Giovana Anceski Bataglion
DETERMINAÇÃO DE BIOMARCADORES GEOQUÍMICOS EM AMBIENTE ANÓXICO DA LAGOA DA CONCEIÇÃO (SC)
Florianópolis-SC 2012
DETERMINAÇÃO DE BIOMARCADORES GEOQUÍMICOS EM AMBIENTE ANÓXICO DA LAGOA DA CONCEIÇÃO (SC)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Santa Catarina como um dos requisitos para obtenção do título de MESTRE EM QUÍMICA: área de concentração: QUÍMICA ANALÍTICA.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira
Florianópolis-SC 2012
DETERMINAÇÃO DE BIOMARCADORES GEOQUÍMICOS EM AMBIENTE ANÓXICO DA LAGOA DA CONCEIÇÃO (SC)
Esta dissertação foi julgada e aprovada para a obtenção do título de Mestre em Química no Programa de Pós-Graduação em
Química da Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianópolis, 07 de fevereiro de 2012.
Prof. Dr. Almir Spinelli Coordenador do Programa
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira Orientador
Profa. Dra. Cristiane Luisa Jost
Prof. Dr. Miguel Soriano Balparda Caro
Acima de tudo a Deus, por me iluminar e abençoar. Obrigado pelas oportunidades de cada dia.
Aos meus pais, Angela e Olmes, e a minha tia Lourdes por sempre acreditarem em mim. Obrigado pelo amor, confiança e encorajamento.
À minha irmã Giandra, por ser minha companheira de todos os dias. Obrigado por me aturar!
Ao Daniel, por todo apoio e companheirismo durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao professor Madureira, pela aceitação no grupo, pela orientação e pela boa convivência.
Aos amigos e colegas do laboratório...Paulo, pelas ótimas discussões sobre química; Morgana, por ter impulsionado minha entrada no grupo; Kalya, pelas “diquinhas”; Patrícia, pelo carinho e dedicação; Vânia, pela ótima convivência; Martinho, por toda colaboração dada neste trabalho e em mais uma porção de coisas; Alessandra, nem tenho como agradecer tanta disponibilidade e prestatividade...E a todos por aturarem meu humor oscilante!!!
Aos companheiros do lab 214, especialmente Luis Otávio e Vanessa, obrigado pelos momentos de descontração na sala do café e pelas ótimas festas.
À Maria Luisa, pelo auxílio durante as coletas.
avaliados a fim de determinar as fontes de matéria orgânica (MO) em um ambiente anóxico da Lagoa da Conceição. Um testemunho e três amostras de sedimentos superficiais (0-5 cm) foram coletados e analisados, após fracionamento e derivatização quando necessário, por cromatografia a gás com detector por ionização em chama (GC-FID) e cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (GC/MS). Biomarcadores geoquímicos como alcanos, álcoois, ácidos graxos e esteróis foram detectados nas amostras de sedimentos superficiais e testemunho. Em ambos os casos, a razão C/N associada à distribuição dos homólogos para cada classe de biomarcadores permitiu inferir que a MO sedimentar é constituída de uma mistura de origens, como: plantas terrestres, detritos de bactérias e, principalmente, algas. A análise de agrupamento hierárquico permitiu agrupar as frações do perfil sedimentar quanto ao efeito do processo de eutrofização e a mudança das fontes de MO nos diversos intervalos de profundidade do testemunho. Para as amostras de sedimentos superficiais, a análise de agrupamento hierárquico possibilitou avaliar a dissimilaridade entre amostras provenientes de coletas realizadas em períodos diferentes. Além da origem da MO sedimentar, a alteração diagenética mediada por bactérias foi avaliada por meio das razões de esteróis saturados/insaturados. Os resultados obtidos neste trabalho estão de acordo com a condição redox e com os parâmetros físico-químicos apresentados pelo ambiente nos períodos de coleta.
evaluated to determine the sources of organic matter (OM) in an anoxic environment region of Conceição Lagoon (SC). A core and three samples of surface sediments (0-5 cm) were collected and analyzed, after fractionation and derivatization when necessary, by GC-FID and GC/MS. Geochemical biomarkers as hydrocarbons, alkanols, fatty acids and sterols were detected in the surface sediment samples and along the core. In both cases, the C/N ratio associated with the distribution of homologs of each class of biomarkers allowed us to infer that the sedimentary OM consists of a mixture of sources, such as terrestrial plants, bacterial debris and algae. Based on the hierarchical analysis the effect of the process of eutrophication and changing sources of OM in the various depth intervals of the core were evaluated. For samples of surface sediments, the hierarchical cluster analysis allowed us to evaluate the dissimilarity between samples collected from different periods. In addition to the origin of the sedimentary OM, the bacterially mediated diagenetic alteration was assessed by means of the ratios of sterols saturated/unsaturated. The results of this study are consistent with redox conditions and physico-chemical parameters provided by the environment in the collection periods.
Modificado de Sigee, 2005. ... 3 Figura 2. Reciclagem da matéria orgânica na coluna d’água e na interface água-sedimento. DOM: matéria orgânica dissolvida; POM: matéria orgânica particulada. Retirado de Harvey, 2006. ... 9 Figura 3. Esquema representando a formação dos isoprenóides pristano e fitano em condições óxicas e anóxicas, respectivamente. Modificado de Peters; Walters; Moldowan, 2005. ... 14 Figura 4. Estrutura dos principais esteróis e sua respectiva nomenclatura e simbologia comumente utilizada. Modificado de Killops; Killops, 2005... 15 Figura 5. Mapa geográfico da Lagoa da Conceição (SC) apresentando os subsistemas Central, Norte e Sul. Retirado de: http://maps.google.com, em 10 de janeiro de 2012. ... 22 Figura 6. Localização geográfica da Lagoa da Conceição (SC) ilustrando o ponto de coleta. ... 29 Figura 7. Fluxograma do processo de extração e fracionamento dos lipídios. ... 32 Figura 8. Principais modos de fragmentação de esteróis silanizados. ... 37 Figura 9. Variação da composição elementar de CHNS com a profundidade do perfil sedimentar. ... 41 Figura 10. Espectro UV/Vis de feopigmentos extraídos de algumas secções do perfil sedimentar. ... 42 Figura 11. Variação da concentração de clorofila-a e COT para algumas secções do perfil sedimentar. ... 44
Figura 12. Razões C/N, C/S e H/C para os diversos intervalos de profundidade do perfil sedimentar. ... 45 Figura 13. Cromatograma de íons extraídos m/z 57 representativo da série de n-alcanos presentes na F1 (intervalo de profundidade: 33-36 cm). Cn indica o número de carbono dos n-alcanos. Os símbolos * e o
correspondem aos alcanos ramificados pristano e fitano, respectivamente. ... 48 Figura 14. Variação da concentração de alcanos totais, C17-C19 e C27
-C31 em relação à profundidade do perfil sedimentar. ... 49
Figura 15. Variação da concentração de alcanos C17-C19 e RTAALC em
relação à profundidade do perfil sedimentar. ... 50 Figura 16. Cromatograma de íons extraídos m/z 97 representativo da série de n-álcoois presentes na F3 (intervalo de profundiade 33-36 cm). Cn indica o número de carbono dos n-álcoois. ... 53
Figura 17. Variação da concentração de n-álcoois totais, C12-C16 e C24
-C28 para o perfil sedimentar. ... 54
Figura 18. Variação da concentração de n-alcoóis C12-C16 e RTAOH
para o perfil sedimentar... 55 Figura 19. Cromatograma de íons extraídos m/z 117 representativo da série de álcoois secundários presentes na F3 (intervalo de profundidade: 33-36 cm). Cn indica o número de carbono dos álcoois
secundários. ... 56 Figura 20. Variação da concentração de álcoois secundários C15-C19 e
primários C12-C16 para os diversos intervalos de profundidade do perfil
sedimentar. ... 57 Figura 21. Cromatograma de íons totais representativo da série de esteróis presentes na F3 (intervalo de profundidade: 33-36 cm). Cn
Figura 22. Proporção de esteróis com 27, 28, 29 e 30 átomos de carbono em relação à profundidade do perfil sedimentar. ... 60 Figura 23. Cromatograma de íons extraídos m/z 143 representativo da série de ácidos graxos esterificados correspondentes a F4 (intervalo de profundidade: 30-33 cm). Cn indica o número de carbono dos ácidos. Os símbolos * e o correspondem aos ácidos C15 e C17
ramificados, respectivamente. ... 62 Figura 24. Dendrograma obtido da análise de agrupamento hierárquico utilizando como variáveis os biomarcadores geoquímicos analisados. Método de agrupamento: método de Ward. ... 64 Figura 25. Variação da concentração de alcanos, álcoois, esteróis e ácidos graxos nas amostras C1, C2 e C3. ... 67 Figura 26. Valores de RTAALC e RTAOH para as amostras C1, C2 e C3.
... 68 Figura 27. Proporção de esteróis C27, C28, C29 e C30 nas amostras C1,
C2 e C3. ... 69 Figura 28. Dendrograma obtido da análise de agrupamento hierárquico para as amostras C1, C2 e C3. Método de agrupamento: método de Ward. ... 70
oxigenação e biofacies resultantes.Modificado de Rullköter, 2006. .. 5 Tabela 2. Lista de reagentes, solventes e padrões utilizados no desenvolvimento do trabalho ... 30 Tabela 3. Condições cromatográficas para a análise da F1, F3 e F4 36 Tabela 4. Fragmentos m/z utilizados para a identificação de alguns esteróis ... 37 Tabela 5. Parâmetros físico-químicos medidos in situ na Lagoa da Conceição em março de 2010 ... 39 Tabela 6. Resultados da análise elementar de CHNS para as amostras C1, C2 e C3 ... 66 Tabela 7. Razão ∆0/∆5 calculada para os esteróis C27, C28 e C29 ... 72
∆0/∆5 : Razão esterol saturado/insaturado
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária C/N: Razão carbono/nitrogênio
C/S: Razão carbono/enxofre C1: Coleta 1
C2: Coleta 2 C3: Coleta 3
CG/MS: Cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas; do inglês Gas chromatography with mass spectrometry
CG-FID: Cromatografia a gás com detector por ionização em chama; do inglês: Gas chromatography with flame ionization detector
Cn: Composto orgânico com n átomos de carbono
Cn∆x: Esterol com n átomos de carbono e insaturação na posição x
COT: Carbono Orgânico Total F1: Fração 1
F2: Fração 2 F3: Fração 3 F4: Fração 4
FAME: Ácidos Graxos Metil Esterificados H/C: Razão hidrogênio/carbono
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
IPC: Índice Preferencial de Carbono
m/z: Razão massa/carga MO: Matéria Orgânica
MOD: Matéria Orgânica Dissolvida MOP: Matéria Orgânica Particulada OD: Oxigênio Dissolvido
RTA: Razão Terrestre Aquático
RTAAC: Razão Terrestre Aquático para Ácidos
RTAALC: Razão Terrestre Aquático para Alcanos
2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA ... 3
2.1 Lagunas: ecossistemas aquáticos ... 3
2.2 Anoxia: estratificação vs processo de eutrofização ... 4
2.3 Matéria orgânica (MO): Produção, preservação e degradação ... 7
2.4 Biomarcadores Geoquímicos...11
2.4.1 Alcanos ... 12
2.4.2 Álcoois e esteróis ... 14
2.4.3 Ácidos graxos ... 16
2.5 Índices relacionados aos biomarcadores ... 17
2.6 Análise de biomarcadores: técnicas cromatográficas ... 20
2.7 Lagoa da Conceição ... 21 3 OBJETIVOS ... 27 3.1 Objetivo Geral ... 27 3.2 Objetivos específicos ... 27 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 29 4.1 Amostragem... 29 4.2 Reagentes... 30 4.3 Análise elementar de CHNS ... 31 4.4 Análise de feopigmentos ... 31
4.5 Extração e fracionamento dos lipídios ... 32 4.5.1 Extração ... 32 4.5.2 Fracionamento ... 33 4.5.3 Derivatização ... 34 4.5.4 Equipamentos ... 35 4.5.5 Fração 1 (F1) ... 36 4.5.6 Fração 3 (F3) ... 36 4.5.7 Fração 4 (F4) ... 38 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 39 5.1 Parâmetros físico-químicos... 39 5.2 Análise elementar de carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre (CHNS) ... 40 5.3 Biomarcadores geoquímicos: testemunho sedimentar ... 47 5.3.1 Hidrocarbonetos alifáticos ... 47 5.3.2 Álcoois ... 52 5.3.3 Esteróis ... 58 5.3.4 Ácidos graxos ... 62 5.3.5 Análise de agrupamento hierárquico: análise de Cluster 64 5.4 Biomarcadores geoquímicos: Amostras de sedimentos superficiais ... 66
5.4.1 Análise de agrupamento hierárquico: ánalise de Cluster 70 5.5 Avaliação da diagênese de esteróis ... 71
1 INTRODUÇÃO
A Lagoa da Conceição é um dos principais pontos turísticos da Ilha de Santa Catarina e, muito deste potencial turístico se deve às suas belezas naturais. Ela representa um patrimônio nacional ecológico costeiro, rodeada por diversas unidades de conservação. Três subsistemas constituem a Lagoa da Conceição, sendo conhecidos como: Lagoa Central, do Norte e do Sul. O subsistema central caracteriza-se por apresentar estratificação salina e anoxia durante o ano inteiro. A circulação da água influenciada, principalmente, pela ação dos ventos e das variações dos ciclos de marés não alcança toda a coluna d’água e agrava a situação anóxica.
Outro aspecto importante relativo à laguna é o processo de eutrofização devido à atividade humana. Este processo tem causado alterações na comunidade fito e zooplanctônica, além da proliferação de macroalgas bênticas, da perda da biodiversidade e, ainda, tem contribuído para a diminuição das concentrações de oxigênio dissolvido.
Anoxia, eutrofização e processos relacionados à produtividade aquática podem acarretar mudanças nos processos geoquímicos que ocorrem na Lagoa da Conceição. A abundância e a identidade de determinados biomarcadores geoquímicos, avaliadas por técnicas cromatográficas, permitem avaliar as mudanças de aporte de matéria orgânica. Assim, a produtividade primária, secundária e o aporte terrestre em um ambiente permanecem “registradas” na forma de matéria orgânica sedimentar. Desta forma, é de extrema importância avaliar as consequências destes processos na matéria orgânica sedimentar do subsistema central da Lagoa Central.
2 REVISÃO BIBLIOGRAFICA 2.1 Lagunas: ecossistemas aquáticos
Ecossistemas como lagunas estão localizados na interface continente-oceano e, por isto, são complexos e altamente produtivos. No Brasil, em geral, usa-se o termo lagoa para se referir a todos os corpos d’água costeiros e mesmo interiores, independente de sua origem. No entanto, a maioria das lagoas costeiras são, na realidade, lagunas (Esteves, 1998). Por definição, laguna é um corpo de águas rasas e calmas, que mantém em geral uma comunicação restrita com o mar, apresentando uma salinidade que pode variar desde quase doce até hipersalina (IBGE, 2004). Uma laguna pode ser dividida em regiões que apresentam comunidades características como apresentado na Figura 1.
Figura 1. Regiões de uma laguna e suas principais comunidades. Modificado de Sigee,
2005.
A região da laguna que está em contato com o ecossistema terrestre adjacente é conhecida como zona litorânea. Folhas provenientes da vegetação circundante desempenham importante
papel na formação de detritos nesta região (Silva; Madureira, 2012). A comunidade planctônica desenvolve-se na região fótica da zona central e é constituída, principalmente, pelo fitoplâncton (algas uni/pluricelulares e algumas bactérias) e zooplâncton (invertebrados). A região profunda da laguna é habitada pela comunidade bentônica (bactérias, fungos e protozoários) que apresenta diversidade e densidade populacional dependente da disponibilidade de nutrientes e oxigênio dissolvido na água (Sigee, 2005).
Os ecossistemas aquáticos, como lagunas, apresentam algumas características que os tornam peculiares, tais como:
Alta capacidade de solubilização de compostos orgânicos e inorgânicos, possibilitando o desenvolvimento de diversos organismos por toda superfície do corpo;
Gradientes verticais de luz, nutrientes, temperatura, salinidade e gases dissolvidos (O2 e CO2).
A distribuição desigual destas variáveis no ambiente aquático tem grandes consequências na distribuição dos organismos e na composição da matéria orgânica dissolvida e sedimentada (Esteves, 1998).
2.2 Anoxia: estratificação vs processo de eutrofização
Ambientes aquáticos podem ser classificados em relação à concentração de oxigênio dissolvido na água, conforme apresentado na Tabela 1. Como resultados dos níveis de oxigenação, têm-se biofacies governadas por diferentes processos metabólicos (Rullkötter, 2006).
Tabela 1. Terminologia para ambientes em diferentes regimes de oxigenação e
biofacies resultantes.Modificado de Rullköter, 2006.
Oxigênio (mg L-1) Ambiente Biofacies
8,0-2,0 Óxico Aeróbico
2,0-0,2 Disóxico Disaeróbico
0,2-0,0 Subóxico Quasianaeróbico
0,0 Anóxico Anaeróbico
A ausência de oxigênio dissolvido em um ambiente aquático pode ser associada à estratificação vertical, resultante da diferença de densidade das camadas de água em relação à temperatura e/ou salinidade, como também, ao processo de eutrofização (Killops; Killops, 2005).
Em lagunas que apresentam estratificação, as camadas de água superficial e subjacente são denominadas epilímnio e hipolímnio, respectivamente (Lampert; Sommer, 2007). No epilímnio, devido à ação solar, existe maior produção de matéria orgânica e oxigênio dissolvido devido à atividade fotossintética resultando em um ambiente aeróbico. Nessa região, há também contribuição de oxigênio proveniente da atmosfera. No hipolímnio, a ação de bactérias sobre a matéria orgânica biodegradável consome grande quantidade de oxigênio, podendo tornar esta região anaeróbica (Manaham, 2001).
Essa situação de anoxia é agravada quando no corpo aquático há pouca circulação, não havendo, na camada inferior, oxigênio dissolvido suficiente para manter o metabolismo da comunidade sem causar déficit. Estratificação acentuada e anoxia são comuns em lagunas costeiras onde a influência dos ventos não é suficiente para misturar as camadas de águas de diferentes densidades (Esteves, 1998).
O processo de eutrofização é definido como o enriquecimento de águas naturais com nutrientes inorgânicos resultando em um aumento da produção de algas e macrófitas. Muitos ambientes aquáticos são naturalmente eutróficos. Entretanto, o termo “eutrofização” tem sido relacionado à atividade humana, onde a introdução artificial de nutrientes (principalmente N e P) tem resultado na alteração da comunidade aquática e da qualidade da água (Sigee, 2005).
O processo de eutrofização em ambientes costeiros pode ser observado biológica e quimicamente. A eutrofização é acompanhada pela proliferação de algas como Enteromorpha e Ulva (algas oportunistas). Quimicamente, observam-se altas concentrações de nutrientes inorgânicos dissolvidos, assim como menor oxigenação da água associado à liberação de ácido sulfídrico (H2S) (Fonseca; Braga,
2006). Segundo Jonge, Elliott e Orive (2002), o aporte de nutrientes em corpos aquáticos associado ao enriquecimento de matéria orgânica estimula o desenvolvimento de organismos decompositores, como bactérias, que consomem oxigênio provocando anoxia. Desta forma, as zonas costeiras têm se apresentado como heterotróficas, considerando que uma maior quantidade de matéria orgânica tem sido acumulada e degradada ao invés de ser localmente produzida (Fonseca, 2006).
Sendo a situação de anoxia resultado de uma estratificação natural do ambiente e/ou do processo de eutrofização antrópico, não é algo trivial atribuir qual a causa mais efetiva. Mesmo em ambientes como Chesapeake (EUA), onde eventos anóxicos ocorrem desde
1930, não se sabe ao certo qual é o fator determinante para a ausência de oxigênio dissolvido (Zimmerman; Canuel, 2000).
2.3 Matéria orgânica (MO): Produção, preservação e degradação
Nos ambientes aquáticos, a MO está presente como moléculas dissolvidas, colóides e partículas (Perdue; Ritchie, 2003). A matéria orgânica dissolvida (MOD) é definida como a porção de material orgânico que passa através de um filtro de porosidade menor que 0,7 µm. Esta porção abrange desde pequenas moléculas a substâncias húmicas poliméricas, normalmente em uma faixa de 1 a 100 kDa (Aitkenhead-Peterson; McDowell; Neff, 2003). De um modo geral, os principais constituintes da MO são carboidratos (~40 %), proteínas (~35 %) e lipídios (~16 %) (Harvey, 2006).
O processo de fotossíntese,conversão de dióxido de carbono e água em compostos orgânicos através da energia luminosa, é a principal forma de produção de MO (produção primária) (Lampert; Sommer, 2007). Plantas vasculares, macrófitas aquáticas, algas macroscópicas, algas unicelulares (fitoplâncton) e cianobactérias são alguns organismos fotossintetizantes (Killops; Killops, 2005). Estes organismos possuem, em sua composição, pigmentos como carotenoides e clorofila tipo a, b e c. A clorofila-a é o pigmento de maior importância e é utilizada para obter uma estimativa da biomassa fitoplanctônica (Wright; Jeffrey, 2006).
A MOD é classificada de acordo com a origem do carbono orgânico, sendo considerada como autóctone, quando produzida através das inter-relações entre a produção primária, fotossíntese e metabolismo dos organismos aquáticos (Baker et al., 2008), ou
alóctone quando oriunda da atmosfera, erosão costeira, rios e vegetação circundante (Aitkenhead-Peterson; McDowell; Neff, 2003). A MO oriunda de efluentes e descartes industriais é classificada como antropogênica (Baker et al., 2008).
A luminosidade e a disponibilidade de nutrientes são os principais fatores que controlam a produção primária. Entretanto, a temperatura e a salinidade também afetam a diversidade de espécies fotossintetizantes e a produção primária autóctone. Certos ambientes, em que ocorre a mistura de água salgada com água doce, podem apresentar maior diversidade de espécies, no entanto, uma minoria pode tolerar grande variação de salinidade (Killops; Killops, 2005).
A matéria orgânica produzida pelo fitoplâncton é alterada ainda na coluna d’água devido ao zooplâncton, bactérias e/ou oxidação química (Schefuß et al., 2006). Além disso, esses organismos heterotróficos excretam outros compostos resultando em um reciclo da matéria orgânica, como pode ser observado na Figura 2 (Harvey, 2006).
Figura 2. Reciclagem da matéria orgânica na coluna d’água e na interface
água-sedimento. DOM: matéria orgânica dissolvida; POM: matéria orgânica particulada. Retirado de Harvey, 2006.
Partículas de argila e outros minerais adsorvem parte da matéria orgânica dissolvida carreando-a para o fundo. A quantidade de matéria orgânica que atinge o sedimento é proporcional à produção do fitoplâncton e inversamente proporcional à profundidade da coluna d’água através da qual a mesma é transportada e exposta à mineralização, processo este que representa a conversão de compostos orgânicos em inorgânicos (NO3-, NH4+,
SO42- e PO43-) (Meyers, 1997).
Em geoquímica orgânica, o termo diagênese refere-se aos processos que alteram os produtos da produção primária através da coluna d’água e nos estágios iniciais de sedimentação sob condições de temperatura e pressão relativamente baixas (Killops; Killops, 2005). Um exemplo de diagênese ocorre nas moléculas de clorofilas,
que podem perder suas ramificações ou mesmo o átomo central de magnésio, sendo neste caso denominadas como feofitinas (Chikaraishi et al., 2007). Durante a diagênese, a matéria orgânica dissolvida e/ou depositada no sedimento pode ser degradada aeróbica ou anaerobicamente. Quando há oxigênio na superfície e/ou interstícios do sedimento, a decomposição dá-se pela comunidade bentônica de detritívoros e/ou bactérias heterotróficas aeróbicas (Souza et al., 2011). Em meio anóxico, a mineralização ocorre devido à atividade de bactérias heterotróficas anaeróbicas estritas ou facultativas (Killops; Killops, 2005). As bactérias anaeróbicas heterotróficas podem ser desnitrificantes, sulfato redutoras ou metanogênicas (Sigee, 2005). A degradação em meio anóxico ocorre em duas etapas consecutivas, sendo:
Quebra das moléculas orgânicas em substratos menores (processo hidrolítico ou fermentativo);
Mineralização a partir dos substratos menores (Sigee, 2005). Alguns autores têm considerado que a decomposição ocorre rapidamente em meio óxico e que em meio anóxico a matéria orgânica é mais bem preservada (Sun; Wakeham; Lee, 1997; Sun; Wakeham, 1998; Wakeham et al., 2007). Desta forma, ecossistemas aquáticos que apresentam águas estagnadas com baixa concentração ou ausência de oxigênio por longos períodos, normalmente, apresentam-se como acumuladores de grandes quantidades de matéria orgânica (Esteves, 1998).
Wakeham et al. (1997), ao estudarem a alteração diagenética da matéria orgânica, concluíram que:
a quantidade de compostos provenientes do fitoplâncton diminuiu ao longo da coluna d’água enquanto que os compostos provenientes de organismos heterotróficos aumentaram;
compostos provenientes de bactérias são mais abundantes próximo ao sedimento;
ocorre a preservação de certos compostos remanescentes de bactérias, fitoplâncton e plantas vasculares no sedimento, mesmo em profundidades maiores.
Portanto, dependendo da especificidade destes compostos, é possível obter informações dos tipos de organismos que contribuíram para a MO sedimentar e estimar suas contribuições relativas (Killops; Killops, 2005).
2.4 Biomarcadores Geoquímicos
Compostos que têm a característica de se manter preservado após o processo diagenético e apresentam sua estrutura química ligada intrinsecamente a um precursor biológico são denominados biomarcadores geoquímicos. Outros termos como fósseis químicos, marcadores moleculares ou indicadores orgânicos são utilizados no mesmo sentido (Simoneit, 2004).
Os biomarcadores geoquímicos atuam como importante ferramenta na caracterização de sedimentos marinhos (Azevedo; Gonçalves; Silva, 2007) e também em estudos sobre produtividade primária, fluxo de material terrestre, mudanças climáticas, presença de poluentes (Madureira, 2002) e origem paleobotânica (Pereira et al., 2009). Ainda, alguns trabalhos fazem uso dos mesmos para estudar ambientes que sofrem eutrofização devido à alta carga de poluentes
que recebe (Zimmerman; Canuel, 2001; Pinturier-Geiss et al., 2002; Hu et al., 2008; Lu; Meyers, 2009).
Lipídios têm sido amplamente utilizados como biomarcadores geoquímicos para a caracterização da natureza e distribuição da MO em sistemas aquáticos devido a sua especificidade e maior resistência a degradação bacteriana em relação a outras classes de compostos (Pinturier-Geiss et al., 2002; Carreira et al., 2010). Por definição, os lipídios são definidos como moléculas orgânicas insolúveis em água e que se dissolvem prontamente em solventes orgânicos apolares (IBGE, 2004). Portanto, os lipídios referem-se a um conjunto de substâncias químicas que não são caracterizados por algum grupo funcional comum. Lipídios como alcanos, álcoois, esteróis e ácidos graxos são normalmente encontrados em ecossistemas aquáticos e utilizados como biomarcadores para inferir a origem da matéria orgânica, como também, em estudos de processos de degradação (Medeiros; Simoneit, 2008; Méjanelle; Laureillard, 2008; Belicka; Macdonald; Harvey, 2009; Schmidt; Hinrichs; Elvert, 2010).
Os lipídios encontrados em ambientes aquáticos podem ser de origem autóctone ou alóctone. Compostos provenientes das membranas celulares do fitoplâncton e zooplâncton constituem a matéria orgânica de origem autóctone (Peters; Walters; Moldowan, 2005). Os lipídios de origem alóctone são provenientes de ceras epiticulares de plantas superiores (Ribeiro; Knoppers; Carreira, 2011). 2.4.1 Alcanos
Apesar da simplicidade dos hidrocarbonetos, uma variedade destes compostos pode ser encontrada em ambientes aquáticos. Os hidrocarbonetos saturados encontrados na natureza apresentam,
principalmente, número ímpar de átomos de carbono (Volkman, 2006). Essa predominância ocorre porque os alcanos são biossintetizados a partir de ácidos graxos, sendo a descarboxilação enzimática o processo envolvido na biossíntese (Killops; Killops, 2005).
Hidrocarbonetos de cadeia curta como n-C15, n-C17 e n-C19,
principalmente n-C17, são característicos de organismos aquáticos
(Mille et al., 2007).Os homólogos de cadeias longas n-C25 – n-C33 são
compostos provenientes de plantas vasculares terrestres. A abundância destes n-alcanos individuais em sedimentos não contaminados, geralmente, segue a tendência n-C25 < n-C27 < n-C29 < n-C31, típica de
fontes tropicais (Jeng, 2006).
Algumas amostras (não contaminadas por petróleo) apresentam um perfil de distribuição de hidrocarbonetos anormal, onde há ausência do predomínio de n-alcanos ímpares ou mesmo predomínio dos homólogos pares. A origem biogênica destes compostos tem sido atribuída a bactérias (Mille et al., 2007), redução de compostos funcionalizados (Souza et al., 2011), vegetação de gramíneas (Kuhn et al., 2010) e bloom de diatomáceas (Bieger; Abrajanol; Hellou, 1997).
Os isoprenóides pristano e fitano, alcanos ramificados, são derivados da cadeia fitol da molécula de clorofila sob condições predominantemente óxicas e anóxicas, respectivamente (Figura 3) (Peters; Walters; Moldowan, 2005). Também tem sido relatada a ocorrência de pristano associada ao zooplâncton e fitano à archaebactérias (Volkman, 2006).
Figura 3. Esquema representando a formação dos isoprenóides pristano e fitano em
condições óxicas e anóxicas, respectivamente. Modificado de Peters; Walters; Moldowan, 2005.
2.4.2 Álcoois e esteróis
Em contraste aos alcanos, os álcoois encontrados em amostras de sedimentos apresentam predomínio de número par de átomos de carbono refletindo sua biossíntese a partir do grupo acetil (C2)
(Killops; Killops, 2005).
Álcoois lineares saturados de cadeia longa de C22 a C32 são
utilizados como biomarcadores de origem terrestre devido à presença destes compostos nas ceras epiticulares de plantas superiores (Ribeiro; Knoppers; Carreira, 2011). Os homólogos de cadeia curta de C12 a C20
são provenientes de organismos aquáticos como algas e zooplâncton. Dentre os álcoois de origem autóctone, há predomínio de C16 e C18
1999). A hidrólise de ésteres de zooplâncton é também uma fonte de álcoois saturados e insaturados C12–C22 (Volkman, 2006).
Um álcool importante é o fitol, gerado na coluna d’água pela hidrólise da molécula de clorofila durante o processo de digestão de copépodes e senescência de diatomáceas (Tolosa et al., 2003). Pouco comum, a ocorrência de álcoois ramificados e secundários é relatada como proveniente da comunidade bacteriana (Cranwell, 1980).
Uma variedade de esteróis é encontrada em sedimentos, refletindo as múltiplas fontes produtoras (algas, plantas e zooplâncton) destes compostos. Esta diversidade de esteróis é originada de pequenas variações em suas estruturas tais como as posições das duplas ligações, alquilações na cadeia cíclica e/ou lateral e estereoquímica (Goad; Akihisa, 1997). A Figura 4 apresenta a estrutura dos principais esteróis, a nomenclatura e a simbologia normalmente utilizada.
Figura 4. Estrutura dos principais esteróis e sua respectiva nomenclatura e simbologia
As características intrínsecas que os esteróis apresentam são ideais para a avaliação das fontes de matéria orgânica sendo, portanto, utilizados na geoquímica orgânica como biomarcadores (Volkman, 2006).
Plantas superiores são as maiores fontes de esteróis como campesterol, sitosterol e estigmasterol (Panconst; Boot, 2004). Jaffé et al. (2001) observaram predominância de esteróis C29,
especialmente sitosterol e estigmasterol, em amostras de sedimentos provenientes de um ambiente com amplo aporte de plantas superiores. No mesmo estudo, mas em outro tipo de ambiente, foi observada predominância de esteróis C27, principalmente o colesterol,
refletindo o maior aporte de fontes planctônicas.
O dinosterol (4α,23,24-trimethyl-5α-cholest-22E-en-3β-ol) é amplamente considerado um biomarcador de dinoflagelados, embora tenha sido encontrado em algumas espécies de diatomáceas (Rampen et al., 2009a). Recentemente, também tem sido relatada a presença de outros metil esteróis em culturas de diatomáceas, principalmente, cêntricas e penadas (Rampen et al., 2009b; Giner; Wikfors, 2011).
2.4.3 Ácidos graxos
Assim como os álcoois, os ácidos graxos encontrados na natureza apresentam, principalmente, número par de átomos de carbono devido à biossíntese a partir da unidade acetil (C2) (Killops;
Killops, 2005).
Dentre os lipídios, os ácidos graxos saturados são os compostos, frequentemente, mais abundantes em sedimentos recentes. Bactérias, algas e plantas superiores são algumas das fontes
destes compostos. Em ambientes aquáticos, as algas costumam ser a maior fonte de ácidos graxos presentes nos sedimentos (Volkman et al., 1998).
Os ácidos de C12 a C16 são os compostos lipídicos
predominantes em algas, embora sejam produzidos em pequenas quantidades por todas as plantas (Meyers, 1997). Outras fontes para estes compostos são bactérias de diversas classes. Plantas terrestres são as principais fontes de ácidos saturados de cadeia longa de C24 a C28.
Estes compostos são constituintes das ceras de folhas de plantas superiores (Allen et al., 2010). Amostras de sedimentos apresentam normalmente predominância de C14, C16 e C18 para ácidos de origem
autóctone e de C24, C26 e C28 para os de origem alóctone (Yoshinaga;
Sumida; Wakeham, 2008).
Ácidos graxos ramificados, principalmente iso e anteiso, são atribuídos exclusivamente à origem bacteriana, especialmente bactérias sulfato redutoras. Estes ácidos ramificados são derivados do correspondente ácido linear durante o metabolismo das bactérias. Os ácidos C15 iso e anteiso, por exemplo, são provenientes da inclusão de
um grupo metil na cadeia do ácido linear C14 (Lu; Meyers, 2009).
Portanto, a presença de ácidos graxos iso e anteiso em amostras de sedimentos denota o aporte de biomarcadores provenientes da alteração microbiana da MO.
2.5 Índices relacionados aos biomarcadores
Qualitativamente, a origem da matéria orgânica sedimentada é atribuída como alóctone ou autóctone com base na predominância de certos compostos. Entretanto, índices e razões foram propostos e
são amplamente utilizados a fim de tornar a interpretação dos resultados menos subjetiva.
A razão C/N é muito útil para diferenciar entre as fontes de matéria orgânica em ambientes aquáticos, uma vez que organismos marinhos são enriquecidos com nitrogênio, e apresentam valores de 6,0 a 8,0 para C/N, se comparados às plantas terrestres que apresentam C/N maior que 12 (Jaffé et al., 2001). Silva e Madureira (2012) encontraram valores para C/N entre 22,1 e 26,4 em amostras de folhas da vegetação de mangue e entre 7,2 e 10,4 para sedimentos de mangue. Os autores consideraram que o sedimento apresenta aporte de MO proveniente de folhas e, principalmente, de organismos aquáticos.
A razão H/C avalia o teor de insaturação da matéria orgânica. Plantas superiores possuem alto conteúdo de lignina e carboidratos, por isso apresentam maior teor de compostos insaturados que resultam em valores entre 1,3 e 1,5 para C/H, enquanto que derivados de plâncton, com grande quantidade de lipídios e proteínas, apresentam H/C entre 1,7 e 1,9 (Rodrigues Neto; Madureira, 2000).
Para avaliar a contribuição de n-alcanos provenientes de plantas superiores na matéria orgânica, tem sido observada a predominância ímpar/par de seus homólogos e a mesma expressa quantitativamente na forma do Índice preferencial de carbono (IPC), calculado de acordo com a equação 1.
Valores para IPC entre 5 e 10 ou maiores são encontrados para amostras de plantas superiores e vasculares, respectivamente. Já valores de IPC próximos à unidade são característicos do aporte de microorganismos, matéria orgânica reciclada ou, mais comumente, de contaminação por petróleo (Jeng, 2006).
A razão terrestre/aquático (RTA) é utilizada com a finalidade de comparar o aporte de n-alcanos provenientes de plantas superiores em relação aqueles de organismos aquáticos conforme a equação 2 (Meyers, 1997).
Equação 2
Valores para RTAALC maiores que a unidade indicam a
predominância de aporte de alcanos de origem alóctone, enquanto que o aporte preferencialmente autóctone é evidenciado por valores de RTAALC menores que a unidade.
A razão terrestre/aquático também pode ser aplicada a alcoóis e ácidos conforme a equação 3 (Pancost; Boot, 2004).
Equação 3
Além da utilização das razões IPC e RTA para inferir a origem da matéria orgânica, a condição redox do meio pode ser inferida pela utilização da razão C/S ou ainda pela relação pristano/fitano.
Valores em torno de 2,0 para C/S são encontrados em locais como o Mar Negro, onde a degradação da matéria orgânica pela ação das bactérias sulfato redutoras é o principal processo de mineralização na coluna d’água anóxica (Neretin et al., 2006).
A predominância de pristano ou fitano é utilizada como indicadora de condição oxidante e redutora, respectivamente. Outra aplicação da razão entre estes isoprenóides é na avaliação da contaminação de sedimentos por petróleo, onde neste caso, a razão é próxima da unidade (Tarozo; Frena; Madureira, 2010).
Outra importante aplicação das razões é na interpretação da degradação diagenética da MO. A conversão de esteróis insaturados a saturados é interpretado como um processo anaeróbico mediado principalmente por bactérias na coluna d’água ou na interface água-sedimento. A razão insaturado/saturado varia de 0,1 a 0,2 e de 0,6 a 1,2 para ambientes óxicos e anóxicos, respectivamente (Lu; Meyers, 2009).
2.6 Análise de biomarcadores: técnicas cromatográficas As técnicas cromatografia a gás com detector por ionização em chama (GC-FID) e cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (GC/MS) são as mais utilizadas na análise de biomarcadores geoquímicos (Simoneit, 2005; Medeiros; Simoneit, 2007; Hübschmann, 2009). Cromatografia a gás é uma das mais importantes técnicas analíticas para a separação e determinação de compostos orgânicos voláteis e/ou volatilizáveis. O processo de separação ocorre por meio da distribuição dos componentes da amostra entre a fase estacionária e a fase móvel constituída por um gás de arraste. Os principais componentes de um cromatógrafo a gás são: cilindro de gás, injetor, forno, coluna, detector, sistema de controle do instrumento e aquisição de dados (Collins; Braga; Bonato, 2006). Os detectores utilizados para a análise de compostos de interesse geoquímico são detector por ionização em chama (FID) e
espectrometria de massas (MS). O FID baseia-se na condutividade elétrica dos íons formados na chama do detector. Inicialmente, há somente a passagem do gás de arraste e a quantidade de íons produzidos é bem pequena, entretanto, quando um composto orgânico passa pela chama, há uma produção maior de cargas devido à formação de íons e elétrons livres, dentre outros, gerando um aumento de corrente. Em um sistema GC/MS, os analitos separados no cromatógrafo a gás são bombardeados por elétrons e fragmentados gerando íons positivos, negativos e radicais e a separação ocorre devido à diferença entre massa/carga dos íons gerados. Em um espectro de massas aparecem picos de intensidades variáveis, cada qual corresponde um íon com uma razão massa/carga (m/z) característica (Hübschmann, 2009).
2.7 Lagoa da Conceição
A Lagoa da Conceição é uma laguna localizada no centro-leste da Ilha de Santa Catarina à latitude 27°34’ S e à longitude 48°27’ O. O corpo lagunar, que possui área de 19,2 km2 e largura entre 150 m e
2,5 km, se distribui em uma configuração alongada e irregular entre dunas e morros resultando em subsistemas que apresentam peculiaridades em relação aos parâmetros físico-químicos da coluna d’água (Sierra; Soriano-Sierra; Salim, 1999).
Três subsistemas constituem a Lagoa da Conceição, sendo conhecidos como: Lagoa Central, do Norte e do Sul, ou simplesmente Lagoa do Meio, de Cima e de Baixo (Figura 5) (Barbosa, 2003).
Figura 5. Mapa geográfico da Lagoa da Conceição (SC) apresentando os subsistemas
Central, Norte e Sul. Retirado de: http://maps.google.com, em 10 de janeiro de 2012.
Dentre os três subsistemas, a Lagoa do Norte apresenta a água mais límpida bem como homogeneidade para os parâmetros físico-químicos. No subsistema Sul há turbidez elevada e pequenas variações de oxigênio dissolvido na coluna d’água. Turbidez intermediária e estratificação vertical em relação à salinidade, temperatura e oxigênio dissolvido são as principais características do subsistema central (Odebrecht; Gomes Júnior, 1999).
Na estratificação salina deste subsistema, têm-se águas com menor salinidade na superfície e mais salinas e densas no fundo (Odebrecht; Gomes Júnior, 1999). A alta salinidade (18-33‰) da camada profunda do subsistema Central é atribuída à ligação da
laguna com o oceano através do Canal da Barra. Antigamente, o canal abria e fechava a cada seis meses (dependendo da maré) e a salinidade variava de 15 a 18‰ (Barbosa, 2003). Com a abertura permanente do canal pela Companhia Integrada de Desenvolvimento Agrícola de Santa Catarina (CIDASC) em 1982, verificaram-se profundas mudanças no sistema, desde o aumento da salinidade à alteração das espécies de fauna salobra para fauna marinha. Acredita-se que, atualmente, o ecossistema lagunar abrigue a fauna dos dois ambientes (Barbosa, 2003).
De acordo com Odebrecht e Gomes Júnior (1999), a estratificação mais notável, no subsistema central, é observada para o oxigênio dissolvido, para o qual valores próximos à saturação foram encontrados na superfície e condição de anoxia próximo ao fundo. Esta estratificação é mantida em todas as épocas do ano, sendo responsável pela estagnação das águas da camada inferior, o que causa anoxia. A situação de anoxia no subsistema central é agravada pela falta de circulação de água. A Lagoa da Conceição é um ecossistema aquático no qual a circulação da água, influenciada principalmente pela ação dos ventos e das variações dos ciclos de marés, não alcança toda a coluna d’água durante o ano inteiro.
Segundo Fonseca (2006), a eutrofização devido à atividade humana tem contribuído para a anoxia da Lagoa da Conceição. Fonseca e Braga (2006) avaliaram a concentração de fósforo e outros nutrientes dissolvidos na Lagoa da Conceição. A partir dos resultados obtidos, o ambiente foi classificado como trófico a hipertrófico, devido ao aumento da proliferação de algas oportunistas e as altas
concentrações de nutrientes em relação a medidas realizadas em décadas anteriores.
Anoxia, eutrofização e processos relacionados à produtividade aquática podem acarretar mudanças nos processos geoquímicos que ocorrem em um ecossistema aquático (Fonseca, 2006). A abundância e a identidade de determinados biomarcadores geoquímicos permite avaliar as mudanças de aporte de matéria orgânica. Desta forma, fenômenos que ocorrem na coluna d’água, como anoxia e eutrofização, permanecem registrados na matéria orgânica sedimentar na forma de biomarcadores geoquímicos (Zimmerman; Canuel, 2000).
Um estudo realizado no Laboratório de Química Ambiental e Geoquímica (LQAG) demonstrou a utilização de C/N, IPC e biomarcadores para a avaliação das fontes de matéria orgânica em amostras de sedimento da Lagoa da Conceição (SC). Foram analisadas cinco amostras de sedimentos superficiais e um testemunho sedimentar, sendo que os pontos de coleta foram escolhidos de forma a obter sedimentos ricos em matéria orgânica. Os resultados obtidos indicaram que a matéria orgânica sedimentar é proveniente, principalmente, de plantas terrestres. Não foram identificados compostos provenientes de aporte antropogênico (Silva et al., 2008).
As amostras de sedimentos utilizadas no trabalho citado foram coletadas em regiões que diferem em alguns aspectos importantes da região de anoxia que foi exposta até o momento. Não há trabalhos relacionados à matéria orgânica em amostras de sedimentos do subsistema central da Lagoa da Conceição. Esta região apresenta uma tendência à degradação ambiental por aspectos como
característica heterotrófica, longo tempo de residência d’água e pequena taxa de exportação dos compostos dissolvidos. Desta forma, é de extrema importância avaliar as consequências da anoxia e eutrofização na matéria orgânica sedimentar do subsistema Lagoa Central.
3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral
Analisar quali e quantitativamente os biomarcadores geoquímicos presentes em amostras de sedimentos superficiais e de testemunho em um local anóxico da Lagoa da Conceição.
3.2 Objetivos específicos
Caracterizar o ambiente de estudo em relação aos parâmetros: temperatura, salinidade, condutividade e oxigênio dissolvido;
Avaliar a produtividade do ambiente ao longo do testemunho sedimentar por meio da correlação das concentrações de carbono orgânico total (COT) e clorofila-a;
Obter informações preliminares sobre a origem da matéria orgânica sedimentada utilizando razões como C/N e H/C;
Inferir a condição redox predominante do ambiente utilizando a razão C/S e os isoprenóides pristano e fitano;
Analisar, por meio de técnicas cromatográficas, as seguintes classes de lipídios: alcanos, álcoois, ácidos graxos e esteróis.
Associar os biomarcadores geoquímicos detectados às respectivas origens e avaliar a sua distribuição ao longo do testemunho;
Avaliar a influência do período de coleta na concentração e distribuição dos biomarcadores geoquímicos;
Correlacionar os resultados obtidos em relação aos biomarcadores com fenômenos que ocorrem na Lagoa da Conceição, como: anoxia, eutrofização e ocupação humana.
4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Amostragem
O ponto de coleta das amostras analisadas neste trabalho situa-se no subsistema central da Lagoa da Conceição (SC), apresitua-senta as coordenadas (27°36’048”S e 48°27’371”O) e é representativo da região que apresenta anoxia (Figura 6). A localização do ponto de amostragem foi obtida a partir de GPS (Global Positioning System).
Figura 6. Localização geográfica da Lagoa da Conceição (SC) ilustrando o ponto de
coleta.
A amostragem, realizada por um mergulhador com equipamento apropriado, constitui-se de três amostras de sedimentos superficiais (aproximadamente 5 cm) e um testemunho (perfil sedimentar). As amostras superficiais foram coletadas em 30/03/2010, 25/06/2010 e 25/01/2011, sendo denominadas C1, C2 e C3, respectivamente. O testemunho foi coletado em 30/03/2010.
Para a coleta das amostras de sedimentos superficiais foram utilizados frascos de vidro e para a coleta do testemunho, um tubo de policloreto de polivinila (PVC) com 5 cm de diâmetro e aproximadamente 60 cm de profundidade. As amostras foram mantidas em um freezer até o momento do fracionamento. O testemunho foi seccionado a cada 3 cm e as porções resultantes liofilizadas em um liofilizador F105 (Edwards).
Durante a coleta, os parâmetros físico-químicos da coluna d’água (salinidade, temperatura, oxigênio dissolvido e condutividade) foram medidos in situ com auxílio de um sensor DO 85 (YSI, Yellow Springs, OH, USA).
4.2 Reagentes
Os reagentes, solventes e padrões utilizados neste trabalho estão resumidamente descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Lista de reagentes, solventes e padrões utilizados no desenvolvimento do
trabalho
Reagentes, solventes e padrões Marca
Solventes: Acetato de etila, acetona, diclorometano,
metanol e hexano (UV/HPLC) Mallinckrodt Chemicals
Ácido acético P.A Grupo Química
Ácido clorídrico P.A Cromoline
Cobre em pó, sulfato de sódio e alumina (todos P.A) Vetec
Clorofórmio UV/HPLC Vetec
Sílica gel (diâmetro: 0,05 – 0,20 mm Carlo Erba Padrões de recuperação: n-C16d34 e p-terfenil deuterado Sigma Aldrich
Padrões internos: 5α-colestano e heneicosanol Sigma Aldrich Padrão interno: n-alcano C30d62 AccuStandard
Padrão de n-alcanos C11-C40 e de ácidos graxos metilados AccuStandard
Padrões: colesterol, colestanol, estigmasterol, sitosterol e
heneicosanol Sigma Aldrich
Cloreto de acetila Fluka
4.3 Análise elementar de CHNS
Aproximadamente 0,5 g de cada porção liofilizada foi descarbonatada com 1 mL de solução HCl 0,1 mol L-1. As amostras
foram mantidas a 60 °C para eliminação da água. O processo foi repetido com água desionizada para retirada do excesso de HCl e, posteriormente, as amostras foram enviadas para a Central de Análises do Departamento de Química (UFSC) para determinação de CHNS por meio do analisador elementar EA 1110 (Carlo Erba). 4.4 Análise de feopigmentos
A extração dos feopigmentos foi realizada em triplicata a partir de 1 g de sedimento utilizando 5 mL de acetona e água (9:1). O extrato foi combinado e, então, submetido à centrifugação (3000 rpm) por aproximadamente 15 minutos. Após esta etapa, uma alíquota do sobrenadante foi retirada e submetida à análise por espectroscopia de absorção molecular na região do visível (UV/Vis). As medidas foram realizadas em um espectrofotômetro UV/Vis com arranjo de diodo modelo 8452-A (HP). A concentração de clorofila-a foi determinada de acordo com a equação 4.
çã
Onde:
Clorofila-a µg g-1;
v volume de solvente usado na extração (mL); m massa de amostra utilizada na extração (g); l caminho óptico (1 cm);
A645 absorbância em 645 nm;
A630 absorbância em 630 nm.
4.5 Extração e fracionamento dos lipídios
O fluxograma apresentado na Figura 7 ilustra esquematicamente os processos de extração e fracionamento dos lipídios, sendo descritos detalhadamente nas sessões seguintes.
Figura 7. Fluxograma do processo de extração e fracionamento dos lipídios.
4.5.1 Extração
Anteriormente ao processo de extração, as amostras de sedimentos foram tratadas com cobre ativado para a remoção de enxofre elementar, uma vez que este é um interferente nas análises cromatográficas de matrizes ambientais. Para realizar a ativação, pesou-se 2,0 g de cobre em pó em tubos de ensaio e adicionou-se 5 mL de ácido clorídrico concentrado. Os tubos foram agitados em agitador do tipo vortex por alguns segundos e a mistura em seguida
foi centrifugada. O sobrenadante contendo o ácido foi retirado e seguiu-se com a lavagem do cobre com metanol, diclorometano e metanol (1:1) e diclorometano até a eliminação da cor amarela da solução. Desta forma o cobre fica ativado sequestrando o enxofre molecular das amostras na forma de complexo.
Os lipídios livres foram extraídos a partir de 5 g de sedimento liofilizado. Em um tubo de vidro próprio para extração, foi adicionado o sedimento, 2 g de cobre ativado e os padrões de recuperação (alcano n-C16d34 e p-terfenil deuterado) utilizados para a
avaliação da eficiência de extração dos compostos. Para a obtenção dos lipídios, a extração foi realizada em triplicata com 15 mL de diclorometano e metanol (2:1). O sistema líquido/sólido foi agitado em vortex para melhor homogeneização e, posteriormente, mantido em ultra-som por 30 minutos. Na sequência, os tubos foram centrifugados com o intuito de separar o sobrenadante. Após a extração em triplicata, o sobrenadante combinado foi concentrado (≈ 1 mL) por rotaevaporação e, posteriormente, submetido ao fluxo de nitrogênio gasoso para eliminação do solvente restante.
4.5.2 Fracionamento
O extrato lipídico de cada amostra foi fracionado por cromatografia sólido-líquido em quatro frações conforme o incremento da polaridade dos compostos. A separação foi realizada em uma coluna de vidro (capacidade para 50 mL) preenchida com 5 g de sílica gel, 1 g de alumina e 1 g de cobre ativado. A sílica gel e a alumina foram desativadas previamente com 5 % de água.
A fração um (F1), correspondente aos hidrocarbonetos saturados, foi eluída com 40 mL de hexano. Os hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos (ausentes em todas as amostras) e demais compostos neutros insaturados, correspondendo a fração dois (F2), foram eluídos com 30 mL de hexano e diclorometano (1:1). Na fração três (F3) foram eluídos os álcoois e esteróis, utilizando-se 30 mL de acetato de etila e metanol (2:1). Para a eluição dos ácidos graxos, fração quatro (F4), foram utilizados 30 mL de acetato de etila e ácido acético (5%). Cada fração foi concentrada (≈ 1 mL) por rotaevaporação e, posteriormente, submetida ao fluxo de nitrogênio gasoso para eliminação do solvente restante. As frações F1 e F2 foram avolumadas para 1 mL de hexano e armazenadas em freezer até o momento da análise cromatográfica. Os compostos presentes nas frações F3 e F4 foram derivatizados anteriormente à análise cromatográfica.
4.5.3 Derivatização
Os álcoois e esteróis (F3) foram silanizados com 50 µL de BSTFA, durante 1 hora, sob temperatura de 60 °C. O excesso de reagente foi eliminado sob fluxo de gás nitrogênio e os compostos silanizados avolumados para 1 mL de hexano. A derivatização da F3 foi realizada no dia da análise cromatográfica.
Os ácidos graxos foram esterificados utilizando-se 1 mL de uma solução de metanol e cloreto de acetila (2 %). O cloreto de acetila foi adicionado vagarosamente sob o metanol refrigerado devido ao caráter exotérmico da reação. O frasco contendo a mistura reacional foi mantido a 60 °C durante 12 horas. Para extração dos ácidos esterificados, adicionou-se ao frasco 1 mL de clorofórmio e 1 mL de solução 10 % KCl. A mistura foi então agitada em vortex e centrifugada para separação das fases orgânica e aquosa. Com uma
pipeta Pasteur retirou-se a fase orgânica e a mesma foi submetida a uma microcoluna de vidro contendo sulfato de sódio anidro (previamente seco a 200 °C durante 12 horas) para retirada de vestígios de água. O procedimento de extração dos ácidos esterificados foi realizado em triplicata para evitar perdas de compostos na fase aquosa. Após, o solvente foi eliminado sob fluxo de nitrogênio gasoso e os compostos avolumados para 1 mL de hexano. As amostras da F4 foram armazenadas em freezer até o momento da análise cromatográfica.
4.5.4 Equipamentos
A identificação e quantificação dos n-alcanos foi realizada em um cromatógrafo a gás com detector de chama modelo 2014 (Shimadzu), utilizando o software GC solution para aquisição e análise dos dados. A análise cromatográfica de ácidos graxos, álcoois e esteróis foi realizada em um cromatógrafo a gás TraceGC Ultra (Thermo Finnigan) acoplado ao espectrômetro de massas Polaris Q, utilizando o software Xcalibur para aquisição e análise dos dados. As análises foram realizadas no modo de varredura de íons totais (“full scan” de 50 a 500 u) em 70 eV. Em ambos os cromatógrafos, utilizou-se uma coluna capilar de 30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 µm espessura filme, sendo a fase estacionária constituída por polidimetilsiloxano e 5% grupos fenila (DB-5). A injeção de cada extrato (1 µL) foi realizada manualmente no modo sem divisão de fluxo (“splitless”). Os programas de temperatura utilizados para as análises cromatográficas da F1, F3 e F4 estão descritos na Tabela 3.
Tabela 3. Condições cromatográficas para a análise da F1, F3 e F4 Condições F1 F3 F4 Temperatura Inicial (°C) 60 50 50 Tempo (min.) 6 5 5 Rampa 1 (°C min-1) 5 5 5 Temperatura 1 (°C) 300 300 300 Isoterma (min.) 10 20 20 Linha de transferência (°C) - 280 280 Fonte de íons (°C) - 175 175 4.5.5 Fração 1 (F1)
A F1 consiste, principalmente, de n-alcanos saturados e dos isoprenóides pristano e fitano. Os compostos presentes na F1 foram identificados e quantificados por GC-FID. A identificação foi realizada com base no tempo de retenção de padrões e a quantificação utilizando C30d62 como padrão interno cromatográfico. As soluções
utilizadas para obtenção da curva analítica foram preparadas nas concentrações de 1,0; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0 μg mL-1 e continham os
n-alcanos (C9-C40) além de pristano e fitano 4.5.6 Fração 3 (F3)
Os álcoois e esteróis silanizados foram analisados por GC/MS. Os álcoois foram identificados com base no perfil de fragmentação observando-se os íons de m/z 97 e 117, característicos de álcoois primários e secundários, respectivamente. Os esteróis foram identificados através do tempo de retenção de padrões ou através da comparação do espectro de massas obtido com o espectro fornecido pela biblioteca NIST 2008 e literatura. Os fragmentos com maior intensidade relativa e o respectivo íon molecular utilizados para a identificação de cada esterol estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Fragmentos m/z utilizados para a identificação de alguns esteróis
Esterol Abreviatura Fragmentos m/z M+*
5,(22E)-Colestadien-3β-ol C27∆5,22 366,255,351 456 5α-Colest-(22E)-en-3β-ol C27∆22 255,269,345 458 5-Colesten-3β-ol C27∆5 368,329,255 458 5α-colestan-3β-ol C27∆0 215,355,445 460 24-Metil-5,(22E)-Colestadien-3β-ol C28∆5,22 380,255,365 470 24-Metil-5α-Colest-(22E)-en-3β-ol C28∆22 255,269,345 472 24-Metil-5-Colesten-3β-ol C28∆5 382,343,367 472 24-Metil-5α-colestan-3β-ol C28∆0 215,369,459 474 24-Etil-5,(22E)-Colestadien-3β-ol C29∆5,22 394,255,379 484 24-Etil-5α-Colest-(22E)-en-3β-ol C29∆22 255,345,269 486 24-Etil-5-Colesten-3β-ol C29∆5 396,357,381 486 24-Etil-5α-colestan-3β-ol C29∆0 215,383,473 488 4α,23,24-Trimetil-5α-Colest-(22E)-en-3β-ol C30∆22 359,269,388 500
*íon molecular para o esterol silanizado; m/z é o pico base.
Observam-se perfis de fragmentações características para esteróis de acordo com a posição e o número de insaturações. Os possíveis modos de fragmentação que os esteróis silanizados apresentam podem ser visualizados no esquema da Figura 8.
Figura 8. Principais modos de fragmentação de esteróis silanizados.
A quantificação dos álcoois e esteróis foi realizada utilizando α-colestano como padrão interno cromatográfico. Para alguns esteróis e álcoois não se tinha padrão e, portanto, a quantificação destes compostos foi realizada com base na curva analítica do composto
com tempo de retenção mais próximo. As curvas analíticas foram obtidas a partir de soluções contendo os padrões: colestanol, colesterol, estigmasterol, β-sitosterol e heneicosanol nas concentrações de 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 μg mL-1.
4.5.7 Fração 4 (F4)
Os ácidos graxos metilados foram identificados com base no perfil de fragmentação observando-se o íon de m/z 143, característico destes compostos, e pelo tempo de retenção de padrões de ácidos graxos metil esterificados (FAME). As soluções de FAME (C12-C28) utilizadas para a obtenção das curvas analíticas foram preparadas nas concentrações de 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 μg mL-1.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Parâmetros físico-químicos
A análise de parâmetros como temperatura, oxigênio dissolvido (OD), condutividade e salinidade pode auxiliar na caracterização do ambiente em estudo. Para tanto, estes parâmetros foram medidos in situ na coluna d’água do subsistema central da Lagoa da Conceição, de acordo com a Tabela 5.
Tabela 5. Parâmetros físico-químicos medidos in situ na Lagoa da Conceição em março
de 2010 Profundidade (m) Temperatura (°C) (mg LOD-1) Salinidade (‰) Condutividade (mS cm-1) 0,0 18,0 8,54 18,6 29,9 0,5 18,0 8,65 18,7 30,1 1,0 18,2 8,42 19,0 30,6 1,5 19,0 8,10 20,7 33,6 2,0 20,0 6,37 25,7 41,6 2,5 21,0 3,67 30,4 46,9 3,0 21,1 3,34 31,2 47,9 3,5 21,0 2,60 31,8 48,7 4,0 21,1 0,50 32,7 50,0 4,5 21,2 0,00 33,1 50,5 5,0 20,8 0,00 33,3 50,8 5,2 20,8 0,00 33,5 50,9
Observando-se os dados, verifica-se que a temperatura da coluna d’água variou pouco com a profundidade, enquanto que a salinidade apresentou mudanças consideráveis, principalmente em torno de 2,0 m. Os valores obtidos para a salinidade encontram-se dentro da faixa que classifica as camadas de água de mesohalinas (5-18‰) a eurihalinas (30-35‰) (Esteves, 1998). O ambiente de estudo apresenta, portanto, uma estratificação salina com águas mesohalinas na superfície e eurihalinas, mais densas, no fundo. Segundo Esteves (1998), a água dos oceanos apresenta salinidade média de 35‰. Os valores de salinidade no fundo da laguna sugerem que a estratificação
apresentada pelo subsistema central é influenciada pela ligação da mesma com o mar através do Canal da Barra.
Valores de OD na faixa de 8,65 a 0,00 mg L-1 foram
observados na superfície e no fundo da coluna d’água, respectivamente. De acordo com a classificação de ambientes aquáticos em relação à concentração de OD, condições óxicas e anóxicas predominam na superfície e fundo, respectivamente (Rullkötter, 2006). Como consequência destes regimes de oxigenação têm-se biofacies aeróbicas na camada de água mesohalina e anaeróbicas na camada eurihalina.
Os dados físico-químicos referentes às outras coletas apresentaram o mesmo perfil de variação e pequenas mudanças nos valores.
A avaliação dos parâmetros físico-químicos da coluna d’água foi necessária para caracterizar e escolher o local de coleta. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que o subsistema central da Lagoa da Conceição apresenta uma estratificação salina associada à anoxia no hipolímnio.
5.2 Análise elementar de carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre (CHNS)
A análise elementar de CHNS permite obter informações acerca da produtividade primária e aporte de MO alóctone em ambientes aquáticos. Para testemunhos sedimentares, a análise elementar é utilizada para avaliar a variação da produtividade/aporte de MO terrestre que ocorre ao longo do tempo. Os resultados obtidos por meio das análises elementares de CHNS para o perfil sedimentar estão apresentados na Figura 9.
