J. Pediatr. (Rio J.) vol.93 número6

(1)

www.jped.com.br

ARTIGO

ORIGINAL

Variants

in

the

interleukin

8 gene

and

the

response

to

inhaled

bronchodilators

in

cystic

fibrosis

夽

,

夽夽

Larissa

Lazzarini

Furlan

a

_,

_José

_Dirceu

_Ribeiro

b

_,

_Carmen

_Sílvia

_Bertuzzo

c

_,

João

Batista

Salomão

Junior

d,e

,

Dorotéia

Rossi

Silva

Souza

f

e

Fernando

Augusto

Lima

Marson

b,c,∗

a_Faculdade_de_Medicina_de_São_José_do_Rio_Preto,_São_José_do_Rio_Preto,_SP,_Brasil

b_Universidade_Estadual_de_Campinas_(Unicamp),_Faculdade_de_Ciências_Médicas,_Departamento_de_Pediatria,_Campinas,_SP,_Brasil c_Universidade_Estadual_de_Campinas_(Unicamp),_Faculdade_de_Ciências_Médicas,_Departamento_de_Genética_Médica,_Campinas,

SP,Brasil

d_Faculdade_de_Medicina_de_São_José_do_Rio_Preto,_Hospital_{Universitário,}_Departamento_de_Pediatria,_São_José_do_Rio_Preto,_SP,

Brasil

e_Faculdade_de_Medicina_de_São_José_do_Rio_Preto,_Hospital_{Universitário,}_Departamento_de_Pneumologia_Pediátrica,_São_José_do

RioPreto,SP,Brasil

f_Faculdade_de_Medicina_de_São_José_do_Rio_Preto,_Centro_de_Pesquisa_de_Bioquímica_e_Biologia_Molecular,_Departamento_de

BiologiaMolecular,SãoJosédoRioPreto,SP,Brasil

Recebidoem2deagostode2016;aceitoem9dejaneirode2017

KEYWORDS

CFTR;

Diseaseseverity; Interleukin8; Lungfunction

Abstract

Objective: Interleukin8proteinpromotesinflammatoryresponses,eveninairways.The pre-senceofinterleukin8genevariantscausesalteredinflammatoryresponsesandpossiblyvaried responses to inhaled bronchodilators. Thus, this study analyzed the interleukin 8 variants (rs4073,rs2227306, andrs2227307) andtheir associationwiththeresponsetoinhaled bron-chodilatorsincysticfibrosispatients.

Methods: Analysisofinterleukin8genevariantswasperformedbyrestrictionfragmentlength polymorphismofpolymerasechainreaction.Theassociationbetweenspirometrymarkersand the responseto inhaledbronchodilators wasevaluated by Mann-Whitneyand Kruskal-Wallis tests. The analysisincludedall cysticfibrosis patients, andsubsequently patientswith two mutationsinthecysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorgenebelongingtoclasses ItoIII.

DOIserefereaoartigo:

http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2017.03.005

夽 _Como_citar_este_artigo:_Furlan_LL,_Ribeiro_JD,_Bertuzzo_CS,_Salomão_Junior_JB,_Souza_DR,_Marson_FA._Variants_in_the_interleukin₈_gene

andtheresponsetoinhaledbronchodilatorsincysticfibrosis.JPediatr(RioJ).2017;93:639---48. 夽夽_Estudo_feito_na_Universidade_Estadual_de_Campinas_(Unicamp),_Campinas,_SP,_Brasil.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:[email protected](F.A.Marson).

(2)

Results: This study included 186 cystic fibrosis patients. There was no association of the rs2227307variantwiththeresponsetoinhaledbronchodilators.Thers2227306variantwas asso-ciatedwithFEF50%inthedominantgroupandinthegroupwithtwoidentifiedmutationsinthe cysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorgene.Thers4073variantwasassociated with spirometry markersinfour genetic models: co-dominant (FEF25-75% and FEF75%), domi-nant(FEV1,FEF50%,FEF75%,andFEF25-75%),recessive(FEF75%andFEF25-75%),andover-dominant (FEV1/FVC).

Conclusions: Thisstudyhighlightedtheimportanceofthers4073variantoftheinterleukin8 gene,regardingresponsetoinhaledbronchodilators,andoftheassessmentofmutationsinthe cysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorgene.

PALAVRAS-CHAVE

CFTR;

Gravidadedadoenc¸a; Interleucina8; Func¸ãopulmonar

Variantesnogenedainterleucina8earespostaabroncodilatadoresinalatórios

nafibrosecística

Resumo

Objetivo: Aproteínainterleucina8promoverespostasinflamatórias,oqueincluisuaatuação nasviasaéreas.A presençadevariantesnogenedainterleucina8causarespostas inflama-tóriasalteradasepossivelmente respostasvariadasaousode broncodilatadoresinalatórios. Assim,esteestudoanalisouasvariantesdainterleucina8(rs4073,rs2227306,rs2227307)esua associaçãoàrespostaabroncodilatadoresinalatóriosempacientescomfibrosecística. Métodos: Foifeitaanálisedasvariantesgenéticasdainterleucina8porrestrictionfragment lengthpolymorphismdareaçãoemcadeiadapolimerase.Aassociaçãoentreosmarcadoresda espirometriaearespostaabroncodilatadoresinalatóriosfoifeitapelostestesdeMann-Whitney e Kruskal-Wallis.A análise incluiu todosos pacientes com fibrose císticae posteriormente pacientescomduasmutaçõesnogenecystic fibrosistransmembraneconductanceregulator pertencentesàsClassesIaII.

Resultados: Esteestudo incluiu186pacientescomfibrose cística. Nãohouveassociaçãoda varianters2227307àrespostaabroncodilatadoresinalatórios.Avarianters2227306foi associ-adaaFEF50%nogrupodominanteenogrupocomduasmutaçõesidentificadasnogenecystic fibrosistransmembraneconductanceregulator.Avarianters4073foiassociadaamarcadores daespirometriaem quatro modelosgenéticos:codominante(FEF25-75% eFEF75%),dominante (VEF1,FEF50%,FEF75%eFEF25-75%),recessivo(FEF75%eFEF25-75%)eoverdominante(VEF1/CVF). Conclusões: Esteestudodestaca,principalmente,aimportânciadavarianters4073dogeneda interleucina8,narespostaabroncodilatadoresinalatórios,concomitantementeaogenótipo dasmutaçõesnogenecysticfibrosistransmembraneconductanceregulator.

Introduc

¸ão

Aresposta abroncodilatadores inalatórios(BD) na fibrose cística(FC)(OMIM:n◦ _219700) _é_muito_variável_e_depende do genótipo do RTFC (Regulador da Condutância Trans-membranadaFibroseCística),dossintomaspulmonarese, principalmente,devariantesnosgenesmodificadores,como oReceptorAdrenérgicoBeta2(ADRB2).1_Até_agora,_apenas

algunsestudosinvestigaramessaresposta.

Asmutac¸õesnogenedoRTFCcausamFC,devidoa defi-ciência,disfunc¸ãoouausênciadaproteínadoRTFC.2_A_FC_é

caracterizadaporumciclocontínuodeinflamac¸ãocrônica dasviasaéreas,quepodeserexacerbadapelainterleucina8 (IL-8), um importante mediador pró-inflamatório. A IL-8

é responsável por iniciar e aumentar a resposta provoca-doranapresenc¸adepatógenosespecíficos,causaativac¸ão

e migrac¸ão de neutrófilos do sangue periférico para os tecidos.3 _A _inflamac_¸ão _crônica _das _vias _aéreas _é _o

cami-nhocomumfinaldelesãopulmonar.Elaéresponsávelpelo aumentonapermeabilidadevascular,contribuiparaedema intersticial,alveolaredasviasaéreas.

O tratamento da doença pulmonar na FC inclui anti--inflamatórios, corticosteroides inalatórios, antibióticos, mucolítico,soluçãosalinahipertônicaefisioterapia.Dentre aspossíveisterapias,hápoucacomprovaçãoquecorrobore umpapeldosBDnaFC.4,5_Contudo,_os_BD_normalmente_são

prescritosporumtempomaiordevidoaepisódiosdepieirae dispneianaFC.6_Os_BD_reduzem_a_liberac_¸ão_de_mediadores,

(3)

pulmonar.7_A_resposta_a_BD_depende,_em_parte,_da_proteína

doRTFC,queinteragecomaproteínadoADRB2para promo-verbroncodilatac¸ão.8_A_espirometria_é_o_principal_método

deavaliarafunc¸ãopulmonar,agravidadeeaprogressãoda doenc¸a,bemcomoarespostaaBD.

Inflamac¸ãoneutrofílicaintensaebaixahiperreactividade brônquica são características comumente observadas na FC.9_Ademais, _a_resposta_das_variantes _genéticas_aos_BD_é

poucoconhecida.1_Pode-se_destacar_o_papel_da_IL-8_no

com-ponente neutrofílicodadoenc¸apulmonarna FC.Osgenes quepodemestar associadosàgravidade daFC e possivel-menteàrespostaaBDforamrelatadosaquienaliteratura científicadetodo omundo.1,10---12 _O _gene_da_IL-8_deve_ser

destacado,poiseleteminfluênciadiretasobreainflamac¸ão pulmonar e pode ser eficaz na resposta a BD. Portanto, esteestudocomparouasvariantesgenéticasdaIL-8rs4073, rs2227306e rs2227307 coma respostaaBD em pacientes comFC,comousodaespirometria.

Material

e

métodos

Pacientes

Foiconduzidoumestudotransversalcom186pacientescom FC, selecionados em dois centros universitários de refe-rência (Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto e Universidade de Campinas) para tratamento de FC, de 2013 a2015. O estudofoi aprovado pelo Comitêde Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Campinas, São Paulo, Brasil (n◦ _528/2008). _Todos _os_{participantes} _foram informados sobre o estudo e assinaram o Documento de Consentimento Informado. Para os pacientes com menos de 18anos, o Consentimento Informado foi assinado pelo pai/mãeouguardião.Oestudoseguiuasrecomendac¸õesda Declarac¸ãodeHelsinque.

OdiagnósticodeFCfoiconfirmadopelapresençadeduas concentraçõesalteradasdesódioecloretonosuor(nívelde cloretoacimade60mEq/L).Alémdisso,nenhumpaciente foisubmetidoatesteinicialdetripsinogênioimunorreativo (IRT).Emumgrupode91pacientes,houveduasmutações nogenedoRTFCpertencentesàsclassesI,IIe/ouIII (asso-ciadasàmaiorgravidadedadoença,devidoàausênciaou não funcionalidade da proteína do RTFC);13 ₆₀ _pacientes

nãoapresentarammutaçãoidentificadadogenedoRTFCou apresentaramduasmutaçõesquepertencemàsclassesIV,V ouVI;e35pacientesapresentaramumamutaçãonogenedo

RTFCquepertenceàsclassesI,IIouIIIeumamutac¸ãonão identificadaoupertencenteàsclassesIV,VouVI(tabela1).

Variáveisclínicas

As seguintes variáveis foram analisadas: escores clínicos (Shwachman-Kulczycki, Kanga e Bhalla); índice de massa corporal(IMC)depacientescommaisde18anos,coma fór-mulaIMC=peso/altura;2_a_versão_3.0.1_do_programa_Anthro

(OrganizaçãoMundialdeSaúde[OMS],2006)foiusadapara criançascommenosdecincoanoseaversão1.0.2do pro-grama Anthro Plus (Organização Mundialde Saúde [OMS], 2007)foiusadaparacriançasdecincoanosaadolescentes de18anos;idadedopacienteeidadenaépocado diagnós-tico;primeirosintomaclínico(um sintomageral,sintomas

pulmonaresedigestivos);períodoatéaprimeiracolonizac¸ão

porPseudomonas aeruginosa mucoide(PAM);

microrganis-mosidentificadosnaculturadeescarroderotina(P.

aeru-ginosa,Achromobacterxylosoxidans,Burkolderiacepaciae

Staphylococcusaureusmucoidesenãomucoides);saturac¸ão

deoxigênio nosangue arterial transcutânea(SaO2); espi-rometriaecomorbidades(póliposnasais,osteoporose,íleo meconial,diabetesmellituseinsuficiênciapancreática).

Aespirometriafoifeitaempacientescommaisdesete anos,comoespirômetroCPFS/D(MedGraphics,SaintPaul, Minnesota, EUA). Os dados foram registrados pela versão

3.8BdosoftwarePFBREEZEparaWindows95/98/NT

(Ame-rican Thoracic Society) e avaliados em percentagem de valorespreditivospara:capacidadevitalforc¸ada(%deCVF), volumeexpiratórioforc¸adono 1◦ _segundo_da _CVF _(VEF

1), proporçãoVEF1/CVF,fluxoexpiratórioforçadoa25%daCVF (FEF25%), fluxo expiratório forçadoa 50% da CVF (FEF50%), fluxoexpiratórioforçadoa75%daCVF(FEF75%),fluxo expi-ratório forçado entre 25% e 75% da CVF (FEF25-75%), fluxo expiratórioforçadomáximo (FEFmax) e volumede reserva expiratória(VRE).Osdadosdaespirometriasãomostrados empercentualdovalorpreditivodeacordocomasequações dePolgarePromadhat(1971);Pereiraetal.(2007)eDuarte etal.(2007).14---16

Todos os pacientes submetidos a espirometria fizeram o teste antes e 15 minutos após administração dos BD [albutrol---C13H21NO3(400mg)].Ospacientesemterapiacom BDforamorientadosainterromperamedicaçãooitohoras antesdaespirometria,casoestivessememtratamentocom BD de curtaação, e 48 horas antes, caso estivessem em tratamentocomBDdeaçãoprolongada.Amudançano per-centualpós-BDfoiusadanaanáliseestatística.Oscritérios derespostaaBD,definidoscomoaumentode>12%e200mL deVEF1inicial,foramusadoscomoosegundomodelopara avaliaraassociaçãoentreasvariantesdogenedaIL-8ea respostaaBD.

Extrac¸ãodoDNAegenotipagem

O DNA genômico foi extraído de amostras de sangue periféricocomométodopadrãofenol-clorofórmioe quanti-ficadoporespectrofotômetroGENanoVueTM_(GE_Healthcare

Biosciences,Pittsburgh,EUA).Nesteestudo,aconcentrac¸ão finaldaamostrafoiestabelecidaem50ng/␮L.

As mutações do RTFC foramanalisadas por reação em cadeia dapolimerase (PCR) (F508del) após digestão enzi-mática(G542X,R1162X, R553X,G551D eN1303K).Outras mutações no gene do RTFC podem ser identificadas por sequenciamento ou com o uso do método SALSA MPLA (AmplificaçãodeMúltiplasSondasDependentesdeLigação) Kit P091-C1 CFTR-MRC-Holland S4X, 2183A > G, 1717-G > A, I618 T com MegaBace1000® (GE Healthcare Bioscien-ces, Pittsburgh,EUA)e ABI3500 (BiossistemasAplicados ---ThermoFisherScientific,SãoPaulo,Brasil).17

As variantes dogenedaIL-8 foramanalisadaspor PCR após digestão com enzimas de restric¸ão. Para a variante rs4073,foram usados os iniciadores 5’-CCA TCA TGA TAG CATCTGTA-3′_e₅′_-CCA_CAA_TTT_GGT_GAA_TTA_TTA_A-3′ _e_a

enzimaderestric¸ãoAseI;paraavarianters2227306,foram usadososiniciadores5′_-CTC_TAA_CTC_TTT_ATA_TAG_GAA_TT-3′

(4)

Tabela1 Distribuic¸ãodospacientescomfibrosecísticaparagenótipodoRTFCeclassesdemutac¸õesidentificadas.a

Genótipo N % Grupodepacientes

−/- 55 29,6 Pacientessemmutac¸ãonogenedo

RTFCoucomumaouduasmutac¸ões pertencesàsclassesIV,VouVI

V562I/- 1 0,5

I507V/- 1 0,5

D110H/V232H 1 0,5

G576A/R668C 1 0,5

p.Glu528G>A/TG11-5T 1 0,5

F508del/- 23 12,4 Pacientescomumamutac¸ãodoRTFC

pertencentesàsclassesI,IIouIIIe umamutac¸ãonãoidentificadaou pertencentesàsclassesIV,VouVI

G542X/- 4 2,2

F508del/3272-26A>G 1 0,5

F508del/P205S 1 0,5

G542X/P205S 1 0,5

G542X/R334W 1 0,5

3120+1G>A/L206W 1 0,5

622-2A>G/711+1G>T 1 0,5

R1162X/- 1 0,5

G542X/I618T 1 0,5

F508del/F508del 49 26,3 Pacientescomduasmutac¸õesdo

RTFCpertencentesàsclassesI,II e/ouIII

−Mutac¸õesG2 (grupoCFTR-B)

F508del/G542X 12 6,5

F508del/N1303K 5 2,7

F508del/R1162X 3 1,6

F508del/R553X 3 1,6

F508del/1584-18672pbA>G 1 0,5

F508del/c.1717-1G>A 2 1

3120+1G>A/R1066C 1 0,5

F508del/2183AA>G 1 0,5

F508del/2184insA 1 0,5

Duplicac¸ãodoéxonF508del/6Ba16 1 0,5

F508del/G85E 1 0,5

F508del/S549R(T>G) 1 0,5

F508del/S4X 1 0,5

G542X/2183AA>G 1 0,5

G542X/R1162X 1 0,5

A561E/A561E 1 0,5

F508del/R1066C 1 0,5

R1070Q;S466X/G542X 1 0,5

F508del/1812-1G>A 2 1

2183AA>G/2183AA>G 1 0,5

3120+1G>A/3120+1G>A 1 0,5

N,tamanhodaamostra;RTFC,reguladordacondutânciatransmembranadafibrosecística.

a_Todos_os_pacientes_avaliados_neste_estudo_foram_incluídos_(grupo_RTFC_-A).

derestric¸ãoEcoRI;eparaavarianters2227307,foram usa-dos osiniciadores 5′_-TAA _AGG _TTT _GAT _CAA_TAT _AGA-3′ _e 5′_-CTT_CCT_TCT_AAT _TCCA_ATA_TG-3′_,_bem_como _a_enzima derestric¸ãoScrFI.18,19 _Os_produtos_da_restric_¸ão_enzimática

foramsubmetidos aeletroforeseem geldepoliacrilamida a 12%, ou gel de agarose a 4%,18,19 _e _corados _com _gel

Red®.

Análiseestatística

Foi feita com a versão 22.0 doSPSS (SPSS Inc.,Chicago, EUA). Foi usada a versão 3.1.9.220 _do _software _GPower

para calcular o poder da amostra, considerou-se o genó-tipo das variantes analisadas e adotou-se o poder para

valor acima de 80%. As condic¸ões a seguir foram aplica-dasparacalcularopoderdaamostra:(testedeanáliseda variâncianolugardotestedeKruskal-Wallis,considerou-se queaanálisedevariânciaéumtestemaisforte)tamanho do efeito=0,25, ␣=0,05, poder=0,80, grau de liberdade do numerador=2, número de grupos=3, n◦ _ideal₌_158;

(testedeMann-Whitney---bicaudal)tamanhodoefeito=0,5, ␣=0,05, poder=0,80, proporc¸ão de atribuic¸ão N2/N1=1, n◦ _ideal---134; _(teste_␹2₎ _tamanho_do_efeito₌_0,3, _␣₌_0,05,

poder=0,80,graudeliberdade=2,n◦_ideal₌_108.

(5)

de Kruskal-Wallis, foram feitas identificação e avaliação adicionaisdasdiferençasentreosgenótiposcomosoftware

paraWindowsMedCalc®,versão16.1 (MedCalc® Software, Ostend,Bélgica).

O teste ␹2 e o teste exato de Fisher foram usados paracomparac¸ãoentreosdiferentesgenótiposegruposde variantesdogenedaIL-8earespostaaBDdefinidoscomo umaumentode>12%e200mLdeVEF1inicial.

Tabela2 Análisedescritivadosmarcadoresclínicoselaboratoriaisdepacientescomfibrosecística

Variáveis Distribuic¸ãoa

Sexo(masculino) 92/186(49,5%)

Etnia(branca) 169/180(93,9%)

Idade(meses) 169;201,41±171,98;143(7a932)

Iníciodossintomas(meses) 159;38,23±114,03;3(0a720) Diagnóstico(meses) 171;87,90±158,39;20(0a833) Iníciodossintomasdigestivos(meses) 140;41,2±112,61;3(0a720) Iníciodossintomaspulmonares(meses) 156;46,33±123,64;6(0a720) Índicedemassacorporal 178;17,28±4,08;16,28(6,5a35,67) Poliposenasal(presenc¸a) 28/162(17,3%)

Diabetesmellitus(presenc¸a) 32/164(19,5%)

Osteoporose(presenc¸a) 25/162(15,4%)

Insuficiênciapancreática(presenc¸a) 130/162(80,2%)

Íleomeconial(presenc¸a) 23/162(14,2%)

1a_Pseudomonas_aeruginosa _121;_103,03

±171,74;31(0a872)b

P.aeruginosamucoide(presenc¸a) 74/173(42,8%)c

P.aeruginosanãomucoide(presenc¸a) 99/173(57,2%)c

Achromobacterxylosoxidans(presenc¸a) 17/174(9,8%)

Burkolderiacepacia(presenc¸a) 25/174(14,4%)

Staphylococcusaureus(presenc¸a) 131/174(75,3%)

SaO2 159;94,87±4,28;96(66a99)

EscoredeBhalla 113;8,9±5,77;8(0a25)

EscoredeKanga 118;18,78±5,82;17,5(10a40)

EscoredeShwachman-Kulczycki 143;65,97±16,78;65(20a95)

CVF 142;72,13±23,86;77(19a126)

FEV1 141;60,99±25,75;63(17a116)

VEF1/CVF 144;79,08±14,99;81(39a113)

FEF25% 119;61,28±31,71;60(7a138)

FEF50% 119;46,2±31,25;40(3a126)

FEF75% 116;36,32±28,77;27,5(4a142)

FEF25-75% 140;47,16±32,51;39(5a150)

FEFMax 114;75,54±25,59;73,5(25a137)

VRE 112;80,96±52,39;69(3a248)

Respostaabroncodilatadorinalatório

CVF 117;1,74±8,19;1(−17a32)

FEV1 117;3,51±8,0;3(−12a48)

VEF1/CVF 111;2,14±7,43;2(−19a32)

FEF25% 99;9,99±24,41;5(−45a110)

FEF50% 99;13,08±26,06;9(−41a114)

FEF75% 99;20,93±46,47;16(−64a235)

FEF25-75% 99;12,28±27,77;9,5(−51a117)

FEFMax 116;2,63±14,48;3(−42a69)

VRE 100;23,04±101,08;0(−90a670)

CVF,capacidadevitalforçada;FEF25%,fluxoexpiratórioforçadoa25%daCVF;FEF25-75%,médiodofluxoexpiratórioforçadoentre25%

e75%daCVF;FEF50%,fluxoexpiratórioforc¸adoa50%daCVF;FEF75%,fluxoexpiratórioforc¸adoa75%daCVF;FEFmax,fluxoexpiratório

forçadomáximo;SaO2,saturaçãodeoxigênionosanguearterial;VEF1,volumeexpiratórioforçadono1◦segundodaCVF;VRE,volume

dereservaexpiratória.

Osdadosdaespirometriasãomostradosempercentualdevalorpreditivo.Todosospacientesavaliadossãodescritos.

a _Os_dados_com_distribuic_¸ão_categórica_são_apresentados_da_seguinte _forma:_n◦ _de _variáveis/n◦ _total_{(percentual);}_os _dados_com

distribuic¸ãonuméricasãoapresentadosdaseguinteforma:tamanhodaamostra;média±desviopadrão;mediana(mínimoamáximo).

b _Os_valores_ausentes_para_primeira_P._aeruginosa_correspondem_a_pacientes_com_fibrose_cística_que_nunca_apresentaram_cultura_positiva

paraP.aeruginosa.

c _Um_paciente_com_fibrose_cística_apresentou_cultura_positiva_para_P._aeruginosa_,_com_valores_negativos_para_IgG_específico_do_antígeno

(6)

A

D

G

J

K

M

L

H

I

B

E

F

C

8 5 25

20 15 10 5 0 –5 –10 4 3 2 1 0 –1 –2 35 50 40 30 20 10 0 –10 –20 30 25 20 15 10 5 0 –5 –10 AA+AT CC AA+AT

AA AT AA+AT

AA AA+TT

AA+AT

TT TT TT

AA+AT AA AA+TT

TT TT

CT AA AT TT

CT+TT CC+TT

AA+AT AA+AT

Rs4073 + 2 mutações do RTFC

rs2227306 + 2 CFTR mutations

Rs4073 + 2 mutações do RTFC Rs4073 + 2 mutações do RTFC

rs4073

rs4073 rs4073

Rs4073 + 2 mutações do RTFC rs4073 rs4073 + 2 CFTR mutations rs4073 + 2 CFTR mutations

V

olume expiratório forçado no 1º

segundo da capacidade vital forçada

Fluxo expiratório forçado 50%

Fluxo expiratório forçado

– 25-75% da capacidade vital forçada

Fluxo expiratório forçado 75% Fluxo expiratório forçado 75% Fluxo expiratório forçado 50% Fluxo expiratório forçado 75%

V

olume expiratório forçado no 1º

segundo da capacidade vital forçada

TT AT TT

6 4 2 0 –2 –4 25 20 15 10 5 0 –5 –10 –15 –20

40 35 45

40 35 30 25 20 15 10 5 0 30 25 20 15 10 5 0 –5 –10 –15 30 20 10 0 –10 –20

50 30 20

(7)

Para a identificação de mutaçõesnogene doRTFC, os pacientes foram analisados com base em dois contextos: (RTFC-A) todos ospacientes com FC, independentemente das mutações dogene (n=186 pacientes); (RTFC-B) paci-entes com duas mutações pertencentes às classes I, II e/ouIII(n=91pacientes).Quantoàsvariantes,foram ado-tados quatro modelos de análise: (i) codominante (teste deKruskal-Wallis); (ii)recessivo(testedeMann-Whitney); (iii) dominante (teste de Mann-Whitney); (iv) superdomi-nante(testedeMann-Whitney),aplicadosemassociaçãoàs variáveis clínicas. Para todasas análises, o valor alfa foi estabelecidoem0,05.

Para análisedoequilíbriodeHardy-Weinberg(HWE) foi usadoosoftwareOnlineEncyclopediaforGenetic Epidemi-ologyStudies(OEGE).

O testedataxa defalsa descoberta(FDR)foi aplicado paracorrigiracomparaçãomúltipladetestes.AFDRéuma abordagemaoproblemademúltiplascomparações.Emvez decontrolarachancedequalquerfalso,oscontrolesdaFDR controlamaproporçãoesperadadefalsospositivosentreos resultadossignificativos.Olimite daFDRé determinadoa partirdadistribuiçãodo valordep observadoe, assim,é adaptativoaovalordesinalnosdados.21_O_valor_de_p_(p)_e

ovalordepcorrigido(pc₎_foram_mostrados_no_manuscrito. Aanálisededesequilíbriodeligac¸ãofoifeitanaversão4.2

dosoftwareHaploview.

Resultados

OsdadosclínicoselaboratoriaisdospacientescomFCsão descritosnatabela2.Adescric¸ãodogenótipoeda frequên-ciadealelosdasvariantesdogenedaIL-8encontra-sena

tabela3.Afigura1mostraosdadoscomvaloresdepevalor depcorrigidoparaassociac¸ãodasvariantesdogenedaIL-8, consideraram-seosquatrosmodelosdeanálisepropostose ogenótipodogenedoRTFC.

Avarianters2227307nãofoiassociada àrespostaaBD emnenhumdosmodelosestudados;aopassoqueavariante rs2227306foiassociadaaFEF50% parapacientescom genó-tipoCC(modelodominante;p=0,05;pc₌_0,083)_e_genótipo CT(modelosuperdominante;p=0,033;pc₌_0,083)_no_grupo

RTFC-B(fig.1DeE).

Deve-se enfatizarde modo especial a varianters4073, associada às variáveis de espirometria: FEV1, proporc¸ão VEF1/CVF,FEF50%,FEF75%eFEF25-75%.AmenorrespostaaBD foiobservadaparagenótipoTT(modelodominante)e paci-entesdo grupo RTFC-Ba VEF1 (fig. 1A),FEF50% (fig. 1 C), FEF75% (fig. 1G) e FEF25-75% (fig. 1 K).O mesmo foi obser-vadoparao grupoRTFC-A paraFEF75% (fig. 1H)e FEF25-75% (fig.1L).Naanálisecodominante,ogenótipoTTapresentou menorrespostaaBDparaVEF75%(fig.1F)eFEF25-75%(fig.1J), respectivamentepara os grupos RTFC-A e RTFC-B. Para o indicadorVEF1/CVF,o genótipoAT nospacientesdogrupo

Figura1 Associaçãodasvariantesrs4073ers2227306daIL-8(interleucina-8)àrespostaabroncodilatadoresinalatóriosem paci-entescomfibrosecística.A.Associaçãoentreovolumeexpiratórioforçadono1◦_segundo_(VEF₁₎_da_capacidade_vital_forc_¸ada_(CVF) ers4073,modelodominanteeduasmutaçõesidentificadasnogenedoRTFC(reguladordacondutânciatransmembranadafibrose cística)pertencenteàsclassesI,IIe/ouIII(grupoRTFC-B)(p=0,028;pc_---0,112)._(AA₊_AT)_n₌_39;_média_de_4,77

±8,95;medianade4 (variaçãode−9a48).(TT)n=21;médiade0,86±5,42;medianade−1(variaçãode−6a15).B.AssociaçãodaproporçãoVEF1/CVF àvarianters4073,modelosuperdominanteegrupoRTFC-B(p=0,029;pc=0,116).(TT)n=30;médiade0,86±7,36;medianade0 (variaçãode−12a23).(AT)n=29;médiade4,76±7,58;medianade4(variaçãode−9a32).C.Associaçãodofluxoexpiratório forçadode50%(FEF50%)daCVFàvarianters4073,modelodominanteegrupoRTFC-B(p=0,046;pc=0,184).(AA+AT)n=37;média de17,38±24,18;medianade16(variaçãode−20a89).(TT)n=21;médiade4,95±20,80;medianade−2(variaçãode−19a 55).D.AssociaçãodoFEF50%àvarianters2227306,modelodominanteegrupoRTFC-B(p=0,050;pc=0,083).(CC)n=15;médiade 1,47±17,22;medianade0(variaçãode−20a29).(CT+TT)n=44;médiade15,84±25,04;medianade10,50(variaçãode−28a 89).E.AssociaçãodoFEF50%àvarianters2227306,modelosuperdominanteegrupoRTFC-B(p=0,033;pc=0,083).(CC+TT)n=33; médiade6,06±20,27;medianade4(variaçãode−20a55).(CT)n=23;médiade19,96±26,43;medianade19(variaçãode−28a 89).F.Associaçãodofluxoexpiratórioforçadode75%(FEF75%)daCVFàvarianters4073,modelocodominanteindependentemente dasmutaçõesidentificadasnogenedoRTFC(grupoRTFC-A)(p=0,044;pc₌_0,058).₁ ₌_/ _3._(AA)_n₌_28;_média_de_29,93_±_39,98; medi-anade30(variaçãode−47a142).(AT)n=42;médiade24,81±53,57;medianade14(variaçãode−58a235).(TT)n=28;médiade 9,14±36,95;medianade2,5(variaçãode−35a119).G.AssociaçãodoFEF75%àvarianters4073,modelodominanteegrupoRTFC-B (p=0,024;pc₌_0,096)._(AA₊_AT)_n₌_38;_média_de₃₃_±_55,23;_mediana_de_(variac_¸ão_de₋₂₇_a_235)._(TT)_n₌_21;_média_de_5,43_±_35,93; medianade2(variaçãode−35a119).H.AssociaçãodoFEF75%àvarianters4073,modelodominanteegrupoRTFC-A(p=0,034; pc₌_0,058)._(AA₊_AT)_(n₌_70;_média_de_26,86

±48,34;medianade18(variaçãode−58a235).(TT)n=28;médiade9,14±36,95; medianade2,5(variaçãode−35a119).I.AssociaçãodoFEF75%àvarianters4073,modelorecessivoegrupoRTFC-A(p=0,040; pc₌_0,058)._(AA)_n₌_28;_média_de_29,93

(8)

RTFC-BmostroumenorrespostaaBD(fig.1B).Porfim,nos pacientesdosgruposRTFC-AeRTFC-B,respectivamente,o genótipoAA(modelorecessivo)parars4073mostroumaior respostaaBDparaFEF75%(fig.1I)eFEF25-75%(fig.1M).

Adistribuic¸ãodehaplótiposparaasvariantesdogeneda

IL-8éapresentadanatabela3.

Para comparac¸ão entre as variantes do gene da IL-8 e a resposta a BD definida como aumento de > 12% e 200mLdeVEF1inicial,nãofoiencontradaassociac¸ão posi-tiva(p>0,05).

Discussão

Mostramosanteriormente ainfluência dasdiferentes vari-antes do gene da IL-8 sobre a gravidade clínica da FC.22

Além disso, este estudo mostra a associação das diferen-tes variantesdo genedaIL-8e suamodulação àresposta a BD, avalia o impacto do medicamento sobre a função pulmonar. A variabilidade das respostas aos BD é deter-minada por vários fatores, como inflamação e obstrução

Tabela3 Distribuic¸ão degenótipos, alelos ehaplótipodas variantesdo geneda IL-8(rs4073, rs2227306e rs2227307)em pacientescomfibrosecística

Variantes Genótipo Número(%) Alelo Número(fa) ␹2 Valordepa

rs4073 AA 54(29,2) A 187(0,51) 3,94 <0,05

AT 79(42,7) T 183(0,49)

TT 52(28,1) Total 370

Total 185

rs2227306 CC 70(38) C 211(0,57) 8,21 <0,05

CT 71(38,6) T 157(0,43)

TT 43(23,4) Total 368

Total 184

rs2227307 GG 31(17,4) G 139(0,39) 1,48 >0,05

TG 77(43,3) T 217(0,61)

TT 70(39,3) Total 356

Total 178

rs4073/rs2227306/rs2227307 Frequência Percentual(%)

AACCGG 3 1,7

AACCGT 5 2,8

AACCTT 24 13,6

AACTGG 3 1,7

AACTGT 4 2,3

AACTTT 7 4,0

AATTGG 2 1,1

AATTGT 2 1,1

AATTTT 3 1,7

ATCCGT 13 7,3

ATCCTT 7 4,0

ATCTGT 30 16,9

ATCTTT 10 5,6

ATTTGG 5 2,8

ATTTGT 6 3,4

ATTTTT 3 1,7

TTCCGG 2 1,1

TTCCGT 5 2,8

TTCCTT 8 4,5

TTCTGG 4 2,3

TTCTGT 6 3,4

TTCTTT 3 1,7

TTTTGG 12 6,8

TTTTGT 5 2,8

TTTTTT 5 2,8

Total 177 100

fa,frequênciaabsoluta;IL-8,interleucina8;%,percentual;␹2,qui-quadrado.

a_␹2_e_valores_de_p_fazem_referência_ao_cálculo_de_equilíbrio_de_{Hardy-Weinberg.}_Os_dados_{significativos}_são_mostrados_em_negrito.

(9)

pulmonar,23_bactérias24_e_sintomas_pulmonares,25_bem_como

genesmodificadores.26_Contudo,_até_agora,_nenhum_estudo

investigouopapeldaIL-8comomediadorpró-inflamatório deFCesuarelac¸ãoaosBDeseasvariantesdogenedaIL-8

podemexplicararespostaindividualaosBDnaFC. Acredita--sequeosbeta-2agonistasdecurtaelongadurac¸ãopodem serbenéficosparapacientescomFCecom hiperresponsivi-dadebrônquicapositiva.6

Em doenc¸as pulmonares progressivas, foram avaliados diferentes marcadores e o uso dos BD parece fornecer melhor resposta ao FEF25-75%, em comparac¸ão com outros marcadores,o que indica envolvimento devias aéreas de menor calibre na FC.27 _Nosso _estudo, _em _{concordância}

comaliteraturadereferência, encontrouumaassociac¸ão davarianters4073 parao marcador FEF25-75% nos modelos dominante(paraosgruposRTFC-AeRTFC-B),codominante (grupoRTFC-B) e recessivo(grupo RTFC-B). Houve melho-ria em diversos outros marcadores de espirometria para rs4073,comoVEF1,VEF1/CVFeFEF50%eFEF75%,oquemostra impactosobreospadrõesderespirac¸ãodospacientes.

OestudodeHillianetal.encontrouumaassociac¸ãodas variantesrs2227307ers4073dogenedaIL-8eagravidadeda doenc¸apulmonar.28 _Nesse_estudo,_os_pacientes_foram

divi-didosemduascoortes:(1)pacienteshomozigotosF508del; (2) pacientes com outros genótipos dogene do RTFC. Na coorte 1, asvariantes rs4073, rs2227306 e rs2227543 não foramassociadasadoençapulmonareavarianters22227307 mostrouassociação,independentementedosexo.Nacoorte 2,asvariantesrs4073ers2227306foramassociadasa gra-vidadedadoençapulmonarem homens.Assim,o sexodo paciente,ogenótipodogenedoRTFCeosgenes modificado-respodemmodularagravidadedadoençapulmonar.28_Nesse

estudo,ogenótipors2227307nãoteveimpactosobrea vari-abilidadedarespostaaBD.Issosugereque,apesardeesse genótipoestar associadoadoenc¸apulmonarem pacientes homozigotosF508del,suarespostaaBDnãoérelevante.

OalvodosBDéaproteínaADRB2,expressanomúsculo lisodasviasaéreas.AsvariantesdeADRB2estãoassociadas àrespostaàmedicac¸ão.Essaproteínafoiamplamente estu-dadaemasmaeaindamuitoraramenteemFC.Aeficáciada respostaaBDeaoscorticosteroidesinalatóriosnomanejo de inflamac¸ão das vias aéreas em asma está confirmada e depende das variantes Arg16Gly (rs1042713; c.46A>G) e Glu27Gln (rs1042714; c.79C>G) do gene ADRB2.[29] A varianteGln27GluconcederesistênciaàproteínaADRB2na respostaaBD.Osalelos46*Ge79*Gprotegemcontraasma, reduzem o risco em 27%.29 _As _variantes _do _alelo_G

indu-zemalteraçõesnaregulaçãodoreceptor,devidoaoaumento dasusceptibilidadeàdegradaçãodeproteínas.Esteestudo constatou que asvariantes Arg16Gly e Gln27Glu do gene

ADRB2 influenciam a respostas aos BD na FC. Na

espiro-metria e em outros marcadores de gravidade, a variante Arg16Glymostrouassociaçãopositiva,aocontrárioda vari-anteGln27Glu.OgenótipoArg/ArgdavarianteArg16Glyfoi associadoamelhoresvaloresdeVEF1eFEF25-75%.Aresposta aBDnasanálisesdehaplótipofoipositivanaausênciados genótiposGly16GlyeGlu27GluparaaproporçãoVEF1/CVF. As variantes deADRB2,capacidadede difusãodos pul-mõesparamonóxidodecarbono,condutânciadamembrana capilar alveolar, volume sanguíneo na capilar alveolar e SaO2,foramavaliadasnarespostaaBDem 18pacientese 20controlessaudáveis,antesedepoisdaadministraçãode

salbutamol(30,60 e90 minutos).Osindivíduos saudáveis não apresentaram alterações nos marcadores avaliados para a variante Glu27Glu. Contudo, na FC, essa variante influenciouarespostaaBD:amelhorrespostaencontrada na presença de pelo menos um alelo 27Glu. Houve uma diferençadedifusãopulmonareSaO2periféricadeacordo comavariaçãodogeneADRB2naposição27eadosagem do medicamento deve ser prescrita de acordo com essa variação.30

A maior parte dos estudos foca nas variantes dogene ADRB2 na resposta a BD. Contudo, este estudo demons-tra que, mesmo indiretamente, as variantes do gene da

IL-8 e possivelmente em outros genes, que modulam a resposta pulmonar inflamatória, podem potencializar ou diminuiroefeitodosBDe,ainda,influenciararespostaao medicamento.

Comrelac¸ãoaoHWE,conformediscutidoanteriormente pornossogrupo,22 _duas_variantes_(rs4073_e_rs2227306)_não

estavamem equilíbrio.Devemos lembrarqueoHWE pres-supõeumapopulaçãoideal,semainterferênciadefatores evolucionários.Contudo,emgenesenvolvidosemcontrole de imunidade, inflamação e infecção, o desequilíbrio do HWEparecerestarassociadodeformasecundáriaaos meca-nismosdeseleçãoquefavoreceramumaleloespecíficoque podetrazerumarespostamaisefetiva.Odesequilíbrionão invalidaoestudodeassociação,poisosgruposfazemparte damesmapopulação.

Limitações do estudo: (i) banco de dados transversal (arespostaaBDfoi avaliadaem umúnico momento);(ii) há vários dados ausentes, se levarmos em consideração osproblemas paraobterasinformaçõesnosregistros;(iii) casoa respostaa BDseja diferentecom base noVEF1 de base,principalmenteemindivíduossaudáveis;(iv)possíveis variáveis de confusão com relação aos resultados, como gravidadedadoença,terapiasatuais,adesãoàmedicação eesforçoadequadonotestedefunçãopulmonar.

AsvariantesdogenedaIL-8(rs2227306eespecialmente rs4073)podemestar associadasàrespostaaBDdurantea espirometria.Essemedicamentopodeserumaopçãopara otratamentodadoença,namaiorpartedotempoem paci-entescomviasaéreasdemenorcalibre.Devem-seconduzir estudosqueenvolvamdoseecombinaçõesde medicamen-tosparadeterminaromelhortratamentodeacordocomo genótipodopacientecomFC,ogenedoRTFC,bemcomoos genesmodificadores.

Financiamento

FALM: Fundac¸ão de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), em apoio às pesquisas n◦ _{2011/12939-4,} n◦_{2011/18845-1,}_n◦_2015/12183-8_e_n◦_{2015/12858-5;}_Fundo deApoioàPesquisa,aoEnsinoeàExtensãodaUniversidade EstadualdeCampinas, emapoioàpesquisan◦ _0648/2015; JDR: Fapesp, em apoio às pesquisas n◦ _2011/18845-1 e n◦ _{2015/12183-8.} _LLF: _Fapesp, _em _apoio _à _pesquisa n◦_{2013/19052-0.}

Conflitos

de

interesse

(10)

Agradecimentos

LucianaMontesRezende,LucianaCardosoBonadiae Stepha-nieVilla-Novaporseuapoiotécnicoduranteaextraçãodo DNAenaidentificaçãodemutaçõesdogenedoRTFC. Mar-celaAugustadeSouzaPinhel,MicheleLimaGregório,Rafael Fernandes Ferreira, Graciele Domitila Tenani e Heloisa Cristina Caldas por seu apoio técnico na padronização da genotipagem da IL-8. Maria Ângela Gonçalves de Oli-veira Ribeiro por fazer os testes de função pulmonar (LAFIP/Ciped/Unicamp).Rafaella MaionchiPereiraMartins porseuapoiotécniconadeterminaçãodosescoresclínicos. MariadeFátimaCorrêaPimentaServidoniporpromoverum eloentreambasasuniversidades.

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