TRANSGÊNESE NA ESPÉCIE CAPRINA TRANSGENESIS IN GOATS
FREITAS, V.J.F.
Universidade Estadual do Ceará (UECE)- Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução E-mail:[email protected]
Resumo
A produção de proteínas humanas recombinantes no leite de caprinos transgênicos oferece uma fonte renovável e segura de proteínas comercialmente importantes mas que não podem ser produzidas eficientemente em quantidades adequadas por outros métodos. Progressos recentes foram conseguidos nas áreas de biologia molecular e fisiologia reprodutiva para aumentar a eficiência de produção e reprodução de animais transgênicos fundadores, como também para melhorar a expressão de proteínas heterólogas em seu leite. A presente revisão tem dois objetivos, primeiramente, oferecer uma visão geral de avanços recentes nas estratégias técnicas aplicadas para produção de caprinos transgênicos, e também, apresentar resultados pessoais obtidos após três anos trabalhando com superovulação, produção de zigotos e transferências para receptoras a fim de obter-se caprinos transgênicos para o G-CSF humano.
Palavras-chave: caprino, transgênese, biotecnologia.
Abstract
The production of recombinant human proteins in the milk of transgenic goats offers a safe, renewable source of commercially important proteins that cannot be produced as efficiently in adequate quantities by other methods. Recent progress has drawn on molecular biology and reproductive physiology to improve the efficiency of producing and reproducing useful transgenic founder animals, and to improve the expression of heterologous proteins in their milk. The present review has two goals. First, to offer an overview of recent advances in the technical strategies applied to the production of transgenic goats, and second, to present personal results obtained after three years working with superovulation, zygote production and transfer to recipients goats in order to obtain transgenic goats to human G-CSF.
Keywords: goat, transgenesis, biotechnology.
Introdução
A espetacular melhoria na produção animal a qual estamos assistindo nos últimos cinqüenta anos é o resultado de uma dupla orientação: de um lado uma melhor utilização das técnicas tradicionais de criação (alimentação, higiene, reprodução etc) e de outra parte uma aplicação rápida de novas técnicas originadas das pesquisas (seleção genética, controle da reprodução, vacinação etc). Os importantes progressos que a pesquisa conseguiu na maior parte das áreas ligadas à biologia, e mais particularmente na genética molecular, levaram a repensar profundamente os programas de pesquisa aplicada aos seres vivos.
Na realidade, não existem mais dúvidas de que a exploração de organismos vivos irá, de uma maneira ou outra, sofrer uma revolução pelo uso dessas novas descobertas e mais particularmente pela “engenharia genética”, a qual introduziu-se em vários setores da biologia (estudo da expressão genética, biologia celular, engenharia de proteínas, fisiologia etc).
Sem dúvida, está em andamento uma revolução na exploração de animais provocada pelas descobertas da biologia. Todavia, a complexidade dos organismos animais deixa este percurso relativamente lento e difícil; sem, no entanto, incitar ao pessimismo. Nesse sentido, técnicas como a transgênese alcançaram um nível de desenvolvimento bastante importante, sendo o tema a ser abordado nesse trabalho, o qual também apresentará a espécie caprina como um excelente modelo animal para aplicação da transgênese.
Transgênese
A seleção animal convencional baseia-se estritamente nas regras de Darwin e Mendel, as quais comandam a evolução e a transmissão de propriedades genéticas do seres vivos. Mutações no genoma são gerados aleatoriamente durante a reprodução por erros na replicação do DNA, modificações químicas do DNA e rearranjamento cromossômico (HOUDEBINE, 1991). Na natureza, o ambiente favorece a emergência dos indivíduos mais adaptados. Na reprodução controlada, as propriedades genéticas retidas são aquelas escolhidas por seleção. A eficiência da seleção é todavia altamente dependente das mutações, as quais não podem ser controladas, e da capacidade de avaliar as características genéticas importantes.
As mutações podem ser induzidas por agentes químicos administrados em quantidades limitadas aos animais. Observações posteriores em animais podem levar ao estabelecimento de novas linhagens com novas propriedades genéticas. Em condições adequadas, o uso sistemático de marcadores genéticos levam à identificação de genes responsáveis pela propriedade fenotípica observada (BROWN & BALLING, 2001). No entanto o sucesso deste tipo de estudo somente é possível em espécies que possuem um ciclo reprodutivo curto e não pode ser aplicada aos animais de produção.
O mapeamento e o seqüenciamento genômico sistemático permitirá o acesso a todos os genes de vários animais de produção. Dessa forma existirá a possibilidade de selecionar animais não somente pela avaliação de
suas propriedades fenotípicas, mas pelo seqüenciamento de vários alelos responsáveis pelas características genéticas observadas nos animais (Figura 1).
Um exemplo pode ilustrar este ponto de vista. É bem conhecido que a qualidade do leite é dependente dos alelos expressos dos genes da proteína do leite. Um seqüenciamento sistemático de seus alelos principais está sendo realizado. Esta informação está sendo usada para selecionar reprodutores bovinos possuindo os melhores alelos. Esta técnica é perfeitamente precisa e pode ser aplicada em qualquer período da vida do animal.
Até que o genoma dos animais de produção seja melhor conhecido, a seleção manterá um certo grau de imprecisão. Na maioria dos casos os animais ainda continuam a ser selecionados pelas suas características fenotípicas. Isto significa que os genes selecionados são desconhecidos e que o rearranjamento de cromossomos durante a formação dos gametas permite que o gene de interesse seja selecionado mesmo se este é desconhecido.
Figura 1: Principais usos de genes isolados. Os genes podem ser isolados por métodos clássicos de clonagem (1), pelo uso de microsatélites (2) ou pelo seqüenciamento sistemático de genomas ou cDNAs. Genes isolados podem ser estudados isoladamente, usados para seleção ou diagnóstico genético, para produção de proteínas recombinantes, na terapia genética ou para transgênese (adaptado de HOUDEBINE, 2001).
Mesmo quando todos os genes dos animais de produção sejam identificados, a seleção permanecerá estritamente dependente das mutações aleatórias que ocorrem durante a reprodução. A transgênese diminui um grande número desses problemas. Em situações otimizadas, o gene isolado e transferido para o animal é bem conhecido e seus efeitos biológicos são esperados. Por outro lado, a transferência de genes induz uma única alteração no genoma do hospedeiro.
Por estas razões, a transgênese aparece como um método interessante para aumentar a produção animal. Antes de detalharmos aspectos técnicos do método, iremos primeiramente conceituar “transgênese” como a modificação da informação genética de um organismo através de técnicas de recombinação de DNA. Podemos também dizer que um “animal transgênico” é aquele que adquiriu uma nova informação genética como resultado de manipulação do seu DNA (NICOLAS & DELOUIS, 1993).
Métodos Usados Para Produção de Animais Transgênicos
O objetivo da transgênese é produzir animais que possuam uma incorporação estável de fragmento de DNA exógeno em sua linhagem germinativa. Os primeiros animais a carregarem genes inseridos experimentalmente foram camundongos produzidos pela injeção de DNA de vírus-símio 40 (SV40) em embriões (JAENISCH & MINTZ, 1974). A transgênese inclui fundamentalmente dois diferentes tipos de experimento: adição de genes e troca de genes por recombinação homóloga. No primeiro caso uma informação genética adicional é introduzida de uma maneira estável dentro do genoma do animal. O gene “estranho” geralmente codificam para uma proteína a qual pertence à mesma espécie ou outra espécie animal. O gene adicional pode ter sido transferido para inibir a expressão de um gene endógeno. No segundo caso, o DNA “estranho” pode ser um gene inativo. O gene endógeno assim torna-se eliminado (knocked out). O DNA “estranho” pode ser modificado mas a versão ativa do gene endógeno ou um gene bastante diferente.
Adição de genes
O método original para produzir animais transgênicos consiste na microinjeção do gene isolado dentro do pró-núcleo de embriões de uma célula. Este método tem sido usado extensivamente em vários mamíferos (roedores, suínos, ovinos, caprinos e bovinos).
A injeção de DNA dentro do citoplasma é seguida de uma taxa variável de sucesso na integração de acordo com a espécie. O uso de vetores retrovirais são então necessários. Assim, vetores retrovirais tem sido utilizados para transferir genes “estranhos” em células embrionárias de galinhas (RONFORT et al., 1997) ou dentro de oócitos de vacas ou macacas (CHAN et al., 1998, 2001).
A transferência de genes em espermatozóides isolados seguida de fertilização pode gerar mamíferos e demais espécies transgênicos (BACCETTI & SPADAFORA, 2000). A permeabilização da membrana espermática seguida de injeção espermática intra-citoplasmática (ICSI) é um eficiente método para produção de animais transgênicos (MARSH-ARMSTRONG et al., 1999). Embora atrativa, a transferência de genes por espermatozóides incubado com DNA continua um método muito pouco eficiente para maioria das espécies, pois a produção de transgênicos é baixa e o DNA “estranho” é quase sempre rearranjado fortemente e inativado. Um trabalho recente demonstrou que espermatozóides incubados com anti-corpos monoclonais reconheceram um antígeno específico e ligando-se ao DNA (QIAN et al., 2001).
Troca de genes
A troca de genes depende da recombinação homóloga. Este é um evento raro e vetores apropriados devem ser usados em células clonadas dentro das quais a troca de gene ocorre (VIVILLE, 1997). Uma das propriedades desses vetores é de permitir a seleção das células nas quais a recombinação homóloga ocorreu.
Células nas quais a troca de gene ocorre deve ser capaz de participar no desenvolvimento de um embrião seguido pela transmissão da mutação para a progênie. Células embrionárias totipotentes (ES) são normalmente usadas em camundongos com este propósito desde 1989 (CAPECCHI, 1989). Por razões desconhecidas, linhagens de células ES não tem sido devidamente detalhadas em outras espécies e a troca de genes por este método continua restrita a duas linhagens de camundongos.
As condições definidas para clonagem de ovinos pela transferência de núcleo à partir de células somáticas de adultos em oócitos enucleados tem sido utilizadas para adicionar genes em ovinos (SCHNIEKE et al., 1997), caprinos (BAGUISI et al., 1999) e bovinos (HOUDEBINE, 2002).
O uso deste método não é uma tarefa fácil por várias razões:
a) os fibroblastos fetais primários usados atualmente na troca de gene tem uma capacidade limitada para dividir; b) recombinação homóloga é geralmente menos freqüente em células somáticas que em células ES e
c) clonagem por transferência nuclear tem uma baixa produção, a qual é posteriormente diminuída quando células são cultivadas previamente (WELLS, 2001).
Apesar das dificuldades atualmente encontradas parece razoável pensar que estes métodos estão sendo melhorados e aplicados em outras espécies que não os ruminantes.
Para qualquer dos métodos utilizados para produzir animais transgênicos, primeiramente é importante estimar-se o tamanho do rebanho necessário para produção da proteína desejada. O tamanho do rebanho necessário para encontrar a produção anual pode ser estimado à partir da seguinte equação:
Tamanho = 1,3 x Necessidade anual total (g)
do rebanho Nível de expressão (g.L-1) x Volume total de leite (L) x Eficiência da purificação (%)
O fator 1,3 leva em conta a observação que, em qualquer outra situação, 30% dos animais em um rebanho leiteiro são normalmente não lactantes. O número aproximado de fêmeas transgênicas necessário para produção de várias proteínas recombinantes representativas foi estimado à partir dessa equação, assumindo um nível médio de expressão de proteína de 5 g. L-1 e uma eficiência de recuperação da proteína de 60% (Tabela 1). Tabela 1: Tamanho do rebanho estimado para várias espécies e produtos.
Proteína Necessidade estimada (kg) Espécie Tamanho do rebanho
Albumina sérica humana 100.000 Bovina 5.400
Anti-tripsina-α1 5.000 Ovina 4.300
Anticorpo monoclonal 100 Caprina 58
Anti-trombina III 75 Caprina 43
Fator IX 2 Suína 4
Adaptado de Rudolph (1999).
Logo após o nascimento, progênies resultantes da transferência de genes por qualquer dos métodos descritos são examinados para a presença do DNA exógeno em seu genoma. Essa análise de DNA é usualmente feita com a reação em cadeia de polimerase (PCR) ou análise por Southern blot (HOGAN et al., 1994). Animais que incorporam o gene em seu próprio DNA são transgênicos e podem ser utilizados para estudos subsequentes.
Resultados Mundiais de Transgênese em Caprinos
Produção de proteínas de interesse farmacêutico no leite de animais transgênicos tem se tornado uma alternativa atrativa para bioreatores de células animais. Todavia, a geração de grandes ruminantes transgênicos é, todavia, proibitivamente caro devido ao longo período gestacional, baixa prolificidade e elevados custos de manutenção desta espécie de ruminante doméstico. Por estas razões, o uso de caprinos leiteiros torna-se uma excelente alternativa para produção de animais transgênicos. Vários autores já citaram a obtenção de caprinos transgênicos (DENMAN et al., 1991; EBERT et al., 1991; GOOTWINE et al., 1997), bem como para produção em larga escala para sua aplicação industrial (EBERT et al., 1994; EDMUNDS et al., 1998).
Devido aos altos custos da produção de transgênicos em animais de produção, tornou-se um objetivo essencial a otimização da produção de embriões microinjetáveis de doadoras e a obtenção de elevadas taxas de gestação nas receptoras. Para obtenção desses objetivos são essenciais as etapas de superovulação das doadoras e de sincronização do estro da receptoras. Em trabalhos anteriores (SELGRATH et al., 1990) ficou estabelecido um tratamento padrão de superovulação de doadoras, observando-se a superioridade do pFSH (hormônio folículo estimulante de origem suína) sobre o eCG (gonadotrofina coriônica humana), como pode ser visualizado na Tabela 2. Estes resultados estabeleceram o pFSH como hormônio padrão para superovulação de doadoras caprinas.
Tabela 2: Resultados de superovulação em cabras doadoras de zigotos em programa de transgênese.
Tratamento N Ovulações (x ± sem) Estruturas recuperadas (x ± sem) Embriões colhidos (x ± sem)
eCG 7 7,7 ± 5,0 3,6 ± 3,4 2,7 ± 3,9
pFSH 7 10,6 ± 6,2 7,3 ± 5,0 5,0 ± 4,3
Adaptado de SELGRATH et al. (1990)
Um outro tratamento de superovulação (Figura 2) foi desenvolvido por BARIL et al (1996) com o objetivo de realizar uma melhor sincronização do momento da ovulação e consequentemente melhorar a qualidade dos zigotos a serem microinjetados. Este tratamento baseia-se no uso de um antagonista do GnRH (Antarelix) e uma posterior injeção de LH, ou seja, primeiramente o pique endógeno de gonadotrofina é bloquedo pelo antagonista do GnRH para depois produzir-se um pique exógeno de maneira mais pontual. Este método possibilita a colheita de um maior número de zigotos com uma mesma idade, melhorando, dessa forma, a eficiência da microinjeção.
Figura 2: Tratamento de superovulação de doadoras caprinas com indução de um pique pré-ovulatório de LH exógeno.
A etapa de fecundação deve ser considerada de elevada importância, pois quanto mais eficiente o método de fecundação maior o número de zigotos passíveis de ser microinjetado. Para tanto, a monta natural continua sendo o método mais eficiente, porém a inseminação artificial por laparoscopia aparece como uma possibilidade de uso de sêmen de animais melhoradores que dificilmente podem ser encontrados em um mesmo local.
Em caprinos, o método de escolha para a produção de animais transgênicos tem sido a microinjeção de zigotos produzidos in vivo e colhidos do oviduto 15 a 20 horas após o momento estimado para a fecundação. Por este método as doadoras são superovuladas, inseminadas ou cobertas após detecção do estro e o oviduto é lavado para colheita dos zigotos presumíveis. Embora este método resulte em zigotos com elevada capacidade de desenvolvimento, o procedimento é caracterizado por uma grande variabilidade no número de zigotos em estádio pró-nuclear. Em adição, devido à formação de adesões após a laparotomia, o método resulta em um uso limitado de animais doadores. Além disso, organizações para o bem-estar animal em várias partes do mundo estão realizando esforços para regulamentar que o limite de procedimentos cirúrgicos que podem ser realizados em um mesmo animal devem estar entre um a quatro.
Uma alternativa para vencer as limitações da laparotomia como técnica de colheita de zigotos está a colheita de oócitos de animais vivos e em bom estado sanitário e nutricional usando uma técnica menos invasiva. A técnica de ovum pick-up por laparoscopia já foi utilizada em ovinos (TERVIT, 1996) e também estendida para caprinos (GRAFF et al., 1995), sendo que BALDASSARRE et al (2003) utilizou para produção de zigotos in vitro e posterior microinjeção em caprinos. Através deste método os autores obtiveram cerca de 120 oócitos/doadora, mesmo na quarta sessão de colheita.
Quando da colheita dos presumíveis zigotos, essas estruturas são levadas ao microscópio invertido, com ou sem centrifugação anterior. Essa centrifugação permitirá uma melhor visualização dos pró-núcleos (BALDASSARRE et al., 2003). Os zigotos com pró-núcleos visíveis são microinjetados com o transgene. Para facilitar essa última operação é necessário que o laboratório possua um bom microscópio invertido munido de óticas DIC (Nomarski). A transferência de embriões propriamente dita é normalmente realizada através de laparotomia nas receptoras para exposição dos ovidutos e inovulação dos zigotos previamente microinjetados. A inovulação é realizada com auxílio de um catéter Tomcat®, o qual é inserido no oviduto através da fímbria.
As taxas de fertilidade variam de 30 a 42%, sendo que destes partos nascem em torno de 4 a 8% de animais transgênicos.
Desde os experimentos iniciais vários caprinos transgênicos já foram produzidos. Destes resultados podemos citar como mais importantes os caprinos transgênicos para os seguintes proteínas: HSA - Albumina sérica humana (GOOTWINE et al., 1997), hG-CSF - Fator estimulante de colônias de granulócitos humano (LEE et al., 2000), seqüência codificando a teia de aranha (BALDASSARRE et al., 2003).
Resultados da Equipe
A partir de 1999 os laboratórios do Instituto de Biofísica (UFRJ) e da Faculdade de Veterinária (UECE) iniciaram um projeto para produção do caprino transgênico para o G-CSF humano. Vários experimentos foram realizados com este intuito, sendo que os parágrafos a seguir descreverão as atividades realizadas para obtenção desses animais transgênicos.
O transgêne utilizado nas experiências da equipe foi obtido pela equipe do Dr. Oleg Serov do Instituto de Biofísica. Tratou-se do hG-CSF, o qual é um fator de crescimento hematopoiético que estimula a proliferação e a diferenciação de células precursoras de neutrófilos, além de aumentar algumas das propriedades funcionais de neutrófilos maduros (METCALF, 1998).
Estes experimentos permitiram o nascimento, em 2001, dos primeiros cabritos nascidos no Brasil após microinjeção embrionária (FREITAS et al., 2002).
O tratamento de superovulação das doadoras da raça Saanen constou de uma impregnação de progestágeno pelo uso de esponjas vaginais com 45 mg de FGA, as quais permaneceram por 11 dias na porção cranial da vagina. No nono dia deste tratamento foi realizada injeção intra-muscular de 50 µg de Cloprostenol, bem como o início de uma série de injeções de pFSH, as quais foram realizadas a cada 12 horas durante três dias, totalizando 200 mg de pFSH. Concomitantemente, as fêmeas receptoras (sem raça definida) eram preparadas pelo uso do mesmo tratamento progestágeno, sendo que no nono dia do tratamento eram aplicadas injeções intra-musculares de 200 UI de eCG (FREITAS et al., 1997).
As doadoras eram fecundadas por monta natural utilizando-se bodes da raça Saanen de fertilidade comprovada, sendo que cada doadora era coberta por, no mínimo, duas vezes. Jejum hídrico e alimentar era imposto às fêmeas (doadoras e receptoras) 24 horas antes da colheita. No momento da colheita de embriões os ovários das doadoras era observado para contagem do número de ovulações e para ter-se uma previsão do número de estruturas a recuperar (Tabela 3).
Tabela 3: Resposta de cabras Saanen submetidas à superovulação para produção de zigotos em um programa de transgênese.
Parâmetro Resposta
Número de doadoras 21
Fêmeas em estro (%) 100,0
Intervalo fim do tratamento-início do estro (h) 22,9 ± 6,5
Cabras superovulando (%) 90,5
Taxa de ovulação 10,8 ± 6,2
No último experimento, realizado em 2002, foram transferidos zigotos para 23 receptoras sem raça definida, sendo que verificou-se uma taxa de fertilidade de 30,4% (7/23) com o nascimento de 14 cabritos. No entanto, após análise nenhum dos animais nascidos eram transgênicos.
Considerações Finais
Embora várias linhagens de animais transgênicos possam ser propostos aos consumidores humanos, nenhum deles está atualmente no mercado. Este é o caso de suínos e peixes com crescimento aumentado. Em ambos os casos testes estão sendo realizados para avaliar o impacto negativo potencial sobre a saúde humana. A geração de animais geneticamente modificados para o consumo humano apresenta-se lento quando comparada a de vegetais. Isto é devido obviamente a problemas técnicos até agora não resolvidos.
No que diz respeito à espécie caprina, a realidade não é diferente. Não obstante a obtenção de vários animais transgênicos em diversos laboratórios, a eficiência para produção de caprinos transgênicos ainda é um ponto crítico na aplicação da tecnologia para produção de proteínas farmacêuticas à partir de caprinos transgênicos.
Os resultados obtidos por nossa equipe confirmam o domínio de todas as etapas do processo. No entanto, o pequeno número de repetições para este tipo de experimento dificultam a obtenção de animais portadores do transgene. Necessário se faz a obtenção de um financiamento de maior porte para que sejam ultrapassadas algumas dificuldades e que a produção do caprino transgênico no Brasil possa ser uma realidade iminente.
Agradecimentos
Este trabalho é o resultado de uma valiosa parceria entre a Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará e o Instituto de Biofísica da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Todos os resultados pessoais aqui apresentados foram oriundos de um trabalho conjunto onde foi essencial a participação dos pesquisadores Oleg Serov, Irina Serova, Loudmila Andreeva, Guenady Dvoriantchikov e Luciene Dias; além de todos os colegas do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução (UECE/FAVET): Davide Rondina, Edilson Lopes Jr., Dárcio Teixeira, Juliana Lima Verde e Iracelma Arruda. Gostaríamos também de agradecer a valiosa ajuda das seguintes agências financiadoras: FINEP, CNPq, FAPERJ e FUNCAP.
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