UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
EVERTON PASCHOAL ANTONIEL
MANIPULAÇÃO GENÉTICA DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO
DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS SOB INDUÇÃO DE
EXPRESSÃO DE ENZIMAS HETERÓLOGAS EM ASPERGILLUS
NIDULANS
GENETIC MANIPULATION OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED
TRANSCRIPTION FACTORS UNDER INDUCTION OF
EXPRESSION OF HETEROLOGOUS ENZYMES IN
ASPERGILLUS NIDULANS
CAMPINAS 2020
EVERTON PASCHOAL ANTONIEL
MANIPULAÇÃO GENÉTICA DE FATORES DE TRANSCRIÇÃO
DIFERENCIALMENTE EXPRESSOS SOB INDUÇÃO DE EXPRESSÃO
DE ENZIMAS HETERÓLOGAS EM ASPERGILLUS NIDULANS
GENETIC MANIPULATION OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED
TRANSCRIPTION FACTORS UNDER INDUCTION OF EXPRESSION
OF HETEROLOGOUS ENZYMES IN ASPERGILLUS NIDULANS
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Funcional e Molecular, na Área de Bioquímica. Dissertation presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Functional and Molecular Biology, in the area of Biochemistry.
Orientador: ANDRÉ RICARDO DE LIMA DAMASIO
CAMPINAS 2020 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO EVERTON PASCHOAL ANTONIEL E ORIENTADA PELO ANDRÉ RICARDO DE LIMA DAMASIO
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Antoniel, Everton Paschoal,
An88m AntManipulação genética de fatores de transcrição diferencialmente expressos sob indução de expressão de enzimas heterólogas em Aspergillus nidulans / Everton Paschoal Antoniel. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
AntOrientador: André Ricardo de Lima Damasio.
AntDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Ant1. Aspergillus nidulans. 2. Biologia de sistemas. 3. Fatores de transcrição. 4. Secreção. I. Damasio, André Ricardo de Lima, 1983-. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Genetic manipulation of differentially expressed transcription
factors under induction of expression of heterologous enzymes in Aspergillus nidulans
Palavras-chave em inglês:
Aspergillus nidulans
Systems biology Transcription factors Secretion
Área de concentração: Bioquímica
Titulação: Mestre em Biologia Funcional e Molecular Banca examinadora:
André Ricardo de Lima Damasio [Orientador] Rafael Silva Rocha
Fernando Segato
Data de defesa: 07-08-2020
Programa de Pós-Graduação: Biologia Funcional e Molecular
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)
- ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0002-8951-5531 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/9212248755460588
Campinas, 07 de agosto de 2020.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. André Ricardo de Lima Damasio Prof. Dr. Rafael Silva Rocha
Prof. Dr. Fernando Segato
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular, da Unidade Instituto de Biologia.
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Gostaria de agradecer a Universidade Estadual de Campinas e ao Instituto de Biologia, que foi onde esta pesquisa foi realizada, e a agência de fomento; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (processo nº 2017/26315-9), pela concessão da bolsa de mestrado.
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. André Damásio, que esteve presente durante todo o processo do mestrado seja para oferecer ajuda, orientação ou apoio moral, e estendo meus agradecimentos ao Prof. Dr. Marcelo Brandão por ter me recebido no seu laboratório no CBMEG e por todo aprendizado e discussões.
Também gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Gustavo Goldman, da Universidade de São Paulo, por ter me recebido no seu laboratório e, em específico, a Patrícia Alves de Castro Silva pela paciência e ter me ajudado de todas as maneiras possíveis.
Um agradecimento muito especial para todos os meus colegas e amigos do Laboratório de Enzimologia e Biologia Molecular de Microrganismos (LEBIMO); Michelle de Assis, Natália Wassano, Jaqueline Gerhardt, Victória Ramos Sodré de Castro, Nathália Vilela, Fernanda Figueiredo, Marcelo Rubio, César Terrasan, Ana Carolina Oliveira, Thiago Gonçalves Souza, João Paulo Franco Cairo, Mariane Zubieta e Fabiano Jares.
E, por fim, agradeço a minha família, minha mãe Cida, irmã Daiane e minha sobrinha Diana, e meus amigos Vera, Jade, Bianca e Jordy, por sempre estarem presentes e me ajudarem ativamente em tudo que eu precisasse.
RESUMO
Como forma de reduzir a dependência em combustíveis fósseis, os biocombustíveis e produtos químicos obtidos através da hidrólise enzimática da biomassa vegetal vem sendo foco de inúmeras investigações científicas. Todavia, a recalcitrância natural da parede celular vegetal, e o alto preço das enzimas ativas em carboidratos, fazem com que a sua degradação completa e eficiente ainda seja um desafio a ser superado para sua viabilização econômica. Dessa forma, o objetivo central deste trabalho foi avaliar a influência da manipulação genética de fatores de transcrição (FTs) sobre os níveis de produção/secreção de enzimas degradadoras da biomassa vegetal. Sabe-se que existe uma relação direta entre superexpressão de genes e estresse de retículo endoplasmático em fungos filamentosos. Em respostas a isso, a célula desencadeia um intenso programa, chamado unfolded protein response, para manter a proteostase celular. Desta forma os FTs manipulados neste trabalho foram selecionados a partir de dados de RNAseq, enriquecimento de GO terms e redes de co-expressão gênica do fungo modelo Aspergillus nidulans exposto ao estresse celular induzido pela superexpressão e secreção de proteínas heterólogas. Estas análises resultaram na seleção de 5 FTs - AN8772, AN9373, AN7331, AN7913, e AN7592 - presentes em módulos de co-expressão enriquecidos com GO terms tais como: proteasomal ubiquitin-independent protein catabolic process (GO:0010499), sporulation (GO:0043934), calcium ion homeostasis (GO:0055074), Golgi vesicle transport (GO:0048193), translation (GO:0006412), protein refolding (GO:0042026) e small molecule catabolic process (GO:0044282). Os 5 FTs foram deletados com sucesso em A. nidulans através da técnica de CRISPR-Cas9. O fenótipo das cepas mutantes foi avaliado quanto a integridade de parede celular (Congo Red – CR e Calcofluor White – CFW), estresse osmótico (Sorbitol), estresse iônico (CaCl2), estresse oxidativo (Menadiona), esporulação e secreção de proteases. A cepa ΔAN7913 e ΔAN7592 foram as mais resistentes a estressores da integridade de parede celular. A cepa ΔAN7592 foi a única a apresentar esporulação reduzida e resistência a estresse osmótico. Para avaliação da resposta de estresse oxidativo a cepa ΔAN8772 foi mais sensível, enquanto o ΔAN7913 foi mais resistente. Nas análises de proteases as cepas ΔAN9373, ΔAN7331 e ΔAN7913 tiveram um aumento na secreção de proteases, demostrando que estes FTs podem ter potencial função na regulação da via de secreção. Além disto, o processo da construção das cepas super-expressando uma enzima heteróloga está em andamento e poderá responder se estes FTs têm influência na secreção de enzimas heterólogas em A. nidulans. Concluímos que foi possível selecionar FTs potencialmente envolvidos na via de secreção de proteínas em A. nidulans utilizando dados de transcriptoma e redes de co-expressão. Além disso, demonstramos que o FTs deletados estão envolvidos em diferentes processos biológicos, destacando o dado preliminar em que demonstramos maior secreção de proteases em alguns mutantes. Por fim, pretendemos aprofundar nossos estudos realizando experimentos adicionais para avaliar os níveis de secreção destes mutantes através da superexpressão de uma enzima recombinante alvo e, eventualmente, descrever o mecanismo que induz este possível aumento de secreção.
Palavras-chave: Aspergillus nidulans, biologia de sistemas, fatores de transcrição, secreção de enzimas
ABSTRACT
As a way to lessen dependence on fossil fuels, biofuels and chemical products obtained through enzymatic hydrolysis of plant biomass, has been the focus of several scientific investigations. However, the recalcitrance of the plant cell wall, and the high price of hydrolytic enzymes mean that its complete and efficient degradation is still a challenge to be overcome for its economic viability. Therefore, the main goal of this project is to evaluate the influence of genetic manipulation of transcription factors (TFs) on the levels of production/secretion of degrading enzymes from plant biomass. It is known that there is a direct correlation between overexpression of genes and endoplasmic reticulum stress in filamentous fungi. In response to this, a cell triggers an intense program, called unfolded protein response, to maintain cellular proteostasis. Thus, the TFs manipulated in this work were selected from RNAseq data, enrichment of GO terms and genetic co-expression network of the fungus model Aspergillus nidulans exposed to cell stress induced by overexpression and secretion of heterologous proteins. This analysis resulted in the selection of 5 TFs - AN8772, AN9373, AN7331, AN7913 and AN7592 - which were in co-expression modules enriched with GO terms such as: proteasomal ubiquitin-independent protein catabolic process (GO: 0010499), sporulation (GO: 0043934), calcium ion homeostasis (GO: 0055074), Golgi vesicle transport (GO: 0048193), translation (GO: 0006412), protein refolding (GO: 0042026) and small molecule catabolic process (GO: 0044282). The 5 TFs were successfully deleted in A. nidulans using the CRISPR-Cas9 technique. The phenotype of the mutant strains was evaluated for cell wall integrity (Congo Red - CR and Calcofluor White - CFW), osmotic stress (Sorbitol), ionic stress (CaCl2), oxidative stress (Menadione), sporulation and protease secretion. The strain ΔAN7913 and ΔAN7592 were the most resistant to stressors of cell wall integrity. The strain ΔAN7592 was the only one to present reduced sporulation and resistance to osmotic stress. To evaluate the oxidative stress response, the strain ΔAN8772 was more sensitive, while ΔAN7913 was more resistant. In the protease analysis, the strains ΔAN9373, ΔAN7331 and ΔAN7913 had an increase in the secretion of proteases, demonstrating that these TFs may have a potential function in the regulation of the secretion pathway. In addition, the process of constructing strains overexpressing a heterologous enzyme is underway and will be able to answer whether these TFs have an influence on the secretion of heterologous enzymes in A. nidulans. It was concluded that it was possible to select TFs potentially involved in the protein secretion pathway in A. nidulans using transcriptome data and co-expression networks. In addition, we demonstrated that the deleted TFs are involved in different biological processes, highlighting our preliminary data that demonstrate greater secretion of proteases in some mutants. Finally, we intend to deepen our studies by carrying out additional experiments to assess the secretion levels of these mutants through the overexpression of a target recombinant enzyme and, eventually, to describe the mechanism that induces this possible increase in secretion.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 - ... ...13 FIGURA 2 -. ... 14 FIGURA 3 - ... 17 FIGURA 4 - ... 19 FIGURA 5 - ... 21 FIGURA 6 - ... 26 FIGURA 7 - ... 28 FIGURA 8 - ... 28 FIGURA 9 - ... 30 FIGURA 10 - ... 32 FIGURA 11 - ... 33 FIGURA 12 - ... 34 FIGURA 13 - ... 35 FIGURA 14 - ... 36 FIGURA 15 - ... 37 FIGURA 16 - ... 38 FIGURA 17 - ... 39 FIGURA 18 - ... 39 FIGURA 19 - ... 40 FIGURA 20 - ... 41 FIGURA 21 - ... 42 FIGURA 22 - ... 42 FIGURA 23 - ... 43 FIGURA 24 - ... 44 FIGURA 25 - ... 45 FIGURA 26 - ... 46 FIGURA 27 - ... 47 FIGURA 27 - ... 47
LISTA DE ABREVIATURAS 1542 mananase GH5
1G primeira geração
2G segunda geração
ABFA alfa-arabinofuranosidase GH51
AMM Meio Mínimo sem qualquer fonte de nitrogênio AspGD Aspergillus Genome Database
BglC beta-glucosidase GH3 CFW Calcofluor White CR Congo Red DTT Ditiotreitol
ER reticulo endoplasmático
ERAD endoplasmic-reticulum-associated protein degradation FDR false discovery rate
FT Fator de transcrição
FTFD Fungal Transcription Factor Database
GO Gene Ontology
HDR Reparo dirigido por homologia MM Meio Mínimo
NHEJ Via de união de extremidade não-homóloga
RPKM Reads por Kilobase por Milhão de Reads Mapeados SREBP Proteína de ligação ao elemento regulador de esterol
TM Tunicamicina
TOM Topology Overlap Measure UPR unfolded protein response
WGCNA Weighted gene co-expression network YG Yeast Glucose
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO...12
2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...13
2.1. Biorefinarias e bioprodutos...13
2.2. Produção de proteínas em fungos filamentosos...14
2.3 Fatores de transcrição em fungos ...17
2.4 Fungos ascomicetos: Aspergillus nidulans como modelo de estudo...20
2.5 Redes de co-expressão genéticas: Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA)...20
3.OBJETIVOS...22
3.1 Objetivo geral...22
3.2 Objetivos específicos...22
4. MATERIAL E MÉTODOS...23
4.1 Manutenção de cepas e meio de cultivo. ...23
4.2 Análise dos genes diferencialmente expressos...23
4.3 Construção de rede de co-expressão e análise de enriquecimento de Gene Ontology (GO...24
4.3.1 Construção de rede de co-expressão...24
4..3.2 Análise de enriquecimento de Gene Ontology (GO) ...24
4.4 Construção dos vetores para deleção via CRISPR-Cas9...24
4.4.1 Construção dos insertos (biobricks) ...24
4.4.2 Construção dos vetores de expressão...25
4.5 Construção do vetor de expressão ...26
4.5.1 Amplificação do gene de uma alfa-L-arabinofuranosidase para expressão heteróloga...26
4.5.2 Clonagem do gene de interesse no vetor de expressão...26
4.6 Transformação em A. nidulans A773 ΔnkuA...27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...27
5.1 Seleção dos Fatores de Transcrição por análise de transcriptoma...27
5.2 Deleção dos fatores de transcrição por CRISPR-Cas9...32
5.3 Caracterização fenotípica...35
5.3.1 Estresse de parede celular...35
5.3.2 Estresse iônico...37
5.4.3 Estresse osmótico...37
5.3.4 Esporulação...38
5.3.5 Estresse oxidativo...39
5.4 Ensaio de secreção de proteases...40
5.5 Construção e análise da rede de co-expressão dos mutantes...42
5.6 Clonagem de abfA em um vetor de expressão...46
5.7 Construção de cepas super-expressando uma enzima heteróloga...47
6. CONCLUSÕES...48
7. REFERÊNCIAS...49
ANEXO 1. Lista de primers e oligonucleotideos ...58
ANEXO 2. Combinação dos primers para formação dos BBs...60
ANEXO 3. Lista de cepas utilizadas...61
ANEXO 4. TERMO DE BIOSSEGURANÇA...62
1. INTRODUÇÃO
Os fungos filamentosos são responsáveis por aproximadamente 50% das enzimas industriais disponíveis, constituindo a melhor promessa como hospedeiros para produção de proteínas recombinantes em escala industrial1,2. No entanto, o alto custo de produção dessas enzimas e sua baixa eficiência têm limitado a aplicação na indústria – é o caso da produção do bioetanol onde a hidrólise enzimática (isto é, sacarificação) continua a ser uma das principais dificuldades devido à recalcitrância da parede celular vegetal, e à eficiência limitada dos coquetéis enzimáticos atuais para converter biomassa vegetal em bioprodutos. É por esse motivo que a indústria exige enzimas mais estáveis, mais ativas e economicamente viáveis3–5. Com o alto preço associado a produção de enzimas necessárias para degradação de biomassa lignocelulósica e a necessidade das biorefinarias nacionais em importar estas enzimas6, a perspectiva da manipulação dos fatores de transcrição em fungos filamentosos, utilizando A. nidulans como modelo, torna-se interessante. A hipótese é que a manipulação de fatores de transcrição poderá gerar cepas superiores quanto a produção de enzimas, reduzindo potencialmente o preço de enzimas e, consequentemente, o preço final do etanol de segunda geração, além do preço final de uma ampla gama de produtos químicos, incluindo ácido 3-hidroxipropiônico, ácido lático, furfural, sorbitol, 1- butanol, entre outros7.
Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo manipular fatores de transcrição selecionados a partir de dados de expressão gênica diferencial por RNA-seq, ao combinar estratégias de indução de estresse celular em A. nidulans, como tratamento com drogas e o design de cepas recombinantes expressando enzimas heterólogas sob controle de um promoter forte. A deleção destes fatores de transcrição traz dados interessantes para a comunidade e, principalmente, gerou dados importantes para propor estratégias de engenharia racional de modo a melhorar o processo de secreção e, assim, diminuir o custo de produção de enzimas.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Biorrefinarias e bioprodutos
As emissões de gases do efeito estufa aumentarão consideradamente nas próximas décadas se nenhuma ação for tomada. Neste contexto, espera-se que a biomassa vegetal desempenhe um papel crítico para mitigar o aquecimento global, evitando que exceda o limite de 1,5°C acima dos níveis pré-industriais8,9. A biomassa possui um potencial significativo na mitigação das mudanças climáticas por poder ser um participante fundamental na produção de biocombustíveis, tais como o bioetanol e o biodiesel, e produtos químicos de base biológica em biorrefinarias, sendo que as previsões atuais estimam uma taxa de crescimento anual para os mercados de bioprodutos de 20% na próxima década e uma participação de mercado para biocombustíveis e biomateriais de cerca de 17% a 30% até 205010,11.
A biomassa lignocelulósica é o material vegetal mais abundante no nosso planeta, consistindo principalmente em paredes celulares de plantas, contém uma estrutura complexa de polissacarídeos, proteínas e lignina, que diferem muito na composição e ligação monoméricas12. Os polissacarídeos da parede celular da planta interagem entre si, para formar uma rede de ligações que conferem rigidez à parede celular (Fig. 1)13.
Figura 1. Estrutura da biomassa lignocelulósica. Imagem adaptada de Rubin, 200813.
Existem duas gerações de biocombustíveis, sendo que, no que concerne a produção de bioetanol, a primeira geração (1G) é caracterizada pela produção do biocombustível através da fermentação da sacarose de cana de açúcar, ou do amido de milho. Por sua vez, a segunda geração (2G) se refere a produção de bioetanol através da degradação da biomassa
lignocelulósica14. No entanto, para que a produção e viabilização do etanol 2G seja possível, é necessário o barateamento e aumento da eficiência nas técnicas de pré-tratamento e hidrólise enzimática4.
O pré-tratamento torna-se necessário porque a biomassa vegetal é altamente recalcitrante e não é diretamente fermentada a bioetanol. Assim sendo, as cadeias de polissacarídeos precisam estar acessíveis para a hidrólise enzimática gerando, assim, açúcares fermentáveis4. Por meio do processo de fermentação, estes açúcares podem ser convertidos não apenas a etanol 2G, mas também em uma série de outros produtos químicos, como por exemplo ácido 3-hidroxipropiônico, ácido lático, furfural, sorbitol, 1-butanol, entre outros (Fig. 2)7.
Figura 2. Processo de produção do etanol e outros produtos químicos através da degradação da
biomassa lignocelulósica. Imagem adaptada de Brandt et al., 201315.
Os principais produtores de enzimas hidrolíticas são os fungos filamentosos, devido à sua alta capacidade de secretar um arsenal complexo de enzimas capazes de desconstruir os polissacarídeos da parede celular de plantas4. Além disto, os fungos filamentosos constituem uma rica fonte de enzimas e metabólitos bioativos para as indústrias de biotecnologia, alimentos e produtos farmacêuticos, sendo que apenas uma pequena fração dessas atividades foram identificadas e caracterizadas16.
2.2. Produção de proteínas em fungos filamentosos
A produção de proteínas tem uma ampla aplicação nas ciências da vida, biotecnologia, medicina e ciências de materiais. Os fungos filamentosos são as principais e mais eficientes fabricas para a produção de proteínas em escala industrial servindo como fonte de
enzimas industrialmente relevantes, como por exemplo: amilases, celulases, lipases, pectinases e proteases1,2,17.
Uma das grandes vantagens na utilização de fungos filamentosas para produção de proteínas, em comparação com outros organismos, é o fato deles possuírem sistemas maduros para processamento pós-traducional (por exemplo, glicosilação, clivagem por proteases e formação de ligações dissulfeto), que são indispensáveis para a função e atividade das proteínas18. Ademais, como os fungos filamentosos desempenham um papel importante na recirculação da biomassa nos ecossistemas eles possuem uma grande diversidade metabólica tornando-os capazes de utilizar eficientemente vários monossacarídeos, incluindo xilose, arabinose e galactose, enquanto que por exemplo, leveduras só podem metabolizar glicose e manose19.
Entretanto, mesmo caracterizando-se como uma eficiente fabrica para produção de proteínas, para sua ampla utilização na indústria é necessário uma diminuição no custo associado a produção de enzimas e aumento na eficiência, é por isto que uma combinação de engenharia de processos, mutagênese aleatória e, mais recentemente, engenharia genética vem sendo aplicada, conseguindo então gerar cepas superiores quanto a produção de enzimas (Tabela 1)5,20.
Tabela 1. Exemplos de engenharia genética de fungos filamentosos para aumentar a secreção de proteínas. Tabela adaptada de Wang et al., 202020.
Proteína de interesse e sua
origem
Hospedeiro Estratégia Secreção
de proteína em fold change Referência α-galactosidase de Aspergillus niger
A. niger Trocando o peptídeo sinal original pelo peptídeo sinal da glucoamilase de A. niger Aproximadamente aumento de 9-fold 21 Eritropoietina de humano Trichoderma reesei
Utilizando o peptídeo sinal da celobiohidrolase I (CBH) e otimizando o promotor cbh1 Não aplicável 22 Quimosina bovina Aspergillus oryzae
Fusão da proteína alvo com α-amilase naturalmente secretada
β-glucuronidase
de A. niger
A. niger Regulação das vias de UPR e ERAD pela superexpressão de sttC
e deleção de doaA
Não quantificada 24
Glicose oxidase de A. niger
T. reesei Regulação das vias de UPR e ERAD pela superexpressão de
bip1 e hac1 Aumento de 1,5-1,8 fold 25 Glicose oxidase de T. reesei
T. reesei Otimização do transporte intracelular através da superexpressão da snc1 Aumento de 2,2- fold 25 Lacasse de Trametes versicolor
A. niger Construção de uma cepa deficiente em proteases pela deleção de
pepAa, pepAb ou pepAd
Aumento de 1,21-1,42- fold
26
Proquimosina bovina
A. niger Otimização do transporte intracelular através da deleção de
Aovip36 ou Aoemp47, e fusão da
proteína alvo com α-amilase
Aproximadamente aumento de 2-fold
27
Glucoamilase de A. niger
A. niger Regulação da morfologia do micélio pela deleção de racA
Aumento de 4-fold 28 Celulase de Neurospora crassa
N. crassa Regulação da via SREBP pela deleção de 2, tul-1, sah-,
dsc-4, scp-1, ou rbd-2
Não quantificada 29,30
Desta maneira, para que seja possível continuar o processo de aumento da produtividade e a especificidade da secreção enzimática é necessária uma maior compreensão dos aspectos fundamentais da síntese e secreção de enzimas em fungos (Fig. 3)20,31. Para este fim, pesquisas atuais estão sendo realizadas em mecanismos celulares para o controle interno da qualidade de proteínas, estresse de secreção, genômica funcional relacionada à expressão e secreção de proteínas, modificação pós-traducional, aplicação de promotores de expressão alternativos, identificação de fatores de transcrição específicos e correlação entre a fisiologia fúngica e produtividade 1,32.
Figura 3. Via de secreção de proteínas em fungos filamentosos. As proteínas recém-sintetizadas entram
no retículo endoplasmático (ER), no qual são enoveladas e modificadas, por exemplo, glicosiladas. A partir daí, as proteínas são entregues ao aparelho de Golgi por transporte de vesículas através das proteínas SNARE. Após outras modificações no aparelho de Golgi, como glicosilação e processamento de peptídeos, as proteínas são novamente secretadas pelo tráfego vesicular para a ponta das hifas e liberadas no meio. As proteínas desenoveladas ou com enovelamento incorreto são classificadas no ER e direcionadas ao proteassoma ou aos vacúolos para degradação. Imagem adaptada de Wang et al., 2020
20.
Enzimas fúngicas são extremamente relevantes para as biorrefinarias, e a utilização de engenharia genética para manipulações nos principais reguladores da degradação da biomassa vegetal são capazes de gerar cepas com maior expressão/produção de enzimas. Um exemplo disto, é a manipulação dos fatores de transcrição: xyr1, cbh1, cre1, ace1, ace3, lae1 e vel1 (artigo de revisão33), ara134, clr-1/clr-235, entre outros. Dessa maneira, ao se investigar mais profundamente esses sistemas de regulação é possível melhorar significantemente o rendimento de enzimas degradadoras da biomassa vegetal e assim, aumentar a produção de biocombustíveis e bioprodutos.
2.3 Fatores de transcrição em fungos
Os fatores de transcrição são proteínas reguladoras que, ao se ligarem a sequências especificas de DNA, controlam, seja ativando ou suprimindo, a taxa de transcrição de genes alvo36. Existem três superfamílias e três famílias de fatores de transcrição que são específicas de fungos, ou seja, elas estão presentes apenas em fungos, não sendo, portanto, encontradas em outros reinos. Assim, as três superfamílias são as seguintes: ‘Zn-cluster’, ‘Zinc domain
conserved in yeast copper-regulated transcription factors’, ‘DNA-binding domain of Mlu1-box-binding protein MBP1’. Por sua vez, as famílias são: ‘APSES’, ‘Fungal-specific transcription factor domain’ e ‘MAT α 1’ 37.
A maior classe de domínios específicos de fungos é a ‘Zn-cluster superfamily’. Este domínio também pode ser encontrado sob os nomes Zn(II)2Cys6, ou Zinc Binuclear Cluster e é uma classe multifuncional de fatores que regulam uma infinidade de processos celulares, tais como: metabolismo de açúcar e aminoácidos, gliconeogênese, respiração, síntese de vitaminas, ciclo celular, remodelação de cromatina, utilização de nitrogênio, proliferação de peroxisomos, resistência a drogas, resposta ao estresse 37,38.
Ao contrário do domínio multifuncional ‘Zn-cluster superfamily’, os representantes das outras duas superfamílias específicas de fungos são mais restritas nas suas funções. O ‘Zinc domain conserved in yeast copper-regulated transcription factors’ apresenta função na utilização de cobre e resposta ao estresse, enquanto o ‘DNA-binding domain of Mlu1-box-binding protein MBP1’ apresenta função relacionada ao ciclo celular 37,39,40.
Até ao momento, a maioria dos fatores de transcrição em fungos ascomicetos relacionados a degradação da parede celular vegetal são pertencentes à ‘Zn-cluster superfamily’, onde há uma tendência de os reguladores positivos pertencerem à classe Zn2Cys, enquanto os repressores tendem a ser parte da classe Cys2His2 41.
A Figura 4 representa a rede desses reguladores, com base em (e combinando) o conhecimento atual de sistemas modelo, como Aspergillus sp., N. crassa e T. reesei. Este esquema é uma visão geral e precisa ser adaptado a todas as espécies de fungos em relação a presença/ausência, função (ões), e possível interação de cada regulador 41.
Figura 4. Visão geral da rede de reguladores envolvidos na degradação da biomassa vegetal. Baseia-se (e combina) com o conhecimento atual dos sistemas
modelo Aspergillus sp., Neurospora crassa e Trichoderma reesi. Imagem traduzida de Benocci et al., 2017 41.
BIOMASSA VEGETAL
Inulina Amido
Inulases Amílases Maltases Mannanases Celulases Xilanases Galactoses Galactases Rhamnosidase Pectinases
Celulose Hemicelulose Pectina
Via da
D-Manose Glicólise Pentose Catabolic PathwayVia das Pentoses-Fosfato Oxido-redutoraVia
Via Leloir Via da
L-Rhammonose Via do Ácido D-galacturônico Reprimindo Induzindo Indução metabólica
Regulador presente em quase todos fungos
2.4 Fungos ascomicetos: Aspergillus nidulans como modelo de estudo
O gênero Aspergillus é um dos fungos filamentosos, e microrganismos em geral, mais utilizados comercialmente. Como todos os fungos filamentosos, eles crescem por meio da extensão das hifas, que se ramificam sub-apicamente para formar uma rede de hifas chamada micélio42. Aspergilli se tornou um dos grupos mais amplamente estudados de fungos filamentosos devido ao seu potencial na degradação de biomassa vegetal e capacidade de secretar uma miríade de enzimas hidrolíticas, tais como celulases e hemicelulases41,43,44.
No que diz respeito às celulases, três principais atividades enzimáticas estão envolvidas na hidrólise de celulose: 1) endoglucanases; 2) exoglucanases, incluindo celodextrinases e celobiohidrolases; e 3) β-glucosidases. No que concerne as hemicelulases, são necessárias endo-β-1,4-xilanases e β-xilosidases para a degradação da cadeia principal de xilano, enquanto que as enzimas acessórias, tais como β-glucuronidases, α-arabinofuranosidases, acetil xilano esterases e feruloil esterases são enzimas que removem os grupos substituintes laterais44.
Considerando-se o gênero Aspergillus, a espécie A. nidulans possui uma ampla gama de ferramentas genômicas, genéticas e bioquímicas que torna essa espécie uma plataforma modelo para análises de processos associados à desconstrução da parede celular vegetal45.
Segundo os dados de sequenciamento, a espécie A. nidulans tem 10.988 genes no seu genoma, dos quais quase 40 e 50% dos genes são "hipotéticos" e carecem de previsões funcionais 46,47. Além disso, apenas entre 10% a 15% dos genes com funções preditas foram estudados experimentalmente em fungos filamentosos e, portanto, têm uma ORF verificada 47,48. Uma abordagem poderosa para superar essa limitação nas anotações é o interrogatório de redes de co-expressão gênica com base nos conjuntos de dados de transcriptomas disponíveis para fungos filamentosos. Essa riqueza de dados foi recentemente utilizada para melhorar as anotações de genes e atribuir previsões de funções genéticas a 65% dos genes previstos no genoma de A. niger, sendo que esta estratégia pode ser aproveitada para anotação de genes em outras espécies de fungos filamentosos49.
2.5 Redes de co-expressão genética: Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA)
Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) é uma das mais utilizadas ferramentas para criação de redes de co-expressão. Esta ferramenta constrói módulos
de co-expressão utilizando o método de cluster hierárquico em uma rede de correlação criada a partir de dados de expressão, tais como dados de RNA-seq50 (Fig. 5).
Figura 5. Exemplo de uma análise de rede de co-expressão. Primeiro, a correlação é determinada para
cada par de genes possíveis nos dados de expressão. Essas correlações podem então ser representadas como uma rede. Módulos nessas redes são definidos usando uma análise de cluster. A rede e os módulos podem ser investigados para identificar reguladores, enriquecimento funcional, hub genes, entre outros. Os genes potenciais de algum traço (p. ex.: doença) podem ser identificados utilizando uma abordagem de culpa por associação que destaca genes que são co-expressos com vários genes do traço correspondente. Imagem traduzida de van Dam et al., 2017 51.
Para atribuir significado biológico aos módulos, uma das abordagens mais amplamente utilizadas é a realização de analises de enriquecimento funcional entre os genes dentro de um módulo e, supondo-se que os genes co-expressos estejam funcionalmente relacionados, as funções biológicas enriquecidas podem então ser atribuídas a genes sem anotação no mesmo módulo, esta abordagem é popularmente chamada de 'culpa por associação'52. Esta abordagem é amplamente utilizada para identificar novos genes com potencial associação a doenças51 e, em fungos filamentosos, vem sendo utilizada para identificar genes associados à desconstrução de biomassa vegetal 53–55.
3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral
Avaliar, através da manipulação de fatores de transcrição, cepas mutantes de A. nidulans quanto a produção/secreção de enzimas.
3.2 Objetivos específicos
• Seleção dos fatores de transcrição através da análise de expressão diferencial de dados de RNA-seq de cepas super-expressando enzimas heterólogas e expostas a drogas.
• Construção de uma rede de co-expressão gênica com consecutiva identificação de módulos de genes co-expressos.
• Análise de enriquecimento funcional dos módulos contendo os fatores de transcrição selecionados.
• Realização da deleção dos fatores de transcrição selecionados via CRISPR-Cas9. • Validação dos mutantes por PCR.
• Caracterização fenotípica dos mutantes:
§ Estressores de parede celular, osmótico, iônico e oxidativo § Esporulação
§ Ensaio de secreção de proteases
• Clonagem de uma alfa-arabinofuranosidase GH51 (abfA) de A. fumigatus em um vetor de expressão
4. MATERIAL E METODOS
4.1 Manutenção de cepas e meio de cultivo.
Utilizou-se Escherichia coli DH5α como hospedeiro para propagar todos os plasmídeos utilizando meio sólido, 2% de agar, ou Lysogeny broth (LB) líquido contendo 100 µg/ml de ampicilina como meio de cultivo. A cepa A. nidulans A773 (pyrG89;wA3;pyroA4) foi obtida a partir do Fungal Genetics Stock Center (FGSC, Kansas City, KS) e a cepa A. nidulans A773 ΔnkuA (ANID2), foi obtidas a partir do nosso estoque de laboratório. Todas as cepas foram cultivadas em meio mínimo - MM (1X Clutterbucks salts (20X Clutterbucks salts: 1,4 M NaNO3, 0,13 M KCl, 0,042 M MgSO4.7H2O e 0,22 M KH2PO4), 1X elementos traços (1000X elementos traços: 7,2 mM ZnSO4.7H20, 17,7 mM H3BO3, 2,52 mM MnCl2.4H20, 2,72 mM FeSO4.7H20, 0,95 mM CoCl2.5H20, 0,7 mM CuS04.5H20, 0,21 mM Na2Mo4.4H20 e 17,11 mM EDTA) pH 6,5 em 37 °C. O meio foi complementado com 2,5 mg/L uridina e 2,5 mg/L uracila, 1 mg/L piridoxina, concentrações indicadas de CR, CFW, menadiona, sorbitol e cloreto de cálcio (CaCl2). MM sem qualquer fonte de nitrogênio (AMM) foi preparado da mesma maneira que o MM convencional, exceto que todos os compostos contendo nitrogênio foram retirados da solução de Clutterbucks e da solução de elementos traços. Uma solução a 10% v/v de leite desnatado foi preparada separadamente e adicionada a MM ou AMM para uma concentração final de 1% v/v. As placas foram inoculadas com 104 esporos por cepa por 48 ou 120 horas. Para determinar o índice de secreção de protease e garantir a normalização específica da cepa, o diâmetro do halo da protease e da colônia foi medido e dividido apenas pelo diâmetro da colônia56.
4.2 Análise dos genes diferencialmente expressos
Os reads de RNA-seq de trabalhos anteriores realizados no laboratório, correspondentes a cepas de A. nidulans super-expressando proteínas heterólogas e cepas tratadas com drogas, em formato FASTQ tiveram sua qualidade avaliada com FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) e MultiQC57. Eles foram então
importados para o CLC Genomics Workbench v7.5.5
(https://www.qiagenbioinformatics.com/) onde foram mapeadas, no genoma de A. nidulans disponível em Aspergillus Genome Database (AspGD), com os seguintes parâmetros: configuração de mapeamento (length fraction = 0,8, similarity fraction = 0,8, maximum number of hits for a read = 10, mismatch com custo de 2, insertion e deletion com custo 3) e configuração de pareamento (minimum distance = 80 e maximum distance = 150). Os valores
de expressão foram expressos em Reads por Kilobase por Milhão de Reads Mapeados (RPKM). Para identificar os genes diferencialmente expressos, foi realizado um t-teste com 2 grupos (controle e cepas tratadas, cada uma em triplicatas biológicas). Genes diferencialmente expressos foram definidos como tendo fold change ≥ 2 ou ≤ -2 e false discovery rate (FDR) corrected p-value (P-value adj) < 0,05.
4.3 Construção de rede de co-expressão e análise de enriquecimento de Gene Ontology (GO)
4.3.1 Construção de rede de co-expressão
Os módulos de genes co-expressos foram inferidos com os valores de RPKM dos dados da cepa controle e expostas as drogas ditiotreitol (DTT) e a tunicamicina (TM) através de uma análise de Weighted gene co-expression network (WGCNA), implementado como um pacote R50. O soft power β foi escolhida aplicando-se o princípio de scale-free topology, utilizando-se uma scale-free topology index (signed) (R2) > 0.9. Em seguida, a matriz de adjacência foi transformada em uma Topology Overlap Measure (TOM) para minimizar os efeitos do ruído e associações espúrias. A matriz de TOM foi então convertida em uma matriz de dissimilaridade (1-TOM) a partir da qual uma árvore hierárquica de agrupamento (dendrograma) de genes foi baseada. Ramos do dendrograma correspondem a agrupamentos de genes altamente co-expressos (módulos). Um tamanho de módulo mínimo de 30 foi escolhido e os módulos cujos perfis de expressão eram muito semelhantes foram fundidos (MEDissTres = 0,2). Para cada módulo foi designado uma cor exclusiva e arbitrária.
4.3.2 Análise de enriquecimento de Gene Ontology (GO)
Os genes foram funcionalmente classificados usando informações de GO obtidas do FungiDB (fungidb.org) e a análise de enriquecimento de GO foi realizada usando a opção Analyze Results com os parâmetros padrão de aspectos ontológicos, evidências GO (computados versus curados) e p-value 58. Os resultados de enriquecimento foram visualizados via Reduce + Visualize Gene Ontology (REViGO)59.
4.4 Construção dos vetores para deleção via CRISPR-Cas9 4.4.1 Construção dos insertos (biobricks)
Os biobricks foram amplificados por PCR usando a polimerase PfuX760. Todos os primers para amplificação dos fragmentos de PCR usaram como molde o pFC902, como descrito anteriormente61. Todos os produtos de PCR para fins de clonagem foram amplificados
por touchdown com intervalo de temperatura de anelamento máximo variando de 68-48°C (0,5⁰C por ciclo). Os volumes de reação padrão foram de 50 µl (Tabela 2). Os produtos de PCR foram submetidos a digestão com DpnI (New England Biolabs) (20 U, 37°C, 1 h), inativação térmica (80°C por 20 min) e purificada usando o sistema Wizard SV Gel e o sistema PCR Clean-Up System (Promega).
Tabela 2. Configuração de reação de PCR.
4.4.2 Construção dos vetores de expressão
USER cloning ou USER fusion foram realizadas como descrito anteriormente62 com pequenas modificações: O vetor pFC330 contendo uma cassete de digestão PacI/Nt.BbvCI foi digerido como descrito anteriormente61 e 1 µl do vector linearizado, 2 µl de cada um dos fragmentos de PCR (respeitando uma proporção molar 1:10 entre vetor e fragmento) e 1 µl de USER enzyme mix, foram misturados num tubo de PCR de 0,2 ml. A mistura foi incubada durante 30 min a 37 °C, e em seguida por 30 min a 24°C. Posteriormente, a mistura reacional de 8 µl foi usada diretamente para transformar células E. coli DH5α quimicamente competentes. Os transformantes foram plaqueados em meio LB solido suplementado com 100 mg/ml de
Componentes Reação de 50 µl Concentração final Água livre de nucleases 31,5 µl Tampão 5X Phusion HF 10 µl 1X 10 mM dNTPs 1 µl 200 µM 10 µM Primer direto 2,5 µl 0,5 µM 10 µM Primer reverso 2,5 µl 0,5 µM DNA modelo 2 µl 30 ng PfuX7 0,5 µl 1,0 unidade/50 µl PCR 98⁰C 30s 98⁰C Touchdown 68-48⁰C (-0,5⁰C por ciclo) 72⁰C 10s 30s 30s/kb 35x 72⁰C 10min 4⁰C ∞
ampicilina. Colônias foram escolhidas aleatoriamente para cada construção e validadas por PCR de colônia e enviadas para sequenciamento.
4.5 Construção do vetor de expressão
4.5.1 Amplificação do gene de uma alfa-L-arabinofuranosidase para expressão heteróloga
O gene Afu2g15160 correspondente a enzima alfa-L-arabinofuranosidase GH51 foi amplificado diretamente do genoma de Aspergillus fumigatus Af293 por PCR usando a polimerase PfuX760. O gene foi amplificado por touchdown com intervalo de temperatura de anelamento máximo variando de 68-48°C (0,5⁰C por ciclo). O volume de reação padrão foi de 50µl (Tabela 2). O produto de PCR foi purificado usando o sistema Wizard SV Gel e o sistema PCR Clean-Up System (Promega).
4.5.2 Clonagem do gene de interesse no vetor de expressão
USER cloning ou USER fusion foi realizado como descrito anteriormente com pequenas modificações62: O vetor pAC284 contendo um cassete de digestão PacI/Nt.BbvCI, promotor PgpdA, terminador TtrpC, marcador de seleção pyrG e 2kb da sequência alvo – TSI (upstream) e TSII (downstream) – para integração em um local especifico do genoma (Fig. 6) foi digerido e 1 µl do vector linearizado, 5 µl do gene amplificado e 1 µl de USER enzyme mix, foram misturados num tubo de PCR de 0,2 ml63. A mistura foi incubada durante 30 min a 37 °C, e em seguida por 30 min a 24°C. Posteriormente, a mistura reacional de 7μl foi usada diretamente para transformar células E. coli DH5α quimicamente competentes. Os transformantes foram plaqueados em meio LB solido suplementado com 100 mg/ml de ampicilina. Colônias foram escolhidas aleatoriamente para cada construção e validadas via digestão por SwaI.
4.6 Transformação em A. nidulans A773 ΔnkuA
A transformação foi baseada no método descritos para A. nidulans64. Conídios de A. nidulans foram inoculados em YG (Yeast Glucose) e germinados a 30 °C e 130 rpm. Após 10h de incubação, os esporos germinados foram lavados em YG fresco, DSPS (1,1 M KCl, 0,1 M ácido cítrico e 1 M KOH para corrigir o pH para 5,8) e ressuspendidos em uma mistura de: 8 ml de YG, 8 ml de DSPS, 125 mg de lisozima de clara de ovo de galinha e 1,02 g de Vinotaste Pro (Novozymes). A suspensão foi incubada a 30 °C, 100 rpm e, após 2h, os protoplastos foram centrifugados, e lavados por centrifugação (2500 x g, 4°C, 10 min) por duas vezes com 30 ml de KCl 0,6 M. Após a centrifugação, o sedimento foi lavado com 30 ml de STC50 (sorbitol 1,2 M, CaCl2 10 mM e Tris-HCl 50 mM, pH 7,5), depois com 2 ml de STC50, e ressuspendido em 500 µl de STC 50. Em um novo tubo, 10 μl (10 μg totais) do vetor e 10 μl de oligômero para reparo, foi misturado a 100 μl da solução de protoplastos e 50 μl de solução filtrada de PEG 25% em STC 50). Após 20 min no gelo, foi adicionado 1 ml de PEG 25% e a mistura foi incubada à temperatura ambiente por 20 min. Esta suspensão foi então diluída em cerca de 3-4 ml de STC50 e 1 ml da solução diluída foi plaqueada em MM sólido suplementado com sorbitol 1,2 M e piridoxina. As placas foram incubadas a 37 °C até o crescimento dos transformantes.
4.7 Validação de cepas recombinantes
Para triagem de transformantes, um PCR de diagnóstico foi realizado diretamente a partir dos conídios utilizando o protocolo descrito por 65, com modificações. Após a extração do DNA com tampão de ruptura (2% (v/v) Triton X-100, 1% (w/v) SDS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, e 10 mM Tris-HCl pH 8) e esferas de vidro, foram tomadas alíquotas para realizar reações de PCRs utilizando uma DNA polimerase de alta fidelidade (Phusion - New England BioLabs).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Seleção dos Fatores de Transcrição por análise de transcriptoma
Os reads de RNA-seq de trabalhos anteriores realizados no laboratório correspondem a cepas de A. nidulans super-expressando proteínas heterólogas e cepas tratadas com drogas, com o objetivo de induzir o estresse celular por 2h e 8h.
As proteínas heterólogas são: alfa-arabinofuranosidase GH51 (AbfA) e beta-glucosidase GH3 (BglC) de A. fumigatus, e uma mananase GH5 termofílica (1542) de
Archaea). As enzimas da família das glicosil hidrolases (GH) tem funções variadas e atuam na degradação da biomassa lignocelulósica.
Estas cepas foram construídas utilizando o vetor de expressão pEXPYR66 e a avaliação da secreção destas proteínas demonstrou que elas são secretadas em diferentes níveis, AbfA > BglC > 1542 (Fig. 7)67. Estas cepas foram denominadas, A.nidulansAbfA, A.nidulansBglC e A.nidulans1542.
Figura 7. Parâmetros fisiológicos e produção de proteínas heterólogas por cepas recombinantes de A. nidulans. A) A.nidulansAbfA, B) A.nidulansBglC, C) A.nidulans1542. Parâmetros fisiológicos (quadro superior): peso seco de micélio (g), pH final e proteínas extracelulares (mg/ml). Atividade enzimática das cepas de A. nidulans durante diferentes períodos de cultivo (quadro central). A maior atividade enzimática em cada cultura foi considerada 100%. SDS-PAGE das proteínas heterólogas secretadas pelas cepas recombinantes de A. nidulans durante diferentes períodos de cultivo (quadro inferior). As proteínas alvo são indicadas por um asterisco. A caixa vermelha indica uma beta-glucosidase intracelular nativa detectada após 48 h de cultivo. A banda correspondente à proteína 1542 não foi detectada por SDS-PAGE (quadro inferior direito). As barras de erro indicam o desvio padrão de três réplicas. Imagem traduzida de Calzado et al., 201867.
Somado ao estresse biológico induzido pela produção recombinante das enzimas mencionadas, foram utilizadas as drogas ditiotreitol (DTT) e a tunicamicina (TM) para induzir um estresse químico. Esses compostos são capazes de induzir quimicamente estresse de reticulo endoplasmático; que por sua vez, ativa a via de unfolded protein response (UPR) para aliviar este estresse e restaurar a homeostase celular68. Os dados do RNA-seq das cepas de A. nidulans expostas a estas drogas estão disponíveis no SRA (número de acesso: PRJNA575553)69.
A Figura 8 resume esquematicamente as análises realizadas com os reads do RNA-seq e para mais detalhes conferir a seção de Material e Métodos.
Figura 8. Workflow para análise do RNA-seq. Os retângulos em verde representam as análises de
bioinformática. O retângulo laranja é um input externo necessário nas análises seguintes. Os tópicos do lado direito ou abaixo dos retângulos são os programas/pacotes utilizados.
Com os dados de expressão diferencial dos genes, realizou-se uma filtragem para se encontrar apenas os fatores de transcrição diferencialmente expressos. Para isto, foi obtida uma lista de fatores de transcrição de A. nidulans com auxílio de uma base de dados de fatores de transcrição Fungal Transcription Factor Database (FTFD)70. Com a lista obtida, foram encontrados um total de 598 fatores de transcrição em A. nidulans. Para identificar alterações de expressão comuns aos diferentes tratamentos, os fatores de transcrição diferencialmente expressos foram plotados em um diagrama de intersecção (Fig. 9).
Como pode ser observado na Figura 9 os genes AN7913, AN9373, AN7331 e AN8772 foram os que estavam diferencialmente expressos em mais condições, sendo que o gene AN7913 estava diferencialmente expresso em todas as condições de cepas super-expressando proteínas heterólogas (2h BglC, 8h BglC, 8h AbfA, 2h AbfA, 8h 1542 e 2h 1542) e em duas condições quando exposto a drogas (8h TM e 8h DTT). Além destes 4 FTs, o gene AN7592 também merece especial destaque por estar diferencialmente expresso somente e na maioria das condições de cepas super-expressando proteínas heterólogas (2h BglC, 8h BglC, 8h AbfA e 8h 1542).
Figura 9. Diagrama de intersecção mostrando os fatores de transcrição diferencialmente expressos (P-value adj < 0,05 e fold change ≥ 2 ou ≤ -2). TM: tunicamicina, DTT: ditiotreitol, AbfA:
arabinofuranosidase, BglC: beta-glucosidase, 1542: mananase GH5 termofílica, 2h: 2 horas de tratamento, 8h: 8h de tratamento. A figura foi criada com o software UpsetR 71.
Desta maneira, um total de 5 fatores de transcrição, primariamente selecionados pelo padrão de expressão diferencial nas condições de superexpressão de proteínas heterólogas, foram selecionados (Tabela 3), e seus níveis de expressão diferencial foram comparadas com a cepa controle (Fig.10). Estes fatores de transcrição identificados sob condições de estresse por superexpressão de enzimas heterólogas e reagentes químicos podem representar reguladores importantes para restaurar a homeostase celular.
Tabela 3. Lista dos genes selecionados por análise de RNA-seq.
Nome sistemático
Ortólogo em
Saccharomyces cerevisiae
Dos 5 genes selecionados 2 tem ortologos em Saccharomyces cerevisiae (Tabela 2). O ortólogo em S. cerevisiae do gene AN7592 é o PIP2/ YOR363C um fator de transcrição ativado por oleato; subunidade de um complexo heterodimérico com Oaf1p, que se liga a elementos de resposta de oleato (ORE) no promotor de genes envolvidos na beta-oxidação de ácidos graxos, organização e biogênese de peroxissomo. Enquanto o ortólogo do gene AN9373 em S. cerevisiae é o UPC2/ YDR213W uma proteína de ligação ao elemento regulador de esterol (SREBP); que após a depleção de esterol induz genes biossintéticos de esterol, e atua em condições ricas como um sensor de esterol77.
AN7331 - lambda repressor-like DNA-binding
domains
Tem domínio(s) predito como
DNA binding, cyanate hydratase activity e função no cyanate metabolic process
-
AN7592 PIP2 Fungal Zn(2)-Cys(6) binuclear cluster domain
Tem domínio(s) predito como
DNA-binding transcription factor activity, RNA polymerase II-specific, zinc ion binding activity, função na regulation of transcription, DNA-templated e
localização nuclear.
-
AN7913 - Zinc finger C2H2-type Proteína de função desconhecida; membro do F9775 secondary metabolite gene cluster 72–75
AN8772 - Basic-leucine zipper (bZIP) domain profile
Fatores de transcrição da família bZIP
76
AN9373 UPC2 Fungal Zn(2)-Cys(6) binuclear cluster domain
Tem domínio(s) predito como
DNA-binding transcription factor activity, RNA polymerase II-specific, zinc ion binding activity, função na regulation of transcription, DNA-templated e
localização no núcleo
-
Figura 10. Nível de expressão dos 5 fatores de transcrição diferencialmente expressos entre todas as
condições. TM: tunicamicina, DTT: ditiotreitol, AbfA: arabinofuranosidase, BglC: beta-glucosidase, 1542: mananase GH5 termofílica, 2h: 2 horas de tratamento, 8h: 8 horas de tratamento. A figura foi criada com ComplexHeatmap78.
5.2 Deleção dos fatores de transcrição por CRISPR-Cas9
O mecanismo imunológico bacteriano e archaeal CRISPR (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas9 foi recentemente transformado em um poderoso sistema de edição de genes79,80. O sistema CRISPR-Cas9 consiste em apenas dois componentes, a nuclease Cas9 e um RNA guia quimérico (sgRNA), e permite a introdução de quebras específicas de fita dupla de DNA (DSBs). O direcionamento preciso da nuclease Cas9 guiada por sgRNA é alcançado pela sequência protospacer do sgRNA81. Para a deleção dos fatores de transcrição foi utilizado um vetor baseado em AMA1; para replicação autônoma e extrachromosomal do vetor, contendo a marca de seleção pyrG e Cas9, onde os sgRNA foram inseridos por USER cloning (Fig. 11)61. Todos os primers e oligonucleotídeos utilizados estão no Anexo 1.
Figura. 11. Construção do vetor CRISPR-tRNA com 2-sgRNAs (A) O pFC902 serve como modelo
para as reações de PCR gerando novos genes de sgRNA para novos vetores de CRISPR-tRNA. Todos os biobricks obtidos por PCR são tratados com USER enzyme, misturados com o vetor CRISPR vazio (pFC330), onde o USER-cassette foi aberto com PacI e Nt.BbvCI, e transformado em E. coli para montagem do vetor in vivo por USER fusion. Observe que as caudas dos primers para USER fusion são indicadas por cores idênticas. Para produzir um 2-sgRNA Splicing-Cassette, o biobrick AB contendo o promotor PAf_U3 seguido por um gene de tRNA é amplificado por PCR pelos primers a e b. Por PCR o biobrick sgRNA-tRNA, CD, foi amplificado pelos primers c e d. O último biobrick, EF, que contém o último sgRNA seguido por um gene de tRNA e um terminador TAf_U3, foi amplificado utilizando os
primers e e f. Todos os primers contêm caudas projetadas para a USER fusion, e as sequencias de gRNA,
incluindo o protospacer completo, são estabelecidos através da fusão das caldas dos primers por fusões. No vetor CRISPR-tRNA completo, todos as sequencias de sgRNA estão posicionadas entre genes tRNA idênticos. (B) Ilustração mostrando USER fusion de um 2-sgRNA Splicing-Cassette através de dois
protospacers diferentes no nível de resolução do nucleotídeo. Os “U” vermelhos representam resíduos
de uracila. A sequência protospacer desejada é definida pelas sequências nas caudas de primers representadas por “n” e “N”, portanto, indicando que qualquer sequência pode ser escolhida. É importante ressaltar que, para cada protospacer, a sequência definida por “n” entre U e A e a sequência definida por “N” entre A e U precisam ser complementares para permitir USER fusion. Imagem adaptada de Nødvig et al., 201861.
Os biobricks (Anexo 2) foram amplificados pelo método USER cloning ou fusion, como descrito nos Materiais e Métodos, purificados, ligados ao vetor linearizado e
A
transformados em E. coli. Os vetores foram então extraídos das colônias e confirmados via sequenciamento.
Em eucariotos, duas vias principais são necessárias para reparo da DSBs geradas pela Cas9. A via de união de extremidade não-homóloga (NHEJ) levando diretamente a uma mutação, e a via de reparo dirigido por homologia (HDR). Para aumentar a possibilidade da excisão do gene alvo após o reparo das duas DSBs, a cepa ANID2 foi selecionada por ser deficiente da via NHEJ, desta maneira, o reparo pode ser eficientemente dirigido através da seleção de uma sequência de DNA de reparo (Fig. 12A e 12B)61.
Os vetores para deleção foram então individualmente co-transformados com o oligonucleotídeo de reparo correspondente a cada gene, e a deleção dos 5 fatores de transcrição foi confirmada através de análise de PCR de diagnóstico (Fig. 12C e 12D). Todas as cepas utilizadas se encontram no Anexo 3.
Figura 12. Deleção dos fatores de transcrição por CRISPR-Cas9. A) Posições gerais das sequências
alvo de sgRNAs (linhas pretas finas) e sequências dos oligonucleotídeo de reparo por HDR (indicado por linhas roxas e azuis) no genoma de A. nidulans. Desenho não está em escala. B) Design do oligonucleotídeo de reparo para deleção gênica. As seções roxa e azul se ligam às seções complementares (roxa e azul) do gene alvo, conforme apresentado no painel A. Correspondem a 45pb
upstream (roxo) e 45pb downstream (azul) aos DSB esperados. C) Análise de reações de PCR de
diagnóstico por eletroforese em gel de agarose. Foram realizadas duas reações independentes de PCR para cada um dos genes deletados. Δ representa a cepa com o gene deletado e WT representa a cepa ANID2. D) Desenho do locus dos genes deletados. As setas azuis indicam a posição dos locais de corte pela Cas9-sgRNA. As setas pretas indicam as posições dos primers para análises de PCR de diagnóstico. Os tamanhos de fragmento de PCR esperados das cepas Δ e WT estão indicados.
5.3 Caracterização fenotípica 5.3.1 Estresse de parede celular
Considerando que a via de secreção é essencial para o transporte de enzimas e moléculas precursoras da parede celular em direção às regiões apicais durante o crescimento da hifa, cepas knockout para genes com função predita na via de secreção podem ser sensíveis a compostos que perturbem a síntese e/ou integridade da parede celular fúngica, desta maneira, as cepas mutantes foram analisadas utilizando concentrações variadas de Congo Red (CR) e Calcofluor White (CFW) (Fig. 13). CR e CFW se ligam as cadeias nascentes de quitina e glucano, inibindo assim as enzimas que conectam a quitina ao β-1,3-glucano e β-1,6-glucano, interferindo negativamente na integridade da parede celular82.
Todas as cepas mutantes foram mais sensíveis quando expostas a CFW 5μg/ml ou 10μg/ml, sendo mais pronunciado na cepa ΔAN7592 em 10μg/ml (p < 0,005) (Fig. 13A). Por outro lado, 4 das 5 cepas mostraram sensibilidade em pelo menos uma das concentrações de CR, se destacando a cepa ΔAN7913 que demonstrou maior resistência na presença de CR (p < 0,0005) (Fig. 13B).
Figura 13. Suscetibilidade dos mutantes a diferentes concentrações de Congo Red e Calcofluor White.
Uma cepa controle de A. nidulans (ANID2) e as 5 cepas com os fatores de transcrição deletados (ΔAN8772, ΔAN9373, ΔAN7331, ΔAN7913 e ΔAN7592) foram cultivadas durante 5 dias a 37 ° C em MM sólido na ausência ou presença de A) CFW (5 e 10 µg/ml) ou B) CR (10 e 20 µg/ml). Os resultados foram expressos como a razão entre a média do diâmetro radial de duas réplicas da cepa tratada e o diâmetro radial da cepa não tratada (duas réplicas). (∗ p-value < 0,05, ∗∗ p-value < 0,005, ∗∗∗ p-value < 0,0005 conforme determinado por um teste de one-way ANOVA seguido de teste Bonferroni).
Um dos resultados interessantes nesta análise é a sensibilidade de todos as cepas mutantes a CFW, e um maior crescimento quando CFW foi adicionado em relação a cepa não tratada (razão entre o diâmetro radial da cepa tratada e o diâmetro radial da cepa não tratada >
1). Uma das possíveis razões para este evento é que nas concentrações selecionadas (5 e 10 µg/ml) as cepas foram capazes de reorganizar suas paredes celulares e crescer sem impedimento, sendo assim, testes com outras concentrações de CFW seriam necessários para medir com maior sensibilidade a resposta das cepas mutantes a esta droga, no entanto, os dados com CR nos permitem demonstrar a possível importância de cada um dos fatores de transcrição na integridade de parede celular.
Uma maior resistência da cepa ΔAN7913 a CR comparada com a cepa controle também pode ser observada em uma concentração de 30 μg/ml (Fig. 14).
Figura 14. Cepa ΔAN7913 é mais resistente a presença de Congo Red que a cepa controle. Diluição
seriada (105 – 103 de esporos) das cepas crescidas por 48h em MM suplementadas com 1% de glicose e
30 μg/ml de CR.
Como a cepa ΔAN7913 apresentou maior resistência a CR em todas as concentrações testadas então é possível especular que o gene AN7913 possa ter alguma função na composição/organização da parede celular. Uma das teorias para conferir resistência a CR baseia-se no grupo de proteínas RCR, estas são proteínas da membrana do retículo endoplasmático que regulam a deposição de quitina nas paredes celulares dos fungos e tornam leveduras resistentes a CR por diminuir o conteúdo de quitina na parede celular 83, sendo assim, é possível teorizar que a cepa ΔAN7913 possa ter maior resistência a CR por possuir menor quantidade de quitina na sua parede celular em comparação a cepa controle, porém para que isto seja comprovado, experimentos estudando a composição da parede celular destas cepas precisam ser realizados.
5.3.2 Estresse iônico
Um dos principais reguladores da secreção de proteínas em fungos filamentosos e leveduras, principalmente no processo de formação de vesículas e transporte de proteínas do ER ao Complexo de Golgi, é o cálcio84,85, sendo assim, uma análise utilizando uma concentração de 200 mM de cloreto de cálcio (CaCl2) foi realizada. Nesta análise as cepas ΔAN9373 e ΔAN7592 apresentaram sensibilidade a cálcio em comparação com a cepa controle (p < 0,05) (Fig. 15).
Figura 15. Suscetibilidade dos mutantes a
CaCl2 Uma cepa controle de A. nidulans (ANID2) e as 5 cepas com os fatores de transcrição deletados (ΔAN8772, ΔAN9373, ΔAN7331, ΔAN7913 e ΔAN7592) foram cultivadas durante 5 dias a 37°C em MM sólido na ausência ou presença de CaCl (200mM). Os resultados foram expressos como a média do diâmetro radial de duas réplicas do tratamento dividido pelo diâmetro radial das réplicas do controle (∗
p-value < 0,05, ∗∗ p-value < 0,005, ∗∗∗ p-value < 0,0005 conforme determinado por um teste de one-way ANOVA seguido de teste Bonferroni).
Nesta análise, assim como ocorreu com CFW, houve um maior crescimento na presença de CaCl2 em relação a cepa não tratada. Desta maneira, testes com outras concentrações serão necessários para medir com maior sensibilidade a resposta das cepas mutantes a esta droga.
5.3.3 Estresse osmótico
Para a análise da resposta a estresse osmótico, tanto na membrana plasmática como na parede celular, utilizou-se uma concentração de 1M de sorbitol. Nesta análise todas as cepas mutantes mostraram diferenças fenotípicas, sendo as cepas ΔAN8772, ΔAN9373, ΔAN7331 e ΔAN7913 mais sensíveis, e a cepa ΔAN7592 mais resistente quando comparada a cepa controle (Fig. 16).
Figura 16. Suscetibilidade dos mutantes a
sorbitol. Uma cepa controle de A. nidulans (ANID2) e as 5 cepas com os fatores de transcrição deletados (ΔAN8772, ΔAN9373, ΔAN7331, ΔAN7913 e ΔAN7592) foram cultivadas durante 5 dias a 37° C em MM sólido na ausência ou presença de Sorbitol (1M). Os resultados foram expressos como a média do diâmetro radial de duas réplicas do tratamento dividido pelo diâmetro radial das réplicas do controle (∗ value < 0,05, ∗∗
p-value < 0,005, conforme determinado por um
teste de one-way ANOVA seguido de teste Bonferroni).
De forma geral, todas as cepas mutantes tiveram sensibilidade alterada em pelo menos uma das condições de estresse de secreção, sendo assim, todas podem potencialmente ter funções na via de secreção. Destas 5 cepas, ΔAN7592 e ΔAN9373 se destacam por possuir sensibilidade a todos os estressores testados. Sensibilidade a estressores de parece celular, tais como CR e CFW, além de cálcio e sorbitol, são comumente utilizados como avaliadores de estresse de secreção86.
5.3.4 Esporulação
O processo de esporulação foi analisado e a cepa ΔAN7592 apresentou uma menor esporulação em comparação ao controle (Fig. 17). Este resultado pode ser interessante visto que alguns estudos em A. niger indicam que uma esporulação reduzida favorece na secreção de proteínas, porém os mecanismos moleculares que ligam a secreção de proteínas e a esporulação assexuada ainda não foram completamente esclarecidos 87–89.
