PRESERVAÇÃO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS DE PEQUENOS RUMINANTES (Preservation of small ruminants’ preantral follicles)
Regiane Rodrigues dos SANTOS*, Ana Paula Ribeiro RODRIGUES, Fabricio Sousa MARTINS, Maria Helena Tavares de MATOS, Juliana Jales de Hollanda CELESTINO &
José Ricardo de FIGUEIREDO
Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA) Universidade Estadual do Ceará
RESUMO
Estudos sobre a reprodução animal têm conduzido ao desenvolvimento de novas biotécnicas nesta área.
A Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais (MOIFOPA) é constituída pelo isolamento, preservação (resfriamento e/ou congelação) e cultivo de Folículos Ovarianos Pré-Antrais (FOPA). A presente revisão mostra a importância, estado atual e limitações da preservação folicular utilizando resfriamento e/ou congelação de FOPA caprinos e ovinos, bem como os principais resultados obtidos.
PALAVRAS-CHAVE: resfriamento, congelação, folículos pré-antrais, caprinos, ovinos.
ABSTRACT
Studies on animal reproduction have lead to development of new biotechniques in this area. The manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) constitutes the isolation, preservation (cooling and/or cryopreservation) and culture of ovarian preantral follicles. The present review shows the importance, state of the art and limitations of follicular preservation using cooling and/or cryopreservation of caprine and ovine preantral follicles, as well as the main results obtained.
KEYWORDS: cooling, cryopreservation, preantral follicles, caprine, ovine.
INTRODUÇÃO
O recente interesse em formar bancos de gametas femininos tem refletido a importância e a necessidade da preservação de oócitos imaturos, onde grande parte é encontrada inclusa em folículos pré-antrais (FOPA). Tal fato pode ser constatado com o atual crescimento da biotécnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA), que visa a otimização da utilização do potencial reprodutivo de animais de alto valor zootécnico e/ou em via de
extinção (RODRIGUES et al., 2001). Além das etapas de isolamento e cultivo folicular in vitro, a biotécnica de MOIFOPA abrange também a preservação de oócitos inclusos nestes folículos por meio do resfriamento e/ou criopreservação.
O resfriamento tem sido utilizado para a preservação de material genético como sêmen (NUNES, 1997), embriões (SMORAG et al., 1989; NUREDDIN et al., 1990; SMITH et al., 1994) e oócitos oriundos de folículos antrais (DEL CAMPO, 1994; MARTINO et al., 1996;
SCHERNTHANER et al., 1997) e pré-antrais (SANTOS et al., 2002; 2003), visando melhorar as condições de transporte mantendo a viabilidade das estruturas até sua manipulação. Além disso, métodos de criopreservação também vêm sendo desenvolvidos e aperfeiçoados para a preservação de sêmen (POLGE, 1949; STOREY et al., 1998), embriões (OTOI et al., 1998) e oócitos oriundos
*Autor para correspondência LAMOFOPA – PPGCV - UECE Av. Paranjana, 1700, Itaperi, 60740-000 Fortaleza - Ceará e-mail: regianers@hotmail.com Ciência Animal, 14(1):7-19, 2004
de folículos antrais (BOSCH et al., 2003;
MOCHIDA et al., 2003) e pré-antrais (AMORIM et al., 2003b; ISACHENKO et al., 2003;
RODRIGUES et al., 2003), com o objetivo de constituir bancos de germoplasma animal.
O objetivo da presente revisão consiste em descrever a importância, objetivos e os fundamentos básicos da preservação de FOPA, além de abordar os principais resultados obtidos com o resfriamento e congelação de oócitos oriundos principalmente de FOPA.
1. Importância dos protocolos de preservação A população folicular, ao nascimento, foi estimada em 160.000 na ovelha (DRIANCOURT et al., 1991) e 20.000 na cabra (BEZERRA et al., 1998). Entretanto, apesar deste número, a maioria dos folículos não chega a ovular, sendo eliminada por meio de um processo conhecido por atresia folicular. Este processo ocorre em todos os estágios do desenvolvimento folicular, porém é menos freqüente em folículos pré-antrais, aumentando progressiva e significativamente em folículos antrais (HIRSHFIELD, 1988). Independente da fase na qual ocorre e, apesar de ser um fenômeno natural, a atresia reduz de maneira significativa o número de oócitos potencialmente ovuláveis, reduzindo, conseqüentemente, o potencial reprodutivo de um animal. A maioria dos oócitos (cerca de 90%) presentes no ovário encontra-se inclusa em FOPA (CAHILL & MAULÉON, 1981; GOUGEON et al., 1994). Portanto com o intuito de aproveitar a grande reserva de folículos pré-antrais presente no ovário, diversos métodos de isolamento e cultivo folicular in vitro têm sido desenvolvidos.
A técnica de isolamento folicular, utilizando o método mecânico permitiu o isolamento de dezenas a milhares de FOPA caprinos (LUCCI, 1999) e ovinos (AMORIM et al., 1998), que poderão ser utilizados em programas de maturação e fecundação in vitro e/ou destinados à constituição de bancos de germoplasma animal. Referente ao desenvolvimento de FOPA in vitro, diversos sistemas de cultivo têm sido desenvolvidos com a evolução da biotécnica de MOIFOPA. Nas espécies ovina (CECCONI et al., 1999) e caprina (HUANMIN & YONG, 2000) já foi verificado o desenvolvimento de FOPA isolados até o estágio
antral. No entanto, os melhores resultados foram observados em espécies de laboratório por alguns pesquisadores como EPPIG & O’BRIEN (1996) que obtiveram, o nascimento de camundongos a partir de FOPA crescidos e maturados in vitro, inclusive após congelação/descongelação (CARROLL et al., 1990).
Apesar da grande eficiência dos protocolos de isolamento folicular, a MOIFOPA ainda possui duas etapas limitantes para o seu sucesso. A primeira delas consiste na necessidade da manutenção da qualidade folicular imediatamente após a coleta (antes do cultivo) através do resfriamento. Além disso, como ainda não existe um protocolo desenvolvido com um meio eficiente para o crescimento de FOPA in vitro, a criopreservação consiste em uma alternativa, a curto prazo, para auxiliar na preservação de oócitos oriundos de animais de interesse zootécnico ou em via de extinção por um longo período. Visto que milhares de FOPA podem ser recuperados a partir de um único ovário utilizando-se os métodos de isolamento disponíveis, torna-se impossível a manipulação da totalidade destes folículos no mesmo dia em que são isolados sem afetar a sua viabilidade antes do cultivo in vitro. Por esta razão, torna-se fundamental o desenvolvimento de protocolos de preservação por resfriamento e/ou congelação, nos quais os FOPA poderiam ser preservados antes de sua manipulação.
2. Objetivo da preservação
O objetivo da preservação consiste em garantir que as células permaneçam com uma baixa taxa metabólica durante um determinado período de estocagem, do qual possam ser resgatadas a fim de continuar o seu desenvolvimento normal.
Entretanto, para que isso seja possível mesmo após
longos períodos de preservação, alguns fatores
essenciais para a sobrevivência das células devem
ser levados em consideração, tais como: escolha
do meio utilizado durante o processo de
resfriamento, temperatura e tempo de preservação,
tipo e concentração de agentes crioprotetores (no
caso da criopreservação), taxa de redução da
temperatura de congelação, manutenção da
temperatura de estocagem, escolha do
procedimento de descongelação e técnicas utilizadas
para assegurar a remoção do crioprotetor (GORDON, 1994). A preservação dos FOPA pode ser realizada por um curto (resfriamento) ou longo período (criopreservação) conforme mostrado nos itens a seguir.
3. Fundamentos da preservação 3.1. Preservação por curto período
A preservação por curto período ou resfriamento consiste na redução da temperatura de preservação, por exemplo até 4 °C, a fim de prevenir que o metabolismo normal leve ao consumo rápido das reservas energéticas foliculares e/ou dos nutrientes contidos no meio de preservação.
Entretanto, para que isso seja possível, alguns fatores essenciais para a sobrevivência das células devem ser levados em consideração, tais como escolha do tempo e temperatura de preservação.
No intuito de desenvolver um protocolo eficiente de preservação de FOPA por resfriamento, nossa equipe de pesquisa (LAMOFOPA - FAVET – UECE) estudou diversos meios em diferentes temperaturas e tempos de incubação (Fig. 1).
Dentre os trabalhos de preservação de FOPA de pequenos ruminantes resfriados in situ, pode-se citar aqueles que utilizaram as soluções salina 0,9%
(SANTOS et al., 2002 - caprinos; SANTOS et al., 2003a - ovinos), Braun-Collins – SBC (SILVA et al., 2000 - caprinos; ANDRADE et al., 2001 - ovinos), à base de água de coco - SBAC (SILVA et al., 2000 - caprinos; ANDRADE et al., 2002 - ovinos), Tampão Fosfato Salina - PBS (SANTOS et al., 2002 - caprinos; SANTOS et al., 2003a - ovinos) e TCM 199 (FERREIRA et al., 2000 -
caprinos; ANDRADE et al., 2002 - ovinos). Os resultados obtidos com os trabalhos supracitados podem ser observados na Fig. 2. Vale ressaltar que nesses estudos, o protocolo era considerado eficiente se mantivesse a percentagem de FOPA normais similar à observada imediatamente após a coleta dos ovários. Com esses estudos, foi possível constatar que o meio de preservação não constitui um fator limitante na preservação de FOPA a baixas temperaturas (4°C), por um curto período (24 h), uma vez que a solução salina 0,9% e TCM 199 apresentaram resultados similares. No entanto, na preservação a 20°C (após 12 h) e, principalmente a 39°C (após 4 h), a utilização de meios de composição mais rica torna-se necessária.
Além do meio, temperatura e tempo de incubação, também foi testada a forma (ovário inteiro, metade ou fragmento ovariano) de preservação utilizando-se o resfriamento (SANTOS et al.,2001). Estes autores observaram não haver relação entre a qualidade folicular e a fragmentação ovariana durante a preservação. Além desses estudos, FERREIRA et al. (2000) conseguiram preservar FOPA caprinos isolados resfriando-os a 4ºC por 24 h e a 20°C por 12 h, utilizando TCM adicionado ou não de ácido-3-indol-acético (IAA).
Em trabalhos posteriormente, MATOS (2003) observou que a temperatura fisiológica, isto é, a 39ºC os FOPA oriundos decaprinos e ovinos podem ser preservados por um período máximo de até 2horas.ó é possível realizar a preservação de FOPA de pequenos ruminantes a temperatura fisiológica, ou seja, a 39°C por um período máximo de 2 h.
Figura 1. Protocolo experimental de resfriamento de FOPA caprinos e ovinos.
PBS = Tampão Fosfato Salina; SBAC = solução à base de água de coco; SBC = solução Braun-Collins; TCM199 = Meio de Cultura de Tecido (Tissue Culture Medium)
3.2. Preservação de célula e tecido por período longo
A criopreservação utilizando-se a congelação permite a preservação de células e tecidos por longos períodos cujo princípio baseia- se na desidratação da célula a fim de prevenir a formação de cristais de gelo intracelular ou minimizar os danos que eles podem causar (SHAW et al., 2000), enquanto mantém o citoplasma super resfriado até a congelação celular (FAHNING &
GARCIA, 1992).
Nos anos 40, a reprodução animal sofreu um grande avanço quando POLGE et al. (1949) descreveram, pela primeira vez, a utilização do glicerol (GLI) para preservar espermatozóides.
Desde então, vários pesquisadores vêm tentando desenvolver procedimentos para congelar não somente espermatozóides, mas também embriões
e gametas femininos em diferentes estágios de desenvolvimento (AMORIM, 2003b). Nos anos 70, novas substâncias foram utilizadas como agentes crioprotetores, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol (ETG) e propilenoglicol (PROH).
Contudo, resultados satisfatórios descritos após criopreservação de FOPA só foram relatados nas últimas duas décadas.
Os diferentes procedimentos de congelação utilizam soluções crioprotetoras que agem protegendo a célula durante o período de estocagem em baixas temperaturas. Tais soluções são compostas geralmente de um ou mais crioprotetores permeáveis, aos quais é possível adicionar compostos não permeáveis que agem desidratando e moderando as mudanças osmóticas celulares (de la VEGA & WILDE, 1991). Diversos tipos de crioprotetores têm sido utilizados em
Barras em negro – ovinos Barras em cinza - caprinos
Figura 2. Resultados obtidos após resfriamento de folículos pré-antrais ovinos e caprinos indicando o
período (em horas) em que a viabilidade folicular foi mantida similar à observada imediatamente pós-
coleta dos ovários.
diferentes concentrações. A escolha do crioprotetor e da concentração depende do procedimento de criopreservação utilizado, da estrutura a ser criopreservada, bem como da espécie animal em questão. Os crioprotetores permeáveis são substâncias de baixo peso molecular e agem penetrando intracelularmente a fim de interagir e influenciar a dinâmica dos microfilamentos e microtúbulos (DOBRINSKY, 1996). Os crioprotetores mais correntemente empregados para a congelação de embriões, oócitos e tecido ovariano são o GLI, DMSO, PROH e ETG. Entretanto, apesar da sua conhecida ação crioprotetora, deve- se considerar sua toxicidade, que é um dos fatores limitantes para o sucesso de um protocolo de criopreservação, principalmente quando altas concentrações dos crioprotetores são empregadas.
Os métodos de congelação são classificados em congelação lenta, rápida, ultra- rápida e vitrificação. Dentre estes métodos, a congelação lenta tem sido largamente utilizada para a preservação de oócitos em diferentes espécies (bovinos – SCHELLANDER et al., 1994;
camundongos – CANDY et al., 1994; humanos – OKTAY et al., 1998).
Já o procedimento de descongelação, por sua vez, pode ser dividido em lento ou rápido. A descongelação rápida, onde a amostra é retirada do nitrogênio líquido e exposta imediatamente à temperatura ambiente ou mergulhada em banho- maria, é o procedimento mais correntemente utilizado (VINCENT et al., 1989; CARROLL et al., 1991; SCHELLANDER et al., 1994; SON et al., 1996; CANDY et al., 1997; GUNASENA et al., 1997a,b; JEWGENOW et al., 1998; SZETEIN et al., 1998; LIM et al., 1999; ASADA et al., 2000).
Entretanto, a descongelação lenta, que geralmente utiliza equipamentos que induzem um aumento gradual da temperatura, também tem sido empregada com êxito. A escolha do procedimento de descongelação geralmente depende do protocolo de congelação e do crioprotetor empregado. Uma vez que a descongelação lenta utiliza mais tempo, ela seria mais prejudicial às células congeladas, pois permitiria que a recristalização ocorresse (MAZUR, 1984).
No que se refere à congelação de oócitos imaturos (principalmente aqueles inclusos em
FOPA), esta consiste em uma alternativa para a restauração da fertilidade, bem como a utilização de um maior número de oócitos por ovário, uma vez que estes folículos são menos sensíveis a crioinjúrias (GOSDEN et al., 1994; SHAW et al., 2000). O menor tamanho do oócito, bem como das suas células de suporte (células da granulosa), sua baixa taxa metabólica, estágio do ciclo celular (núcleo no estado de prófase da primeira divisão meiótica), número restrito de células da granulosa, ausência de zona pelúcida e de grânulos corticais periféricos e a pequena quantidade de lipídios intracitoplasmáticos têm tornado a criopreservação de oócitos imaturos oriundos de FOPA mais vantajosa que aquela realizada com oócitos maturos.
Uma vez que a grande maioria dos oócitos encontra- se inclusa em FOPA e que estes oócitos não possuem o fuso meiótico, os riscos por problemas citogenéticos são menores nas divisões celulares subseqüentes (OKTAY et al., 1998). Portanto, eles são pouco suscetíveis às aberrações cromossômicas (CANDY et al., 1994) e, conseqüentemente, mais resistentes aos procedimentos de congelação. Além disso, diferentemente dos oócitos maturos, sugere- se que os FOPA possuem tempo para reparar danos subletais nas organelas e em outras estruturas durante a sua prolongada fase de crescimento, que ocorreria durante o cultivo in vitro. Entretanto, ainda não há um número suficiente de experimentos nesta área para comprovar esta suposição (OKTAY et al., 1998).
3.2.1. Congelação de folículos pré-antrais Os folículos pré-antrais podem ser congelados utilizando duas técnicas básicas:
congelação dos folículos inclusos no tecido ovariano (in situ), ou após isolamento dos folículos pré- antrais do córtex ovariano (Tab. 1 e 2 respectivamente). A maioria dos estudos na literatura referem-se à congelação de tecido ovariano (GOSDEN et al., 1994, COX et al., 1996, HOVATTA et al., 1996; NEWTON et al., 1996;
GUNASENA et al., 1997a,b, CANDY et al., 1997, SALLE et al., 1998, BAIRD et al., 1999, DEMIRCI et al., 2001, 2002, LUCCI et al., 2003) e somente alguns autores relatam a congelação de folículos pré- antrais isolados (CORTVRINDT, et al., 1996;
JEWGENOW et al., 1998; AMORIM et al.,
2003a,b; RODRIGUES et al., 2004).
3.2.1.1. Congelação de FOPA inclusos no tecido ovariano (in situ)
A preservação de tecido ovariano é uma opção estratégica para conservar as funções gametogênicas e esteroidogênicas do ovário. O tecido ovariano pode ser congelado em pequenos fragmentos (NISOLLE et al., 2000; OKTAY et al., 2000), metades (DANIEL et al., 1983; SZTEIN et al., 1998) ou o tecido ovariano por inteiro (DEANESLY, 1957; SUGIMOTO et al., 2000).
Normalmente, em animais de produção, como ovelhas e cabras, a congelação é realizada utilizando pequenos fragmentos de tecido ovariano para facilitar os procedimentos de manipulação.
GOSDEN et al. (1994) obtiveram o primeiro nascimento de um animal viável após congelação, descongelação e cultivo de fragmentos de tecido ovariano ovino. Recentemente, resultados similares foram obtidos por SALLE et al. (2002).
O crescimento folicular até o estágio antral (SALLE
et al., 1998,1999; NEWTON et al., 1999) e
ovulação (AUBARD et al., 1999) também foram
Tabela 1. Forma de criopreservação, crioprotetor, procedimentos após descongelação e principais
resultados obtidos em ovinos e caprinos.
relatados em ovinos após o transplantes de tecido ovariano previamente congelado.
Após descongelação, o tecido ovariano pode ser destinado ao isolamento folicular (ZHANG et al., 1995; OKTAY et al., 1997; ABIR et al., 1999; NEWTON et al., 1999), cultivo in vitro (SUGIMOTO et al., 1996; PAYNTER et al., 1999) ou ainda ao transplante (GOSDEN et al.,1994).
Após o cultivo, os folículos podem ser isolados e os oócitos recuperados para posterior maturação e fecundação in vitro e transferência embrionária.
Contudo, a maioria dos pesquisadores têm optado pelos procedimentos de transplante dos fragmentos (COX et al., 1996; SALLE et al., 1998; AUBARD et al., 1999; OKTAY et al., 2000; SHAW et al., 2000; SUGIMOTO et al., 2000; VAN DEN BROECKE et al., 2001) para que possa haver um restabelecimento ideal da síntese hormonal proporcionando um melhor crescimento e maturação oocitária (NUGENT et al., 1997).
Apesar dos resultados promissores, a congelação do tecido ovariano e seu posterior transplante fornece algumas desvantagens. Em primeiro lugar, geralmente são observadas injúrias de reperfusão causadas pela isquemia, o que pode levar a danos na membrana celular pela peroxidação lipídica. E, em segundo lugar, a totalidade da população folicular não pode ser facilmente
manipulada no tecido ovariano (SHAW et al., 2000), o que pode representar o maior problema. Os principais avanços obtidos, em ovinos e caprinos, com a congelação de FOPA inclusos no tecido ovariano são mostrados na Tab. 1.
3.2.1.2. Congelação de FOPA isolados
Outra opção para congelação folicular consiste na utilização de folículos isolados. No entanto, as pesquisas realizadas com folículos isolados ainda são escassas provavelmente pela preferência ao transplante, o qual representa uma possibilidade de restaurar a função do fragmento ovariano em outras fêmeas, não somente por facilitar a disseminação dos gametas femininos, mas também pela produção hormonal. Além disso, ainda não é possível estabelecer um protocolo padrão e ótimo para o cultivo in vitro de FOPA, o que torna importante a congelação destes folículos isolados.
GOSDEN et al. (2002) hipotetizaram que
utilizando o cultivo in vitro de FOPA isolados,
poderia ser possível obter mais oócitos maturos que
através dos procedimentos de transplante, desde
que isso pudesse evitar a perda folicular causada
pela isquemia. CORTVRINDT et al. (1996)
mostrando que o cultivo in vitro de folículos isolados
como uma alternativa para o transplante, afirmaram
que este procedimento poderia ser mais
Tabela 2. Forma de criopreservação, crioprotetor, procedimentos após descongelação e principais
resultados obtidos em ovinos e caprinos.
Figura 3. Taxa de perdas foliculares ocorridas durante período de equilíbrio e congelação/descongelação após utilização de quatro crioprotetores em duas concentrações sobre FOPA ovinos e caprinos in situ e isolados.
Fopa ovinos in situ
GLI ETG DMSO PROH 1,5 3M 1,5 3M 1,5 3M 1,5 3M
Fopa caprinos in situ
GLI ETG DMSO PROH 1,5 3M 1,5
Fopa ovinos isolados
GLI ETG DMSO PROH 1,5 3M 1,5 3M 1,5 3M 1,5 3M
Fopa caprinos isolados
GLI ETG DMSO PROH 1,5 3M 1,5
economicamente favorável. Os principais avanços obtidos, com ovinos e caprinos, com a congelação de FOPA isolados são mostrados na Tab. 2.
3.2.2. Danos celulares durante a criopreservação de FOPA caprinos e ovinos
Finalmente, é importante ressaltar que
durante os procedimentos de congelação, os FOPA
sofrem injúrias desde o período de equilíbrio (ou
seja, período em que os FOPA são mantidos na
presença do crioprotetor antes da congelação) até
a congelação e descongelação. Tais observações
foram possíveis após utilização de quatro
crioprotetores (DMSO, ETG, PROH e GLI) em
duas concentrações (1,5 M e 3 M) para avaliar toxicidade e ação crioprotetora sobre FOPA ovinos (SANTOS et al., 2003b) e caprinos (RODRIGUES et al., 2004) in situ e isolados (Fig. 3). Observou- se que as perdas foliculares iniciam-se desde o período em que o tecido ovariano ou suspensão folicular entram em contato com o agente crioprotetor. Além disso, a intensidade e o momento (período de equilíbrio ou congelação/
descongelação) de tais injúrias depende do crioprotetor e sua concentração. Por exemplo, como observado na Fig. 3, excetuando-se o GLI (único crioprotetor no qual observa-se efeito significativo da criopreservação em relação ao teste de toxicidade) as perdas foliculares observadas após criopreservação já podem ser observadas durante o período de equilíbrio.
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS
A preservação de oócitos imaturos oriundos de folículos pré-antrais consiste em uma alternativa para a preservação da fertilidade em humanos e do material genético de animais de alto valor zootécnico ou em via de extinção. As melhores taxas de sobrevivência folicular para caprinos e ovinos obtidas em pesquisas no LAMOFOPA situam-se entre 90% para resfriamento (preservação por período curto) e 65% para criopreservação (preservação por período longo). Contudo, uma melhor compreensão do comportamento folicular durante os procedimentos de resfriamento, congelação e descongelação, bem como a exposição aos crioprotetores poderá auxiliar na obtenção de resultados mais satisfatórios.
O crescimento folicular após descongelação consistirá na etapa fundamental para a propagação dos gametas femininos em larga escala. No entanto, torna-se necessário desenvolver sistemas de cultivo que suportem o crescimento folicular e maturação oocitária in vitro. Este é um processo complexo, o qual requer um melhor conhecimento da foliculogênese, além de um sistema de cultivo dinâmico e variável para os diferentes estágios de desenvolvimento folicular (DEPALO et al., 2002).
Além disso, o primeiro passo para desenvolver tais sistemas de cultivo consiste em investigar a biologia
do crescimento oocitário e multiplicação e diferenciação das células da granulosa e, em seguida, tentar simular in vitro as mesmas condições encontradas no ovário.
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