cada dia que nasce e termina, por tudo que já conquistei e pelo que ainda está por vir;
Aos meus familiares que mesmo longe torcem por mim, cuja ajuda é de fundamental importância para que eu permaneça forte na minha caminhada;
AGRADECIMENTOS
À Profª. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima, que acreditou na minha dedicação e aceitou me orientar no Mestrado. Sou muito grato pela orientação, ensinamentos científicos e pelo exemplo de caráter, dedicação, inteligência e humildade;
Ao Prof. Dr. Thúlio Antunes de Arruda, por ter me inserido no mundo da pesquisa científica com produtos naturais e ter me apresentado a minha orientadora; À banca examinadora, nominalmente à Profa. Dra. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, Profa. Dra. Lindomar de Farias Belém, bem como os suplentes, Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida e Profª. Drª. Beatriz Susana Ovruski de Ceballos pela avaliação e contribuições significativas;
A toda equipe do Laboratório de Micologia, à bioquímica Maria de Fátima F. P. Carvalho e aos alunos: Janiere, Zilmara, Valéria, Filipe Oliveira, Felipe Queiroga e Juliana pelo suporte e grande ajuda na realização dos experimentos;
À Janiere Pereira de Sousa, minha colega de laboratório e amiga, pelo incentivo, apoio incondicional e ajuda fundamental para realização deste trabalho. Mas principalmente pelos bons momentos de companheirismo, diversão e ajuda mútua;
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos pelos ensinamentos e atividades desenvolvidas no Mestrado, que fizeram toda a diferença e foram imprescindíveis para minha formação;
Às secretárias do Programa de Pós-graduação, Tânia Alves e Caroline Mangueira, pela presteza, prontidão, atenção e gentileza com que sempre me atenderam;
À Universidade Federal da Paraíba, em especial ao Centro de Ciências da Saúde, ao Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos e a CAPES pela oportunidade de realização do Mestrado;
RESUMO
QUEIROZ, E. O. Atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais de Coriandrum sativum L. (coentro) e Foeniculum vulgare Mill. (funcho) sobre
cepas de Cryptococcus neoformans. 43 p. Dissertação (Mestrado em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos – Área de Concentração: Farmacologia) - Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2012.
Cryptococcus neoformans é uma levedura capaz de provocar no homem uma
infecção denominada criptococose que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos. A infecção geralmente atinge o sistema nervoso central provocando meningoencefalite, de evolução grave e fatal, acompanhada ou não, de lesão pulmonar, fungemia e focos secundários na pele, ossos e rins. Os fármacos de escolha para seu tratamento são geralmente anfotericina B associada a 5-fluocitosina. Entretanto, o aumento da resistência aos antifúngicos disponíveis e a toxicidade provocada por eles levam a busca de novos antifúngicos, fazendo com que os produtos naturais sejam foco de pesquisas na busca de substâncias com propriedades antifúngicas. Desta forma, o estudo teve como objetivo investigar a atividade antifúngica dos óleos essenciais de Coriandrum sativum L. (coentro) e Foeniculum vulgare Mill. (funcho) in vitro sobre 14 cepas de Cryptococcus neoformans. Foram determinadas a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
Concentração Fungicida Mínima (CFM), pela técnica da microdiluição, e avaliados os efeitos dos óleos essenciais sobre a micromorfologia e a curva de morte fúngica de C. neoformans. Foi encontrado para o óleo essencial de C. sativum CIM= 64
µg/mL e CFM= 64 µg/mL, e para o óleo essencial de F. vulgare, CIM= 256 µg/mL e
CFM= 512 µg/mL. Não foram observadas alterações na micromorfologia das cepas ICB 59 e LM 310 da levedura quando submetidas ao contato com os óleos essenciais. Foi constatada, porém uma diminuição na contagem de formas viáveis com aumento das concentrações dos óleos essenciais. Na curva de morte microbiana causada pelo óleo essencial de C. sativum sobre a cepa de C. neoformans LM 310, observou-se um efeito fungicida (redução ≥3 log10UFC/mL a
partir do inóculo inicial), no tempo de 24 horas, na CIMx4; e nas CIMx2 e CIMx4, para a cepa ICB 59. O óleo essencial de F. vulgare, para a cepa LM 310, iniciou sua
atividade fungicida no tempo de 4 horas nas CIMx2 e CIMx4, a CIM foi fungicida a partir de 8 horas. A atividade fungicida para a cepa ICB 59 iniciou-se em 4 horas para todas as concentrações do óleo essencial (CIM, CIMx2 e CIMx4). Os óleos essenciais de C. sativum e F. vulgare apresentaram atividade antifúngica contra
cepas de C. neoformans, portanto, representam uma possibilidade de tornarem-se
novos produtos com potencial efeito antifúngico no tratamento da criptococose. Há, entretanto, necessidade de estudos posteriores que pesquisem aspectos mais aprofundados dos óleos essenciais testados, para que possam ser utilizados na terapêutica.
ABSTRACT
QUEIROZ, E. O. In vitro antifungal activity of essential oils of Coriandrum sativum L. (coriander) and Foeniculum vulgare Mill. (fennel) against strains of Cryptococcus neoformans. 43 p. Dissertation (Master's degree in Natural Products
and Bioactive Synthetics - Concentration Area: Pharmacology) – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2012.
Cryptococcus neoformans is yeast capable of causing infection in humans called
cryptococcosis that primarily affects immunocompromised patients. The infection usually affects the central nervous system causing meningoencephalitis with a severe and fatal evolution, accompanying or not, lung injury, fungemia and secondary outbreaks on the skin, bones and kidneys. The drugs of choice for treatment are usually amphotericin B associated with 5-flucytosine, however, increasing resistance to antifungal agents available and toxicity caused by them lead the search for new antifungals, becoming natural products as focus of studies in the research of substances with antifungal properties. Thus, the study aimed to investigate the antifungal activity of essential oils of Coriandrum sativum
L. (coriander) and Foeniculum vulgare Mill. (fennel) in vitro against 14 strains of Cryptococcus neoformans. The minimum inhibitory concentration (MIC) and
minimum fungicidal concentration (MFC) were determinated by the microdilution technique, and the effects of essential oils on the morphology and time-kill curve of
C. neoformans were evaluated. Was found for the essential oil of C. sativum MIC= 64
µg/mL and MFC= 64 µg/mL, and for the essential oil of F. vulgare, MIC= 256 µg/mL
and MFC= 512 µg/mL. There were no changes in the morphology of LM 310 and ICB 59 strains of the yeast when subjected to contact with essential oils. Has been observed a decrease in count of viable forms with increasing concentrations of essential oils. In the time-kill curve of C. neoformans, compared to the essential oil of C. sativum, was observed fungicidal effect (decrease ≥ 3 log10UFC/mL from the initial
inoculation), at 24 hours, at MICx4 for the strain LM 310, and in MICx2 and MICx4, for the strain ICB 59. The essential oil of F. vulgare, for strain LM 310, began
fungicidal activity at the time of 4 hours in MICx2 and MICx4, the MIC was fungicidal at 8 hours. The fungicidal activity for the strain ICB 59 began in 4 hours for all concentrations of essential oil (MIC, MICx2 and MICx4). The essential oils of C. sativum and F. vulgare has antifungal activity against strains of C. neoformans,
therefore represent a possibility to become new products with antifungal potential in the treatment of cryptococcosis. However, there is need for further studies to search deeper aspects of the essential oils tested, so they can be used in therapy.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
CIM –Concentração Inibitória Mínima
CIMx2 –2 vezes o valor da Concentração Inibitória Mínima CIMx4 –4 vezes o valor da Concentração Inibitória Mínima CFM –Concentração Fungicida Mínima
ASD – Agar Sabouraud dextrose
SIDA –Síndrome da Imunodeficiência Adquirida UFC –Unidades Formadoras de Colônias
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Médias das CIM e CFM dos óleos essenciais de C. sativum e F. vulgare
sobre cepas de C. neoformans...23
Tabela 2: Média das formas viáveis (leveduras) de C. neoformans, por campo
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Micromorfologia da cepa ICB 59 de C. neoformans, após 72h de
incubação...25 Figura 2: Curvas de morte da cepa LM 310 frente ao óleo essencial de C. sativum...26
Figura 3: Curvas de morte da cepa ICB 59 frente ao óleo essencial de C. sativum...27
Figura 4: Curvas de morte da cepa LM 310 frente ao óleo essencial de F. vulgare...28
SUMÁRIO
1 Introdução ... 11
2 Objetivos ... 13
Geral ... 13
Específicos ... 13
3 Fundamentação Teórica ... 14
3.1 Cryptococcus neoformans: morfologia, infecção e aspectos gerais ... ....14
3.2 Produtos naturais como fonte de novos fármacos ... 16
3.3 Coriandrum sativum L.: uma breve revisão ... 16
3.4 Foeniculum vulgare Mill.: aspectos importantes ... 18
4 Metodologia ... 19
4.1 Desenho do estudo ... 19
4.2 Micro-organismos utilizados ... 19
4.3 Meios de cultura ... 19
4.4 Suspensão fúngica e inóculo...19
4.5 Óleos essenciais...20
4.6 Preparação das emulsões dos óleos essenciais...20
4.7 Controle com antifúngico padrão...20
4.8 Estudo da atividade antifúngica dos óleos essenciais...21
4.8.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) - Método da microdiluição...21
4.9 Estudo da micromorfologia das leveduras...22
4.10 Efeito do óleo essencial sobre a curva de morte fúngica...22
5 Resultados e Discussão ... 23
6 Conclusões ... 30
Referências...31
Anexo A...39
Anexo B...40
Anexo C...41
Anexo D...42
1 Introdução
Cryptococcus neoformans é um fungo leveduriforme, de formato oval e
envolvido por uma cápsula de mucopolissacarídeos. Apresenta duas variedades, C. neoformans e C. gattii, responsáveis pela infecção denominada criptococose, que
acomete principalmente o sistema nervoso, mas também pode atingir os pulmões, rins e pele. Apesar de sua baixa incidência, apresenta altos índices de mortalidade, podendo ser contraída por meio da inalação dos esporos da levedura por indivíduos imunocomprometidos (C. neoformans var. neoformans) ou imunocompetentes (C. neoformans var. gattii), de solos contaminados com fezes de pombos ou
provenientes de eucaliptos, respectivamente (CORRÊA et al., 1999; PAPPALARDO; MELHEM, 2003; SIDRIM; ROCHA, 2004; CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008).
O tratamento da criptococose em humanos é feito pela utilização de alguns antifúngicos, como o fluconazol, a anfotericina B e a 5-fluocitosina (PAPPALARDO; MELHEM, 2003; BIVANCO; MACHADO; MARTINS, 2006; CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008). Entretanto, cada vez mais tem aumentado o número de micro-organismos resistentes aos fármacos padrões, levando os pesquisadores a buscar alternativas para desenvolver novos agentes antifúngicos. Nesse contexto, os produtos naturais surgem como uma alternativa promissora, seja pela utilização de seus extratos, componentes isolados ou óleos essenciais, sendo estes últimos reconhecidos pelo seu alto poder antimicrobiano (SIMÕES et al., 2000; ALMEIDA, 2003; SOUZA et al., 2005).
As ervas aromáticas Coriandrum sativum L. e Foeniculum vulgare Mill. têm
sido utilizadas pela população como especiarias, para dar mais sabor, aroma e até conservar alguns alimentos. Ambas pertencem à família Apiaceae/Umbelliferae e
Coriandrum sativum L., popularmente conhecido como coentro, tem sua maior
importância associada ao consumo das folhas frescas, empregadas como condimento (QUER, 1993). Seus frutos/sementes secas também são ricos em óleos essenciais largamente empregados na indústria alimentícia para fabricação de licores, doces e condimentos, bem como na indústria de perfumes e cosméticos (NASCIMENTO; PEREIRA, 2005). A atividade antimicrobiana do seu óleo essencial já tem sido demonstrada em alguns estudos (HAMMER; CARSON; RILEY, 1998; ELGAYYAR et al., 2001; LO CANTORE et al., 2004; MATASYOH; MAIYO; NGURE, 2008).
Foeniculum vulgare Mill., denominado de funcho (PIO CORREIA, l984), tem
suas sementes (frutos) e seu óleo essencial utilizados como flavorizantes em licores, pães, massas, peixes e queijos, bem como componente de cosméticos e produtos farmacêuticos (PICCAGLIA; MAROTTI, 2001). Tem despertado um considerável interesse quanto ao estudo do potencial antioxidante e atividade antimicrobiana do extrato e óleo essencial de suas sementes/frutos, devido seu histórico na medicina popular. Várias evidências de suas atividades antibacterianas e antifúngicas têm sido relatadas em alguns estudos (RUBERTO et al., 2000; ARAQUE; ROJAS; USUBILLAGA, 2007; EL-ADLY; ABADA; GHARIB, 2007; SOYLU et al., 2007).
Frente ao problema apresentado e às possibilidades de novas descobertas que contribuam significativamente para a ciência e para a saúde da população, o estudo tem por objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais
de Coriandrum sativum L. e Foeniculum vulgare Mill. sobre cepas de Cryptococcus neoformans.
2 Objetivos
Objetivo geral
Avaliar a atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais de Coriandrum sativum L. e Foeniculum vulgare Mill. sobre cepas de Cryptococcus neofomans
Objetivos específicos
Determinar as Concentrações Inibitória e Fungicida Mínimas (CIM e CFM) dos óleos essenciais sobre as cepas avaliadas
Verificar possíveis alterações morfológicas no fungo leveduriforme frente aos óleos essenciais
3 Fundamentação Teórica
3.1 Cryptococcus neoformans: morfologia, infecção e aspectos gerais
O fungo Cryptococcus neoformans apresenta-se como uma levedura globosa
ou ovalada, com 3 a 8µm de diâmetro, com brotamento único ou múltiplo, de colo estreito, e envolvida por uma característica cápsula mucopolissacáride. Apresenta-se como colônia de cor branca a creme, brilhante, de textura mucóide, margem lisa e inteira, crescendo bem após três dias à temperatura de 25 a 37ºC, em cultivo nos meios como Agar Sabouraud glicose 2% e Agar extrato de malte e levedura. O componente capsular predominante é a glucuronoxilomanana, determinante dos seus sorotipos (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008). A utilização da tinta Nanquim para confecção de esfregaços do material gelatinoso fresco permite a visualização da cápsula, que não se cora, cujos polissacarídeos conferem um aspecto gelatinoso (QUEIROZ et al., 2008).
C. neoformans apresenta cinco sorotipos: A, B, C, D e AD, de duas
variedades denominadas C. neoformans var. neoformans (A, D e AD) e C. neoformans var. gattii (B e C), ambas apresentando a capacidade de produzir
melanina com a formação de colônias marrons no meio Agar niger (PAPPALARDO;
MELHEM, 2003; CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008). Trata-se de um fungo que vive como sapróbio no meio ambiente: em solos contaminados com fezes de pombos (C. neoformans var. neoformans) e junto a eucaliptos (C. neoformans var. gattii), sendo que a infecção criptococócica mais freqüentemente ocorre em
pacientes imunodeprimidos (C. neoformans var. neoformans, fungo oportunista),
mas também pode ocorrer em hospedeiros imunocompetentes (C. neoformans var. gattii, patógeno primário) (CORRÊA et al., 1999).
países desenvolvidos chegando a 43% nos países em desenvolvimento como a Tailândia, levando o portador a um tempo médio de sobrevida de 14 dias (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008).
Em humanos, a criptococose é mais frequente em adultos, mas apesar de rara pode afetar crianças, sendo diagnosticada, majoritariamente, em pacientes com imunodepressão celular, como os soropositivos. Nos últimos anos, o aumento do número de casos da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) foi acompanhado pelo aumento da incidência de criptococose (PAPPALARDO; MELHEM, 2003). Dessa forma, esta micose é atualmente considerada a doença oportunista com maior morbidade e mortalidade entre os pacientes soropositivos (QUEIROZ et al., 2008).
Dentre os principais fatores de virulência de C. neoformans destacam-se a
termotolerância, os componentes da parede celular e da cápsula, a capacidade de adesão e a produção de enzimas (KUROKAWA; SUGIZAKI; PERAÇOLI, 1998). Tanto a parede celular como a cápsula sintetizada pelos fungos, são estruturas que protegem os microrganismos do sistema de defesa do hospedeiro. A produção de melanina que se deposita na parede do fungo é proveniente de substratos contendo dopamina e da ação de enzimas como a fenoloxidase. Como o cérebro é rico em substratos para a fenoloxidase, como a dopamina, isto poderia ser responsável pelo tropismo destes organismos pelo sistema nervoso (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008).
No tratamento de humanos, tanto imunocompetentes quanto imunocomprometidos, é utilizada a anfotericina B em associação com a 5-fluocitosina, em infecções disseminadas, ou fluconazol e itraconazol, como alternativa para o tratamento de infecções cutâneas (PAPPALARDO; MELHEM, 2003; BIVANCO; MACHADO; MARTINS, 2006; CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008). No entanto, o aumento crescente de indivíduos imunodeprimidos, os efeitos colaterais causados pelos fármacos utilizados no tratamento desta infecção (QUEIROZ et al., 2008), além do desenvolvimento de tolerância ou resistência do C. neoformans aos antifúngicos convencionais, tem levado os pesquisadores a buscar
3.2Produtos naturais como fonte de novos fármacos
A utilização de plantas medicinais pelo homem tem sido uma alternativa na busca de prevenir e curar doenças. A Fitoterapia vem sendo difundida desde o seu surgimento, principalmente por raizeiros, curandeiros e benzedeiras, através de ensinamentos a populações que às vezes só tem acesso a este recurso terapêutico. Seu nascimento está intimamente ligado à origem da humanidade, confundindo-se com a própria história da civilização humana (ALMEIDA, 2003).
A alegação de que algumas plantas exercem um dado efeito terapêutico em humanos pode constituir uma valiosa informação para a descoberta de fármacos, já que seu uso pela população funciona como uma pré-triagem quanto a sua utilização em humanos, dando um direcionamento para uma determinada ação terapêutica e reduzindo significativamente os investimentos em tempo e dinheiro, mesmo assim não se pode descartar que por ser um produto natural seja destituído de toxicidade. (ALMEIDA, 2003; SIMÕES et al., 2000).
Em estudos de cunho científico algumas ervas aromáticas e seus produtos derivados (extratos, óleos essenciais, constituintes químicos) tem sempre mostrado resultados satisfatórios na inibição de microrganismos patógenos oportunistas, patógenos primários, deteriorantes, e/ou na inibição da produção de toxinas microbianas (SOUZA et al., 2005).
Os óleos essenciais são originados do metabolismo secundário das plantas e possuem composição química complexa, destacando-se a presença de terpenos e fenilpropanoides (GONÇALVES et al., 2003; SILVA et al., 2003). Constituem os elementos voláteis contidos em muitos órgãos vegetais, e estão relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência de muitas plantas, exercendo papel fundamental na defesa contra microrganismos (SIQUI; SAMPAIO; SOUSA, 2000). Tem sido estabelecido cientificamente que cerca de 35% dos óleos essenciais exibem propriedades antibacterianas e 60% possuem propriedades antifúngicas (BHAVANANI; BALLOW, 1992).
3.3 Coriandrum sativum L.: uma breve revisão
Coriandrum sativum L., popularmente conhecido como coentro, é uma
família Apiaceae/Umbelliferae (JOLY, 2002) e sua maior importância no país está
associada ao consumo das folhas frescas, empregadas como condimento de intenso aroma. A palavra “coentro” deriva do grego kóris (Koriandron) que significa
percevejo (CORRÊA, 1984) devido ao acentuado aroma das folhas, flores e sementes. Trata-se de uma erva anual, glabra, com a raiz pivotante do tipo fusiforme e que pode atingir alturas que vão de 30 a 60 cm na fase vegetativa e até 140 cm durante a floração. A espécie possui caule ereto e simpodial. Os galhos possuem coloração verde, podendo se tornar violeta durante a época da floração, e terminam com uma inflorescência. O galho da planta adulta é oco e sua base pode ter até 2,0 cm de diâmetro (DEIDERICHSEN, 1996; NASCIMENTO; PEREIRA, 2005).
Amplamente consumido no Brasil, é indispensável à culinária das regiões Norte e Nordeste, como parte de vários pratos típicos, sendo consumido in natura
(folhas e ramos verdes) ou na forma de sementes (inteiras ou moídas), onde encontra condições climáticas favoráveis ao cultivo durante todo o ano, já que é uma espécie de clima quente, intolerante a baixas temperaturas. Entretanto, seu cultivo e uso têm se tornado popular também em outras regiões do país (WANDERLEY JÚNIOR; MELO, 2003; NASCIMENTO; PEREIRA, 2005). Os frutos ou as sementes secas também são ricos em óleos essenciais com aroma e sabor muito apreciados e largamente empregados na indústria alimentícia para a fabricação de licores, doces e condimentos e também na indústria de perfumes e cosméticos (NASCIMENTO; PEREIRA, 2005).
Utilizado na preparação de infusões atua como analgésico, antiespasmódico, antigripal e diurético. Do C. sativum obtém-se um óleo essencial, o linalol, que é
utilizado na produção de fármacos e também para corrigir o aroma e sabor de alguns medicamentos (QUER, 1993; NASCIMENTO; PEREIRA, 2005). Numerosos estudos têm sido propostos para analisar a composição química e as atividades farmacológicas do seu óleo essencial, que contém importantes compostos bioativos com efeito antimicrobiano e antioxidante (ZHOU et al., 2011).
A atividade antimicrobiana do óleo essencial de C. sativum, tem sido
demonstrada em alguns estudos, apresentando ação sobre bacterias Gram-positivas/negativas e alguns fungos, como Candida albicans (HAMMER; CARSON;
RILEY, 1998; ELGAYYAR et al., 2001; LO CANTORE et al., 2004; MATASYOH;
3.4 Foeniculum vulgare Mill.: aspectos importantes
Foeniculum vulgare Mill. é uma das mais conhecidas plantas da família Apiaceae/Umbelliferare. Trata-se de uma erva perene nativa da região do
Mediterrâneo (TUTIN, 1976; MIRALDI, 1999), mas atualmente, tanto a espécie cultivada, quanto selvagem, pode ser encontrada em várias áreas do mundo com altas temperaturas. Sua utilização data de tempos ancestrais na Índia, Roma e Grécia (KRISHNA DE, 2004). F. vulgare ocorre com frequência em Portugal e na
Espanha, sendo cultivado em diversos países da Ásia, norte da África e América do Sul (COSTA, 1994; CZYGAN et al.,1994). Conhecido popularmente como funcho, foi
introduzido no sul do Brasil pelos colonos no século XVI (PIO CORREIA, l984), existindo grandes culturas nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná (CRUZ, 1964; MATHIAS; CONSTANTE; ARAUJO, 1972).
Segundo Muckensturm et al. (1997), a espécie F. vulgare pode ser dividida
em duas subespécies, piperitum e vulgare, sendo que a subespécie vulgare é
reconhecida por quatro variedades e uma destas variedades (variedade vulgare)
dividida em três quimiotipos: estragol, estragol/anetol e anetol. Suas sementes (frutos) e seu óleo essencial são usados como flavorizantes em licores, pães, massas, peixes e queijos, bem como componente de cosméticos e produtos farmacêuticos (PICCAGLIA; MAROTTI, 2001). O funcho apresenta uma longa história de uso medicinal. Tradicionalmente, suas sementes (frutos) são utilizadas como agente anti-inflamatório, analgésico, carminativo, diurético e antiespasmódico. Recentemente, F. vulgare tem despertado um considerável interesse para estudo do
4 Metodologia
4.1 Desenho do estudo
Trata-se de um estudo experimental realizado no Laboratório de Micologia do Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde - CCS, da Universidade Federal da Paraíba - UFPB, durante o período de outubro de 2010 a outubro de 2011.
4.2 Micro-organismos utilizados
Foram utilizadas 14 cepas da levedura C. neoformans: FGF 3, FGF 5, FCF
10, FCF 102, FCF 119, ICB 59, LM 5, LM 109, LM 309, LM 310, LM 1909, LM 2301, LM 2601 e JM 10 (todas pertencentes ao estoque do laboratório de Micologia). As cepas foram mantidas em Agar Sabouraud dextrose e estocadas a 4ºC (geladeira) e 35ºC (estufa).
4.3 Meios de cultura
Foram utilizados os meios Agar Sabouraud dextrose – ASD e Caldo Sabouraud dextrose (DIFCO Laboratories LTDA), os quais foram preparados conforme instruções do fabricante.
4.4 Suspensão fúngica e inóculo
Durante a realização dos ensaios, as cepas foram mantidas em Agar Sabouraud dextrose – ASD e incubadas a 35°C/24-72 horas. Para a obtenção do inóculo, selecionou-se 3 a 5 colônias semelhantes, as quais foram transferidas para 5 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% (Farmax: Distribuidora Amaral Ltda/ Minas Gerais) estéril, de modo a produzir uma leve turvação, de densidade visualmente equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland, obtendo-se assim um inóculo de concentração aproximada de 106UFC/mL. Essa suspensão foi utilizada
4.5 Óleos essenciais
Foram utilizados os óleos essenciais de C. sativum e F. vulgare, selecionados
para os ensaios de atividade antifúngica por meio de uma triagem realizada anteriormente com 14 óleos essenciais disponíveis no próprio Laboratório de Micologia/CCS/UFPB. O óleo essencial de C. sativum foi adquirido da FERQUIMA
Ind. e Com. Ltda. (Vargem Grande Paulista - SP); e o de F. vulgare, cedido pelo
professor Paulo Alves Wanderley, do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia da Paraíba – IFPB de Sousa, PB.
4.6 Preparação das emulsões dos óleos essenciais
Foram preparados 5 mL da emulsão de cada óleo essencial, no momento da execução dos ensaios. Os óleos essenciais foram diluídos conforme protocolo recomendado por Allegrini et al.,1973. Em um tubo estéril foi adicionado o óleo essencial em estudo, solubilizado em 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) e 2% Tween 80 (INLAB/Indústria Brasileira). Em seguida, foi adicionada água destilada esterilizada, em quantidade suficiente para 5 mL, e posteriormente, agitado por 5 minutos usando-se aparelho agitador tipo Vórtex (Fanem), para obtenção da concentração desejada (1024 µg/mL).
4.7 Controle com antifúngico padrão
Para o controle dos ensaios com C. neoformans foi utilizada uma associação
de anfotericina B com 5-fluocitosina (PAPPALARDO; MELHEM, 2003; BIVANCO; MACHADO; MARTINS, 2006; CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008), os quais foram adquiridos do Centro de Controle e Produtos para Diagnósticos Ltda. (CECON/SP). Foi preparada uma emulsão semelhante a dos óleos essenciais, contendo 100µg/mL de anfotericina B e 10 µg/mL de 5-fluocitosina (CIMs determinadas pela CECON/SP), solubilizados em 5% de dimetilsulfóxido (DMSO) e 2% Tween 80 (INLAB/Indústria Brasileira), acrescidos de água destilada esterilizada em quantidade suficiente para 5 mL.
4.8 Estudo da atividade antifúngica dos óleos essenciais
4.8.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) - Método da microdiluição
O teste foi realizado em placas estéreis de microtitulação (CRALPLAST) que contém 96 cavidades organizadas em oito séries identificadas de A a H, cada qual com doze cavidades numeradas de 1 a 12. Em cada cavidade da microplaca foram dispensados 100 L do caldo Sabouraud dextrose duplamente concentrado e na cavidade da linha A, adicionado 100 L da solução do óleo essencial na concentração inicial (1024 g/mL). Em seguida, foram feitas as diluições seriadas, transferindo-se 100 L para as nove cavidades consecutivas (1-9), para obtenção das várias concentrações do óleo. A penúltima cavidade (11) foi deixada sem o óleo essencial, usada como controle positivo (viabilidade da cepa) e na última cavidade (12) foi adicionado 100 L da associação dos antifúngicos, para o controle. Posteriormente, em cada cavidade, foi adicionado 10 L do inóculo da levedura, sendo cada coluna referente a uma cepa fúngica. As placas foram assepticamente seladas e incubadas a 35 °C por 24-72 horas. Após o período de incubação, procedeu-se a realização da leitura através de comparação visual. A CIM foi considerada a menor concentração do óleo capaz de inibir 100% do crescimento de cada levedura, tendo como referência o seu respectivo controle positivo (VILJOEN et al., 2003; SAHIN et al., 2004; LONGHINI et al., 2007; SCORZONI et al., 2007).
Para determinação da CFM, foram colocados em uma microplaca 100 L do caldo Sabouraud dextrose, seguindo a mesma sequência para determinação da CIM. E em seguida foi adicionado nas primeiras cavidades, 10 L da suspensão de leveduras referente a CIM (retirados da placa utilizada no ensaio anterior - determinação da CIM) e nas duas próximas cavidades foram adicionados 10 L das concentrações CIMx2 e CIMx4, referentes a cada cepa. As microplacas foram incubadas a 35 °C por 24-72 horas e em seguida, realizada a leitura. A CFM foi considerada a concentração que inibiu 100% do crescimento das leveduras neste ensaio.
4.9 Estudo da micromorfologia das leveduras
Em lâminas de vidro estéreis foram colocados 10 L de solução salina a 0,9% (Farmax: Distribuidora Amaral Ltda/ Minas Gerais), 10 L de cada suspensão fúngica preparada no ensaio para determinação da CIM (contendo quatro vezes, duas vezes e o valor exato da CIM, o controle positivo e o negativo), após 24, 48 e 72 horas de incubação e, em seguida, foram adicionados 10 L de tinta Nanquim/ tinta da China para evidenciar a cápsula da levedura (CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE, 2008; QUEIROZ et al., 2008). As lâminas foram examinadas em microscópio óptico na objetiva de 40x para se observar possíveis alterações na morfologia das leveduras. Além disso, foi realizada uma contagem das leveduras viáveis em cinco campos de cada lâmina, obtendo-se uma média.
4.10 Efeito do óleo essencial sobre a curva de morte fúngica
O estudo da atividade do óleo essencial sobre a curva de morte das leveduras foi realizado com os valores de CIM obtidos anteriormente. Foi utilizado para realização desse experimento o método de contagem de células viáveis. Inicialmente, 1 mL da suspensão da levedura (106 UFC/mL) foi inoculado em 4 mL do caldo Sabouraud dextrose. Em seguida, adicionados em cada tubo, 5 mL da emulsão do óleo essencial com concentrações de quatro vezes, duas vezes e com o valor exato da CIM. O volume final obtido foi de 10 mL. O sistema foi agitado por 30 segundos no aparelho Vortex e incubado a 35 °C. Em diferentes intervalos de tempo (0, 2, 4, 8 e 24 horas) pós-adicionamento dos óleos essenciais, 0,1mL da mistura foi uniformemente inoculada em placas de Petri contendo Agar Sabouraud dextrose, e incubada a 35 °C por 24-72 horas. No final do período de incubação, o número médio de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/mL) foi contado e comparado com o que se verifica nos ensaios para controle positivo (em que a emulsão do óleo essencial se faz ausente) e negativo (em que a emulsão do óleo essencial foi substituída pelos antifúngicos). Todos os testes foram realizados em duplicata e o resultado, a média das duas repetições, expresso em log10UFC/mL (ARORA; KAUR,
5 Resultados e Discussão
A tabela 1 apresenta os valores médios encontrados para a CIM e CFM dos óleos essenciais sobre as diferentes cepas da levedura. Foi encontrado para o óleo essencial de C. sativum uma CIM= 64µg/mL e uma CFM= 64 µg/mL, e para o óleo
essencial de F. vulgare, CIM= 256 µg/mL e CFM= 512 µg/mL (considerando-se os
valores capazes de inibir 100% das cepas - excetuando-se a cepa LM 109), além disso, concentrações menores foram encontradas inibindo uma boa porcentagem das leveduras.
Tabela 1: Médias dasCIM e CFM dos óleos essenciais de C. sativum e F. vulgare sobre
cepas de C. neoformans.
C. neoformans
Óleos essenciais (µg/mL)
Controle do crescimento
Anfotericina B (100 µg/mL) + 5-fluocitosina
(10 µg/mL)
C. sativum F. vulgare
CIM CFM CIM CFM
FGF 3 32 32 256 256 + -
FGF 5 32 32 256 256 + -
FCF 10 32 64 128 128 + -
FCF 102 64 64 256 256 + -
FCF 119 32 32 256 256 + -
ICB 59 32 32 128 512 + -
LM 5 32 64 256 512 + -
LM 109 64 256 256 1024 + -
LM 309 64 64 256 256 + -
LM 310 32 32 128 128 + -
LM 1909 32 64 128 128 + -
LM 2301 64 64 128 128 + -
LM 2601 64 64 128 128 + -
JM 10 64 64 128 128 + -
O método da microdiluição, utilizado neste experimento, é considerado um dos melhores para determinação da CIM in vitro, por apresentar características
métodos descritos na literatura, além de requerer uma pequena quantidade de amostra, poder ser utilizado em um grande número de cepas e deixar um registro permanente (ELOFF, 1998).
De acordo com Holetz et al. (2002), que propõe uma escala para classificar as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM), os produtos naturais testados que apresentarem CIM abaixo de 100 µg/mL têm atividade antimicrobiana considerada boa, entre 100 µg/mL e 500 µg/mL, moderada, entre 500 µg/mL e 1000 µg/mL, fraca e acima de 1000 µg/mL, inativa.
Tomando-se por base tal escala, o óleo essencial de C. sativum apresentou
uma boa atividade antifúngica (CIM= 64 µg/mL), enquanto a atividade do óleo essencial de F. vulgare sobre as cepas da levedura foi considerada moderada (CIM=
256 µg/mL).
De acordo com estudo de Begnami et al. (2010) que avaliou o efeito antifúngico do óleo essencial de C. sativum contra espécies de Candida, foram
encontrados valores de CIM que variaram de 125 µg/mL (para C. parapsilosis CBS
604) a 500 µg/mL (para C. albicans CBS 562). Já no estudo de Matasyoh et al.
(2008), foi encontrada uma CIM de 163 mg/ml do mesmo óleo essencial em questão sobre C. albicans. Desta forma, um resultado importante foi encontrado no presente
estudo, com um valor de CIM bem menor do óleo essencial de C. sativum frente a
cepas de C. neoformans.
Quanto ao óleo essencial de F. vulgare, estudo realizado por Anwar et al.
(2009), avaliando seu efeito sobre bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos, encontrou valores de CIM que variaram de 62,6 µg/mL (sobre Bacillus subtilis) e 259,3 µg/mL (sobre Escherichia coli). Pode-se afirmar que um ótimo
resultado foi evidenciado neste estudo, que encontrou uma CIM de 256 µg/mL do mesmo óleo essencial sobre cepas do fungo leveduriforme C. neoformans, que
demonstra certa resistência a alguns antifúngicos devido à presença de uma cápsula espessa.
Tabela 2: Média das formas viáveis (leveduras) de C. neoformans, por campo
(objetiva de 40x),no estudo da micromorfologia.
Cepas ICB 59 LM 310
Tempos de incubação 24h 48h 72h 24h 48h 72h
Controle (Levedura) 14 46 56 21 66 54
C. sativum
CIM 8 35 13 19 42 13
CIM X 2 7 27 12 15 34 11
CIM X 4 9 24 6 13 23 9
F. vulgare
CIM 15 26 9 18 29 17
CIM X 2 13 22 10 18 21 11
CIM X 4 11 19 7 16 19 9
Anfotericina B + 5-fluocitosina 1 1 1 2 2 1
C. neoformans permaneceu com sua cápsula inalterada mesmo após o tempo
de 72h de incubação e na maior concentração dos óleos essenciais testados, bem como na presença dos antifúngicos padrões (Figura 1).
Figura 1: Micromorfologia da cepa ICB 59 de C. neoformans, após 72h de incubação:
A) Controle da levedura; B) Na presença do óleo essencial de C. sativum (CIMx4);
C) Na presença do óleo essencial de F. vulgare (CIMx4); D) Na presença dos
Na patogenicidade do C. neoformans a formação desta cápsula espessa
possui um papel importante (CHANG; KWON-CHUNG, 1994), porque seus polissacarídeos (glucuronoxilomana, galactoxilomanana e manoproteínas) apresentam vários efeitos imunomodulatórios sobre a resposta do hospedeiro, como inibição da fagocitose, supressão da imunidade mediada por células T e tolerância imunogênica. Entre os mecanismos que resultam neste fenômeno, encontra-se a interferência desses polissacarídeos na migração de leucócitos e neutrófilos por quimiotaxia devido à dessensibilização de seus receptores, impedindo que os mesmos deixem a circulação sanguínea e migrem para o local da inflamação (ELLERBROEK et al., 2004).
Os óleos essenciais, por serem compostos hidrofóbicos, poderiam exercer sua ação antimicrobiana desorganizando ou até mesmo rompendo a membrana do micro-organismo (BRULL; COOTE, 1999). Entretanto, há outros modos de ação antifúngica dos compostos oriundos de plantas, envolvendo granulação citoplasmática e a inativação e/ou inibição de enzimas intra e extracelulares (STANGARLIN; FREITAS; CRUZ, 1999). Portanto, sugere-se que os óleos essenciais possam ter atuado por algum desses mecanismos, pois mesmo sem promoverem alterações na cápsula polissacarídica, foram capazes de exercer efeito fungistático e/ou fungicida sobre C. neoformans.
As figuras 2 e 3 apresentam, respectivamente, as curvas de morte fúngica das cepas LM 310 e ICB 59 frente ao óleo essencial de C. sativum.
0 4 8 12 16 20 24
101 102 103 104 105 106 107 108 Controle Antifúngico CIM
CIM x 2 CIM x 4
Limite de detecção
Tempo (h) lo g10 U F C /m L
0 4 8 12 16 20 24 101 102 103 104 105 106 107 108 Controle Antifúngico CIM CIM x 2 CIM x 4
Limite de detecção
Tempo (h) lo g10 U F C /m L
Figura 3: Curvas de morte da cepa ICB 59 frente ao óleo essencial de C. sativum.
Na avaliação das curvas de morte fúngica foi considerada atividade fungicida dos produtos quando estes promoveram uma redução no crescimento da levedura maior ou igual a 3 log10UFC/mL (≥ 99,9%) e atividade fungistática quando houve
uma redução no crescimento menor que 3 log10UFC/mL (< 99,9%) UFC/mL, em
relação ao inóculo inicial (KLEPSER et al., 1998; KEELE et al., 2001; ERNST et al., 2002).
Os resultados apresentados nas figuras 2 e 3 são semelhantes. O óleo essencial de C. sativum manteve baixa a taxa de multiplicação das leveduras, cerca de 2
log10UFC/mL abaixo da concentração inicial nas primeiras 8 horas, apresentando
efeito fungistático para ambas as cepas. Atividade fungicida foi observada no tempo de 24 horas, na CIMx4, para a cepa LM 310, e nas CIMx2 e CIMx4, para a cepa ICB 59, levando, neste último caso, a contagem de colônias ao limite de detecção.
O efeito do óleo essencial divergiu da associação de antifúngicos padrão, pois esta iniciou sua atividade antifúngica em 2 horas, mantendo a contagem de colônias sempre no limite de detecção para as duas cepas.
No estudo da curva de morte fúngica utilizando-se o óleo essencial de F. vulgare
0 4 8 12 16 20 24 101 102 103 104 105 106 107 108 Controle Antifúngico CIM
CIM x 2 CIM x 4
Limite de detecção
Tempo (h) lo g10 U F C /m L
Figura 4: Curvas de morte da cepa LM 310 frente ao óleo essencial de F. vulgare.
0 4 8 12 16 20 24
101 102 103 104 105 106 107 108 Controle Antifúngico CIM
CIM x 2 CIM x 4
Limite de detecção
Tempo (h) lo g10 U F C /m L
Figura 5: Curvas de morte da cepa ICB 59 frente ao óleo essencial de F.vulgare.
Para a cepa LM 310 o óleo essencial (CIMx2 e CIMx4) iniciou sua atividade fungicida no tempo de 4 horas após contato com a levedura, a CIM foi fungicida a partir de 8 horas. A atividade fungicida para a cepa ICB 59 iniciou em 4 horas para todas as concentrações do óleo essencial (CIM, CIMx2 e CIMx4).
Comparando-se as curvas do óleo essencial de F. vulgare com a curva da
associação de antifúngicos, pode-se observar uma grande semelhança entre elas, divergindo apenas no tempo de início da ação fungicida, sendo que todas elas fizeram a contagem de colônias da levedura cair e permanecer no limite de detecção até o tempo de 24 horas.
parasitária fúngica, minimizando assim a situação de imunodepressão ou restabelecendo a imunidade (SIDRIM; ROCHA, 2004). Neste contexto, a busca de produtos naturais com atividade antimicrobiana é de grande importância, pois os fármacos sintéticos têm gerado uma série de inconvenientes, como o aumento da multirresistência de micro-organismos (SANTOS et al., 1999).
Os óleos essenciais de C. sativum e F. vulgare representam, portanto, uma
alternativa promissora para pesquisadores que visem descobrir substâncias com potencial antifúngico, efetuando-se estudos mais aprofundados quanto aos resultados (testes in vitro, por exemplo) e testes que assegurem sua segurança
6 Conclusões
Os óleos essenciais de Coriandrum sativum L. e Foeniculum vulgare Mill.
apresentaram atividade antifúngica frente as cepas de Cryptococcus neoformans estudadas;
As Concentrações Inibitórias e Fungicidas Mínimas (CIMs e CFMs) dos óleos essenciais de C. sativum e F. vulgare foram consideradas boas e moderadas,
respectivamente;
A micromorfologia da levedura não foi alterada pelos óleos essenciais nem pelos antifúngicos padrões, entretanto foi observada uma redução na contagem de formas viáveis dependente da concentração dos óleos essenciais e do tempo;
Ambos os óleos essenciais apresentam tanto efeito fungistático quanto fungicida, dependentes da concentração e do tempo de contato com o fungo, sendo que a curva de morte gerada pelo óleo essencial de Foeniculum vulgare é a que mais se assemelha à associação dos antifúngicos padrões;
Referências
ALLEGRINI, J. et al. Emulsions d’huiles essentielies, fabrication et applications in
microbiologia. Société de Pharmacie de Montpellier. v. 33, n. 1, p. 73- 86, 1973.
ALMEIDA, M. Z. de. Plantas Medicinais. 2. ed. Salvador: EDUFBA, 2003. 216 p.
ANWARA, F. et al. Antioxidant and antimicrobial activities of essential oil and extracts
of fennel (Foeniculum vulgare Mill.) seeds from Pakistan. Flavour and Fragrance
Journal. v. 24, p. 170–176, 2009.
ARAQUE, M., ROJAS, L. B., USUBILLAGA, A. Antibacterial activity of essential oil of
Foeniculum vulgare Miller against multiresistant Gram-negative bacilli from
nosocomial infections. Ciencia. v.15, n.3, p. 366–370, 2007.
ARORA, D. S.; KAUR, J. Antimicrobial activity of spices. International journal Antimicrobial Agent. v. 12, p. 257-262, 1999.
BARONI, F. A. Ocorrência de Cryptococcus neoformans em excretas de
pombos localizadas em torres de igrejas na cidade do Rio de Janeiro: fatores de virulência e sensibilidade aos antifúngicos. São Paulo, 2001. (Tese de Doutorado – Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo).
BAUER, A. W. et al. Antibiotic susceptibility testing by standardized single disc
method. American Journal of Clinical Pathology. v. 45, p. 493-496, 1966.
BEGNAMI, A. F. et al. Antimicrobial potential of Coriandrum sativum L. against
different Candida species in vitro. Food Chemistry. v.118, p. 74–77, 2010.
BHAVANANI, S. M.; BALLOW, C. H. New agents for Gram-positive bacteria. Current Opinion in Microbiology. v.13, p. 528-534, 1992.
BRULL, S.; COOTE, P. Preservative agents in foods: mode of action and microbial resistance mechanisms. International Journal of Food Microbiology. v. 50, p. 1-17, 1999.
CASALS, J. B. Tablet sensitivity testing of pathogenic fungi. Journal of Clinical Pathology. v. 32, p. 719-722, 1979.
CHANG, Y. C.; KWON-CHUNG, K. J. Complementation of a capsuledeficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Molecular Cell
Biology. v. 14, n. 7, p. 4912-4919, 1994.
CLEELAND, R.; SQUIRES, E. Evaluation of new antimicrobials in vitro and in
experimental animal infections. In: LORIAN, V. Antibiotics in laboratory medicine. 3. ed. Baltimore: Willians & Wilkins, p. 739-788, 1991.
CONSENSO EM CRIPTOCOCOSE – 2008. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical,v.41, n.5, p. 524-544, 2008.
CORRÊA, M. P. S. C. et al. Criptococose em crianças no Estado do Pará, Brasil.
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. v.32, n.5, p. 505-508, 1999.
CORRÊA, M. T. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Rio de Janeiro: Ministério da Agricultura, v.2, p.335-336, 1984.
COSTA, A. F. Farmacognosia. 4 ed., Lisboa: Fundação Calouste Gubenkian, 1994.
CRUZ, G. L. Dicionário de plantas úteis do Brasil. 4 ed. Rio de Janeiro, 1964.
CZYGAN, F. C. et al. Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals. Stuttgart,
Germany: Ed. Norman Grainger Bisset, 1994.
DEIDERICHSEN, A. Coriander (Coriandrum sativum L.): Promoting the
Genetics and Crop Plant Research, Gatersleben/International Plant Genetic Resources Institute, Rome, 1996. 82 p.
DRUTZ, D. J. In vitro antifungical susceptibility testing and measurement of levels of
antifungical agents in the body fluids. Review of Infectology Diseases. v. 9, n. 2, p. 411-415, 1987.
EL-ADLY, A. A.; ABADA, E. A.; GHARIB, F. A. Antibacterial effects of low power laser light and volatile oil of fennel (Foeniculum vulgare var. dulce) on Grampositive
and Gram-negative bacteria. International Journal of Agriculture and Biology. v.9, n.1, p. 22–26, 2007.
ELGAYYAR, M. et al. Antimicrobial activity of essential oils from plants against
selected pathogenic and saprophytic microorganisms. Journal of Food Protection. v. 64, n.7, p. 1019–1024, 2001.
ELLERBROEK, P. M. et al. Effects of the capsular polysaccharides of Cryptococcus neoformans on phagocyte migration and inflammatory mediators. Current Medicinal
Chemistry. v. 11, n. 2, p. 253-266, 2004.
ELOFF, J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Medica. v. 64, n. 8, p. 711-713, 1998.
ERNST, E. J. et al. In Vitro Activity of Micafungin (FK-463) against Candida spp.:
Microdilution, Time-Kill, and Postantifungal-Effect Studies. Antimicrobial agents and chemotherapy. v. 46, n. 12, p. 3846–3853, 2002.
GAYOSO, C. W. et al. Efeito inibitório do óleo essencial de Cinnamonnum zeylanicum Blume, alfa-pineno e beta-pineno sobre fungos isolados de
GONÇALVES et al. Produção e composição do óleo essencial de alfa vaquinha
(Ocimim selloi Benth.) em resposta a dois níveis de radiação solar. Revista
Brasileira de Plantas Medicinais. v.6, p. 8-14, 2003.
HAMMER, K. A.; CARSON, C. F.; RILEY, T. V. In vitro activity of essential oils, in
particular Melaleuca alternifolia (tea tree) oil and tea tree oil products, against
Candida spp. Journal of Antimicrobes and Chemotherapy. v.42, p. 591–595,
1998.
HOLETZ, F. B. et al. Screening of some plants in the Brazilian folk medicine for the
treatment of infectious diseases. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. v. 97, n. 7, p. 1027-1031, 2002.
JOLY, A. B. Botânica: Introdução à taxonomia vegetal. São Paulo: Companhia Editora Nacional, v.4, 2002.
KEELE, D. J. et al. Evaluation of amphotericin B and flucytosine in combination
against Candida albicans and Cryptococcus neoformans using time-kill methodology.
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. v.41, n. 3, p. 121–126, 2001.
KLEPSER, M. E. et al. A. Influence of test conditions on antifungal time-kill curve
results: Proposal for standardized methods. Antimicrobial agents and chemotherapy. v.42, n. 5, p. 1207–1212, 1998.
KRISHNA DE, A. The genus Foeniculum. In: JODRAL, M.M. (Ed.), Illicium, Pimpinella and Foeniculum – Medicinal and Aromatic Plants. vol. 40. CRC Press
LLC Chapter 12, 2004.
LIMA, I. O. et al. Inhibitory effect of some phytochemicals in the growth of yeasts
potentially causing opportunistic infections. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. v. 41, n. 2, p. 199-203, 2005.
LO CANTORE, P. et al. Antibacterial activity of Coriandrum sativum L. and Foeniculum vulgare Miller var. vulgare (Miller) essential oils. Journal of Agriculture
and Food Chemistry. v.52, p. 7862–7866, 2004.
LONGHINI, R. et al. Obtenção de extratos de própolis sob diferentes condições e
avaliação de sua atividade antifúngica. Revista Brasileira de Farmacognosia. v.
17, n. 3, 2007.
MATASYOH, J. C.; MAIYO, Z. C.; NGURE, R. M. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Coriandrum sativum. Food Chemistry. v.113, n.2, p. 526–529, 2008.
MATHIAS, M. E.; CONSTANTE, L.; ARAUJO, D. Flora ilustrada Catarinense. Conselho Nacional de Pesquisas, Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, Herbário “BarbosaRodrigues”. Fascículo: Umbelíferas, Itajaí. 1972.
MIRALDI, E. Comparison of the essential oils from ten Foeniculum vulgare Miller
samples of fruits of different origin. Journal of Flavour and Fragrance. v.14, p. 379-382, 1999.
MUCKENSTURM, B. et al. Phytochemical and chemotaxonomic studies of Foeniculum vulgare. Biochemical Systematics and Ecology. v. 25, p. 353-358,
1997.
NASCIMENTO, W. M.; PEREIRA R. S. Coentro: A hortaliça de mil e uma utilidades. Horticultura Brasileira. v.23, n.3, 2005.
aerobically. 2. ed. Tentative Standart. NCCLS Document M7-T2, V. B. n. B. Villa Nova PA, National committee for Clinical Laboratory Standart, 2002.
PAPPALARDO, M. C. S. M.; MELHEM, M. S. C. Cryptococcosis: a review of the brazilian experience for the disease. Revista do Instituto de Medicina Tropical. v.45, n.6, p. 299-305, 2003.
PICCAGLIA, R., MAROTTI, M. Characterization of some Italian types of wild fennel (Foeniculum vulgare Mill.). Journal of Agricultural and Food Chemistry. v. 49, p.
239–244, 2001.
PIO CORREA, M. Dicionário de plantas úteis do Brasil e exóticas cultivadas. Vol.III, Rio de Janeiro: Imprensa Nacional, p.369-371, 1984.
QUEIROZ, J. P. A. F. et al. Criptococose - Uma revisão bibliográfica. Acta
Veterinaria Brasilica. v.2, n.2, p.32-38, 2008.
QUER, R. B. Plantas medicinales: El dioscorides renovado. Barcelona: editorial Labor S/A. v.2, 1993. 386 p.
RUBERTO, G. et al. Antioxidant and antimicrobial activity of Foeniculum vulgare and Crithmum maritimum essential oils. Planta Medica. v.66, p. 687–693, 2000.
SAHIN, F. et al. Biological activities of the essential oils and methanol extract of Origanum vulgare ssp. vulgare in the Eastern Anatolia region of Turkey. Food
Control. v.15, p.549-557, 2004.
SANT'ANA, J. F. et al. Criptococose em felino. Arquivos Brasileiros de Medicina
Veterinária e Zootecnologia. v.51, n.4, p.333-334, 1999.
SANTOS, F. A. et al. Antibacterial activity of propolis produced in Brazil against
SCORZONI, L. et al. The use of standard methodology for determination of
antifungal activity of natural products against medical yeasts Candida sp and Cryptococcus sp. Brazilian Journal of Microbiology. v. 38, p. 391-397, 2007.
SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos.Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2004.
SILVA, A. F. et al. Composição química do óleo essencial de Hyptis suaveolens (L.)
Poit. (Lamiaceae). Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v.6, p. 1-7, 2003.
SIMÕES, C. M. O. et al. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto
Alegre/ Florianópolis: UFRGS/ UFSC, 2000.
SIQUI, A. C.; SAMPAIO, A. L. F.; SOUSA, M. C. Óleos essenciais - potencial antiinflamatório. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento. v.16, p. 38-43, 2000.
SOUZA, E. L. et al. Avaliação da atividade antisséptica do extrato seco de
Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville e de preparação cosmética contendo este extrato. Revista brasileira de Farmacognosia. v. 1, n.1, 2007.
SOUZA, E. L. et al. Orégano (origanum vulgare l., lamiaceae): uma especiaria como
potencial fonte de compostos antimicrobianos. Revista Higiene Alimentar. v.19, n.132, p. 40-45, 2005.
SOYLU, S. et al. Antifungal effects of essential oils from oregano and fennel on Sclerotinia sclerotiorum. Journal of Applied Microbiology. v. 103, p. 1021-1030,
2007.
STANGARLIN, J. R.; FREITAS, K. R. S. E.; CRUZ, M. E. Plantas medicinais. Biotecnologia, Ciência & Desenvolvimento. v. 2, p. 16-22, 1999.
TUTIN, T. G. Foeniculum Miller. In: HEYWOOD, V.H. et al. (Eds.), Rosaceae to Umbelliferae. Flora Europaea, vol. 2. Cambridge, United Kingdom: Cambridge
VILJOEN, A. et al. Osmitopsis astericoides (Asteraceae) - the antimicrobial activity
and essential oil composition of a Cape-Dutch remedy. Journal of Ethnopharmacology. Leinden, v.88, p.137-143, 2003.
WANDERLEY JÚNIOR, L. J. G.; MELO, P. C. T. Tapacurá: nova cultivar de coentro adaptada às condições subtropicais do Brasil. In: Congresso Brasileiro de Olericultura, v.43, 2003. Resumos... Recife: SOB (CD-Rom).
ZHOU, Z. F. et al. Analysis of the essential oils of Coriandrum sativum using GC-MS
ANEXO B
Análise do óleo essencial de Coriandrum sativum
Componente Tempo de
retenção (min) (%) Ciclopropeno-1- metil-3-(2-metilciclopropil) 8.07 3,05
p-cimeno 11,15 4,69
Limoneno 11,33 2,05
Óxido de linalol 12,92 4,42
Óxido de trans-linalol 13,5 3,16
Terpinoleno 14,05 72,9
2-pentinal, 4,4,-dimetil 15,47 1,86
2-octin-1-ol 15,5 2,46
Acetato de ciclohexil 17,2 0,53
ANEXO C
