NATÁSSIA CRISTINA MARTINS OLIVEIRA
ESTUDO DOS NICHOS PERIVASCULAR E
VÁSCULO-NERVOSO COMO FONTE DE CÉLULAS ESTROMAIS
MESENQUIMAIS NA POLPA DENTÁRIA HUMANA
Piracicaba 2016
ESTUDO DOS NICHOS PERIVASCULAR E
VÁSCULO-NERVOSO COMO FONTE DE CÉLULAS ESTROMAIS
MESENQUIMAIS NA POLPA DENTÁRIA HUMANA
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em BIOLOGIA BUCO-DENTAL, na área de HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Rocha Marques ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA Natássia Cristina Martins Oliveira E ORIENTADA PELO PROF. DR. Marcelo Rocha Marques.
Piracicaba 2016
Dedico este trabalho aos meus pais Abadia e Raimundo, às minhas irmãs Andreia e Nívea, aos meus sobrinhos Nicole e Benjamin, e ao meu noivo Wanderson pelo amor incondicional, suporte emocional e compreensão nos momentos de ausência.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), na pessoa de seu diretor, Prof. Dr. Guilherme Elias Pessanha Henriques.
À Profa. Dra. Cínthia Pereira Machado Tabchoury, coordenadora geral da Graduação, e à Profa. Dra. Maria Beatriz Duarte Gavião, coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Biologia Buco-dental, da FOP-UNICAMP.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão da bolsa de doutorado, que me permitiu dedicação exclusiva à pesquisa.
Ao meu orientador Marcelo Rocha Marques, pela paciência, compreensão e presença constante ao longo desses 4 anos. Deixo aqui minha admiração pela sua perseverança e dedicação à pesquisa, pela sua disponibilidade para discutir questões profissionais e pessoais sempre que precisei, e por além de docente, ser amigo dos alunos.
Aos professores doutores membros da banca pelo aceite e contribuição na melhoria deste trabalho, Katiucia Batista da Silva Paiva, Karina Gonzales Silvério Ruiz, Paula Dechichi Barbar e Alexandre Augusto Zaia.
Aos professores da área de Histologia e Embriologia da FOP-UNICAMP: Sérgio Roberto Line, pelo exemplo de simplicidade, humildade e sabedoria; Ana Paula de Souza, pela oportunidade de crescimento profissional e conhecimento no estágio em docência e pelas valiosas considerações na qualificação do meu doutorado; e Pedro Duarte Novaes, pela seriedade que realiza suas funções nesta instituição.
Ao Prof. Paulo Cézar Simamoto Júnior, à Profa. Paula Dechichi Barbar, à Profa Camilla Christian Gomes Moura, e ao Prof. Conrado Aparicio minha eterna gratidão por terem me iniciado na carreira científica, na docência e na pesquisa.
Ao Prof. Alan Roger dos Santos Silva, do departamento de Estomatopatologia, pela disposição em nos ajudar com as reações de imunohistoquímica e ao pós-doc Felipe Paiva Fonseca, do mesmo departamento, que além da digitalização das imagens, muito contribuiu para meu exame de qualificação, participando da banca avaliadora.
À “minha” aluna de iniciação científica, que acabou virando uma grande companheira, Tatiane Barbosa e à mestranda Marta Bazzano pelo auxílio e disposição na coleta e processamento dos dentes, bem como isolamento das células.
Aos meus colegas da FOP, Ingrid Sousa, Eduardo Eurioste, Roger Guedes, Marta Bazzano, Mayra Faria, Gabriell Borgato, Zulieth Arrieta, Manuel Espejo, Francielly Felipetti, Maria Lembring, Aline Planello, Luciana Mofatto, Danielle Portinho, Rodrigo Silva, Carolina Carneiro, Carine Oliveira, Carlos Velazco, Miki Saito, Mércia Cunha, Thaís Oliveira, Simone Busato, Érika Harth, Lívia Alves, Nilva Cervigne, Juliana Neves, Gustavo Narvaes, Eliene Narvaes, Flávia Rodrigues, Adriano Luis e Suzete Neder, pela contribuição no meu crescimento profissional e científico, e pelos momentos de descontração e risadas que tornaram os meus dias mais fáceis.
Aos meus amigos de Uberlândia (MG), Renata Alves, Daiane Almeida, Paula Caetano, Sara Pires, Daniela Santos, Talita Martins, Ana Paula Viadanna, Naila Machado, Sandro Mayrink, Mauro Marques, Vinícius Silva, pelo apoio e torcida mesmo à distância, e à minha eterna mestre e tutora, Cléo Geovanini. Podem ter certeza, que cada um de vocês contribuiu grandemente para a idealização da pessoa que eu gostaria de ser e para a trajetória profissional que eu venho traçando.
Às pessoas que me acolheram em Piracicaba muitas vezes fazendo às vezes da família que estava longe, Leudiana Miranda, Juliane Gomes, Ana Carolina Correia, Beatriz Sahadi, Jaqueline Correia, Fernanda Gennaro, Luiza Fernandes, Graciele Dib, Paula Pafetti, Amanda Falcão, Márcia Fernandes, Thiago e Gabriela Bessa.
Aos meus pais, às minhas irmãs, aos meus sobrinhos, aos meus cunhados e à minha sogra, por terem compreendido todas as vezes que não pude estar presente em datas comemorativas e por todas as vezes que não pude dar a atenção devida porque estava em experimento.
À minha mãe, em especial, obrigada pela paciência e por não ter desistido de falar comigo, apesar da correria. Você é meu exemplo, minha heroína e meu grande porto seguro.
Ao meu melhor amigo, que por coincidência é meu noivo e grande incentivador pessoal e profissional, Wanderson. Gratidão por ter você ao meu lado, pelos ensinamentos diários, pelas discussões filosóficas, pelo seu otimismo e positividade e mais do que tudo, pelo seu amor.
“É melhor atirar-se à luta em busca de dias melhores, mesmo correndo o risco de perder tudo, do que permanecer estático, como os pobres de espírito, que não lutam, mas também não vencem, que não conhecem a dor da derrota, nem a glória de ressurgir dos escombros. Esses pobres de espírito, ao final de sua jornada na Terra não agradecem a Deus por terem vivido, mas desculpam-se perante Ele, por terem apenas passado pela vida.”
Células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs) têm sido reportadas em uma estreita relação espacial com vasos sanguíneos em diversos tecidos adultos humanos e, mais recentemente, com o feixe vásculo-nervoso (FVN) que acompanha arteríolas em modelo de incisivo murino. Tal localização parece ser importante nas funções que estas células exercem nos tecidos pós-natais, uma vez que estariam estrategicamente posicionadas para manter a homeostasia e o reparo dos mesmos. Neste sentido, o presente projeto teve como objetivo avaliar uma possível associação de células estromais mesenquimais indiferenciadas com os nichos perivascular e vásculo-nervoso na polpa dentária humana. Para tanto, foram selecionados 14 pacientes de ambos os gêneros, com idade entre 13 e 30 anos, e que tinham indicação de remoção de dois terceiros molares contralaterais hígidos e sem doença periodontal. Um dos dentes foi destinado à cultura de células: a polpa dentária foi coletada, digerida e plaqueada para determinação da frequência de células estromais mesenquimais (por meio do ensaio de CFU-F) e para caracterização das mesmas (por ensaios de diferenciação in vitro e imunofenotipagem). O outro dente foi fixado e destinado ao processamento histológico de rotina para imunomarcação de CD34, α-SMA e S100, a fim de localizar na polpa vasos sanguíneos em geral e arteríolas associadas a fibras/feixes nervosos. A frequência de CFU-F foi contada para cada paciente e os cortes histológicos foram digitalizados para determinação da densidade de área vascular (DAV) e densidade de área de arteríolas associadas a nervos (DAAN) no software Image-Pro Plus®. Aproximadamente 0,01 a 0,05% do total de células isoladas da polpa no presente estudo eram células estromais mesenquimais indiferenciadas, capazes de formar CFU-Fs em cultura. Este resultado foi confirmado pela habilidade desta pequena população de células da polpa, de todos os pacientes, se diferenciarem em pelo menos duas linhagens mesodérmicas, e pelo fenótipo antigênico das mesmas, com média de positividade maior que 95% para CD105, CD90 e CD73 e menor que 4% para marcadores de origem hematopoiética. Após a plotagem das médias de CFU-Fs vs. as médias de densidades de área para cada paciente, não houve correlação significativa entre as variáveis CFU-F e DAV (r= 0,188; p= 0,52), rejeitando-se a hipótese de que o nicho perivascular (e provavelmente pericitos) fosse a maior fonte de células indiferenciadas da polpa. No entanto, houve uma significativa associação entre as médias de CFU-F e DAAN (r= 0,62; p= 0,0179), aceitando-se a hipótese de que o nicho vásculo-nervoso (e provavelmente células ao redor de arteríolas associadas a nervos) originaria a maior parte das células mesenquimais indiferenciadas da polpa in vitro. Estes dados preliminares são a primeira evidência, na polpa dentária humana, de ligação indireta entre progenitores mesenquimais e arteríolas envolvidas por fibras/feixes neurais.
Palavras-chave: Polpa Dentária. Células mesenquimais estromais. Nicho de células-tronco. Vasos sanguíneos.
Multipotent mesenchymal stromal cells (MSCs) have been reported in a close spatial relationship with blood vessels in several human adult tissues and, more recently, with the neurovascular bundle (NVB) accompanying arterioles in mouse incisor model. This localization appears to be important for the functions these cells exert on postnatal tissues, once it would be strategically positioned to maintain homeostasis and repair, in case of lesions. In this sense, this project aimed to evaluate a possible association of undifferentiated mesenchymal stromal cells with perivascular and neurovascular niches in human dental pulp. Fourteen patients were selected of both genders, aged between 13 and 30, undergoing extraction of two healthy contralateral third molars, with no periodontal disease. One of the teeth was used for cell culture: the pulp was collected, digested and plated to determine the frequency of mesenchymal stromal cells (through CFU-F assay) and to characterize them (for in vitro differentiation assays and immunophenotyping). The other tooth was fixed and histologically processed for subsequent labeling by immunohistochemistry for CD34, α-SMA and S100, in order to localize blood vessels and arterioles associated with nerve fibers/bundles at the dental pulp. The frequency of CFU-F was counted for each patient and the histological slides were scanned to determine the vascular area density (DAV) and arterioles associated with nerves area density (DAAN) at Image-Pro Plus® software. In the present study, about 0.01 to 0.05% from the pulp-isolated total cells were undifferentiated mesenchymal stromal cells, capable of CFU-F formation under culture. This result was confirmed by the ability of these pulp cell small populations, from all patients, to differentiate into at least two mesodermal lineages, and for their antigenic phenotype with positivity mean greater than 95% for CD105, CD90 and CD73, and less than 4% for markers of hematopoietic origin. After plotting the data of CFU-F frequency vs. area densities for each patient, there was no significant correlation between the averages of CFU-F number and DAV (r= 0.188; p= 0.52), rejecting the hypothesis that perivascular niche (and probably pericytes) would be the major source of pulp undifferentiated cells. However, there was a significant association between the averages of DAAN and CFU-F (r= 0.62; p= 0.0179), accepting the hypothesis that the NVB (and probably the cells around arterioles associated to nerves) could originate most of pulp undifferentiated mesenchymal cells in vitro. These preliminary data are the first evidence, in human dental pulp, of indirect link between mesenchymal progenitors and arterioles associated with neural fibers/bundles.
2 REVISÃO DA LITERATURA... 15
2.1 Células-tronco 15 2.2 Células-tronco mesenquimais 16 2.3 Células estromais mesenquimais da polpa dentária humana 18 2.4 Origem e localização das MSCs na polpa dentária 20 2.4.1 Origem da crista neural craniana 22 2.4.2 Origem da medula óssea 23 2.4.3 Origem do nicho perivascular 23 2.4.4 Origem do nicho vásculo-nervoso 26 3 PROPOSIÇÃO... 28
4 MATERIAL E MÉTODOS... 29
4.1 Seleção de pacientes 29 4.2 Coleta das amostras 30 4.3 Isolamento de células da polpa dentária 31 4.4 Cultura de células da polpa dentária 32 4.5 Ensaio de CFU-F (Colony Forming Units - Fibroblast) 32 4.6 Ensaios de diferenciação in vitro 33 4.7 Citometria de fluxo 35 4.8 Imunohistoquímica 37 4.9 Análise da Imunohistoquímica 38 4.10 Análise Estatística 40 5 RESULTADOS... 41 5.1 Ensaio de CFU-F 41 5.2 Ensaios de diferenciação in vitro 45 5.3 Citometria de Fluxo 49 5.4 Análise Imunohistoquímica (qualitativa) 51 5.5 Análise Imunohistoquímica (quantitativa) 53 6 DISCUSSÃO... 56
7 CONCLUSÃO... 66
REFERÊNCIAS... 67
1 INTRODUÇÃO
Células-tronco mesenquimais (native Mesenchymal Stem Cells, nMSCs) residem em diversos órgãos e tecidos adultos, servindo como um reservatório de células indiferenciadas para manutenção da homeostasia (turn over celular fisiológico) e o reparo de injúrias (da Silva Meirelles et al., 2006). Os nichos de células-tronco adultas potencialmente oferecem uma fonte de células autólogas com propriedades imunomodulatórias, tróficas e regenerativas que podem ser úteis em uma ampla variedade de terapias celulares e na engenharia tecidual (da Silva Meirelles et al., 2016), ainda sob investigação. No entanto, embora as nMSCs tenham sido extensamente estudadas, a localização exata dessas células in vivo e quais seriam seus nichos não estão totalmente esclarecidos até o presente momento.
A maioria dos modelos utilizados para estudar as nMSCs são baseados nas suas propriedades in vitro (capacidade de se aderirem ao plástico, diferenciação multipotencial e expressão de determinados antígenos de superfície) sendo, portanto, oportuno chamá-las de células estromais mesenquimais multipotentes (Multipotent Mesenchymal Stromal Cells, MSCs), ao invés de nMSCs, para melhor descrevê-las em cultura (Dominici et al., 2006). Baseados principalmente nestes critérios in vitro, vários autores propuseram que o nicho in vivo das MSCs em diversos tecidos adultos seria o nicho perivascular e que os pericitos, em específico, seriam sua contrapartida in situ (da Silva Meirelles et al., 2006; Covas et al., 2008; da Silva Meirelles et al., 2008; Crisan et al., 2008; Corselli et al., 2012; da Silva Meirelles et al., 2015a; da Silva Meirelles et al., 2015b), inclusive na polpa dentária humana (Alliot-Licht et al., 2001; Shi e Gronthos, 2003; Téclès et al., 2005; Arthur et al., 2009; Karbanová et al., 2011; Martens et al., 2012; Machado et al., 2015).
Recentemente, com a incorporação da técnica de rastreamento de linhagem (lineage-tracing) para o estudo de células-tronco, tornou-se possível identificar toda a progênie de uma célula individual in vivo durante o desenvolvimento, a manutenção e o reparo tecidual (Kretzschmar e Watt, 2012). Utilizando-se desta tecnologia, diversos autores demonstraram em camundongos transgênicos outras origens não-pericíticas para as nMSCs da polpa dentária murina (Feng et al., 2011; Kaukua et al., 2014; Zhao et al., 2014), além da possível origem perivascular (Feng et al., 2011; Janebodin et al., 2011; Ishikawa et al., 2012; Pang et al., 2016). Dentre eles, Zhao et al. (2014) propuseram, em modelo de incisivo de camundongo, que a regulação e a localização das nMSCs estariam muito mais associadas ao feixe vásculo-nervoso
(FVN) do que à perivasculatura. De acordo com os autores, células localizadas ao redor de arteríolas acompanhadas por nervos e marcadas positivamente para o fator de transcrição Gli1, um possível marcador de MSCs in vivo até então desconhecido para tal função, originariam as células mesenquimais indiferenciadas da polpa.
A polpa dentária humana é um tecido conjuntivo frouxo altamente vascularizado e inervado (Nanci, 2013), sendo reconhecidamente uma fonte de células estromais mesenquimais multipotentes denominadas DPSCs (Dental Pulp Stem Cells) (Gronthos et al., 2000). Embora evidências sugiram que as MSCs da polpa estariam em estreita associação espacial com as paredes dos vasos sanguíneos, até o momento, nenhum estudo avaliou se existe alguma relação entre as DPSCs e arteríolas associadas a nervos. Considerando que incisivos de camundongos diferem dos dentes humanos à medida que os primeiros crescem continuamente ao longo da vida, é oportuno testar se a associação proposta por Zhao et al. (2014) se mantém na polpa dentária humana. Além do mais, identificar os diferentes nichos de células-tronco/progenitores no órgão dental é crucial para o entendimento dos mecanismos que suportam a sobrevivência das mesmas e a proposição de abordagens terapêuticas de sucesso.
Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese de que as MSCs da polpa dentária humana estariam associadas à vasos sanguíneos (nicho perivascular) e/ou arteríolas acompanhadas de feixes neurais (nicho vásculo-nervoso). Para tanto, baseado em um modelo proposto por da Silva Meirelles et al. (2009), verificamos se existe uma associação causal quantitativa entre o número de células mesenquimais indiferenciadas obtidas da polpa, com a densidade de área de vasos sanguíneos e/ou arteríolas associadas a nervos, utilizando terceiros molares contralaterais de um mesmo paciente. Estes resultados trouxeram evidência indireta para a hipótese de que as MSCs na polpa dentária humana estão fisicamente associadas não só às localizações perivasculares (e possivelmente pericitos), mas principalmente à localização periarterial associada a nervos (e possivelmente células Gli1+).
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Células-tronco
Células-tronco (Stem Cells, SCs), por definição, são aquelas capazes de autorrenovação ilimitada ou prolongada (habilidade de se dividir e originar células-tronco filhas com características idênticas) e que originam pelo menos um tipo celular em estágio de diferenciação mais avançado (Watt e Hogan, 2000). Baseado em sua origem e capacidade de diferenciação, as células-tronco recebem diversas classificações (Rodríguez-Lozano et al., 2012). As células-tronco embrionárias (Embryonic Stem Cells, ESCs), por exemplo, podem ser removidas na fase de zigoto a mórula inicial do embrião, sendo caracterizadas como totipotentes (capazes de originar todas as células do organismo). As ESCS ainda podem ser removidas a partir da massa celular interna do blastocisto em embriões pré-implantatórios, sendo caracterizadas como pluripotentes, isto é, capazes de formar todos os tecidos do corpo, com exceção dos anexos embrionários (Hynes et al., 2012).
Indivíduos adultos também possuem células-tronco, as células-tronco adultas ou pós-natais (Adult Stem Cells, ASCs), que funcionam como reservatórios para a manutenção, renovação e reparo dos tecidos nos quais se encontram (da Silva Meirelles et al., 2006). Em mamíferos, as ASCs normalmente permanecem em estado quiescente por longos períodos, ou seja, fora do ciclo celular e com metabolismo baixo, mas podem tornar-se ativas (entrando no ciclo celular novamente) frente a necessidades fisiológicas, doenças ou injúrias teciduais (Li e Clevers, 2010). Uma vez no ciclo celular, as ASCs podem se dividir simetricamente em duas tronco filhas idênticas (autorrenovação), quando a expansão do número de células-tronco é requerida (como durante o desenvolvimento ou após uma injúria); ou assimetricamente em uma célula-tronco filha inalterada (autorrenovação) e uma célula filha progenitora comprometida (diferenciação), garantindo simultaneamente a perpetuação das células-tronco e a geração de descendentes diferenciados (como durante a renovação fisiológica e o reparo de uma injúria) (Morrison e Kimble, 2006; Li e Clevers, 2010).
Embora não apresentem a mesma capacidade de diferenciação das embrionárias, as células-tronco adultas podem ser isoladas virtualmente de qualquer órgão ou tecido (da Silva Meirelles et al., 2006), sem as questões éticas e legais envolvidas com as ESCs (Chagastelles et al., 2010). Além do mais, a possibilidade de cultivar células-tronco pós-natais para uso
terapêutico posterior no mesmo paciente elimina dificuldades imunológicas de imunocompatibilidade (rejeição), bem como o risco de transmissão de patógenos (Fortier, 2005; Chagastelles et al., 2010; Hynes et al., 2012). Desta maneira, as células-tronco adultas estão emergindo como candidatas atraentes e práticas para uso na medicina regenerativa, seja em terapias celulares seja na engenharia tecidual (Fortier, 2005; Hynes et al., 2012).
2.2 Células-tronco mesenquimais
A primeira célula-tronco adulta reportada em humanos foi a hematopoiética (Hematopoietic Stem Cell, HSC) (Till e McCulloch, 1961). Localizada na medula óssea, esta célula origina as diferentes células do sangue, tanto as da linhagem mielóide (eritrócitos, megacariócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos) quanto as da linhagem linfóide (linfócitos T, linfócitos B e células natural killer) (revisado por Nardi e Alfonso, 1999). Além da HSC, outras tronco pós-natais já foram descritas. Exemplos incluem as células-tronco epiteliais presentes na epiderme e nas cristas intestinais, que originam as células das camadas do epitélio de revestimento (Slack, 2000); as células-tronco neurais no sistema nervoso central, que dão origem a neurônios e células da glia (McKay, 1997); as células satélites no músculo, que originam as fibras musculares (Charge e Rudnicki, 2004); e as células-tronco mesenquimais (Mesenchymal Stem Cells, MSCs), que também habitam a medula óssea.
Apesar do termo “células-tronco mesenquimais” ter sido utilizado pela primeira vez por Caplan (1991), as MSCs foram inicialmente isoladas a partir da medula óssea por Friedenstein et al. (1968) e descritas como células aderentes, fibroblastóides e clonogênicas, capazes de formar colônias de células-filhas idênticas em cultura que lembravam pequenos depósitos de osso ou cartilagem, mais tarde denominadas unidades formadoras de colônia de fibroblastos (Colony Forming Units - Fibroblasts, CFU-F) (Friedenstein et al., 1970). Estudos posteriores demonstraram que as células às quais Friedenstein et al. (1968) se referiam tinham capacidade de se diferenciar in vitro em linhagens mesodermais (osso, tendão, cartilagem, tecido adiposo, tecido muscular) (Caplan, 1991; Prockop, 1997; Pitenger et al., 1999), ectodermais (células da glia e neurônios)(Kopen et al., 1999; Wislet-Gendebien et al., 2005) e endodermais (hepatócitos) (Sato et al., 2005).
A capacidade de se diferenciar não apenas em linhagens mesodermais, levou a questionar a inapropriação do termo “mesenquimal” para descrevê-las (da Silva Meirelles et
al., 2006). Somado a isso, ficou claro que nem todas as células aderentes em cultura com capacidade de se proliferar e diferenciar in vitro, mantinham a habilidade de auto-renovação e diferenciação in vivo, questionando-se também o rótulo de “células-tronco” (Kfoury e Scadden, 2015). A natureza heterogênea e ambígua das chamadas MSCs aliada à falta de um marcador específico das mesmas, bem como às diferentes metodologias para seu cultivo e caracterização, utilizadas de maneira inconsistente entre os pesquisadores (Dominici et al., 2006; Kfoury e Scadden, 2015), levou a Sociedade Internacional de Terapia Celular (International Society for Cell Therapy, ISCT) a emitir um esclarecimento sobre sua nomenclatura.
De acordo com a ISCT, o termo “células mesenquimais estromais multipotentes” (Multipotent Mesenchymal Stromal Cells, MSCs) é a designação recomendada para as células isoladas de diferentes tecidos que têm sido frequentemente chamadas de “células-tronco mesenquimais” (Horwitz et al., 2005). Este último termo deve ser reservado apenas às células que cumprem critérios mais rigorosos de classificação, como auto-renovação e diferenciação in vivo (Horwitz et al., 2005). A nova nomenclatura manteve o acrônimo amplamente reconhecido “MSC” em uso (Horwitz et al., 2005). Nesta tese, para evitar confusão dos acrônimos, usaremos nMSCs para células-tronco mesenquimais nativas (no seu estado nativo in vivo) e MSCs para células estromais mesenquimais (células em cultura capazes de se diferenciar em pelo menos um fenótipo mesodermal maduro), assim como propôs da Silva Meirelles et al. (2016).
Logo em seguida, a ISCT propôs um critério mínimo para definir as MSCs humanas (Dominici et al., 2006), a fim de prover à comunidade científica uma padronização que permitisse comparações de células com características similares originadas de diferentes tecidos. De acordo com esse critério, qualquer população de células que satisfaça as seguintes características, independentemente do seu tecido de origem, é referida como MSC: (i) aderência ao plástico, sob condições de cultura padrão; (ii) capacidade de diferenciação multipotencial in vitro, demonstrada por coloração, para osteoblastos, adipócitos e condroblastos; (iii) fenótipo antigênico mensurado por citometria de fluxo, com mais de 95% da população celular expressando CD105, CD73, CD90 e menos de 2% da população expressando CD45 (marcador pan-leucocitário), CD34 (marcador de progenitores hematopoiéticos e células endoteliais), CD14 ou CD11b (marcadores de monócitos e macrófagos), CD79a ou CD19 (marcadores de células B) e antígeno leucocitário humano HLA-DR (marcador de MSCs estimuladas).
Subsequentemente à descoberta das MSCs na medula óssea humana, vários outros estudos as descreveram em inúmeros órgãos e tecidos adultos derivados de todas as três
camadas germinativas, como: medula óssea, osso trabecular (Noth et al., 2002), sangue (Kuznetsov et al., 2001), sinóvia (De Bari et al., 2001), cartilagem (Hiraoka et al., 2006), tecido adiposo (Zuk et al., 2001), músculo (Nesti et al., 2008), periósteo (Zannettino et al., 2008), tonsilas (Janjanin et al., 2008), timo (Rzhaninova et al., 2005), fígado (Sato et al., 2005), pele (Shih et al., 2005), folículo piloso (Cotsarelis et al., 1990), polpa dentária (Gronthos et al., 2000). Além dos tecidos adultos, as MSCs também foram descritas em tecidos perinatais que normalmente são descartados logo após o parto, tais como segmentos do cordão umbilical (vasos, geléia de Wharton e sangue do cordão) (McElreavey et al. 1991; Lee et al., 2004; Sarugaser et al., 2005), âmnio ou membrana amniótica, córion e placenta (Yen et al., 2005). A imensa variedade de fontes para isolamento das MSCs fez dessas células um dos tipos mais estudados de células-tronco adultas, aumentando exponencialmente o número de publicações a respeito (da Silva Meirelles et al., 2008).
2.3 Células estromais mesenquimais da polpa dentária humana
Populações de células estromais mesenquimais derivadas de tecidos dentais estão dentre as muitas MSCs que residem em tecidos especializados que foram isoladas e caracterizadas. O primeiro tipo de célula estromal mesenquimal dentária foi isolado a partir da polpa de dentes permanentes humanos e nomeado “Dental Pulp Stem Cells” (DPSCs) (Gronthos et al., 2000). Em seguida, MSCs dos seguintes tecidos dentais foram descritas: de polpa de dentes decíduos esfoliados ou “Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth” (SHED) (Miura et al., 2003), do ligamento periodontal ou “PerioDontal Ligament Stem Cells” (PDLSCs) (Seo et al., 2004), do folículo dental que circunda o germe dentário em desenvolvimento até a erupção ou “Dental Follicle Precursor Cells” (DFPCs) (Morsczeck et al., 2005) e da papila apical de dentes permanentes em desenvolvimento ou “Stem Cells from Apical Papila” (SCAP) (Sonoyama et al., 2006; Sonoyama et al., 2008). Todas essas populações de células pós-natais de origem dental possuem qualidades de células estromais mesenquimais multipotentes (MSCs). Entretanto, a relação de desenvolvimento precisa entre essas diferentes populações de células-tronco ainda não está clara (Huang G et al., 2009).
Dentre as células estromais mesenquimais derivadas de tecidos dentais, as DPSCs têm sido o foco de diversos estudos, talvez por compartilhar de algumas características interessantes à medicina regenerativa como (i) fácil acesso ao sítio de coleta dessas células com baixíssima morbidade (método não invasivo) (d’Aquino et al., 2008; Yan et al., 2011); (ii)
MSCs autólogas podem ser obtidas a partir da coleta da polpa dentária de terceiros molares amplamente extraídos e rotineiramente descartados (Liu et al., 2006; d’Aquino et al., 2008; La Noce et al., 2014); (iii) como o terceiro molar é o último dente a se desenvolver em humanos (começa aos 6 anos de idade), encontra-se em um estágio de desenvolvimento precoce, fornecendo uma quantidade de tecido pulpar suficiente para isolamento de DPSCs (Liu et al., 2006; d’Aquino et al., 2008); (iv) mantêm suas propriedades após criopreservação por longos períodos (Papaccio et al., 2006; Zhang et al., 2006a; d’Aquino et al., 2008; La Noce et al., 2014), podendo ser utilizadas para estabelecimento de criobancos (Graziano et al., 2007); (v) demonstram plasticidade para se diferenciarem in vitro nas linhagens odonto/osteogênica, adipogênica, condrogênica, miogênica, neurogênica, em células epiteliais da córnea, em células de melanoma e até mesmo em células-tronco de pluripotência induzida (iPS cells) (d’Aquino et al., 2008; Yan et al., 2011); (vi) compartilham de propriedades imunoprivilegiadas (inibem a resposta imune) e anti-inflamatórias favoráveis ao alotransplante (d’Aquino et al., 2008; Leprince et al., 2012; Wada et al., 2013) e já relatadas para MSCs em geral (da Silva Meirelles, 2016); (vii) apresentam interatividade com biomateriais como matriz colágena, hidroxiapatita (Hidroxyapatite, HA), fosfato tricálcio (TriCalcium Phosphate, TCP), quitosana, biocoral, titânio e os polímeros biodegradáveis poli(ácido lático) (PLA) e poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA) (Zhang et al., 2006b; d’Aquino et al., 2008; La Noce et al., 2014).
Devido à sua versatilidade, as DPSCs já foram testadas in vivo em diversos modelos animais, apresentando resultados positivos na melhora do reparo pós-infarto do miocárdio em ratos (Gandia et al., 2008); no tratamento de distrofia muscular em cachorros (Kerkis et al., 2008); na reconstrução do epitélio da córnea em coelhos com deficiência de células-tronco límbicas (Monteiro et al., 2009; Gomes et al., 2010); na regeneração de tecido ósseo (d’Aquino et al., 2008), associadas ou não a biomateriais e fatores de crescimento, em defeitos ósseos nos maxilares de cães (Yamada et al., 2010; Ito et al., 2011; Yamada et al., 2011); no tratamento de injúria da medula espinhal em ratos (Sakai et al., 2012); na melhora de lesões cerebrais hipóxico-isquêmicas em ratos (Fang et al., 2013); na melhora da polineuropatia diabética em ratos (Hata et al., 2015); na cicatrização de tecido lesionado da bexiga por cistite induzida quimicamente em ratos (Hirose et al., 2015); na regeneração do complexo dentina-polpa após transplante de DPSCs, associadas ou não a materiais bioativos, em camundongos (Gronthos et al., 2000; Gronthos et al., 2002; Huang et al., 2010), ratos (Yu et al., 2006) e cães (Wang et al., 2013); na regeneração do complexo periodontal associada a microscaffolds em camundongos (Lee et al., 2014); e até mesmo na regeneração completa de dentes utilizando uma construção
de germe dentário-like (odontoblastos e osteoblastos diferenciados a partir de DPSCs + células epiteliais da gengiva + scaffold bioativo) em mini porcos (Yang et al., 2016).
Embora estes e outros dados obtidos por experimentação animal forneçam clara evidência do potencial das DPSCs para uso em terapias celulares e engenharia tecidual, ensaios clínicos utilizando essas células não têm sido amplamente relatados (La Noce et al., 2014). A primeira aplicação clínica de DPSCs foi realizada por D’Aquino et al. (2009b) ao enxertar o biocomplexo composto por células-tronco/progenitores da polpa humana autológa + scaffold de esponja colágena em defeitos ósseos na mandíbula, restituindo o tecido ósseo perdido por completo. Atualmente, existem apenas 12 ensaios clínicos em andamento utilizando DPSCs listados no banco de dados de estudos clínicos humanos conduzidos em todo o mundo (ClinicalTrials.gov) contra 623 ensaios utilizando diferentes MSCs.
O desenvolvimento da medicina regenerativa de maneira segura e eficaz exige uma profunda compreensão da biologia das nMSCs da polpa, como base essencial para o planejamento e execução de terapias clínicas e regenerativas bem-sucedidas (Huang G et al, 2009). Sendo assim, é importante que sejam feitos mais avanços no entendimento da biologia das DPSCs no que tange, por exemplo, à sua origem embriológica, localização espacial, nichos nos quais estão inseridas, potencial de diferenciação, subpopulações, dentre outros, a fim de melhor explorar a capacidade destas células para tratamento de diversas condições clínicas.
2.4 Origem e localização das MSCs na polpa dentária
A polpa dentária é um tecido conjuntivo frouxo de origem ectomesenquimal, desenvolvido a partir da papila dental. No início do desenvolvimento embrionário, células da crista neural craniana (Cranial Neural Crest, CNC) migram para o primeiro arco faríngeo e participam da diferenciação do mesênquima dental para a formação da papila e folículo dentais (Thesleff, 2003). Ao longo do desenvolvimento, a polpa dentária torna-se povoada por células de origem tanto da crista neural que migraram, quanto por células não-neurais intrínsecas, provavelmente derivadas do mesênquima do primeiro arco (Chai et al., 2000). Desta maneira, a polpa dentária madura compreende uma população mista de células descendentes da CNC e do mesênquima (Sloan e Smith, 2007).
Morfologicamente, a polpa dentária adulta é constituída por quatro camadas: (1) uma camada de odontoblastos na periferia da polpa; (2) uma estreita zona acelular de Weil,
logo abaixo dos odontoblastos, apresentando densidade celular reduzida; (3) uma zona rica em células, adjacente à zona de Weil, com alta densidade celular; e (4) uma região central rica em vasos sanguíneos, fibroblastos e feixes neurais. As principais células que povoam a polpa são odontoblastos, fibroblastos, células ectomesenquimais indiferenciadas (células-tronco/progenitores), células de defesa (macrófagos, linfócitos e células dendríticas), células nervosas, células vasculares (endoteliais) e perivasculares (pericitos, células musculares lisas e fibroblastos perivasculares) (Nanci, 2013).
Os odontoblastos são células pós-mitóticas formadoras da dentina que possuem uma capacidade de reparo e regeneração limitada. Em resposta a estímulos leves do ambiente (atrição, trauma oclusal ou cárie inicial), odontoblastos pré-existentes aumentam sua atividade secretora para sintetizar uma matriz dentinária terciária reacional. Por outro lado, fortes estímulos nocivos (cáries profundas ou exposição pulpar) levam à destruição dos odontoblastos existentes próximos à injúria. Uma vez que os odontoblastos vizinhos são incapazes de se dividir, células-tronco ou células progenitoras são recrutadas, migram até a região lesionada e se diferenciam em odontoblasts-like que formarão a dentina terciária reparadora (Balic et al., 2010).
A origem e a localização das células-tronco/progenitores mesenquimais na polpa dentária, assim como em outros tecidos, ainda é controversa. Acredita-se que essas células residam em áreas específicas chamadas nichos (Scadden et al., 2006). Nichos consistem de localizações anatômicas particulares que hospedam células-tronco quiescentes distribuídas por todo corpo, permitindo sua autorreplicação (Mitsiadis et al., 2011). O microambiente específico do nicho regula como as populações de células-tronco participam na manutenção, reparo e regeneração do tecido, de acordo com suas necessidades. Sinais específicos derivados do nicho permitem às células-tronco se manterem vivas e mudarem seu número e destino (autorrenovação e diferenciação) (Scadden et al., 2006; Djouad et al., 2009). Moléculas sinalizadoras solúveis como Wnt, Notch, Fator de crescimento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor, FGF) e proteínas Hedgehog são importantes reguladores parácrinos da função das células-tronco, com capacidade de induzir sua proliferação e diferenciação (Mitsiadis et al., 2007).
Expressão aumentada de Notch, após injúria pulpar em molares de ratos, foi observada no estroma pulpar, na camada odontoblástica e subodontoblástica e em regiões perivasculares (Lovschall et al., 2005). Expressão da proteína Sonic Hedgehog (Shh) associada
a nervos sensoriais próximos de arteríolas foi observada em polpa de incisivos murinos tanto em situações de homeostasia quanto injúria (Zhao et al., 2014). A expressão diferencial de Notch e Shh em regiões distintas da polpa dentária, sugere que a mesma pode abrigar diferentes nichos de células-tronco com capacidades e origens diversas (Lovschall et al., 2005).
Coincidentemente, diferenças nas capacidades de proliferação e diferenciação in vitro e in vivo das MSCs isoladas da polpa dentária foram descritas em relatos anteriores (Gronthos et al., 2000; Gronthos et al., 2002; Huang et al., 2006; d`Aquino et al., 2007) indicando heterogeneidade dentro das populações de DPSC. Essa heterogeneidade, por sua vez, pode ser atribuída à influência do ambiente local no qual as nMSCs da polpa estão inseridas no tecido adulto (Janebodin et al., 2011), refletindo a importância do nicho no estabelecimento do fenótipo e comportamento das células-tronco (Fuchs et al., 2004) às quais ele interage in situ.
Ao longo das passagens em culturas de longo prazo, por exemplo, células-tronco adultas podem perder sua natureza, incluindo a habilidade de autorrenovação e a capacidade de multidiferenciação, principalmente devido às condições de cultura in vitro (como a composição do meio rotineiramente utilizado) não conseguirem simular por completo o nicho in situ dessas células-tronco (Yan et al., 2011). Pensando em terapias celulares e regenerativas, a etapa de expansão das células-tronco in vitro é essencial para obter o número de células adequado ao transplante.
Assim, identificar possíveis nichos de células-tronco/progenitores no órgão dental é essencial para o entendimento dos mecanismos que suportam a sobrevivência e a diferenciação das DPSCs, bem como propôr abordagens terapêuticas que levem em conta a biomimetização in vitro do nicho in vivo dessas células. Três possíveis origens para as as nMSCs da polpa dentária foram revisadas por Yan et al., (2011): a partir da crista neural craniana, a partir da medula óssea e a partir do nicho perivascular. Além dessas, discutiremos o recém proposto nicho vásculo-nervoso como fonte de MSCs da polpa em modelo animal.
2.4.1 Origem da crista neural craniana (CNC)
A primeira hipótese é de que as nMSCs da polpa são derivadas da crista neural craniana. Do ponto de vista da biologia do desenvolvimento, as células da crista neural originam a maioria dos tecidos orais e dentais, incluindo a polpa dental (Chai et al., 2000). Assim, é sensato assumir que as DPSCs in vivo são derivadas do ectomesênquima da CNC (d’Aquino et
al., 2009a). Sasaki et al. (2008) demonstraram que as DPSCs contêm subpopulações primitivas de células-tronco da crista neural, incluindo células precursoras positivas para Nestin, neurônios positivos para Tuj e células da glia positivas para S100, todos marcadores relacionados à CNC. Waddington et al. (2009) também demonstraram uma subpopulação de progenitores dentro das DPSCs marcada para LANGFR (Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor), outro marcador de células da CNC, que também expressaram STRO-1, vimentina, CD105 e Notch2, marcadores de células tronco/progenitoras.
2.4.2 Origem da medula óssea
A segunda hipótese é de que as nMSCs da polpa migrariam a partir da medula óssea, via vasos sanguíneos e se acomodariam na polpa dentária, pelo menos em situações de injúria. Evidências foram encontradas de que as DPSCs têm propriedades muito similares às MSCs de medula óssea in vitro (Gronthos et al., 2000; Shi e Gronthos et al., 2003). Análises de microarray de cDNA demonstraram que ambos os tipos celulares compartilham um perfil de expressão gênica similar, como marcadores associados ao endotélio, osso e fibroblastos (Shi et al., 2001).
Posteriormente, Zhou et al. (2010) mostraram, em modelo animal, que MSCs da medula óssea de camundongo transgênico para a proteína fluorescente verde (Green Fluorescent Protein, GFP), transplantadas para camundongos irradiados podiam ser encontradas na camada de odontoblastos expressando proteínas dentinárias específicas. Os autores concluíram que as células-tronco/progenitoras da medula óssea também se diferenciariam em odontoblastos em situações de homeostasia. No entanto, este resultado levanta um questionamento em relação à utilidade de se avaliar propriedades das células-tronco por meio de transplante, uma vez que este modelo é mais similar à situação de reparo de injúria do que homeostasia, e não é um processo fisiológico (Zhao et al., 2014).
2.4.3 Origem do nicho perivascular
A terceira hipótese e a mais aceita dentre todas, embora ainda não completamente comprovada, é de que as nMSC da polpa se originariam do nicho perivascular, em particular dos pericitos. Anatomicamente, pericitos são células perivasculares que residem na superfície
abluminal de células endoteliais mantendo contato direto com as mesmas em capilares e microvasos (da Silva Meirelles et al., 2016). Fenotipicamente, pericitos expressam o proteoglicano de condroitin-sulfato NG2 (Neural/Glial antigen 2), a proteína actina de músculo liso alfa (alpha-Smooth Muscular Actin, α-SMA), a glicoproteína transmembrana CD146 (Cluster of Differentiation 146); e o receptor beta do fator de crescimento derivado de plaquetas (Platelet-Derived Growth Factor Receptor beta, PDGF-Rβ) (Crisan et al., 2008), embora esses não sejam os únicos marcadores descritos na literatura.
Classicamente, os pericitos possuem as seguintes funções (i) regulam a contratilidade dos vasos sanguíneos aos quais estão associados e, por consequência, sua pressão sanguínea (Chen et al., 2009); (ii) controlam a proliferação das células endoteliais e, consequentemente, a angiogênese (Chen et al., 2009); (iii) fazem parte da barreira hematoencefálica (Blood-Brain Barrier, BBB) comunicando-se ativamente com outras células da unidade neurovascular como as células endoteliais, os astrócitos e os neurônios (Dore-Duffy e Cleary, 2011). Adicionalmente a essas funções, evidências crescentes indicam que os pericitos originariam as células-tronco mesenquimais em todo o organismo (da Silva Meirelles et al., 2006; da Silva Meirelles et al., 2008; da Silva Meirelles et al., 2009; Crisan et al., 2008; Zannettino et al., 2008; Chen et al., 2009; Crisan et al., 2009; Corselli et al., 2010; Corselli et al., 2012; da Silva Meirelles et al., 2015a; da Silva Meirelles et al., 2015b; da Silva Meirelles et al., 2016), especialmente devido à ampla similaridade apresentada por ambas as células quanto ao fenótipo e o potencial de diferenciação.
Achados em diferentes tecidos, demonstram o potencial de diferenciação de pericitos nos seguintes tipos celulares: osteoblastos, condroblastos, fibroblastos, adipócitos (Nehls e Drenckhahn, 1993; Lin et al., 2008; Zannettino et al., 2008), células miogênicas (Crisan et al., 2008) e odontoblastos (Alliot-Licht et al., 2001; Shi e Gronthos, 2003; Feng et al., 2011). A origem a partir dos pericitos explicaria a ampla distribuição de MSCs no organismo adulto, uma vez que todos tecidos compartilham uma característica em comum: hospedam vasos sanguíneos (da Silva Meirelles et al., 2006; da Silva Meirelles et al., 2008).
Da Silva Meirelles et al. (2006) propuseram um modelo no qual os pericitos são fonte de células-tronco importantes na manutenção e reparo tecidual. Neste modelo, os pericitos funcionam como um reservatório de células indiferenciadas para suprir as demandas celulares dos tecidos cujos quais eles pertencem, adquirindo características fenotípicas locais. Quando necessário, sinais específicos do microambiente coordenam a transição de pericitos para
progenitores comprometidos e, por fim, para células com fenótipo maduro que irão se integrar ao tecido adjacente. Esse processo ocorre naturalmente, mas no caso de injúria tecidual, processos alternativos podem ser ativados. Neste caso, pericitos podem ser mobilizados diretamente para o tecido sem a transição para a célula progenitora.
O modelo proposto por Meirelles et al. (2006) não exclui a possibilidade de existência de outras células-tronco específicas do tecido (não derivadas de pericitos). Inclusive, de acordo com Feng et al. (2011), a contribuição de MSCs derivadas de pericitos e não derivadas de pericitos para a diferenciação celular em qualquer tecido depende da sua vascularidade e de sua cinética de crescimento e/ou reparo. Em tecidos com baixa vascularidade, como na cartilagem articular, a contribuição de pericitos para a formação de MSCs será menor do que em tecidos com maior suprimento sanguíneo.
A polpa dentária é um tecido altamente vascularizado e diversos estudos apontam que o nicho perivascular seria a principal fonte de MSCs na polpa humana (Alliot-Licht et al., 2001; Shi e Gronthos, 2003; Téclès et al., 2005; Arthur et al., 2009; Karbanová et al., 2011; Martens et al., 2012; Janebodin et al., 2013; Machado et al., 2015) e na polpa murina (Lovschall et al., 2005; Lovschall et al., 2007; Feng et al., 2009; Janebodin et al., 2011; Ishikawa et al., 2012; Janebodin et al., 2013; Pang et al., 2015).
Para exemplificar alguns dos estudos clássicos na polpa humana, Shi e Gronthos (2003) demonstraram colocalização in situ dos marcadores STRO-1 (progenitores mesenquimais) e CD146 (progenitores de origem perivascular) restrita às paredes dos vasos sanguíneos na polpa dentária saudável. Os autores também verificaram que DPSCs STRO-1+ expressam marcadores vasculares como CD146, α-SMA (actina de músculo liso) e 3G5 (pericito), sugerindo que as MSCs de polpa possam ter uma origem perivascular. Téclès et al., (2005), utilizando um modelo organotípico de cultura de dente ex vivo, monitorou a captação de bromodeoxyuridina (BrdU) por células progenitoras proliferativas em resposta à injúria provocada por capeamento pulpar. Os autores observaram que células marcadas por BrdU migravam de regiões perivasculares até o sítio da injúria, possivelmente originando odontoblastos-like e contribuindo com a dentinogênese reparativa.
A relação entre DPSCs com o nicho perivascular na polpa dentária humana foi demonstrada por estudos in vitro, in situ e ex vivo, o que impede a confirmação absoluta de sua origem como é possível fazer pelo rastreamento de linhagens em camundongos transgênicos. Somado à ausência de um marcador específico de nMSCs que sinalizasse sua localização exata
in situ, bem como permitisse sua separação por Fluorescent-Activated Cell Sorting (FACS) ou Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) para cultivo in vitro, mais estudos sobre esse nicho na polpa dentária humana utilizando outros modelos ainda são necessários.
2.4.4 Origem do nicho vásculo-nervoso
Recentemente foi proposta a hipótese, em camundongos, de que as nMSCs da polpa se originariam do nicho vásculo-nervoso, especialmente de células ao redor de arteríolas marcadas positivamente para Gli1, um fator de transcrição ativado por sonic hedgehog (Shh) que controla a proliferação e diferenciação celular (Hardcastle et al., 1998). Zhao et al. (2014), utilizando modelo de incisivo murino, propuseram um papel inédito para os nervos na regulação de células-tronco. De acordo com os autores, nervos sensoriais do feixe vásculo-nervoso (FVN) secretam a proteína Shh que ativaria a expressão de Gli1 nas células periarteriais, mas não em vênulas e capilares. Estas células periarteriais seriam a grande fonte de MSCs na polpa de camundongos, participando tanto da homeostase quanto do reparo de injúrias in vivo e dando origem à toda população de MSCs in vitro, inclusive à subpopulação derivada de pericitos.
O papel dos nervos na regulação do nicho de células-tronco ainda não é compreendido (Zhao et al., 2014), embora alguns relatos na literatura já descrevam uma relação. Nervos sensoriais que inervam o folículo piloso parecem regular a resposta de um grupo de células-tronco durante o reparo frente a injúria (Brownell et al., 2011). A inervação simpática também parece regular a saída de células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (Katayama et al., 2006) e o seu aparecimento durante a embriogênese (Fitch et al., 2012). Nervos adrenérgicos se associam e regulam MSCs da medula óssea positivas para Nestin (Méndez-Ferrer et al., 2010). Nervos parassimpáticos são essenciais para a função das células progenitoras epiteliais durante a formação das glândulas salivares e para o reparo das mesmas depois de adultas (Knox et al., 2010).
Nos tecidos adultos, os nervos distribuem-se ao longo das artérias e, juntamente com o tecido conjuntivo frouxo ao redor, formam o FVN, uma estrutura anatômica comum encontrada em diversos órgãos (Zhao et al., 2014). Essa proximidade dos nervos com as artérias provavelmente explica porque apenas células que circundam as arteríolas teriam Gli1 ativado, um efetor transcricional que responde especificamente à via de sinalização de Shh (Hardcastle et al., 1998), no caso provida pelos nervos. A associação de células Gli1 apenas com arteríolas
acompanhadas de nervos, mas não com outras arteríolas é consistente com o papel essencial que os nervos teriam no nicho de MSCs da polpa de incisivos murinos (Zhao et al., 2014). A comunicação entre nervos sensoriais e arteríolas regula a formação do FVN durante o desenvolvimento (Lawson et al., 2002) e os achados expostos por Zhao et al. (2014) indicam que essa comunicação continua na vida adulta.
Zhao et al., (2014) também relataram de maneira inédita um novo papel para Gli1 como marcador de células-tronco mesenquimais in vivo. Os autores ressaltam que os marcadores clássicos de MSCs, muitos deles propostos pela ISCT, não seriam apropriados para identificar as MSCs in vivo, embora in vitro essas células os expressariam. Os marcadores clássicos, ao contrário, identificam pericitos ao redor de toda a vasculatura in vivo. Talvez por isso todos os estudos até então apontavam os pericitos como as células fonte das MSCs. Entretanto, mesmo a população de pericitos seria derivada das células Gli1+ e sua contribuição com as MSCs estariam relacionadas muitos mais com o reparo de injúrias (16% dos odontoblastos seriam derivados de NG2+) do que com a homeostasia (2% dos odontoblastos seriam derivados de células NG2+).
Embora o FVN seja uma estrutura anatômica comum ao longo do corpo, assim como a vasculatura, mais estudos são necessários para determinar se o FVN também funciona como um nicho de MSCs em outros órgãos. Há de se salientar ainda que todas essas considerações foram feitas em modelo de incisivo de camundongo que difere dos dentes humanos à medida que crescem continuamente. Sendo assim, é necessário testar se essa hipótese também vale para a polpa dentária humana, assim como para outros tecidos. De qualquer forma, os resultados inéditos achados por Zhao et al. (2014) coletivamente tem um impacto importante no campo de estudos com células-tronco que pode vir a mudar o consenso sobre o nicho perivascular.
3 PROPOSIÇÃO
3.1 Objetivo Geral
Avaliar uma possível associação de células estromais mesenquimais indiferenciadas com os nichos perivascular e vásculo-nervoso na polpa dentária humana.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar in vitro o potencial de células isoladas da polpa como MSCs: capacidade de formar colônias, extensão da multipotencialidade e fenotipagem das células baseada na presença ou ausência de marcadores de superfície específicos; Verificar se há correlação positiva entre a frequência de células estromais
mesenquimais indiferenciadas da polpa dentária com a densidade de vasos sanguíneos e/ou a densidade de arteríolas associadas a feixes neurais.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção de pacientes
Foram selecionados 14 pacientes, de ambos os gêneros, com faixa etária entre 13 e 30 anos e que tinham indicação ortodôntica e/ou profilática de exodontia de dois terceiros molares contralaterais (2 superiores ou 2 inferiores), extraídos no mesmo dia ou não. Os dentes deveriam estar hígidos e não acometidos por doença periodontal ou pericoronarite, e se apresentarem de maneira similar entre si quanto ao posicionamento na cavidade oral (incluso, semi-incluso ou erupcionado), a rizogênese (completa ou incompleta) e as dimensões mésio-distais (diferença ≤ 10% determinadas por radiografia panorâmica e no próprio dente após extraído). Na Tabela 01 estão descritas características dos doadores e dos respectivos dentes coletados.
Tabela 01 - Caracterização dos dentes coletados de diferentes doadores.
Paciente Gênero Idade Dentes Extraídos Nível de erupção Rizogênese
1 F 13 Superiores Incluso Incompleta
2 F 13 Superiores Incluso Incompleta
3 F 15 Inferiores Incluso Incompleta
4 F 19 Superiores Semi-incluso Incompleta
5 F 19 Inferiores Incluso Incompleta
6 F 19 Superiores Incluso Incompleta
7 F 19 Inferiores Semi-incluso Incompleta
8 M 19 Superiores Erupcionado Completa
9 M 19 Inferiores Semi-incluso Completa
10 F 20 Inferiores Incluso Incompleta
11 F 20 Superiores Incluso Incompleta
12 F 20 Inferiores Incluso Incompleta
13 M 22 Superiores Semi-incluso Completa
14 F 30 Superiores Incluso Completa
Todos os procedimentos foram realizados sob aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de Piracicaba FOP-UNICAMP (protocolo nº 090/2013, ver ANEXO 1) e após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) pelo paciente.
4.2 Coleta das amostras
Os terceiros molares foram coletados nas clínicas de graduação e especialização da FOP/Unicamp e em algumas clínicas particulares de Piracicaba/SP. A exodontia foi realizada de modo simples, a fim de evitar danos aos dentes para que os mesmos permanecessem íntegros. Imediatamente após a extração dos dois molares contralaterais do mesmo paciente, os dentes foram imersos em meio de coleta a 4°C composto por meio α-MEM (α-Modification of Eagle´s Medium – GIBCO), 2mM L-glutamina, suplementado com 5% de antibiótico (Penicilina 10.000UI/mL e Estreptomicina 10mg/mL - GIBCO) e 3% de antifúngico (Anfotericina B 25µg/mL - GIBCO).
Em seguida, as amostras foram transportadas à sala de cirurgia do Departamento de Morfologia para limpeza em gaze embebida com soro fisiológico e remoção de tecidos moles remanescentes com auxílio de curetas Gracey. No caso de dentes com rizogênese incompleta, a papila apical foi removida com alveolótomo (QUINELATO), a fim de evitar a contaminação da polpa dental com este tecido (no dente que seria destinado à cultura de células) e também facilitar a difusão do fixador pela polpa (no dente que seria destinado ao processamento histológico). Já no caso de rizogênese completa, o dente teve a extremidade de seu ápice radicular cortado com disco diamantado estéril e caneta de baixa rotação, sob irrigação constante, com o intuito de facilitar a remoção da polpa radicular no dente da cultura de células e, novamente, facilitar a fixação do tecido pulpar no dente que seria processado.
Após os ajustes para melhor fixação da polpa, o dente destinado ao processamento histológico foi imerso em solução de paraformaldeído a 4% por 24 horas à temperatura ambiente. Subsequentemente, o elemento dentário foi lavado duas vezes com PBS (Phosphate Buffered Saline) 1x e desgastado com broca carbide e ponta diamantada em alta rotação, com irrigação, para remoção do esmalte. Em seguida, foi colocado em solução descalcificante de ácido etilenodiamino tetra-acético (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, EDTA) 4,13% tamponado, sob agitação constante, por aproximadamente 90 dias. O EDTA foi trocado 3x por semana.
No dente cuja polpa seria destinada à cultura de células, foi feito um sulco horizontal ao redor da superfície radicular cerca de 2mm apicalmente à junção amelocementária e com ~2mm de profundidade. Para tanto, foi utilizado disco de carborundum estéril e caneta de baixa rotação, sob irrigação constante com soro fisiológico estéril, a fim de evitar danos térmicos à polpa. Em seguida, uma fratura foi realizada na região do sulco utilizando-se alavanca reta e fórceps devidamente esterilizados (modificado de Tjäderhane et al., 1998). Os fragmentos obtidos (coroa e raiz) foram imediatamente imersos em meio de transferência à 37ºC, composto por meio α-MEM 2mM L-glutamina suplementado com 3% de antibiótico e 1% de antifúngico, e transportados ao laboratório de cultura de células.
4.3 Isolamento de células da polpa dentária
O protocolo de isolamento das células foi baseado no de Liu et al., (2006) e Akiyama et al., (2012), mas com modificações. Brevemente, no interior do fluxo laminar, a polpa foi removida da câmara pulpar e dos canais radiculares com auxílio de um escavador pequeno (Figura 01A) e uma sonda reta, respectivamente. Em seguida, o tecido pulpar foi picotado em fragmentos menores sobre uma placa de vidro estéril com auxílio de uma lâmina de bisturi (Figura 01B), a fim de facilitar a dissociação de suas células da matriz extracelular. Durante todo o processo a polpa permaneceu em condições úmidas, o que é importante para manter a viabilidade celular.
Figura 01 - Etapas do isolamento de células da polpa dentária. (A) Remoção do tecido pulpar com auxílio de escavador. (B) Fragmentos da polpa dental após picote com lâmina de bisturi.
A dissociação foi feita por digestão enzimática com uma solução de colagenase tipo I (3 mg/mL) (SIGMA-ALDRICH) e dispase tipo II (4 mg/mL) (SIGMA-ALDRICH) por 1:30h a 37°C, pipetando a cada 30min para digerir completamente o tecido. A inativação da atividade enzimática se deu com a adição de meio de plaqueamento a 37ºC, composto por meio α-MEM 2mM L-glutamina suplementado com 15% de FBS (Fetal Bovine Serum - SIGMA-ALDRICH), 3% de antibiótico e 1% de antifúngico. A suspensão celular de “single cells” foi obtida pela passagem destas células em filtro de 70 µm (MILLIPORE), para eliminar restos de tecido que não foram digeridos, seguida de centrifugação a 3000 rpm por 3 min à temperatura ambiente.
4.4 Cultura de células da polpa dentária
O pellet resultante foi ressuspendido em meio de plaqueamento, homogeneizado e o número de células contado pelo método de exclusão com azul de tripan 0,4%. Uma fração dessa suspensão de células foi plaqueada para a expansão da cultura (placa petri de 60cm2 -
TPP) e a outra fração para o ensaio de CFU-F (placa de 6 poços - TPP), sendo mantidas em estufa umidificadora a 37°C e 5% CO2. Após 3 dias em cultura, as placas foram lavadas duas
vezes com solução salina balanceada de Hanks (Hank’s Balanced Salt Solution Ca2+ e Mg2+
free, HBSS - SIGMA-ALDRICH) para remoção das células não aderentes. Em seguida, o meio de plaqueamento foi trocado pelo mesmo volume de meio de expansão (α-MEM 2mM L-glutamina, 15% de FBS, 1% de antibiótico e 0,1% de antifúngico) a 37ºC. Meio novo era substituído a cada 2-3 dias.
As placas destinadas à expansão celular permaneceram em cultura até que o centro das colônias formadas atingisse uma densidade celular alta (pós-confluência) (Akiyama et al., 2012), quando então a subcultura foi realizada com solução de tripsina/EDTA em HBSS (2,5g/L de tripsina e 0,3g/L de EDTA). Após a primeira passagem, o meio de expansão foi trocado pelo meio base composto por α-MEM 2mM L-glutamina, 10% de FBS, 1% de antibiótico e 0,1% de antifúngico. A cultura foi mantida nestas condições até a passagem P.3, na qual todas as células foram congeladas. Com exceção do ensaio de CFU-F, todos os outros experimentos de caracterização celular (diferenciações in vitro e imunofenotipagem) foram realizados na quinta passagem (Akiyama et al., 2012).
4.5 Ensaio de CFU-F (Colony Forming Units - Fibroblast)
O ensaio de CFU-F baseia-se na capacidade de uma única célula tronco/progenitora originar uma colônia de células fibroblastóides idênticas (clones) em baixa densidade de plaqueamento (Bianco et al., 2006). Assim, a frequência de células indiferenciadas da polpa recém-extraída foi estimada em placa de 6 poços por meio do plaqueamento de 6x104 células/poço, em triplicata, por 14 dias em cultura. Após esse período, as células foram lavadas 2x com HBSS, fixadas com paraformoldeído a 4% por 40min e coradas com Azul de toluidina 0,1% por 5min à temperatura ambiente. Os poços foram então lavados com água destilada por 2x para remover o excesso do corante e colocados na capela para a água evaporar.
A contagem das colônias formadas foi realizada de duas maneiras em lupa estereoscópica (ZEISS), sendo considerados CFU-Fs: (i) agregados maiores que 50 células (Gronthos et al., 2000) e (ii) agregados > 2mm em diâmetro (Huang A et al., 2009) (Figura 02). A eficiência de formação de colônias in vitro (Colony Forming Efficiency, CFE) foi expressa em porcentagem como o número total de colônias formadas (CFU-Fs) dividido pelo número de células plaqueadas vezes 100 (Huang A et al., 2009).
4.6 Ensaios de diferenciação in vitro
Células obtidas de cada paciente, na quinta passagem, foram submetidas a ensaios de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro (baseados em Vater et al., 2011), em placas de 24 poços. Brevemente, as células foram plaqueadas em triplicata nas seguintes densidades e volumes de meio base: 0,5x104/cm2 em 0,5mL (osteogênica), 2x104/cm2 em 0,5mL (adipogênica) e 1,7x107/mL em uma gotícula de 25µL (4,25x105 células) no centro do poço (condrogênica – sistema de cultura em micromassa). A indução da diferenciação em cada linhagem foi realizada quando as culturas atingiram a confluência de ~70% (após 24h), ~90% (após 24h) e pós-confluência (após 3h), respectivamente.
Neste momento, o meio base foi trocado por 0,5mL dos respectivos meios de indução com suplementos específicos para cada linhagem (Tabela 02), além da suplementação comum de 1% de antibiótico e 0,1% de antifúngico. Com exceção da diferenciação condrogênica, que foi induzida por kit comercial, todos os suplementos foram esterilizados por filtração em membrana de 0,2µm. O meio de indução sem suplementos específicos foi utilizado como controle negativo para todas as linhagens.
Tabela 02 - Meios de indução para diferenciação em linhagens específicas.
Linhagem Meio FBS Suplementos Específicos
Osteogênica α-MEM
2mM L-glutamina 10%
50μg/ml ácido ascórbico 2-fosfato†, 10mM β-glicerofosfato†, 10nM dexametasona† Adipogênica α-MEM 2mM L-glutamina 2% Indução: 0,5mM isobutilmetilxantina†, 200µM indometacina†, 5µM rosiglitazona†, 1µM dexametasona†, 10µM insulina† Manutenção: 10µM insulina† Condrogênica StemPro® Chondrocyte Differentiation Basal Medium‡
__ StemPro® chondrogenesis supplement‡
† SIGMA-ALDRICH, ‡GIBCO
As diferenciações foram mantidas em cultura por 21 dias (osteogênica e adipogênica) e 14 dias (condrogênica), sendo os respectivos meios de indução e controle trocados cuidadosamente a cada 3 dias. Na diferenciação adipogênica, em específico, o meio era trocado alternando ciclos de indução e manutenção. Após 3 ciclos, as células permaneceram por mais 3 dias em meio de manutenção. Ao final de cada período de indução, os poços foram lavados com HBSS, fixados com paraformaldeído 4% por 30min à temperatura ambiente, lavados novamente com água destilada e corados de acordo com a diferenciação.
Para a diferenciação osteogênica, foi utilizado vermelho de alizarina S (SIGMA-ALDRICH) 2% pH 4,2 por 20min, de modo que depósitos de cálcio na matriz óssea mineralizada pudessem ser detectados (Figura 02A). Para a diferenciação adipogênica, os poços foram previamente lavados com isopropanol 60% por 5min e, só então, corados por 15min com óleo vermelho O (SIGMA-ALDRICH) (solução de 60% óleo vermelho 0,3% para 40% de água destilada), a fim de evidenciar gotículas lipídicas no citoplasma (Figura 02B). A diferenciação condrogênica foi evidenciada com azul de alcian 1% pH 2,5 (SIGMA-ALDRICH) por 30min, com intuito de detectar glicosaminoglicanas carboxiladas da cartilagem, como ácido hialurônico (Figura 02C).
Figura 02 - Poços de indução das diferenciações osteogênica (A), adipogênica (B) e condrogênica (C) corados com vermelho de alizarina S (depósitos de cálcio), óleo vermelho O (depósitos de gordura) e azul de alcian (ácido hialurônico), respectivamente. Notar que a diferenciação condrogênica foi realizada por sistema de cultura em micromassa (Zhang et al., 2010).
Com intuito de remover o excesso de corante, as placas das diferenciações osteogênica e adipogênica foram lavadas 4x vezes com água destilada, e as placas da diferenciação condrogênica 3x com ácido clorídrico 0,1N. Estas últimas ainda foram lavadas 1x com água destilada para neutralizar a acidez. Durante todo o processo de coloração, as soluções foram cuidadosamente adicionadas e removidas para evitar que as monocamadas de células descolassem do fundo do poço. Todas as placas foram deixadas secando para que pudessem ser fotografas em microscópio invertido em objetiva de 10x. Os experimentos de diferenciação foram feitos pelo menos 3x com protocolos diferentes até chegarmos em um protocolo reproduzível e confiável para cada linhagem.
4.7 Citometria de fluxo
A análise por citometria de fluxo foi utilizada para caracterizar as células isoladas da polpa em relação ao seu fenótipo antigênico (imunofenotipagem). Seguindo o painel estipulado pela ISCT (Dominici et al., 2006) para classificar uma célula como estromal mesenquimal multipotente (MSC), foram utilizados marcadores positivos e negativos para MSCs. Além destes, marcadores relacionados à uma possível origem perivascular também foram testados (Tabela 03).
Resumidamente, células da polpa dentária de cada paciente, na quinta passagem (~90 de confluência), foram tripsinizadas, centrifugadas e ressuspendidas em HBSS gelado
contendo 10% FBS (staining buffer). As amostras foram então contadas e ajustadas para a concentração de 5x105 células/tubo em 5mL de staining buffer. Todo o processo de imunomarcação daqui em diante foi realizado a 4°C. Assim, os tubos foram centrifugados a 3000rpm por 5min sob refrigeração e o bloqueio de sítios inespecíficos realizado com soro humano a 10% em HBSS por 30min.
As células foram lavadas com staining buffer e novamente centrifugadas para posterior incubação com os respectivos anticorpos monoclonais conjugados a diferentes fluorocromos (Tabela 03) por 30min, em ausência de luz. No caso do anticorpo primário não-conjugado CD146, após a primeira incubação de 30min com o mesmo, as células foram lavadas e posteriormente incubadas com anticorpo secundário policlonal anti-IgG Alexa Fluor 488 (MOLECULAR PROBES) por 30min adicionais no escuro. Em seguida, as células foram lavadas novamente com staining buffer, centrifugadas e fixadas em paraformoldeído a 1% em HBSS. Os tubos foram então armazenados a 4ºC sob proteção da luz até o momento da aquisição no citômetro de fluxo.
Tabela 03 - Anticorpos monoclonais anti-humanos utilizados para avaliação do fenótipo antigênico.
Marcadores Anticorpo Clone Diluição Fabricante
Típicos de MSCs CD105-FITC CD90-FITC CD73-FITC 266 5E10 AD2 1:20 1:40 1:40 BD Pharmingen Biolegend Biolegend Negativos para MSCs CD45-APC CD34-PerCP-Cy5.5 CD19-FITC CD14-FITC HLA-DR-FITC H130 8G12 HIB19 HCD14 L243 1:40 1:5 1:50 1:50 1:50 Biolegend BD Biosciences Biolegend Biolegend Biolegend
Origem Perivascular CD146 purificado NG2-PE P1H12 9227 1:200 1:20 Biolegend BD Pharmingen Fluorocromos: Isotiocianato de fluoresceína (FITC), aloficocianina (APC), PerCP-Cy5.5, ficoeritrina (PE), Alexa Fluor 647.
Como controle negativo da reação, células de cada paciente foram preparadas como descrito acima, porém não foram marcadas com anticorpos (Park et al., 2013). Um total de
