Tecnologia do DNA recombinante

Tecnologia do

DNA recombinante

Tecnologia do DNA Recombinante

• déc. 70

• conhecimento de mecanismos biomoleculares

– enzimas biológicas

Replicação do DNA

Remoção do primer

Ligação dos fragmentos de Okasaki Separação das fitas

por hidrólise

Enzimas de Restrição (II)

• endonucleases de restrição

• proteínas monoméricas ou diméricas

• organismos procarióticos

– reconhecimento e clivagem de sequência

específica (sítio de restrição) da dupla hélice de DNA exógeno

– DNA endógeno: metilado Grupo metil

Enzimas de Restrição (II)

• sítios de restrição: 4 a 8 pb

• simetria rotacional: sequências palindrômicas

sítio de restrição nome da enzima origem (organismo)

5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’

BamHI Bacillus amyloliquefaciens H

5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’

EcoRI Escherichia coli RY13

5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5’

HaeIII Haemophilus aegyptius

5’ CTGCAG 3’ 3’ GACGTC 5’

PstI Providencia stuartii

5’ CTCGAC 3’ 3’ GAGCTC 5’

XhoI Xanthomonas holcicola

Enzimas de Restrição (II)

• hidrólise de ligação fosfodiéster

– OH (3’)+ fosfato (5’) – extremidades:

• cegas

Enzimas de Restrição (II)

Enzimas de Restrição (II)

sítio de restrição:

DNA Ligase

• catalisa a formação de uma ligação

fosfodiéster entre duas moléculas

• requer:

– 3’ OH livre – 5’ fosfato livre

• geração de moléculas recombinantes

DNA Ligase

DNA recombinante

Clonagem molecular

• Clones: descendentes de uma

única célula

• Vetor de clonagem

– inserto de DNA

• Transformação

Vetores de Clonagem

• transportam o inserto de DNA para dentro da

célula hospedeira

• replicação autônoma

• sítio de clonagem

– sítio exclusivo de restrição

Vetores de Clonagem

Plasmídeos

• DNA circular • dupla fita

• extracromossômico

• bactérias e algumas leveduras • replicação autônoma

• indicadores diferenciais:

– genes de resistência a antibióticos

• ampicilina • tetraciclina – marcas auxotróficas • mutante lac

-Plasmídeos

• transformação

• insertos de até cerca de 9kb

– >9kb: cosmídeos

• shuttle vectors:

– aplicável para:

Plasmídeos

• pBR322

inativação por inserção

Plasmídeos

• Bluescript M13

_/M13

BAC

• bacterial artificial chromosome

• baseado no plasmídeo F de E. coli

• insertos de até 300kb (vetor de alta

capacidade)

• genoma humano

• genoma de Drosophila

YAC

• yeast artificial chromosome • manutenção em levedura

• insertos de até 1.000kb (vetor de alta capacidade) • marcadores para seleção:

• TRP1 (triptofano)

• NEO (resistência a kanamicina)

• componentes funcionais de um cromosomo eucariótico

Quanto maior o inserto, maior a chance de rearranjos e quimeras

Bacteriófagos

Bacteriófagos

• Bacteriófago λ

• transfecção

• manutenção de genes

essenciais à reprodução viral

• substituição de material não

Bacteriófagos

• Bacteriófago M13

– não destrói a célula hospedeira – pouca estabilidade

– sequenciamento OK – biblotecas

+/-Vetores de Expressão

• geração de um produto gênico

• vetores:

Procariotos

Eucariotos

extensa e complexa _{Presença de}

Vetores de expressão procarióticos

• Escherichia coli, Bacillus subtilis • plasmídeos

– promotores eficientes

– sítios de ligação ao ribossomo • criação de vetores híbridos

• sistemas com promotores induzíveis • sistemas de fusão

• nem sempre capazes de produzir proteínas funcionais de genes eucarióticos

Vetores de expressão eucarióticos

• leveduras

– origem de replicação eucariótica

– regiões controladoras de transcrição, tradução e modificações eucarióticas

– poliadelinação/capping – introns

Vetores de expressão eucarióticos

• Características essenciais:

1. promotor induzível ou constitutivo: alto nível de transcrição

2. processamento de RNAm e tradução 3. terminador da transcrição

4. marca de seleção

5. ori de procariotos

Vetores de expressão eucarióticos

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