iv
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Marcelo Dornelas, que tornou possível a concretização deste trabalho graças a sua integral dedicação e seu total comprometimento, estando sempre disponível para a solução de todos os problemas e dúvidas que surgiram ao longo do percurso.
À CAPES, pelo apoio financeiro.
À Profª. Drª. Tamara Canto Fonseca pelo apoio ao trabalho como um todo, e em especial pela ajuda com as secções para a Microscopia Óptica.
Ao Prof. Dr. Elliot Watanabe Kitajima por disponibilizar o uso do Microscópio Eletrônico de Varredura (LEO) do NAP/MEPA- ESALQ (USP).
À Profª Drª Siu Mui Tsai do Centro de Energia Nuclear na Agricultura pelo seqüenciamento dos clones.
Ao Programa de Pós Graduação em Biologia Vegetal da Unicamp.
Aos colegas, funcionários e professores do Departamento de Fisiologia Vegetal da Unicamp.
Aos amigos que presenciaram e compartilharam todos os momentos, felizes e tristes ao longo deste trabalho, sempre me apoiando e fazendo com que eu continuasse até o final.
Aos meus pais e minha irmã, nos quais eu me espelho, e os quais são os pilares onde encalço os meus passos.
v ÍNDICE
RESUMO ... vi
SUMMARY ... vii
I INTRODUÇÃO ... 1
1.1 O gene LEAFY (LFY)... 1
1.2 A clonagem e caracterização de LFY/FLO em outras angiospermas sugerem divergência de função. ... 5
1.3 Qual o papel ancestral e o verdadeiro papel biológico atual do gene LFY? ... 8
1.4 Gavinhas, flores e inflorescências: Espécies de Passiflora como um modelo para o estudo da evolução da função do gene LFY. ... 11
II OBJETIVOS ... 13
III. MATERIAL E MÉTODOS ... 14
3.1. Material Vegetal ... 14
3.2. Microscopia óptica (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 14
3.3. Clonagem e análise de fragmentos de seqüência dos homólogos do gene LFY em Passiflora ... 15
3.4 Obtenção de plantas transgênicas de P. edulis e P. suberosa via A. tumefaciens ... 17
3.4.1 Seleção de transformantes ... 19
3.5 Análise da expressão de PeLFY e PsLFY via RT-PCR e hibridização in situ. . 20
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 22
4.1 Descrição do desenvolvimento reprodutivo de P. edulis var. flavicarpa Deg e P. suberosa L. ... 22
4.2 Clonagem de fragmentos dos homólogos do gene LFY em Passiflora ... 30
4.3 Expressão de homólogos do gene LFY em duas espécies de Passiflora. ... 33
4.3.1. RT-PCR ... 33
4.3.2 Hibridizações in situ ... 38
4.4 Obtenção de plantas transgênicas de Passiflora suberosa e Passiflora edulis via Agrobacterium tumefaciens. ... 43
V. CONCLUSÕES ... 47
vi RESUMO
O gene LEAFY (LFY) específico de plantas, além de atuar na transição do meristema vegetativo para o reprodutivo, parece regular também a transição do desenvolvimento de produtos do meristema apical tão diversos quanto: folhas-gavinhas; flores-gavinhas e inflorescências-flores solitárias, além de diminuir drasticamente o tempo necessário para que a planta passe da fase vegetativa para a fase reprodutiva. O gênero Passiflora é um candidato em potencial para o estudo da evolução da função biológica do gene LFY, por conter todas as estruturas morfológicas em que o referido gene atua. Neste estudo, foram analisadas duas espécies divergentes de Passiflora: Passiflora edulis var flavicarpa e Passiflora
suberosa. O desenvolvimento reprodutivo de ambas foi caracterizado com o uso de
microscopia óptica e de microscopia eletrônica de varredura. Análises moleculares da função do gene LFY também foram executadas nestas duas espécies. Isolou-se, via PCR, fragmentos potencialmente correspondentes a homólogos do referido gene em P. edulis e em P. suberosa. Estas seqüências gênicas, denominadas respectivamente PeLFY e PsLFY foram utilizadas em análises filogenéticas. O padrão de expressão de ambos os genes foi investigado em experimentos de RT-PCR e hibridização in situ em diferentes tecidos durante o desenvolvimento das espécies de Passiflora estudadas Adicionalmente, foram obtidas plantas transgênicas de P. suberosa, contendo uma construção de superexpressão do gene
vii SUMMARY
The LEAFY (LFY) gene is plant-specific, and besides playing a role in the transition of the vegetative to the reproductive meristems, it seems to regulate the development of different products of the shoot apical meristem (SAM) as leaves-tendrils, flowers-tendrils, solitary flowers-inflorescences. It is also responsible for decreasing substantially the time needed for the transition from the vegetative to the reproductive phase. The genus Passiflora is a good model for the study of the evolution of the biologic function of the LFY gene, because it has all morphological structures in which this gene acts. In this study, two distinct species: Passiflora edulis var. flavicarpa and
Passiflora suberosa had their reproductive development analyzed by optical
microscopy and scanning electron microscopy. Molecular analyzes of LFY functions were also performed in both species. Fragments corresponding to homologs of the
LFY gene were cloned from P. edulis and P. suberosa by PCR. These fragments
were named PeLFY and PsLFY, respectively and were used in filogenetic analyzes. The expression patterns of these genes were investigated by RT-PCR and in situ hybridization in different tissues of the studied Passiflora species. Additionally, transgenic lines of P. suberosa were obtained that contained a construction that promoted the overexpression of the Arabidopsis LFY gene.
1
I INTRODUÇÃO
1.1 O gene LEAFY (LFY)
Os meristemas apicais de plantas-modelo com Antirrhinum majus e
Arabidopsis thaliana possuem uma região de diferenciação que origina primórdios
foliares e, em um determinado momento da vida da planta, converte-se em meristema da inflorescência para a formação das flores.
O desenvolvimento de meristemas florais a partir dos meristemas de inflorescência é mediado pela ação de genes de identidade de meristemas florais. Entre eles está o gene LEAFY (LFY) em Arabidopsis, cujo homólogo em Antirrhinum é o gene FLORICAULA (FLO; Weigel et al., 1992).
Mutações no gene FLO causam a formação de brotações indeterminadas no lugar de flores em Antirrhinum (Coen, 1991) e em mutantes lfy de Arabidopsis, o florescimento é retardado e as estruturas que normalmente se desenvolveriam em flores se desenvolvem em inflorescências secundárias e flores anormais precedidas por brácteas (Weigel et al. , 1992).
FLO e LFY compartilham 70% da identidade de seqüência dos aminoácidos, e
um domínio ácido indicando a possibilidade de codificarem um fator de transcrição (Coen, 1991). Em Arabidopsis, o papel do LFY tem sido estabelecido como ativador de genes homeóticos que regulam a organogênese floral (Weigel et al., 1992) e também parece atuar na supressão da formação de brácteas florais no tipo selvagem, uma vez que mutantes lfy apresentam a formação de brácteas ectópicas.
2
Ambos LFY e FLO se expressam nos últimos primórdios foliares antes da transição floral e nos meristemas florais, principalmente durante as fases iniciais da formação dos órgãos florais (Coen & Meyerowitz, 1991; Weigel et al., 1992). Em
Antirrhinum, a expressão de FLO é também observada nas brácteas.
APETALA 1 (AP1) é um outro gene de identidade do meristema floral em Arabidopsis, que atua conjuntamente com o gene LFY. Quando LFY e AP1 não são
funcionais, não há a conversão dos meristemas de inflorescência em meristemas florais (Irish & Sussex, 1990).
Um grande número de genes que controlam o tempo da transição para o florescimento foi identificado em Arabidopsis pela análise de mutantes. Muitos destes mutantes apresentam alterações pleiotrópicas como mudanças na forma das folhas e na densidade de tricomas. Estas observações sugerem que poucos dos genes reguladores da transição para o florescimento controlam unicamente esta característica (Telfer et al., 1997).
A expressão constitutiva de LFY (35S::LFY) promove o florescimento precoce em Arabidopsis e em outras espécies, indicando a grande importância da transcrição de LFY na transição para o florescimento (Weigel & Nilsson 1995; Blázquez et al., 1997; Nilsson et al., 1998; Peña et al., 2001 ). Entretanto, estudos com duplos mutantes de Arabidopsis, juntamente com observações da atenuação do fenótipo de 35S::LFY em dias curtos, indicam que existe um outro mecanismo que atua paralelamente ou antagonicamente à transcrição de LFY (Weigel & Nilsson 1995, Ruiz-Garcia et. al 1997). Para compreender como genes do tempo de florescimento estão envolvidos neste mecanismo paralelo à atuação do gene LFY, Nilsson et al. (1998) investigaram como mutações em 11 loci diferentes, promovendo o
3
florescimento tardio, afetam a resposta da expressão constitutiva de LFY, bem como a atividade do promotor do gene LFY. Chegou-se a um modelo onde genes controladores do tempo de florescimento, juntamente com genes envolvidos na síntese de GAs, atuam sinergicamente com LFY, que por sua vez atua na iniciação floral, induzindo a expressão de AP1, que por sua vez também é controlada por genes relacionados ao fotoperíodo, levando à iniciação da formação dos órgãos florais. Mais recentemente foram descobertos dois genes com funções redundantes, os homeobox PENNYWISE (PNY) e POUND-FOOLISH (PNF), que se expressam no meristema vegetativo e da inflorescência e promovem a expressão de LFY, uma vez que mutantes pny e pnf voltam a florescer com a expressão ectópica de LFY. Mutações nos genes pny e pnf combinadas com lfy, levam a um fenótipo onde a especificação floral é bastante reduzida e o padrão de formação da inflorescência é bastante alterado, denotando a participação destes genes na transição do meristema da inflorescência para o meristema floral (Kanrar et al., 2008).
Atualmente sabe-se que o produto do gene LFY não atua sozinho. Um gene que codifica uma proteína F-Box, denominado UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO), atua sinergicamente com LFY para a ativação de APETALA3 (AP3) que é responsável pela determinação da identidade das pétalas e estames (Jack et al., 1992; Ingram et al., 1995; Levin & Meyerowitz, 1995; Wilkinson & Haughn, 1995; Lee et al., 1997). Chae et al. (2008), com ensaios in vitro e in vivo demonstraram que UFO interage fisicamente com LFY e esta interação é necessária para a ativação do promotor de AP3. Em petúnia, o gene homólogo ao UFO, DOUBLE TOP (DOT) parece regular a atividade transcricional de LFY, uma vez que DOT é essencial para que haja a expressão dos genes de identidade do meristema floral. Nas petúnias em
4
mutantes para este gene não houve transição do meristema da inflorescência para o floral e sua superexpressão causou florescimento precoce (Souer et al., 2008). Estas interações gênicas entre o LFY e outros genes são representadas na Figura 1.
DL GA GAI Giberilna FT CO LFY AP1
Determinação do Meristema Floral
PNY/PNF
UFO AP3
Figura 1: Modelo que resume a relação de outros genes (PNY/PNF, UFO, CO, FT) e fatores endógenos, como as giberilinas (GA) que levam à iniciação floral e à determinação dos órgãos no meristema floral. PENNYWISE (PNY),
POUND-FOOLISH (PNF), UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO), CONSTANS (CO), FLOWERING LOCUS T (FT).
Recentemente, a proteína codificada pelo gene LFY teve a estrutura de seu domínio de ligação com o DNA revelada por cristalografia. Basicamente, LFY apresenta um vinco formado por um novelo com 7 hélices que se liga ao DNA como um dímero cooperativo, formando contatos específicos com os nucleotídeos. Esta
5
estrutura se assemelha com proteínas tipo ¨helix-turn-helix¨, que incluem as proteínas do tipo ¨homodomíneos¨, presentes na regulação da morfogênese em eucariotos superiores (Hamès et al.,2008).
1.2 A clonagem e caracterização de LFY/FLO em outras angiospermas sugerem divergência de função.
Apesar da conservação da seqüência de LFY entre espécies distantes, diferenças significativas estão emergindo em relação ao seu padrão de expressão, o que pode indicar a existência de uma divergência funcional. Adicionalmente à sua expressão nos meristemas florais, a análise da expressão de homólogos do gene
LFY em outras angiospermas como agrião, tabaco, tomate, videira, batata e
crisântemo revelou a presença de transcritos destes genes no meristema vegetativo, brácteas, primórdios foliares e folhas (Pouteau et al., 1997; Shu et al., 2000; Kelly et al., 1995; Molinero-Rosales et al., 1999; Ma et al., 2008; Guo & Yang, 2008).
Em alguns casos, a função de alguns destes homólogos de LFY em tecidos não-florais foi estudada, como no caso do gene UNIFOLIATA (UNI). O gene UNI é um homólogo de FLO e LFY em ervilha (Pisum sativum; Hofer et al., 1997). Os mutantes uni, além de alterações na estrutura da flor, também apresentam alterações no corpo vegetativo, as folhas compostas são substituídas por folhas simples com pecíolo curto e sem a presença de gavinhas. Experimentos de hibridização in situ, mostraram que UNI se expressa fortemente em primórdios foliares, inflorescências e nos primórdios dos órgãos florais. O papel funcional de UNI na regulação da morfogênese da folha é suportado pela presença de transcritos de
6
UNI nos primódios foliares durante os 4 primeiros plastrocrons do desenvolvimento
dos mesmos (Hofer et al., 1997). A análise da expressão de UNI em outros mutantes envolvidos na formação do complexo folha-gavinha, permitiu determinar a ação antagônica de UNI em uma série de genes envolvidos na formação de padrão da estrutura das folhas (Gourlay et al., 2000).
A função de homólogos de LFY na regulação da diferenciação de folhas compostas parece ser conservada em leguminosas. Sabe-se que nas plantas vasculares o gene envolvido na formação de folhas compostas é o KNOTTED1-like (KNOX1; Champagne et al., 2007). Porém, em um clado da família Fabaceae da qual a ervilha faz parte, a expressão deste gene não está relacionada com a construção das folhas compostas, sendo LFY o gene responsável por este processo. Experimentos de silenciamento gênico do LFY em outras espécies de leguminosas, como a soja (Glicine max), mostraram inibição na formação de folhas compostas nestas plantas, denotando a participação deste gene no processo de construção da arquitetura foliar (Champagne et al., 2007; Wang et al., 2008).
A regulação do florescimento em espécies lenhosas perenes é bastante diferente da observada em espécies herbáceas. Ortólogos do gene FLO/LFY já foram clonados em várias espécies lenhosas (Southerton et al. , 1998; Rottman et al., 2000; Peña et al., 2001; Carmona et al., 2002; Dornelas et al., 2004; Dornelas & Rodriguez, 2005a, 2005b, 2006a, 2006b)
Em Eucalyptus spp., foram clonados dois homólogos funcionais do gene LFY de duas espécies diferentes: ELF1 (E. globulus) e EgLFY (E. grandis). Tanto ELF1 como EgLFY são homólogos ao gene LFY, baseando-se em seus padrões de expressão nos meristemas florais de Eucalyptus spp. e de experimentos com plantas
7
transgênicas superexpressando os genes de Eucalyptus em mutantes lfy ou plantas selvagens de Arabidopsis. (Southerton et al. , 1998; Dornelas et al., 2004).
As plantas do gênero Citrus também são perenes, lenhosas e possuem uma fase juvenil longa, com duração de 6 a 20 anos, dependendo da espécie. Com o objetivo de acelerar seu tempo de florescimento, Peña et al. (2001) transformaram plantas de Citrus para expressarem constitutivamente os genes LFY e AP1 de
Arabidopsis. Ambos os transgenes induziram a produção de flores e frutos férteis nas
plantas transformadas já no seu primeiro ano de desenvolvimento, incluindo uma grande diminuição de sua fase juvenil.
Em Populus trichocarpa, Rottmann et. al (2000) isolaram um homólogo do gene LFY nomeado PTLF. Sondas antisense deste gene hibridizaram fortemente o meristema floral em desenvolvimento, tanto de plantas com flores masculinas como de plantas com flores femininas. Também se observou hibridização nas gemas vegetativas de ramificações maduras. Os resultados de hibridização indicaram a presença de transcritos nos meristemas laterais e nas axilas de folhas jovens, mas não no meristema apical vegetativo.
Em lianas perenes como a videira, o florescimento requer duas fases de crescimento: o florescimento é induzido em meristemas latentes durante o verão, mas a iniciação e o desenvolvimento floral acontecem durante a primavera (Carmona et al., 2002). O ortólogo do gene LFY em videira é o VFL e, como em outras angiospermas, VFL é expresso em meristemas laterais, independentemente do destino final destes (Carmona et al., 2002). Isto sugere que VFL deve estar envolvido não somente na iniciação do florescimento, mas também no desenvolvimento das inflorescências, folhas e gavinhas. Transcritos de VFL acumulam-se nas margens
8
dos primórdios foliares e Carmona et al. (2002) sugeriram que nestas regiões VFL podem estar envolvidos na manutenção da proliferação celular, auxiliando a gerar a forma palmada das folhas de videira.
Outro papel sugerido ao gene LFY é sua participação na construção arquetípica do ramo floral, que pode formar uma única flor ou uma inflorescência contendo inúmeras flores por eixo. Shu et al. (2000) sugeriram o envolvimento de
LFY na definição destas características em um estudo comparativo entre Arabidopsis, que produz uma inflorescência contendo flores não precedidas por
brácteas, e uma espécie aparentada, Jonopsidium acaule, que produz flores solitárias protegidas por brácteas. Foram isolados de J. acaule dois homólogos do gene LFY: vcLFY1 e vcLFY2, que devido à relativa diferença das seqüências de seus introns e à notável semelhança de seus exons, denotam uma recente duplicação paráloga do gene LFY nesta espécie (Shu et al., 2000). A análise da expressão de
vcLEAFY1 em J. acaule evidenciou a presença de transcritos nas brácteas e no
meristema apical vegetativo, bem como nos meristemas florais. Os autores atribuíram esta diferença temporal e espacial da expressão dos homólogos de LFY nesta espécie à produção de flores solitárias.
1.3 Qual o papel ancestral e o verdadeiro papel biológico atual do gene LFY?
A clonagem de homólogos do gene LFY em espécies não-angiospermas o torna um candidato ideal para estudos sobre a evolução e o surgimento das flores. Partindo-se inicialmente das gimnospermas, o isolamento e caracterização da expressão de homólogos de LFY em Pinus radiata (Mellerowicz et al., 1998;
9
Mouradov et al., 1998) demonstrou a presença de um parálogo ao gene LFY, nomeado de NEEDLY (NLY) cuja expressão é mais evidente nos cones femininos, enquanto o ortólogo ao LFY (PRFLL) teve alta expressão detectada nos cones masculinos. Estes resultados permitiram o desenvolvimento de uma teoria para o surgimento das flores que postula que uma vez que as angiospermas perderam o parálogo NEEDLY e mantiveram LFY e, se em gimnospermas esses dois genes parecem discriminar cones femininos de cones masculinos, respectivamente, sugere-se que as flores hermafroditas típicas de angiospermas sugere-se originaram a partir das estruturas masculinas de gimnospermas. Assim, pela origem essencialmente ¨masculina¨ das flores hermafroditas, esta teoria foi denominada “The Mostly Male
Theory” (Frohlic & Parker, 2000)
Ao caracterizar os homólogos de LFY em Gnetum parvifolium, Shindo et al. (2001), demonstraram com hibridizações in situ a expressão do homólogo GpLFY nos primórdios dos estróbilos femininos desta espécie. Uma vez que GpLFY é um ortólogo de LFY, assim como PRFLL, seu padrão de expressão contradiz a teoria
“Mostly Male”. Da mesma maneira, em Pinaceae (Picea, Podocarpus e Taxus), a
presença de transcritos de homólogos de LFY e NLY foi observada nas estruturas reprodutivas femininas dos 3 gêneros estudados. Igualmente, foi detectada a presença de NLY nos primórdios de cones masculinos (Vázquez-Lobo et al., 2007).
Alternativamente à teoria “Mostly Male” existem outras duas teorias. A teoria de Albert parte do pressuposto que as proteínas NLY e LFY possuem funções idênticas nas Gimnospermas. As diferenças encontradas no padrão de expressão destas proteínas são devido às diferenças significativas encontradas entre os promotores dos dois genes (Albert et al., 2002).
10
A segunda teoria, “Out of Male”, (Theißen & Becker, 2004) parte do pressuposto que mutações homeóticas, principalmente devido a mudanças na expressão do fator B, foram responsáveis pelo surgimento de estruturas hermafroditas em gimnospermas, que por sua vez deram origem às flores.
Ceratopteris richardii, uma pteridófita, possui duas cópias de LFY, nomeadas
de CrLFY1 e 2, cujo padrão de expressão analisado por Nothern Blot demonstrou que transcritos de ambos os genes foram encontrados tanto no ápice do meristema vegetativo como no ápice do meristema reprodutivo e nas folhas reprodutivas. Uma expressão mais reduzida de CrLFY1 e 2 também foi detectada em outros tecidos incluindo os brotos vegetativos, raízes e gametófitos (Himi et al., 2001). Porém, estes dados comparados com o padrão de expressão de genes MADS nesta mesma espécie (Haseb et al., 1998) são incongruentes, sugerindo que CrLFY1 e 2 não induzem diretamente os genes MADS-box de Ceratopteris (Himi et al., 2001) .
Em plantas mais basais, Tanahashi et al. (2005) analisou a presença de duas cópias de LFY no musgo Physcomitrella patens. Com uma construção contendo o gene GUS (β- glucorosidase) inserido logo após o códon STOP de uma das cópias de LFY (PpLFY1) e em frame no segundo éxon do parálogo (PpLFY2), foi possível observar a expressão destes genes ao longo do ciclo de vida desta briófita. Conclui-se que ambos apreConclui-sentam um padrão de expressão muito parecido, fazendo-Conclui-se presente no desenvolvimento do arquegônio, mas não no do anterídeo e em todo o esporófito depois da fecundação. Em linhagens onde ambos os genes foram alterados, produziram-se esporófitos com más formações, o que indica o papel destes homólogos no desenvolvimento do zigoto, sugerindo uma divergência de função de LFY em briófitas.
11
Desta forma, quando Maizel et al. (2005) tentou transformar mutantes lfy de
Arabidopsis com o gene PpLFY1, as plantas mutantes permaneceram inalteradas.
Da mesma maneira, em experimentos de microarranjo comparando o padrão de expressão entre plantas selvagens de Arabidopsis e mutantes lfy complementados com PpLFY sobre o controle do promotor do LFY nativo de Arabidopsis, demonstrou-se que PpLFY não foi capaz de ativar nenhum dos genes que são normalmente ativados por LFY. Ainda, em ensaios com leveduras, foi possível concluir que a proteína PpLFY é incapaz de se ligar aos promotores de AP1 ou AG. Neste mesmo trabalho, Maizel analisou ainda homólogos de LFY de pteridófitas, gimnospermas e de duas angiospermas, ervilha e petúnia. Com os experimentos de complementação de mutantes lfy de Arabidopsis, microarranjos e ensaios com leveduras, o que se observou foi uma perda gradativa de conservação das funções dos homólogos de
LFY, à medida em que os homólogos testados são oriundos de clados cada vez mais
distantes filogeneticamente de Arabidopsis. Os autores sugeriram que estas modificações gradativas na capacidade de ativação gênica conservada são devido a mutações no domínio de ligação com o DNA dos homólogos de LFY nas espécies estudadas.
1.4 Gavinhas, flores e inflorescências: Espécies de Passiflora como um modelo para o estudo da evolução da função do gene LFY.
Há mais de 600 espécies pertencentes ao gênero Passiflora, a maioria originária de regiões neo-tropicais (Kugler & Kind, 2004; Ulmer & MacDougal, 2004). Este gênero apresenta características morfológicas que o torna interessante para o
12
estudo da evolução da função do gene LFY, pois possui estruturas como inflorescências ou flores solitárias, gavinhas, folhas trilobadas, nas quais o desenvolvimento está provavelmente relacionado com a atuação deste gene. Assim, enquanto algumas espécies de Passiflora possuem várias flores organizadas em inflorescências, outras produzem flores solitárias (Figura 2), outras ainda possuem inflorescências contendo uma mistura de flores e gavinhas, de onde surgiu a sugestão de que as gavinhas em Passiflora poderiam ser oriundas de uma variação morfológica de estruturas florais (Krosnick & Freundenstein, 2005). Para este trabalho, foram escolhidas duas espécies divergentes, pertencentes ao gênero
Passiflora e que apresentam uma associação diferente das características
potencialmente controladas pelo gene LFY. Uma delas é P. edulis var. flavicarpa Deg., que pertence ao subgênero Passiflora e apresenta diferenciação morfológica vegetativa com a passagem gradual do estado juvenil para o adulto (substituição de folhas simples por folhas trilobadas e produção de gavinhas nas plantas maduras) e possui flores solitárias. A outra espécie estudada, P. suberosa L., pertencente ao subgênero Decaloba, superseção Cieca e possui suas flores arranjadas em uma inflorescência e não apresentam variações notáveis na transição para a vida adulta (cerca de 2 a 3 flores por inflorescência; (Ulmer & MacDougal, 2004).
Além da oportunidade única de se estudar estas características presentes nestas espécies de Passiflora, o que não seria possível em espécies-modelo como
Arabidopsis, já foram relatados protocolos otimizados de organogênese direta in vitro
para ambas as espécies (Scorza & Janick, 1980; Dornelas e Vieira 1994) e protocolos eficientes de transformação genética mediada por Agrobacterium também estão disponíveis (Manders et al., 1994).
13
Portanto, torna-se possível a aplicação de técnicas de transformação genética visando à manipulação da expressão dos homólogos de LFY em Passiflora para estudos do seu papel biológico.
Figura 2: A- Nó de um ramo de P.edulis. B- Esquema representativo deste nó. FL:Flor, Fo: Folha; G:Gavinha; a seta mostra a gema vegetativa.
II OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo geral a análise morfoanatômica do desenvolvimento reprodutivo e o estudo da função de homólogos do gene LFY na morfogênese de gavinhas, inflorescências e flores solitárias em Passiflora. Os objetivos específicos, foram: a clonagem, de fragmentos de homólogos do gene LFY de duas espécies divergentes de Passiflora: P. edulis e P. suberosa; o estudo do padrão de expressão destes homólogos em Passiflora. Adicionalmente, pretendeu-se a manipulação dos padrões de expressão destes homólogos de LFY nas espécies de
Passiflora mencionadas com a obtenção de plantas transgênicas contendo uma
construção de superexpressão do gene LFY de Arabidopsis.
14
III. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Material Vegetal
Ápices contendo meristemas vegetativos de plantas juvenis e adultas bem como ápices contendo meristemas reprodutivos em estágio inicial de desenvolvimento foram coletados de plantas de P. edulis var. flavicarpa Deg. e P.
suberosa L., cultivadas em casa de vegetação e nos campos experimentais do
Departamento de Fisiologia Vegetal, do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), em Campinas, SP.
3.2. Microscopia óptica (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV)
O material foi fixado a vácuo, em 4% paraformaldeído (p/v), por 24h a 4oC. A seguir foi desidratado em série etílica, posteriormente foi emblocado em resina plástica (Historesin, Leica), segundo as instruções do fabricante e secções de 3-5 µm foram obtidas com o uso de micrótomo rotativo, fixadas em lâminas e corados com azul de toluidina a 0,05% (p/v), em tampão de tetraborato de sódio, e observadas em microscópio ZEISS modelo AXIOSKOPE. O material a ser submetido à MEV, após fixação e desidratação foi seco ao ponto crítico, dissecado sob lupa binocular com auxílio de pinças e agulhas; montado em suportes metálicos com fita adesiva dupla-face e metalizado com ouro coloidal (Balzers Sputter; camada de 30nm). A observação foi feita em microscópio de varredura LEO 435 VP no NAP/MEPA (ESALQ/USP, Piracicaba, SP).
15
3.3. Clonagem e análise de fragmentos de seqüência dos homólogos do gene LFY em Passiflora
As duas espécies estudadas tiveram seu DNA genômico extraído pela técnica do CTAB (2% CTAB; 1,4M NaCl; 100mM Tris-HCL pH 8,0; 20mM EDTA pH 8,0; 1% polivinilpirrolidona MW 10.000), segundo a literatura (Doyle & Doyle, 1990). Amostras de DNA genômico foram utilizadas como molde na reação cíclica da polimerase (PCR), com utilização dos Primers LA: 5´-CGGAYATIAAYAARCCI AARATGMGICAYTA-3´ e LB: 5´-CGGATCC GTGICKIARIYKIGTIGGIACRTA-3´ (Frohlich e Meyerowitz 1997), sob as seguintes condições: extensão inicial por 3min a 94ºC, 35 ciclos de 45seg a 94ºC; 1min a 50ºC e 1min a 72ºC. Estes primers já foram testados para a clonagem de homólogos de LFY em um grande número de espécies de plantas, com resultados positivos em todos os casos (Dornelas e Rodriguez, 2005a, 2005b, 2006a, 2006b). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1% e os resultados obtidos foram documentados fotograficamente e analisados.
Os produtos de PCR que apresentaram entre 250-240pb, foram clonados no vetor pGem®T-easy (Promega®), de acordo com as especificações do fabricante. Células quimiocompetentes de Escherichia coli On Shot® Top10 (Invitrogen®) foram transformadas com os plasmídeos resultantes por choque térmico a 42ºC por 1 min e colocadas em gelo logo em seguida. 250 ml de meio SOC líquido (2% Triptona, 05% Extrato de Levedura; 10mM NaCl; 2,5mM KCl; 10mM MgCl2; 10mM MgSO4; 20mM
glucose) foram adicionados à suspensão de bactérias e as mesmas foram mantidas a 37ºC por 1h. Em seguida, os possíveis transformantes foram espalhados em placas contendo meio LB (Peptona 10g/l; Extrato de Levedura 5g/l; NaCl 5g/l; Agar
16
15g/l) suplementado com ampicilina (100mg/l), X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside 3%) e IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside 100mM). Colônias brancas foram individualizadas e sub-cultivadas no mesmo meio e sob as mesmas condições. O isolamento de DNA plasmidial foi realizado com o PureLink Quick Plasmid Miniprep kit (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. Clones individuais foram seqüenciados com utilização do kit DYENAMIC (GE), de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos das reações de seqüenciamento foram precipitados com etanol 95%, acetato de sódio 3M e glicogênio (1g.L-1). Os precipitados foram lavados em etanol 75%, secos a vácuo e analisados em um seqüenciador 3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems), no Laboratório de Genômica do CENA/USP, em Piracicaba, SP.
Para investigar se as seqüências clonadas correspondiam a possíveis homólogos do gene LFY em Passiflora, buscas de similaridade de seqüência entre os clones obtidos e as seqüências dos bancos de dados públicos foram realizadas com o emprego do algoritmo BLAST (Altschul et al.,1997). Para a construção da árvore filogenética, as seqüências de aminoácidos de homólogos de LFY de angiospermas e gimnospermas foram obtidas dos bancos de dados públicos (NCBI; www.ncbi.gov) e foram alinhadas com as seqüências de Passiflora com a utilização do programa Clustal W (Thompson et al, 1994). O alinhamento obtido foi utilizado para a obtenção de uma matriz de distâncias (método de parcimônia) pelo programa Mega 3.0 (Kumar et al., 2000). A solidez das árvores obtidas foi testada com cálculos de Bootstrap, em 1000 repetições.
17
3.4 Obtenção de plantas transgênicas de P. edulis e P. suberosa via A.
tumefaciens
Inicialmente, germinaram-se sementes de P. edulis e P. suberosa previamente esterilizadas por 20 minutos em solução saturada de hipoclorito de cálcio e lavadas três vezes em água destilada autoclavada, em Meio de Germinação (MG; meio MS de Murashige & Skoog (1962), com metade da concentração de sais e vitaminas e solidificado com 2,5 g/l de Phytagel, Sigma) autoclavado. Estas sementes foram mantidas a 25ºC, no escuro. Para a obtenção de explantes, os hipocótilos estiolados resultantes desta germinação (após cerca de 15 dias em cultura) foram seccionados em fragmentos de 0,5cm. Estes explantes foram inoculados em uma suspensão de
Agrobacterium tumefaciens cepa GV3850, contendo o plasmídeo pBIN 19 35S::GUS
(McCabe et al., 1988) ou, alternativamente, pDW151 35S::LFY (Figura 3), plasmídeo que inclui a construção 35S::LFY (Weigel et al., 1992) em Meio de Indução (MI; meio MS de Murashige & Skoog, 1962, líquido, suplementado com 1µM 3´,5´-dimethoxy-4´-hydroxyacetophenone [acetosseringona]). Para a obtenção do inóculo de A.
tumefaciens, colônias bacterianas isoladas, crescidas em meio YEP sólido (10g/l de
extrato de levedura, 10g/l de peptona, 5g/l de NaCl e 3g/l de ágar) e suplementado com os antibióticos kanamicina (25mg/l) e rifampicina (50mg/l), foram inoculadas no mesmo meio líquido, contendo a mesma concentração de antibióticos e mantidas no escuro a 28º sob agitação de 160rpm até uma OD600nm de 0,5 a 1,0. Após atingirem este estágio de crescimento, este inóculo foi centrifugado a 5000rpm por 10 minutos, e o precipitado obtido foi ressuspendido em um volume de MI suficiente para uma
18
Figura 3: Mapa do plasmídeo utilizado nos experimentos de superexpressão do gene LEAFY. A seta cheia preta compreendida entre as letras ¨J¨ corresponde à seqüência codificadora do gene LFY de Arabidopsis. A seta branca que a precede, corresponde ao promotor constitutivo 35S e a seta branca após a seqüência de LFY corresponde ao gene NPTII que confere resistência à kanamicina.
Os explantes foram mergulhados na suspensão de Agrobacterium em MI, sonicados (Thorton, Mod. MiniSon) por cerca de 2min e submetidos a vácuo (400mmHg) por 3min. Após este tratamento, os explantes foram mantidos em contato com a suspensão de Agrobacterium, sob agitação (160rpm) a 28ºC, no escuro, por 16h. Posteriormente, os explantes foram transferidos para o Meio de Co-cultivo (MCC; meio MS de Murashige & Skoog (1962), suplementado com 1µM acetosseringona; 2 mg/l 6-benzilaminopurina [BAP]; 10% água de coco e solidificado com 2,5 g/l de Phytagel, Sigma) onde foram cultivados por 3 dias e então transferidos para o Meio de Regeneração e Seleção (MRS; meio MS de Murashige &
19
Skoog, 1962, suplementado com 2 mg/l BAP; 10% água de coco; 200mg/l kanamicina; 300mg/l cefatoxima sódica [Timentin] e solidificado com 2,5 g/l de Phytagel, Sigma) renovado periodicamente a cada 15 dias, até a regeneração das plantas. As condições de regeneração de plantas inteiras de Passiflora spp.., via organogênese, foram descritas anteriormente (Dornelas & Vieira, 1994).
3.4.1 Seleção de transformantes
Para verificação da eficiência de transformação dos explantes com a construção contendo o gene GUS, utilizou-se o teste histoquímico da beta-glucuronidase (McCabe et al., 1988). Os materiais potencialmente transformados foram imersos em solução 1mM de 5-bromo-4chloro-3-indoyl ß-d-glucuronic acid (X-Gluc) em tampão (100mM NaH2PO4.H2O; 0,5mM K4Fe(CN)6.3H2O; 10mM de
Na2EDTA.2H2O e 0,1% Triton X-100) e mantidos a 37ºC, durante 16 horas. Para a
melhor visualização dos pontos azuis as amostras foram imersas em etanol 70% para remoção da clorofila.
As plântulas obtidas nos experimentos de transformação com o plasmídeo pDW151 (com a construção de superexpressão do gene LFY de Arabidopsis) tiveram seu DNA genômico extraído pela técnica do CTAB (2% CTAB; 1,4M NaCl; 100mM Tris-HCL pH 8,0; 20mM EDTA pH 8,0; 1% polivinilpirrolidona MW 10.000) segundo a literatura (Doyle & Doyle, 1990). Amostras de DNA genômico, diluídas em uma concentração ótima de 200ng por reação, foram utilizadas como molde na reação cíclica da polimerase (PCR) com utilização dos primers 5´-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3´ e 5´-ATCGGGAGG GGCGAT ACCGTA-3´, sob
20
as seguintes condições: desnaturação inicial da fita a 94ºC por 4 minutos, seguida de 35 ciclos de: 1min a 94ºC; 1 min a 58ºC; 1 min a 72ºC e um período adicional de 10 min de extensão a 72ºC. Esta reação visa a amplificação de um fragmento de 0,8 Kpb do gene NPT-II contido no plasmídeo pDW151 (Venkatachalam et al., 2000).
3.5 Análise da expressão de PeLFY e PsLFY via RT-PCR e hibridização in situ.
Para a realização da RT-PCR, RNAs totais dos tecidos das duas espécies foram isolados pelo método do Trizol (invitrogen), com posterior tratamento com DNAse turbo® e síntese do cDNA utilizando-se o kit “Super Script First Strand Synthase” (Invitrogen). Estas fitas de cDNA foram utilizadas como molde nas reações de PCR. Como controle da qualidade dos cDNAs sintetizados foram utilizados os primers 5´-GAGGCTATTCGGCTATGACTG-3´ e 5´-ATCGGGAGG GGCGAT ACCGTA-3´ que amplificam um fragmento de aproximadamente 750pb do gene constitutivo ACTINA em espécies de Passiflora sob as seguintes condições: desnaturação inicial por 3 minutos a 94oC, seguida de 34 ciclos de 1min a 94ºC, 1min a 55ºC e 1min a 72ºC. Para a análise da expressão dos homólogos de LFY em
Passiflora, foram utilizados os cDNAs obtidos em reações com os mesmos primers e
condições descritas no item 3.3. Optou-se por uma reação saturada (35 ciclos) uma vez que esta análise é somente qualitativa.
As hibridizações in situ foram realizadas utilizando-se sondas não-radioativas, segundo as técnicas já descritas na literatura (Dornelas et al., 1999; 2000). As sondas foram obtidas a partir dos fragmentos de PeLFY e PsLFY obtidos como descrito no item 3.3. Para tal, os plasmídeos contendo os fragmentos foram
21
linearizados com a enzima PSTI (a 37oC por 1h). Sondas sense e antisense foram obtidas por transcrição in vitro pela enzima T7, em reação contendo uracila marcada com digoxigenina (DIG-UTP), segundo as instruções do fabricante do kit de marcação (Roche).
O material foi fixado a vácuo, em 4% paraformaldeído (p/v), por 24h a 4 oC. A seguir foi desidratado em série etílica, posteriormente foi emblocado em parafina, seccionados seriadamente (8 µm) e montados em lâminas de vidro cilanadas. Alternativamente, ápices meristemáticos de plantas na fase reprodutiva devidamente fixados e desidratados foram utilizados inteiros e diretamente na hibridização, de acordo com a técnica denominada hibridização tipo ¨whole mount¨.
A hibridização foi conduzida sob condições de estringência apropriadas. Os cortes de material emblocado foram desparafinados em baterias de xilol:álcool (3:1, 1:1, 1:3, álcool absoluto) e submetidos ao tratamento de pré-hibridização com proteinase-K [1µg/ml em 0,05M Tris HCl pH:7,5]. No caso dos tecidos hibridizados inteiros, estes foram re-hidratados em série etílica reversa e posteriormente submetidos ao tratamento de proteinase-K de maneira semelhante ao que se procedeu para os cortes histológicos. A visualização do sinal de hibridização foi obtida através de reação colorimétrica, utilizando-se anticorpos anti-DIG (1:1000) em tampão contendo 1M Tris-HCl; 5M NaCl; 1% Blocking agent (Roche) conjugados à fosfatase alcalina empregando um solução comercial de NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride) /BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate p-Toluidine) mais supressor (Levamissole 1mM) como substrato (Pierce). O material hibridizado foi observado em microscópio ZEISS modelo AXIOSKOPE ou lupa binocular Leica MDG30 e fotografado para documentação e posterior análise.
22
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Descrição do desenvolvimento reprodutivo de P. edulis var. flavicarpa Deg e P. suberosa L.
A análise do desenvolvimento reprodutivo de P. edulis e P. suberosa observado em microscopia óptica e em microscopia eletrônica de varredura (Figura 4, 5, 6 e 7) permitiu a determinação da origem e a descrição das características das estruturas passíveis de terem seu desenvolvimento controlado por homólogos do gene LFY em Passiflora. Esta auxilia a interpretação dos resultados oriundos dos experimentos de expressão gênica por hibridização in situ.
Passiflora edulis
Os produtos do meristema apical foram originados de maneira espiralada (Figura 5). A Figura 4 mostra a orientação, posicionamento e identidade das estruturas documentadas na Figura 5A para uma melhor compreensão. Na fase reprodutiva, o meristema apical caulinar produziu primórdios de folha (P), que, por sua vez, originam os primórdios das estípulas (ES) e da folha propriamente dita (FO). Na região adaxial, na axila do primórdio foliar, observou-se um conjunto de células que compuseram um meristema axilar alongado, no sentido da largura do primórdio foliar. Este meristema axilar dividiu-se para formar, do lado direito (observando-se a partir do meristema apical), o meristema floral, cujo primeiro primórdio formado, foi o da bráctea abaxial. No lado esquerdo, formou-se o primórdio de gavinha.
Em P. edulis, observou-se a produção de apenas um meristema floral pelo meristema axilar. Notou-se claramente que a gavinha e o meristema floral possuem uma origem comum. Tal observação pode sugerir a participação do homólogo do
23
gene LFY de P. edulis no desenvolvimento das gavinhas, uma vez que em videira, o homologo de LFY, VFL, é expresso em meristemas axilares, independentemente do destino final destes (Carmona et al., 2002). Segundo estes autores, isto sugere que
VFL está envolvido não somente na iniciação do florescimento, mas também no
desenvolvimento das inflorescências, folhas e gavinhas (Carmona et al.,2002).
Figura 4: A-MEV do ápice caulinar em estágio reprodutivo de P. edulis. B- Esquema demonstrativo do ápice caulinar de P. edulis na fase reprodutiva.
B A
24
Figura 5: A- MEV do meristema apical de P. edulis na fase reprodutiva. B, C e D- mostram fases consecutivas da formação dos produtos oriundos do meristema axilar, com o desenvolvimento do meristema floral (protegido por brácteas) e do primórdio da gavinha. E- secção longitudinal mediano do meristema apical de P. edulis na fase reprodutiva. P: primórdio de folha e estípula, br1: primórdio da primeira bráctea; ES: primórdio de estípula; FO: primórdio de folha; M: meristema apical; MA: meristema lateral axilar; MF: meristema floral; pg: primórdio de gavinha, Barra=50µm.
25
Passiflora suberosa
Os produtos do meristema apical também são originados de maneira espiralada em P. suberosa (Figura 7). A Figura 6 mostra a orientação, posicionamento e identidade das estruturas documentadas na Figura 7A, para uma melhor compreensão. O primórdio da folha (P) se dividiu para formar os primórdios das estípulas (ES) e da folha propriamente dita (FO), assim como em P. edulis. Adicionalmente, também de maneira similar ao observado para P. edulis, na região adaxial do primórdio foliar de P. suberosa, observou-se a formação de um meristema axilar alongado. No entanto, diferentemente de P. edulis, este meristema axilar dividiu-se em três regiões distintas para formar, do lado direito (observando-se a partir do meristema apical), um meristema floral, na região central, um primórdio de gavinha e, do lado esquerdo, um segundo meristema floral. O segundo meristema floral possui desenvolvimento atrasado em relação ao primeiro, sugerindo a diferenciação seqüencial destas estruturas a partir do meristema lateral axilar. O primeiro primórdio formado pelos meristemas florais foi o de uma bráctea. Enquanto em P. edulis três brácteas protegem a flor, em P. suberosa apenas uma bráctea é formada. Eventualmente, meristemas florais adicionais foram observados na axila da bráctea em P. suberosa, enquanto em P. edulis as flores foram sempre solitárias.
26
Figura 6: A- MEV do ápice caulinar em estágio reprodutivo de P. suberosa. B- Esquema demonstrativo do ápice caulinar de P. suberosa na fase reprodutiva.
27
Figura 7: A- MEV do meristema apical de P. suberosa na fase reprodutiva. B, C e D- mostram fases consecutivas da formação dos produtos oriundos do meristema axilar, com o desenvolvimento de meristemas florais (protegidos por uma única bráctea) e do primórdio da gavinha. E- corte longitudinal mediano do meristema apical de P. suberosa na fase reprodutiva. P: primórdio de folha e estípula br: primórdio da bráctea; ES: primórdio de estípula; FO: primórdio da folha propriamente dita; M: meristema apical; MF1: primeiro meristema floral; MF2: segundo meristema floral; pg: primórdio de gavinha; mv: meristema lateral vegetativo; P: primórdio da folha; tp1: primórdio da primeira tépala, Barra=50µm.
28
Um resultado intrigante obtido da caracterização do desenvolvimento reprodutivo em P. edulis e P. suberosa foi a observação da origem compartilhada entre os meristemas florais e o primórdio da gavinha (Figuras 5A e 7A). Esta origem comum dos meristemas florais e dos primórdios de gavinha também foi observada em videira (Vitis vinifera), onde o desenvolvimento reprodutivo é bem caracterizado, inclusive do ponto de vista molecular (Calonje et al., 2004; Carmona et al., 2002; 2008). Em videira, sugere-se que as gavinhas sejam flores modificadas e que as mesmas sejam componentes estruturais da inflorescência, recrutados durante a evolução das espécies de Vitis (Carmona et al., 2002). Desta forma, é plausível sugerir a ocorrência de evolução convergente das gavinhas, em famílias tão divergentes como Passifloraceae e Vitaceae, possivelmente fundada nos mesmos processos moleculares. Estes processos provavelmente baseiam-se no recrutamento de estruturas florais modificadas pela expressão diferencial de genes-chave do desenvolvimento floral, como os homólogos do gene LFY (veja os resultados do padrão de expressão dos homólogos de LFY em Passiflora nesta tese e também os resultados de Calonje et al., 2004; Carmona et al., 2002; 2008).
Ao contrário do observado para Vitaceae, a estrutura da inflorescência é muito pouco compreendida em Passifloraceae. As espécies com importância econômica, como P. edulis, P. alata e P. quadrangularis, pertencem ao subgênero Passiflora. Neste subgênero a maioria das espécies possui inflorescências reduzidas, geralmente produzindo apenas uma flor solitária. Esta característica é considerada derivada em relação ao observado para outras espécies do gênero (Ulmer & McDougal, 2004). P. suberosa pertence ao subgênero Decaloba e neste subgênero
29
a maioria das espécies possui inflorescências reduzidas contendo 2 a 3 flores (Ulmer & McDougal, 2004). A análise da estrutura das inflorescências de espécies de gêneros considerados basais na família, como Adenia, Paropsia e Mitostemma levou Krosnick & Freundenstein (2005) a sugerirem um modelo básico de inflorescência para Passifloraceae com duas características principais: a presença de um eixo alongado de primeira ordem, que freqüentemente termina em uma gavinha, e ramificações laterais de ordens superiores que resultam em um cimo composto.
Modelos moleculares que tentam explicar os mecanismos que originam modificações das estruturas das inflorescências em plantas têm sido investigados (Prusinkiewicz et al., 2007). O modelo mais recente inclui um papel fundamental para homólogos do gene LFY na determinação do que os autores chamaram de ¨vegetativeness¨ que é a capacidade de proliferação celular característica do desenvolvimento indeterminado dos meristemas da inflorescência (Prusinkiewicz et al., 2007). A investigação do padrão de expressão do gene LFY em espécies divergentes de Passiflora poderá corroborar este modelo e sugerir mecanismos moleculares para a regulação das transições evolutivas entre inflorescências contendo muitas flores (e.g. como em P. racemosa, subgênero Passiflora), inflorescências contendo 2 flores (como na maioria das espécies do subgênero Decaloba) e inflorescências reduzidas a flores solitárias (como na maioria das espécies do subgênero Passiflora).
30
500pb 250pb 4.2 Clonagem de fragmentos dos homólogos do gene LFY em Passiflora
Com a utilização dos primers LA e LB nas condições de PCR descritas no item 3.3., foram obtidos, a partir do DNA genômico de P. edulis e P. suberosa, fragmentos de cerca de 250pb (Figura 8).
Figura 8: Eletroforese em gel de agarose (1%) das reações de PCR contendo DNA genômico de P. edulis e P. suberosa como molde e os primers LA e LB. As setas indicam as bandas de ±250pb referentes à amplificação esperada com a utilização destes primers. O controle negativo corresponde a uma reação na qual não se adicionou DNA genômico.
Após a clonagem e seqüenciamento destes fragmentos, verificou-se que o fragmento obtido com os primers LA e LB para P. suberosa e P. edulis continham 235 nucleotídeos. O alinhamento destas seqüências mostrou uma diferença de 14 nucleotídeos que corresponde a uma diferença de 6% entre elas. Ambas apresentaram, uma similaridade média de 90% com a região do segundo exon do gene LFY de A. thaliana. Esta região codifica 74 aminoácidos. Ao se comparar a seqüência de aminoácidos entre as duas espécies estudadas notou-se que as
31
mesmas diferem em apenas 3 aminoácidos. A comparação com a seqüência protéica de LFY de Arabidopsis revelou uma diferença de 10 aminoácidos entre
Arabidopsis e P. edulis e de 9 aminoácidos entre Arabidopsis e P. suberosa (Figura
9).
A seqüência de aminoácidos obtida para as duas espécies de Passiflora faz parte de uma região conservada e muito importante da região C-terminal da proteína LFY. Esta região é a responsável pela dimerização do fator de transcrição e pelo reconhecimento de seqüências específicas dos promotores dos genes nos quais LFY atua como regulador da expressão (Hamès et al.,2008).
As observações descritas acima sugerem que os fragmentos clonados representam fragmentos de ortólogos do gene LFY em P. edulis e P. suberosa. Assim, estes fragmentos foram denominados PeLFY e PsLFY, respectivamente.
32
Figura 9: Alinhamento das seqüências de aminoácidos codificados pela região clonada dos genes PeLFY de P. edulis e PsLFY de P. suberosa com seqüências homólogas de espécies vegetais divergentes representativas de angiospermas e gimnospermas.
33
Uma análise filogenética comparativa entre as seqüências de aminoácidos codificadas por PeLFY e PsLFY, com seqüências de outras espécies (Figura 10), revelou as relações de similaridade entre elas. As seqüências de gimnospermas foram reunidas em um clado suportado por um valor de Bootstrap de 97%. Dentre as seqüências de angiospermas, as de monocotiledôneas gramíneas (Lolium e arroz) são mantidas num mesmo clado fortemente suportado (Bootstrap de 99%). Estas observações concordam com outras filogenias do gene LFY presentes na literatura (Frohlich & Meyerowitz, 1997; Dornelas & Rodriguez, 2005a; Maizel et al., 2005) e suportam a conservação de função do produto deste gene em angiospermas (Maizel et al., 2005). As seqüências dos homólgos de LFY de P. edulis e P. suberosa encontram-se num mesmo clado (Bootstrap de 96%), entre as seqüências de dicotiledôneas, concordando com suas posições filogenéticas relativas.
4.3 Expressão de homólogos do gene LFY em duas espécies de Passiflora. 4.3.1. RT-PCR
cDNAs foram sintetizados a partir de amostras de RNA total de folhas (F), raízes (R), caule (C), ápices contendo meristemas vegetativos de plantas juvenis, que produzem apenas primórdios foliares (MJ) e ápices contendo meristemas na fase reprodutiva, que produz primórdios de folhas trilobadas, primórdios de gavinhas e meristemas florais em diferentes fases de desenvolvimento (MR), das duas espécies de Passiflora estudadas. Estes cDNAs foram utilizados em reações de RT-PCR com os primers LA e LB, para determinar o padrão de expressão de PeLFY e
PsLFY nestes tecidos. Como mostrado nas Figuras 11 e 12, apenas as amostras de
34
Figura 10: Análise filogenética oriunda das matrizes de distância calculadas a partir do alinhamento mostrado na Figura 9, compreendendo as seqüências deduzidas de aminoácidos da região C-terminal de homólogos de LFY de várias espécies, incluindo PeLFY de P. edulis e PsLFY de P. suberosa. Os valores mostrados são referentes aos cálculos de Bootstrap de 1000 repetições. Apenas valores de Bootstrap maiores que 70% são mostrados.
35
fragmentos de PeLFY (Figura 11) e PsLFY (Figura 12). Estes resultados indicam que os homólogos de LFY de Passiflora são expressos apenas em tecidos reprodutivos e não são expressos em tecidos vegetativos isolados (caule e folhas) de plantas maduras. Este resultado concorda com o observado para outras espécies vegetais para as quais o padrão de expressão de homólogos de LFY foram determinados, uma vez que a principal função relatada para o referido gene é sua participação na regulação da diferenciação do meristema floral (Coen & Meyerowitiz, 1991; Weigel et al., 1992; Weigel e Nilsson, 1995; Blázquez et al., 1997; Dornelas & Rodrigez, 2005a, 2005b, 2006a, 2006b).
Ao contrário de P. suberosa que produz folhas trilobadas mesmo durante a fase juvenil, P. edulis, após a transição da fase juvenil para a fase adulta, deixa de produzir folhas simples e passa a produzir folhas trilobadas e gavinhas (Ulmer e MacDougal, 2004). Os resultados obtidos com os experimentos de RT-PCR descritos acima não permitem concluir se a expressão de PeLFY nos ápices reprodutivos está relacionada apenas com produção de tecidos reprodutivos, ou também na transição da fase vegetativa juvenil para a fase vegetativa adulta. Portanto um experimento adicional de RT-PCR foi realizado para a verificação da presença de transcritos de
PeLFY com cDNA oriundo de tecidos de ápices contendo meristemas vegetativos
adultos (MA), que produzem os primórdios das folhas trilobadas e primódio de gavinha, em contraste com o meristema vegetativo juvenil (MJ) que produz primórdios de folhas simples e não produz gavinha.
36
Figura 11: RT-PCR de diferentes tecidos de Passiflora edulis, no painel superior, a banda corresponde à amplificação do fragmento de PeLFY. No painel inferior, as bandas indicam amplificação do gene constitutivo ACTINA. F:folha, R:raiz, C: caule, MJ:ápices de plantas juvenis, MR:ápices de plantas na fase reprodutiva.
Figura 12: RT-PCR de diferentes tecidos de Passiflora suberosa, no painel superior, a banda corresponde à amplificação do fragmento de PsLFY. No painel inferior, as bandas indicam amplificação do gene constitutivo ACTINA F:folha, R:raiz, C: caule, MR:ápices de plantas na fase reprodutiva.
Os resultados deste experimento complementar revelaram a amplificação de fragmentos do gene PeLFY nas amostras de ápices vegetativos maduros (Figura 13). Estes resultados indicam a expressão de PeLFY nestes tecidos, sugerindo a participação da proteína PeLFY no controle do desenvolvimento das estruturas não produzidas pelos meristemas vegetativos juvenis, como as folhas trilobadas e as gavinhas. A expressão de homólogos de LFY em tecidos vegetativos já foi relatada na literatura (Kelly et al., 1995; Pouteau et al., 1997; Molinero-Rosales et al., 1999; Shu et al., 2000; Ma et al., 2008; Guo & Yang, 2008). Em leguminosas, há evidências 250pb
750pb
250pb
37
da participação direta dos homólogos de LFY no desenvolvimento de estruturas vegetativas na diferenciação das folhas compostas e na formação de gavinhas (Hofer et al, 1997; Champagne et al., 2007; Wang et al., 2008). Resultados recentes de experimentos com plantas transgênicas de leguminosas têm demonstrado uma correlação entre a expressão dos homólogos de LFY e a modificação da complexidade da estrutura foliar. Plantas juvenis de soja produzem um primeiro par de folhas simples e opostas e, em seguida, apenas folhas compostas são produzidas em filotaxia espiralada (Champagne et al., 2007). Em plantas transgênicas de soja nas quais a expressão do homólogo de LFY de soja (GmLFY) foi reduzida, nós adicionais de folhas simples e opostas foram produzidas (Champagne et al., 2007). De forma similar, plantas de alfafa geralmente produzem folhas compostas com três folíolos, mas mutantes para o homólogo de LFY de alfafa (SGL1) produzem apenas folhas simples. Desta forma, é possível que a expressão de PeLFY e PsLFY nos meristemas vegetativos possa estar associada à diferenciação de folhas trilobadas nestas espécies, especialmente na transição de folhas juvenis simples para folhas adultas trilobadas em P. edulis.
Figura 13: RT-PCR de ápices de plantas de P. edulis em diferentes estágios de desenvolvimento. No painel superior, as bandas correspondem à amplificação de um fragmento do gene PeLFY. No painel inferior, as bandas indicam a amplificação de um fragmento do gene constitutivo ACTINA.
Adicionalmente aos fenótipos associados à complexidade das estruturas foliares, há ainda, tanto em leguminosas quanto em videira, relatos do papel de
750pb 250pb
38
homólogos de LFY na diferenciação das gavinhas (Hofer et al., 1997; Carmona et al.,2002). Mutantes de ervilha para o seu respectivo homólogo de LFY (UNI) além de produzirem folhas simples em substituição às folhas compostas, ainda não produzem gavinhas que, em ervilha, são folhas modificadas (Hofer et al.,1997). O homólogo de
LFY de videira, VFL, se expressa nos estágios iniciais de desenvolvimento das
gavinhas (Carmona et al., 2002). Assim, é possível que a expressão de PeLFY e
PsLFY nos meristemas vegetativos maduros, que produzem primórdios de gavinhas,
esteja relacionada à diferenciação destas estruturas em Passiflora.
Visando uma melhor compreensão do padrão de expressão de PeLFY e
PsLFY durante o desenvolvimento reprodutivo em Passiflora, foram realizados
experimentos de hibridização in situ em ápices vegetativos maduros e em ápices reprodutivos das espécies de Passiflora estudadas.
4.3.2 Hibridizações in situ
As hibridizações in situ revelaram o padrão de expressão dos genes PeLFY e
PsLFY em ápices de P. edulis e P. suberosa, respectivamente (Figura 14 e 15).
Verificou-se que em ambas as espécies os sinais de hibridização estão presentes nos primórdios foliares (FO) (Figuras 14A, E-G; 15A e F), no meristema axilar (ml) como um todo (Figuras 14F e G e 15F), e nos meristemas florais (mf) e nos primórdios de gavinha (ga) (Figuras 14B, C, H-J; 15B, D-J).
Nas duas espécies estudadas, os primórdios foliares apresentam sinal de hibridização para este gene com maior intensidade na região adaxial (Figuras 14E-G e 15F), e não foi detectada expressão nas estípulas (14A e 15B) que compartilham com as folhas a origem em um mesmo primórdio. O meristema axilar que dará
39
origem às flores e às gavinhas demonstrou expressar LFY em toda sua estrutura para as duas espécies, tanto na fase vegetativa, como na fase reprodutiva (14F e G e 15F, setas). Isto sugere a participação dos genes PeLFY e PsLFY no desenvolvimento das gavinhas e dos meristemas florais. Enquanto durante o seu desenvolvimento inicial, os primórdios de gavinha expressam PeLFY e PsLFY de maneira uniforme (Figuras 14E, I e 15B, E, I e F), nos estágios mais tardios, a expressão se limita a pontos de crescimento localizado como as regiões apicais e/ou as de contato (Figuras 14B e C).
No meristema floral, a expressão de PeLFY e PsLFY também é uniforme no início do desenvolvimento e se torna mais localizada durante o desenvolvimento dos órgãos florais (Figuras 14H-J; 15F-J). Em P. suberosa, a expressão é suprimida nos primórdios das brácteas logo após a sua formação (Figura 15 F e G), enquanto em
P. edulis a expressão nestes órgãos continua até a formação dos primórdios florais
(Figuras 14H-J). Este padrão de expressão diferencial poderia estar relacionado ao diferente número de primórdios de brácteas (1 em P. suberosa e 3 em P. edulis) ou ao fato das brácteas florais de P. edulis produzirem nectários extra-florais, enquanto estas estruturas estão ausentes na bráctea floral de P. suberosa. Uma observação contrária a esta última hipótese é o fato dos nectários extra-florais das folhas de P.
40
Figura 14: Hibridizações in situ tipo “whole mount” e em cortes histológicos de P.
edulis com a sonda de PeLFY. A-D Hibridizações tipo “whole mount”. (A) Primórdio
foliar, note que não há expressão nas estipulas. (B) Apice do primórdio de uma gavinha. (C) Primórdio de gavinha em desenvolvimento. Note a expressão em regiões localizadas (seta). (D) Meristema floral. A seta aponta o sinal de hibridização nas regiões internas. (E) Ápice caulinar. Note a presença de transcritos nos primórdios foliares (FO e seta) e nos primórdios de gavinha. (F) Hibridização in situ do ápice de P. edulis no qual a região adaxial dos primórdios foliares está marcada bem como os meristemas axilares. (G) Meristema axilar e primórdios foliares hibridizados. (H) Meristema floral e primórdio de bráctea. (I) Meristema floral e primórdio de gavinha. (J) Meristema Floral em um estágio mais desenvolvido com as brácteas e primórdios de sépalas mostrando sinal de hibridização. Note a ausência de sinal no meristema vegetativo. Barras: A, C e D: 1mm; B e E: 400µm; F, G e J: 100µm; H: 50µm; I:80µm; br: primórdio de bráctea; ES: estípulas; FO: primórdio de folha; ga: primórdio de gavinha; M: meristema apical caulinar; mf: meristema floral; ml: meristema axilar; se: primórdio de sépala.
41
Figura 15: Hibridizações in situ tipo “whole mount” e em cortes histológicos de P.
suberosa com a sonda de PsLFY. (A) Hibridização “whole mount” do primórdio foliar.
(B) Hibridização “whole mount” de um nó com estipulas, flores e gavinhas, não há marcação nas estipulas. (C) Base de uma folha mostrando a ausência de sinal de hibridização nos nectários extra-florais (setas). (D) Inflorescência e meristema lateral vegetativo. Note a ausência de sinal no meristema vegetativo (seta). (E) Conjunto de inflorescência e primórdio de gavinha. Um dos meristemas florais não mostra sinal de hibridização (seta) e seu desenvolvimento provavelmente será abortado. (F) Ápice caulinar de P. suberosa aonde os meristemas axilares (setas), primórdios foliares e de gavinhas mostram sinal de hibridização. (G) Meristema floral no estágio de formação dos primórdios de tépalas com marcação mais evidente na região central e nos primórdios e mais fraca na bráctea (seta). (H) Meristema floral em estágio de formação dos primórdios dos estames (setas) com marcação evidente nestes. (I) Meristema floral e primórdio de gavinha. (J) Meristema floral no estágio de formação dos primórdios de carpelos (seta). Barras: A, B e I: 1mm; C e D: 0,4mm; E, H e J: 200µm; F: 300µm; G:150µm; br: primórdio de bráctea; ES: estípulas; es: primórdio de estame; FO: primórdio de folha; ga: primórdio de gavinha; M: meristema apical caulinar; mf: meristema floral; te: primórdio de tépala.
