Síntese de Derivados Triazólicos com Potencial Ação para a Fibrose Cística
Aluno: Samuel Bento Ribeiro
Orientadora: Camilla Djenne Buarque Müller
1.Introdução
A fibrose cística (FC) é uma doença genética causadas por mutações no gene regulador de condutância transmembranar (CFTR), que pode ser divida em 6 classes gerais. Este gene codifica uma proteína expressa nas células epiteliais, principalmente dos órgãos pulmão, pâncreas e testículos, que funciona como um canal de cloreto e também é responsável por regular o transporte icônico no suor, sucos digestivos e mucos. Logo, uma mutação neste gene pode gerar complicações, tais quais danos pulmonares, podendo levar o paciente à morte devido insuficiência respiratória. A mutação mais prevalente é a deleção de uma fenilalanina na posição 508 (ΔF508) pertencente à classe II, a qual está presente em 80% dos pacientes com FC.
Sabe-se que os fármacos existentes atuam como moduladores do CFTR, que podem ser divididos basicamente em 3 grupos: agentes read-through, corretores e potenciadores. Assim, o projeto terá como objetivo sintetizar e avaliar a relação entre a estrutura e atividade de uma diversidade de corretores e/ou potenciadores para o processamento, tráfego e função do ΔF508-CFTR envolvido na fibrose cística.
2. Revisão bibliográfica 2.1. Fibrose cística
A fibrose cística é uma doença autossômica recessiva, causada por mutações no gene regulador de condutância transmembranar (CFTR). Ou seja, é caracterizada por atingir a população pelo gene recessivo originado pelo cruzamento dos pais do indivíduo, note que os pais devem pelo menos portar o gene recessivo defeituoso, conforme a Figura 1.
Figura 1 - Mecanismo autossômico recessivo.
Fonte: https://pt.slideshare.net/
O gene CFTR codifica uma proteína CFTR expressa nas células epiteliais de diferentes órgãos, principalmente pulmões, pâncreas e testículos, que funciona como um canal de cloreto e é responsável por regular o transporte iônico no suor, sucos digestivos e mucos. Mutações neste gene causam falha na secreção de íons cloreto e bicarbonato, transporte excessivo de sódio mediado pelo canal de sódio sensível a amilorida(ENaC) e depleção da quantidade de água na superfície líquida que recobre as vias aéreas, culminando na desidratação e acidificação do líquido do epitélio da via aérea e, aumento da produção e viscosidade do muco. A partir disso, é visto que pacientes com FC, apesar de sofrerem com deficiência em diversos sistemas fisiológicos, observa-se que a principal causa de morbidade da FC é por infecção recorrente e inflamação descontrolada no pulmão, podendo levar o paciente a morte devido insuficiência respiratória, desse modo a fibrose cística também é conhecida como
―mucovisidade‖.
2.1.1. CTFR
O gene CFTR é encontrado no braço longo do cromossomo 7, no lócus q31. O processo que leva a formação da proteína, a partir do cromossomo, envolve a transcrição do DNA para o RNA mensageiro (mRNA), tradução do mRNA para os
peptídeos e processamento e glicosilação até o seu transporte e inserção na membrana apical da célula (Riordan et al, 1989; Rogan et al, 2011).
A proteína CFTR, localiza-se principalmente na membrana apical das células epiteliais, é um membro da subfamília C, da família de transportadores ATP-binding- cassete (ABC), entretanto, existem pelo menos duas características do CFTR que o diferencia dos outros membros da família ABC: é o único a funcionar como um canal de íons e é o único que possui 5 domínios (os demais possuem 4), dado que também tem um domínio regulador. O CFTR é constituído por 1480 aminoácidos que formam duas parte homólogas, cada um contendo um domínio transmembranar hidrofóbico, TMD1 e TMD2, com 6 extensões alfa-hélice hidrofóbicas, que formam o canal iônico de cloreto e um domínio de ligação a nucleotídeos de cada lado, NBD1 e NBD2, as quais estão conectadas por um domínio regulatório não estruturado (RD). Sabe-se que os domínios TMDs estão alinhados em forma de poro ou conduto, por onde os íons cloreto são conduzidos através da membrana e os domínios NBDs são responsáveis pela ligação e pela hidrólise de ATP, fornecendo energia para a atividade do canal. Uma vez que o RD é fosforilado, os domínios NBD se ligam ao ATP abrindo o canal CFTR e a hidrólise fecha-o, desta forma, é visto que a atividade do canal é regulada pelo estado de fosforilação. Tal estrutura pode ser observada na Figura 2.
Figura 2 - Estrutura da proteína CFTR.
Fonte: LUBAMBA et al., 2012.
2.1.2. Mutações
Existem atualmente aproximadamente 2000 mutações descritas para a fibrose cística. As mutações podem ser divididas em 6 principais classes (Tabela 1). Tomando como estudo as classes II, III e IV, pode-se caracterizá-las a seguir.
A mutação de classe II leva a enovelamento errôneo da proteína, resultando degradação prematura pelo sistema de controle de qualidade do retículo endoplasmático (RE), e consequentemente reduzindo o número de canais na superfície celular. Já a mutação de classe III diz que, a quantidade de proteína na membrana celular não apresenta diferença em relação às condições normais, porém, a regulação do canal feita pela ligação e hidrólise de ATP é afetada, resultando em um bloqueio anormal, impedindo que haja a mudança conformacional necessária para a abertura do canal. E, por fim, a mutação de classe IV, esta à de classe III, altera a condutância do canal, através do bloqueio do poro de condução iônica, reduzindo a condutância.[2]
2.1.3. Estratégias terapêuticas
A busca por métodos terapêuticos eficazes culminou com a descoberta de fármacos que atuam como moduladores do CFTR, que podem ser divididos basicamente em 3 três grupos: agente read-through, corretores e potenciadores (Figura 3).
Figura 3 - Estruturas de fármacos corretores (lumacaftor e tezacaftor) e potenciador (ivacaftor), utilizados no tratamento da fibrose cística.
Agentes read-through promovem a supressão do códon de parada prematuro, permitindo a completa tradução do RNA mensageiro do CFTR, sendo uma alternativa para tratamento das mutações de Classe I, em que não há síntese da proteína CFTR.
Os corretores, auxiliam no enovelamento proteico melhorando a estabilidade conformacional do CFTR, permitindo que a proteína chegue a superfície celular. São úteis para pacientes que possuem mutações de classe II, onde o tráfego do CFTR é interrompido no RE. Um exemplo de fármaco dessa classe é o Lumacaftor (VX-809), que mostrou restaurar a expressão e função do ∆F508-CFTR (a mutação mais comum do gene CFTR). Entretanto, o lumacaftor sozinho apresentou melhoras pulmonares pouco significativas. Outros diversos corretores têm sido testados com o intuito de aprimorar a ação do lumacaftor. Recentemente foi aprovado o Tezacaftor (VX-661), que se mostrou bem tolerado com baixa incidência de efeitos adversos em estudos clínicos.[2]
Os potenciadores melhoram a condução de íons cloreto ao induzirem uma mudança conformacional da proteína provendo a abertura do canal. Podem ser utilizados nos mutantes de classe III e IV, onde o CFTR é expresso na superfície celular, porém de forma inativa ou com baixa atividade. Foi visto uma melhora bastante
acentuada dos sintomas respiratórios e gástricos em pacientes com mutações de classe III, com uso de Ivacaftor (Kalydeco TM, vertex Pharmaceuticals), o primeiro medicamento aprovado da classe dos potenciadores.[2]
Atualmente foi aprovado pelo FDA e EMA o tratamento com a combinação lumacaftor/ivacaftor(Orkambi, Vetex Pharmaceuticals) de pacientes homozigotos para F508-CFTR, a mutação mais comum do CFTR. Porém, os medicamentos Kalydeco e Orkambi não são viáveis para a metade da população fibrocística, além de serem extremente caros. O que torna evidente a necessidade de se buscar novas estratégias terapêuticas.
2.2. Quinolonas
É encontrado na literatura que a estrutura básica da quinolona é dada por anéis bicíclicos, contendo uma carbonila em sua cadeia e a partir dessa estrutura são realizados derivados. A primeira quinolona descoberta foi o ácido nalidíxico (Figura 4), onde este e seus derivados apresentaram uma atividade antibacteriana.
Figura 4 - Estrutura do ácido nalidíxico.
Pôde-se perceber então que, conforme houve a evolução da indústria farmacêutica, novas gerações de quinolonas foram descobertas, entre elas destaca-se, por exemplo, o Ivacaftor(DB 08820), que como descrito anteriormente (Figura 4), atua como um potenciador no tratamento da fibrose cística.
2.2.1. Síntese de quinolonas
Uma das rotas mais populares para a síntese de uma quinolona, é realizando uma reação entre uma anilina e um éster malônico (Esquema 1) de interesse, ou seja, uma síntese de Gold-Jacoub.
Esquema 1: Estrutura básica da síntese de Gold-Jacoub.
3. Objetivos
Como parte de um projeto extenso envolvendo alunos de pós graduação na síntese da (1a) e 3-(2,4-di-tert-butil-5-hidroxifenil-3H([1,2,3]triazolo[4,5,b]quinolin- 9(4H)-ona (1b) com potencial ação para a fibrose cística, o objetivo do meu projeto é sintetizar a ethyl 4-oxo-1,4-diidroquinolina-3-carboxilato 4,
4. Metodologia
4.1. Síntese da methyl 4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylate (4)
Para a síntese da quinolona 4 a estratégia empregada foi a partir da reação de Gold-Jacoub, onde este é baseado em uma reação de condensação de Claisen, seguida de uma cicloadição ao submeter o sistema a uma temperatura elevada. Esta reação é feita entre 4-bromoanilina 2 e o etiletoximetilenemalonato 3.
A partir da quinolona 4 pode-se então realizar a adição do alcino à carbonila, via uma reção de substituição nucleofílica e, em seguida, realizar uma reação ―click‖ entre a 1-azido-4-bromobenzeno (6a) e 3-(3-(trimetillsilil)propioloyl)quinolin-4(1H)-ona (5), obtendo assim o 3-(1-(4-bromophenyl)-1H-1,2,3-triazol-4-carbonil)quinolin-4(1H)-ona (1a).
Esquema 2: Estratégia sintética para formação da quinolona-triazol 1a.
4.2. Síntese do 3-(2,4-di-tert-butil-5-hidroxifenil-3H([1,2,3]triazolo[4,5,b]quinolin- 9(4H)-ona (1b)
Como descrito no projeto para a preparação da quinolona-triazol 1b, foi proposta a reação de cicloadição entre arilazidas 6a e a enaminona 7 (Esquema 3), previamente preparada a partir do cloreto de cianurila com a adição cetona (SALEH; AL-OMAR;
ABDEL-AZIZ, 2010). Para os compostos formados a partir das estratégias citadas seriam realizadas tentativas de ciclizações intramolecular via reação de Cadongan ou catálise fotoredox.
Esquema 3: Estratégia sintética para formação da quinolona-triazol 1b.
5. Resultado e discussões
5.1. Síntese da 1-azido-4-bromobenzene (6a)
A azida foi preparada a partir de uma reação via sal de diazônio seguida da adição de NaN3 (WILKENING, I. et al), segundo o Esquema 4 com rendimento médio de 67%.
Esquema 4: Síntese 1-azido-4-bromobenzene (6a)
5.2. Síntese do etil 4-oxo-1,4-diidroquinolina-3-carboxilato (4)
Para a síntese da quinolona (4), foi empregada uma reação de condensação de Claisen entre a anilina e o éster do o etiletoximetilenemalonato (3) para a síntese do intermediário e, em seguida, foi colocado o sistema sob alta temperatura para realização da ciclização do intermediário, para obtenção da quinolona (4)(Esquema 5). Embora seja uma abordagem muito utilizada na literatura houveram diversas complicações, dado que é necessário um controle extremo da temperatura. É mostrado a seguir o mecanismo da síntese de tal quinolona 4 (Esquema 6).
Esquema 5: Síntese do etil 4-oxo-1,4-diidroquinolina-3-carboxilato.
Esquema 6: Mecanismo formação do intermediário.
Esquema 7: Mecanismo síntese ethyl 4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxylate.
5.3. Síntese da quinolona (1b)
A síntese da quinolona 1b foi proposta de acordo com o Esquema 8, abaixo através de uma reação de cicloadição 1,3-dipoloar entre a enaminona 3-(dimetilamino)- 1-(2-nitrophenil)prop-2-en-1-ona 7 e 1-azido-4-bromobenzeno 6a para formar o intermediário 8. Este intermediário será utilizado para posterior estudo de ciclização via ligação C-N através de um aluno de pós-graduação.
Esquema 8: Síntese da quinolona 1b.
5.3.1. Síntese da enaminona
As enaminonas foram preparadas a partir da reação de cloreto de cianurila com dioxana seca em DMF seco formando o intermediário [3- (dimetilamino) -2-azaprop-2- en-l-ilideno] dimetilamonio, conhecido por reagente de Gold, um sal imínio descrito por Gold em 1960. É um intermediário utilizado em muitas reações orgânicas, porém por ser higroscópico, deve ser manuseado em um ambiente livre de umidade, o que torna o seu isolamento complexo. Por isso, a sua formação in situ, seguida da adição da cetona em metóxido de sódio foi uma alternativa prática e útil para a reação (Esquema 9)(SALEH; AL-OMAR; ABDEL-AZIZ, 2010) e, em seguida, no Esquema 10 é mostrado seu mecanismo de reação.
Esquema 9: Síntese da enaminona 3-(dimethylamino)-1-(2-nitrophenyl)prop-2-en-1-ona
Esquema 10: Mecanismo reação síntese da enaminona
6. Conclusão
Foi realizada a síntese da azida com 67% rendimento, para posterior reação com a quinolona 5. Diante dos problemas apresentados tal como o controle da temperatura, sintetizou-se a quinolona 4 com máximo rendimento de 50%. No entanto, a síntese da quinolona 1a não foi realizada, uma vez que, não foi possível obter o produto, quinolona 5, dado que a adição do alcino à quinolona 4 não foi bem sucedida.
Buscando uma nova rota para sintetizar quinolonas-triazol, foi realizada, também a síntese da enaminona 7 com rendimentos de 50%. Tal enaminona será utilizada para dar continuidade na síntese da quinolona (1b).
6.1. Perspectivas
Como perspectiva, serão realizados estudos para aprimorar e realizar a síntese da quinolona 1a. Nota-se que, será realizada a reação para a formação da quinolona 8 como descrito na metodologia e, posteriormente, ciclização desta via reação de Cadongan para síntese da quinolona-triazol 1b.
7. Procedimento experimental 7.1. Síntese da azida
Em um balão de 100 mL contendo a anilina (3 mmol) dissolvida em 5 ml de água foram adicionados 3 mL de ácido sulfúrico. A solução foi colocada sob agitação em banho de gelo a 0°C. O NaNo2 (269,1 mg, 3,9 mmol) foi dissolvido em 5 mL de água e adicionado lentamente ao balão. Após 15 minutos e dissolver todo o precipitado, a azida de sódio (NaN3, 253,5 mg, 3,9 mmol) foi dissolvida em 5 mL de água e adicionada lentamente à reação. Após 1 hora extraiu-se a reação com éter etílico e água, secou-se a fase orgânica com Na2SO4 anidro e evaporou-se non evaporador rotatório.
Rendimento: 67%
7.2. Síntese quinolona (4)
7.2.1. Síntese do intermediário dietil 2-((fenilamino)metilene)malonato
Dietil etoximetilenomalonato (1,8 mL, 4,6 mmol) e anilinina (0,85 mL, 4,6 mmol) foram adicionados em um balão de 10 mL e aquecidos a 120 ° C durante 2 h. A mistura
reacional foi removida do calor, adicionaram-se 2 ml de éter de petróleo gelado e o balão foi resfriado num banho de gelo durante 30 min. Os cristais formados foram lavados com hexano e filtrados a vácuo.
7.2.2. Síntese do etil 4-oxo-1,4-dihidroquinolona-3-carboxalato (4)
Difenil éter (10 mL) foi aquecido à 256º até entrar em ebulição em um balão de 25 mL, foi adicionado dietil 2-((fenilamino)metilene)malonato (500 mg, 1,9 mmol) aos poucos e a solução ficou em refluxo por 15 minutos. A reaçaõ foi resfrada em
temperatura ambiente e formou-se o precipitado marrom claro. Adicionou-se hexano e filtrou-se.
7.3. Síntese da enaminona
Uma solução de cloreto cianúrico (129 g, 0,7 mmol), dioxana seca (0,15 mL) e N-N-dimetilformamida (0,3 mL, 4,2 mmol) foi refluxada sob forte agitação em um balão de 10 mL por 1 hora a 100 ºC. Esfriou-se a solução à temperatura ambiente, e foi adicionado NaOMe 25% (0,4 mL, 4mmol) em pequenas porções, seguida da adição da acetofenona apropriada (1 mmol). A mistura ficou sob refluxo a 100ºC por 4h. A formação do produto foi observada por TLC. A mistura foi extraída com acetato de etila. A fase orgânica foi seca com Na2SO4 anidro e evaporada no evaporador rotatório (SALEH; AL-OMAR; ABDEL-AZIZ, 2010).
(E)-3-(dimetilamino)-1-(2-nitrofenil)prop-2-en-1-ona (4c)
Rendimento: 50%
8. Referências
1. BEDWELL, D. M. et al. Suppression of a CFTR premature stop mutation in a bronchial epithelial cell line. Nature Medicine, v. 3, n. 11, p. 1280–1284, 1997.
2. Farias, Ligia. Chaves. De Freitas. Dissertação de mestrado. Síntese de Derivados Triazólicos com Potencial Ação para a Fibrose Cística, 2019.
3. Procianoy, E. Teste da medida da diferença de potencial nasal transepitelia.
Doutora—[s.l.] UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE MEDICINA, 2014.
4. Riordan J.R., Rommens J.M., Kerem B-S., Alon N, Rozmahel R., Grzelczak Z., Zielinski J., Plavsic S.L.N., Chou J-L., Drumm M.L., Ianuzzi C.M., Collins FS., Tsui LC. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science, 1989; 245:1066-1072.
5. Rogan MP, Stolz DA, Hornick DB. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator intracellular processing, trafficking and opportunities for mutation-specific treatment. Chest, 2011;139 (6):1480-1490
6. SALEH, T. S.; AL-OMAR, M. A.; ABDEL-AZIZ, H. A. One-Pot Synthesis of Enaminones Using Gold’s Reagent. Letters in Organic Chemistry, v. 7, n. September, p. 483–486, 2010.
7. THOMAS, J. et al. Metal-Free Route for the Synthesis of 4-Acyl-1,2,3-Triazoles from Readily Available Building Blocks. Chemistry - A European Journal, v. 22, n.
29, p. 1–6, 2016.
8. WESSIG, P. et al. The photo-dehydro-diels-alder reaction: An efficient route to naphthalenes. Synthesis, n. 9, p. 1445–1454, 2005.
