Endonucleasas de Restricción Utilizadas en Biotecnología

(1)

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

Escuela Profesional de Ingeniería Ambiental

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN UTILIZADAS EN BIOTECNOLOGÍA

Biotecnología Asesor:

Dr. Hebert Hernan Soto Gonzales Responsable:

Luna Merma, Mayra Alexandra 2019205034 VII Ciclo

Ilo, Moquegua, Perú

2022

(2)

2 ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN 4

2. OBJETIVOS 4

2.1. OBJETIVO PRINCIPAL 4

3. DESARROLLO 4

3.1 BioLabs 4

3.2 Levantamiento de endonucleasas de restricción 5

3.2.1 AatII 5

3.2.2 ACLI 6

3.2.3 AgeI-HF® 7

2.3.4 ApaI 8

2.3.5 BaeGI 10

2.3.6 BanI 12

2.3.7 BbvI 13

2.3.8 BfaI 15

2.3.9 BpmI 16

2.3.10 BsrI 18

2.3.11 BstXI 19

2.3.12 BstYI 21

2.3.13 BtgZI 22

2.3.14 BtsIMutI 24

2.3.15 Cac8I 25

2.3.16 CviAII 27

2.3.17 Ddei 28

2.3.18 OrejaI 30

2.3.19 EcoNI 32

2.3.20 falla 33

2.3.21 FokI 35

(3)

3 2.3.22 HaeII 36

2.3.23 MBOI 38

2.3.24 kasi 40

2.3.25 NaeI 41

2.3.26 PaeR7I 43

2.3.27 PCI 44

2.3.28 SwaI 47

2.3.29 StyD4I 48

2.3.30 ScaI-HF

^®

51

(4)

4 1. INTRODUCCIÓN

Las enzimas de restricción se denominan también nucleasas de restricción, endonucleasas de restricción y en ocasiones restrictasas. Pertenecen a este grupo una gran diversidad de endodesoxirribonluceasas, descubiertas como enzimas propias de distintas bacterias. Se dispone hoy comercialmente de un gran número de ellas con elevada especificidad, estabilidad y pureza. Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan ADN de doble cadena cuando reconocen un patrón de secuencia específico. Generan fragmentos de ADN conocidos como fragmentos de restricción.

Las enzimas de restricción son herramientas imprescindibles en biología molecular, ingeniería genética y biotecnología. Las enzimas de restricción son nucleasas que cortan el ADN cuando reconocen un patrón de secuencia específico. Se nombran con tres letradas del género y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria) y, finalmente, por un número romano que las identifica cuando en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad.

La importancia de las enzimas de restricción radica en su gran especificidad para reconocer una secuencia corta de DNA bicatenario e hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra, siempre en la misma posición. Cada enzima se caracteriza, pues, por su sitio o secuencia de reconocimiento o de restricción, o secuencia diana. Los fragmentos de DNA resultantes son útiles para iniciar la clonación celular o acelular, para el análisis del DNA, para elaborar mapas físicos de restricción o para la detección de polimorfismos.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO PRINCIPAL

- Realizar el levantamiento de 30 endonucleasas de restricción aleatoriamente

3. DESARROLLO 3.1 BioLabs

Ingresamos a la página de BioLabs,

https://international.neb.com/products/restriction-endonucleases

(5)

5 3.2 Levantamiento de endonucleasas de restricción

3.2.1 AatII

Fuente del producto

Fuente: Una cepa de E. coli que porta el gen AatII de Acetobacter aceti (IFO 3281).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(6)

6 3.2.2 ACLI

Fuente del producto: Una cepa de E. coli que porta el gen AclI de Acinetobacter calcoaceticus M4 (SK Degtyarev).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Definición de unidad

Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Condiciones de reacción

1X Tampón rCutSmart™

Incubar a 37°C

Tampón rCutSmart™ 1X

Acetato de potasio

50 mM Tris-acetato

20 mM Acetato de magnesio 10 mM 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C)

Actividad en NEBuffers

NEBuffer™ r1.1: <10 %

NEBuffer™ r2.1: <10 %

NEBuffer™ r3.1: <10 %

Tampón rCutSmart™: 100 %

Compatibilidad de diluyente

(7)

7 Diluyente B

Búfer de almacenamiento

Tris-HCl

10 mM KCl 100 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C

Inactivación de calor

No

Sensibilidad a la metilación

Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: Bloqueada

Isosquizómeros

psp1406i

3.2.3 AgeI-HF®

Fuente del producto : Una cepa de E. coli que porta el gen AgeI clonado y modificado de Ruegeria gelatinovora (ATCC 25655)

Reactivos suministrados: Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(8)

8 2.3.4 ApaI

Fuente del producto

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37

°C en una reacción total de 50 µl.

Condiciones de reacción 1X Tampón rCutSmart™

Incubar a 37°C

Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio

50 mM Tris-acetato

20 mM Acetato de magnesio 10 mM 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C)

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 100 % NEBuffer™ r2.1: 50 % NEBuffer™ r3.1: 10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad de diluyente Diluyente A

Búfer de almacenamiento Tris-HCl

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM

200 µg/ml Albúmina recombinante Glicerol al 50 %

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación

Metilación de dam : No sensible

Metilación de dcm : No sensible

Metilación de CpG: Bloqueada Isosquizómeros

AgeI AsiGI BshTI CspAI PinAI

(9)

9 Una cepa de E. coli que porta el gen ApaI de Acetobacter pasteurianus sub.

pasteurianus (ATCC 9432).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto

(10)

10

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN de pXba en 1 hora a 25 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Condiciones de reacción

1X Tampón rCutSmart™

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

NEBuffer™ r1.1: 25 %

NEBuffer™ r3.1: <10 %

Tampón rCutSmart™: 100 %

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible

Metilación de dcm : Bloqueada por superposición Metilación de CpG: Bloqueada por superposición Isosquizómeros

Bsp120I PspOMI

Actividad a temperatura

@25°C: 100%

2.3.5 BaeGI

(11)

11 Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen BaeGI clonado de Bacillus aestuarii GG790 (X.

Pan)

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 μg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl.

Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37°C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2

100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C)

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 75 % NEBuffer™ r2.1: 75 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 25 % Compatibilidad de diluyente

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % DTT 1 mM pH 7,4 a 37 °C Inactivación de calor

(12)

12

80°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

BseSI BstSLI

2.3.6 BanI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen BanI de Bacillus aneurinolyticus (IAM 1077).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 10 % NEBuffer™ r2.1: 25 % NEBuffer™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 %

(13)

13

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible

Metilación de dcm : Bloqueada por algunas combinaciones de superposición Metilación de CpG: Bloqueada por algunas combinaciones de superposición Isosquizómeros

AccB1I BshNI BspT107I HgiCI+

2.3.7 BbvI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen BbvI de Bacillus brevis (ATCC 9999).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(14)

14

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN de pBR322 en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 100 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 25 %

Tampón rCutSmart™: 100 %

• Diluyente B

Búfer de almacenamiento Tris-HCl 10 mM

200 ml NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

BseXI BstV1I Lsp1109I

(15)

15 2.3.8 BfaI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen BfaI clonado de Bacteroides fragilis ( VPI 3392)

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: <10 % NEBuffer™ r2.1: 10 % NEBuffer™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad de diluyente

(16)

16

• Diluyente B

Búfer de almacenamiento 10 mM Tris-HCl

300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 80°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

FspBI MaeI SspMI XspI

2.3.9 BpmI

Fuente del producto

Una cepa de E.coli que porta el gen BpmI clonado de Bacillus pumilus (SK Degtyarev).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(17)

17

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 75 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 %

• Diluyente B

GSUI

(18)

18 2.3.10 BsrI

Fuente del producto

Bacilo estearotermófilo (C. Polisson) Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN de ΦX174 en 1 hora a 65 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: <10 % NEBuffer™ r2.1: 50 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 10 %

(19)

19

• Diluyente B

Bse1I BseNI

@37°C: 10%

2.3.11 BstXI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen BstXI clonado de Bacillus stearothermophilus X1 (N. Weiker).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(20)

20

Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 37°C en un

volumen de reacción total de 50 µl.

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: <10 % NEBuffer™ r2.1: 50 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 25 %

• Diluyente B

300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 ml EDTA

metilación de dam : no sensible metilación de dcm : bloqueada por algunas combinaciones de metilación de CpG superpuestas: no sensible

(21)

21 2.3.12 BstYI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen BstYI de Bacillus stearothermophilus Y406 (Z.

Chen).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 60

°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Condiciones de reacción 1X tampón rCutSmart™

Incubar a 60 °C

50 mM Tris-acetato

• Diluyente A

Búfer de almacenamiento

(22)

22

Tris-HCl

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor No

Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

BstX2I MflI PsuI XhoII+

@37°C: 10%

2.3.13 BtgZI

Fuente del producto

Una cepa de E.coli que porta el gen BtgZI clonado de Bacillus thermoglucosidasius (X. Pan)

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(23)

23

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ en 1 hora a 60 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 60 °C

50 mM Tris-acetato

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 80°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : no sensible Metilación de dcm : no sensible Metilación de CpG: alterada Actividad a temperatura

@37°C: 50%

(24)

24 2.3.14 BtsIMutI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen BtsI clonado y modificado de Bacillus thermoglucosidasius .

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 µg de ADN de pUC19 en 1 hora a 55°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 55°C

50 mM Tris-acetato

Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad de diluyente

• Diluyente A

(25)

25

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 80°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Actividad a temperatura

@37°C: 50%

2.3.15 Cac8I

Fuente del producto

Clostridium acetobutylicum ABKn8 (G. Reysett) Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(26)

26

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 50 % NEBuffer™ r2.1: 75 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 %

• Diluyente B

10 mM KCl 100 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50

% Triton® X-100 al 0,1 % 200 µg/ml BSA

Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible

Metilación de CpG: Bloqueada por algunas combinaciones de superposición Isosquizómeros

BstC8I

(27)

27 2.3.16 CviAII

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen CviAII del virus Chlorella PBCV-1 (JL Van Etten).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 µg de ADN de pUC19 en 1 hora a 25°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 25 °C

50 mM Tris-acetato

(28)

28

NEBuffer™ r1.1: 50 % NEBuffer™ r2.1: 50 % NEBuffer™ r3.1: 10 %

• Diluyente C

250 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml BSA 50 % Glicerol

0,15 % Triton® X-100 10 mM TCEP

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

FaeI FatI Hin1II Hsp92II NlaIII

@37°C: 10%

2.3.17 Ddei

Fuente del producto

(29)

29 Una cepa de E. coli que porta el gen DdeI de Desulfovibrio desulfuricans (NCIB 83120).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 75 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 100 % Tampón rCutSmart™: 100 %

• Diluyente B

300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor

(30)

30

65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

BstDEI HPyF3I

2.3.18 OrejaI

Fuente del producto

Una cepa de E.coli que porta el gen EarI de Enterobacter aerogenes (C. Polisson).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(31)

31

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

• Diluyente B

300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación

Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible

Metilación de CpG: Deteriorada por superposición Isosquizómeros

Bst6I Eam1104I Ksp632I+

(32)

32 2.3.19 EcoNI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen EcoNI clonado de Escherichia coli CDC A-193 (ATCC 12041)

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

(33)

33

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

BstENI XagI

2.3.20 falla

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que lleva el gen FauI clonado FauI de Flavobacterium aquatili (SK Degtyarev).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(34)

34

• Definición de unidad

Incubar a 55°C

50 mM Tris-acetato

Compatibilidad de diluyente o Diluyente A

10 mM KCl 50 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % DTT 1 mM pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: Bloqueada Actividad a temperatura

@37°C: 50%

(35)

35 2.3.21 FokI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen FokI de Flavobacterium okeanokoites (IFO 12536).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

(36)

36

NEBuffer™ r1.1: 100 % NEBuffer™ r2.1: 100 % NEBuffer™ r3.1: 75 %

• Diluyente A

50 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 200 µg/ml BSA 50 % Glicerol 0,1 % Tween® 20 pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible

Metilación de dcm: Deteriorada por superposición Metilación de CpG: Deteriorada por superposición Isosquizómeros

BseGI BstF5I BtsCI

2.3.22 HaeII

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen HaeII de Haemophilus aegypticus (ATCC 11116).

Reactivos suministrados

(37)

37 Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 80°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: Bloqueada Isosquizómeros

(38)

38

BfoI BstH2I

2.3.23 MBOI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen MboI de Moraxella bovis (ATCC 10900).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(39)

39

Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para digerir 1 µg de ADN λ (dam-) en 1 hora a 37°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : Metilación de dcm bloqueada : No sensible

Metilación de CpG: Deteriorada por superposición Isosquizómeros

Bsp143I BssMI BstKTI BstMBI DpnII Kzo9I NdeII Sau3AI

(40)

40 2.3.24 kasi

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen KasI de Kluyvera ascorbata (C. Polisson).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN de pBR322 en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

(41)

41

• Diluyente B

500 ml KCl 0,1 mM EDTA 200 µg/ml BSA 50 % Glicerol 0,1 % Triton® X-100 1 mM MgCl 2

pH 7 a 25 °C

Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: Bloqueada Isosquizómeros

DinI EgeI EheI Mly113I NarI PluTI SfoI SspDi

2.3.25 NaeI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen NaeI de Nocardia aerocolonigenes (ATCC 23870).

Reactivos suministrados

(42)

42 Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

Actividad en NEBuffers NEBuffer™ r1.1: 25 % NEBuffer™ r2.1: 25 % NEBuffer™ r3.1: <10 % Tampón rCutSmart™: 100 % Compatibilidad de diluyente

• Diluyente A

10 mM NaCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM 200 µg/ml BSA Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor No

Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: Bloqueada Isosquizómeros

KronI MroNI

(43)

43

NgoMIV PdiI

2.3.26 PaeR7I

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen PaeR7I de Pseudomonas aeruginosa PA0303 pMG7 (RV Miller).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 µg de ADN λ (digestión HindIII) en 1 hora a 37

°C en un volumen de reacción total de 50 µl.

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

(44)

44

• Diluyente A

10 mM KCl 50 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor No

Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: Bloqueada Isosquizómeros

Sfr274I SlaI XhoI

2.3.27 PCI

Fuente del producto

Una cepa de E.coli que porta el gen PciI clonado de Planococcus citreus SE-F45

(SK Degtyarev).

(45)

45 Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(46)

46

NEBuffer™ r3.1: 100 %

Tampón rCutSmart™: 50 %

• Diluyente B

BspLU11I+

PscI

(47)

47 2.3.28 SwaI

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen SwaI de Staphylococcus warneri (B. Frey).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(48)

48

NEBuffer™ r3.1: 100 %

Tampón rCutSmart™: 10 %

• Diluyente B

Búfer de almacenamiento Tris-HCl 10

mM NaCl 400 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 %

200 µg/ml Albúmina recombinante pH 7,4 a 25 °C

Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

Sonrisa

@37°C: 25%

2.3.29 StyD4I

(49)

49 Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen StyD4I clonado de Salmonella typhi D4 (ES Anderson).

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(50)

50

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

• Diluyente B

300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 500 µg/ml BSA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 65°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible

Metilación de dcm : Bloqueada por superposición Metilación de CpG: Deteriorada por superposición Isosquizómeros

Bme1390I BmrFI BstSCI MspR9I ScrFI

(51)

51 2.3.30 ScaI-HF

^®

Fuente del producto

Una cepa de E. coli que porta el gen ScaI clonado y modificado de Streptomyces caespitosus (H. Takahashi)

Reactivos suministrados

Los siguientes reactivos se suministran con este producto:

(52)

52

Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 1 μg de ADN λ en 1 hora a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl.

Incubar a 37°C

50 mM Tris-acetato

• Diluyente B

10 mM NaCl 200 mM DTT

1 mM EDTA 0,1 mM

pH 7,4 a 25 °C Inactivación de calor 80°C durante 20 minutos Sensibilidad a la metilación Metilación de dam : No sensible Metilación de dcm : No sensible Metilación de CpG: No sensible Isosquizómeros

BmcAI ZrmI