FACULDADE DE ENFERMAGEM
Jéssica da Silva Cunha Breder
EFEITO DO TRATAMENTO TÓPICO COM MEMBRANA DE QUITOSANA E ALGINATO EM FERIDA DE CAMUNDONGOS DIABÉTICOS
CAMPINAS 2017
Jéssica da Silva Cunha Breder
EFEITO DO TRATAMENTO TÓPICO COM MEMBRANA DE QUITOSANA E ALGINATO EM FERIDA DE CAMUNDONGOS DIABÉTICOS
Dissertação apresentada à Faculdade de Enfermagem da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestra em Ciências da Saúde, na Área de Concentração: Cuidado e Inovação Tecnológica em Saúde e Enfermagem.
ORIENTADOR: MARIA HELENA DE MELO LIMA
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO
DEFENDIDA PELA ALUNA JÉSSICA DA SILVA CUNHA BREDER, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA HELENA DE MELO LIMA.
CAMPINAS 2017
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas Ana Paula de Morais e Oliveira - CRB 8/8985
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Effect of topical treatment with chitosan and alginate membrane wound in diabetics mice
Palavras-chave em inglês: Diabetes mellitus Wound healing Biological dressings Chitosan Nursing
Área de concentração: Cuidado e Inovação Tecnológica em Saúde e Enfermagem
Titulação: Mestra em Ciências da Saúde Banca examinadora:
Maria Helena de Melo Lima [Orientador] Hosana Gomes Rodrigues
Maria Esméria Corezola do Amaral Data de defesa: 04-07-2017
Programa de Pós-Graduação: Enfermagem
Breder, Jéssica da Silva Cunha, 1991-
B743e BreEfeito do tratamento tópico com membrana de quitosana e alginato em ferida de camundongos diabéticos / Jéssica da Silva Cunha Breder. –
Campinas, SP : [s.n.], 2017.
BreOrientador: Maria Helena de Melo Lima.
BreDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Enfermagem.
Bre1. Diabetes mellitus. 2. Cicatrização de feridas. 3. Curativos biológicos. 4. Quitosana. 5. Enfermagem. I. Lima, Maria Helena de Melo,1966-. II.
Programa de Pós-Graduação em Enfermagem da Faculdade de Enfermagem da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
ORIENTADOR: Maria Helena de Melo Lima
MEMBROS:
1. Profa. Dra. Maria Helena de Melo Lima 2. Profa. Dra. Hosana Gomes Rodrigues
3. Profa. Dra. Maria Esméria Corezola do Amaral
A Deus, pois a única explicação é o seu poder, de modo que toda a glória cabe a Ele. Aos meus pais, meu esteio, sem eles eu jamais terei apoio e motivação para continuar a caminhada mesmo em meio às dificuldades.
Ao meu marido e melhor amigo, Íkaro, que é a minha melhor parte e quem esteve ao meu lado durante todo este percurso. Obrigada por me oferecer suporte em todos os momentos que precisei.
Aos meus irmãos: que estiveram presentes em meio alegrias e tristezas.
A meus familiares e amigos que de alguma forma me acompanharam nesta jornada. À minha orientadora Maria Helena de Melo Lima, por todo o empenho em compartilhar comigo sua experiência e conhecimento. Agradeço por não ter poupado finais de semana e feriados para me ajudar. Exemplo de persistência e trabalho.
Ao professor Dr. Mario José Abdalla Saad, por ter aberto as portas de seu laboratório e me possibilitar desenvolver minha pesquisa.
Às técnicas do laboratório Sandra Brambilla e Dioze Guadagnini, agradeço por terem me recebido e ajudado nos momentos de dúvidas.
Aos alunos do laboratório do Prof. Mario Saad e Prof. José Barreto que me ofereceram ajuda sempre que solicitado.
Aos alunos do grupo de pesquisa da professora Maria Helena, em especial, a Flávia Azevedo, Priscila A. Peruzzo e Flávia Zanchetta, que me motivaram e me fortaleceram nesta caminhada.
Ao Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Enfermagem da Unicamp. À Fundação Capes do Ministério da Educação.
RESUMO
O reparo de feridas é um processo biológico complexo e dinâmico que envolve as fases: hemostasia, inflamatória, proliferativa e remodelagem. Na presença do diabetes mellitus esse processo de cicatrização torna-se limitado. Estudos mostram que a membrana de quitosana e alginato modula a fase inflamatória, estimula a proliferação de fibroblastos e de fibras colágenas, acelerando o processo de cicatrização em animais saudáveis. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do tratamento tópico com a membrana de quitosana e alginato por meio de marcadores inflamatórios, fibras colágenas em lesões de camundongos diabéticos induzidos com estreptozotocina. O estudo foi composto pelos grupos: CAM (Chitosan and Alginete Membrane), animais tratados com membrana de quitosana e alginato previamente umedecida com salina 0,9% e, o CG (Control Group), animais tratados apenas com solução salina 0,9%. As feridas de ambos os grupos foram umedecidas diariamente com soro fisiológico 0,9% até completa cicatrização. Ao longo de 10 dias as feridas foram avaliadas pelos parâmetros: período de fechamento, histologia, fibras colágenas e concentração de citocinas pró e anti-inflamatórias. Para o cálculo das dimensões das feridas e concentração de proteínas foi utilizado o software IBM SPSS Statistics 20, sendo os grupos comparados utilizando o teste t de Student com nível de significância de p<0,05. No 1º dia pós ferida o grupo CAM mostrou maior concentração das citocinas IL-1α e IL-1β em relação ao grupo CG. No 2º dia pós lesão o grupo CAM apresentou maior quantidade de G-CSF e TNF-α do que o grupo CG. No 5º dia de tratamento o grupo CAM demonstrou significante redução da concentração de G-CSF quando comparado ao grupo CG. No 6º dia após lesão, a área da ferida dos animais do grupo CAM foi significantemente menor do que o grupo CG. O grupo CAM, no 10º dia de tratamento, apresentou menor quantidade de IL-10 e TNF-α quando comparado ao grupo CG. Na análise das fibras colágenas o grupo CAM, no 10º dia após a ferida, mostrou maior quantidade quando comparado ao grupo CG. No mesmo dia o grupo CAM demonstrou um aspecto mais organizado das fibras de colágeno em relação ao grupo CG. Em conclusão, a membrana de quitosana e alginato diminuiu o tempo de cicatrização das feridas, modulou a fase inflamatória e aumentou o número e a organização das fibras de colágeno favorecendo a reepitelização.
ABSTRACT
Wound repair is a complex and dynamic biological process, involving hemostasis, inflammatory, proliferative and remodeling phases. In the presence of diabetes mellitus this healing process becomes limited. Studies have shown that the chitosan and alginate membrane modulate the inflammatory phase, stimulates the proliferation of fibroblasts and collagen fibers, accelerating the healing process in healthy animals. Thus, the objective of this work was to evaluate the effect of topical treatment with the chitosan and alginate membrane by means of inflammatory markers, collagen fibers in lesions of diabetic mice induced with streptozotocin. The study was composed of two groups: CAM (Chitosan and Alginete Group), composed of animals treated with chitosan and alginate membrane previously moistened with 0.9% saline and CG (Control Group), formed by animals treated with saline solution 0.9%. The wounds of both groups were moistened daily with 0.9% saline until complete healing. The wounds were evaluated over 10 days, using different parameters: closure period, histology, collagen fibers and concentration of pro and anti-inflammatory cytokines. The IBM SPSS Satistics software was used to calculate the wound dimensions and protein concentration, and the groups were compared using t-Studant test with a significance level of p<0.05. On the 1st post wounding, the CAM group showed a
higher amount of the IL-1α and IL-1β cytokines than the CG group. On the 2nd post-operative
day, the CAM group presented higher amounts of G-CSF and TNF-α than the CG group. On the 5th day of treatment, the CAM group showed a significant reduction of the G-CSF
concentration when compared to the CG group. On the 6th day after injury, the area of the
wound of the animals of the CAM group was significantly lower than the CG group. The CAM group, on the 10th day of treatment, showed lower amount of IL-10 and TNF-α when
compared to the CG group. In the analysis of the collagen fibers, the CAM group, on the 10th day after the wound, showed greater amount when compared to the CG group. The
same period the CAM group showed a more organized collagen fibers as compared to the CG. In conclusion, the chitosan and alginate membrane accelerating wound healing process, modulated the inflammatory phase and increased the amount and organization of the collagen fibers enhancing reepithelialization.
SUMÁRIO
1. Introdução ... 9
1.1-Pele ... 9
1.2- Ferida ... 10
1.4- Diabetes e a cicatrização da pele ... 11
1.5- Membrana de Quitosana e Alginato ... 12
2. Objetivos ... 14 2.1- Objetivo geral ... 14 2.2- Objetivos específicos ... 14 3.1- Materiais ... 14 3.2- Tipo de estudo ... 14 3.3- Amostras ... 15 3.4- Indução do diabetes ... 15 3.6- Procedimento cirúrgico ... 15 3.8- Coleta de tecido ... 16 3.9- Técnicas de análise ... 17 3.10- Análise Estatística ... 18 3.11- Aspectos Éticos ... 18 4. Resultados ... 18
4.1 Análise morfométrica e histológica (H&E) ... 18
4.2 Análise das fibras colágenas ... 20
4.3 Análise das citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatória ... 22
5. Discussão ... 23
6. Conclusão ... 27
7. Referências ... 27
1. Introdução 1.1-Pele
A pele é um dos maiores órgãos, alcançando 16% do peso corporal e, desempenha múltiplas funções. Entre estas funções podemos citar: proteção do organismo contra desidratação e atrito devido à sua camada queratinizada; por meio de suas terminações nervosas sensoriais, recebe constantes informações sobre o ambiente e as envia para o sistema nervoso central; colabora com a termorregulação do corpo; participação da excreção de várias substâncias por meio das glândulas sudoríparas; função protetora contra raios ultravioleta por meio do pigmento melanina, que é produzido e acumulado na epiderme e, formação da vitamina D3 pela ação da radiação ultravioleta do sol sobre
precursores sintetizados no organismo. Apresenta ainda células do sistema imunitário, que atuam contra a invasão de microrganismos1.
A pele consiste em duas camadas distintas: a epiderme e a derme, uma porção conjuntiva abaixo da epiderme onde se encontram os apêndices (pelos, glândulas sudoríparas e sebáceas) e estruturas como vasos sanguíneos e fibras nervosas. Em continuidade da derme se situa a hipoderme uma frouxa e conectiva camada de tecido adiposo que, embora não faça parte da pele, atua como suporte e união dos tecidos e órgãos adjacentes2.
A epiderme é a camada mais externa constituída por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado1. É composta por células especializadas como queratinócitos, células
responsáveis pela produção de queratina e os melanócitos, células responsáveis pela produção de melanina. Há também as células de Langerhans que atuam na resposta imunológica e as células de Merkel que são mecanoreceptores2.
A derme é constituída por duas camadas de limites distintos: a papilar, superficial, e a reticular, mais profunda. A camada papilar é delgada, constituída por tecido conjuntivo frouxo. Nesta camada estão as fibrilas especiais de colágeno, que se inserem por um lado na membrana basal e pelo outro penetram profundamente a derme. Essas fibrilas contribuem para prender a derme à epiderme1. Os pequenos vasos sanguíneos observados
nessa camada são responsáveis pela nutrição e oxigenação da epiderme. A camada reticular é mais espessa, constituída por tecido conjuntivo denso (fibroblastos e espessos feixes de fibras colágenas e elásticas)1. Os fibroblastos são células alongadas com formato
fusiforme, responsáveis pela síntese da Matriz extracelular (colágeno tipo I e tipo III, elastina, glicosaminoglicanas, fibronectinas), contribuem para formação da membrana
10
basal fonte de proteinases, regulação da diferenciação epitelial, secreção de fatores de crescimento, envolvimento na reparação tecidual e contração na cicatrização3.
1.2- Ferida
A ferida pode ser definida como uma interrupção na continuidade do tecido e a perda da integridade da pele4, é caracterizada pelo rompimento de estruturas e funções dos tecidos
subjacentes5. Pode ser causada por trauma físico, químico ou desencadeada por afecções
clínicas4.
De acordo com o tempo de reparo tecidual as feridas podem ser classificadas, em agudas ou crônicas6. As feridas agudas são as originadas de cirurgias ou traumas, sua reparação
ocorre de forma ordenada e oportuna, o tempo de cicatrização geralmente varia de 5 a 10 dias7. As feridas crônicas são aquelas que não conseguiram prosseguir no processo
ordenado de cicatrização para produzir integridade anatômica e funcional dentro de um período de três meses8.
1.3- Processo de cicatrização da ferida
O processo de cicatrização de feridas é composto por fases que se sobrepõem, sendo elas, hemostasia e inflamação, proliferação e maturação e, remodelação9.
A lesão do tecido causa danos celulares, destruição de vasos sanguíneos e consequentemente o extravasamento de sangue e seus constituintes, provocando degranulação de plaquetas e ativação da cascata de coagulação e do sistema complemento9. A formação do coágulo é capaz de restabelecer a hemostasia e dar início a
formação da matriz extracelular provisória para que seja possível a migração celular. As plaquetas por sua vez, liberam grânulos que funcionam como um reservatório para proteínas biologicamente ativas, tais como, fator de crescimento transformante-β (TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)10 e fator de crescimento vascular
endotelial (VEGF)9. Os mediadores liberados pelas plaquetas ativadas se difundem pela
matriz provisória formando um gradiente quimiotático que orienta a migração de células envolvidas na resposta inflamatória11. Em resposta a este gradiente, neutrófilos e
macrófagos, infiltram a área da ferida e auxiliam no desbridamento e remoção do tecido desvitalizado e de partículas estranhas11. Essas células são essenciais para o sucesso do
(IL-1α), interleucina 1-Beta (IL-1β), fator de necrose tumoral-alpha (TNF-α) 11-14, que são
responsáveis por disparar e realçar a fase inflamatória13,14. Outro fator essencial para a fase
inflamatória é o fator estimulante da produção de colônia de granulócitos (G-CSF) este prioriza o desvio da hematopoiese em direção a linhagens mielóides através do sinal transdutor G-CSF15,16. Consequentemente, mais neutrófilos maduros são produzidos e
liberados dentro da circulação17. A interleucina10 (IL-10), outra interleucina crucial para o
processo de cicatrização, é um dos mais conhecidos sinalizadores negativos da inflamação, acredita-se que ela seja o mais importante mediador com papel limitador e finalizador da resposta inflamatória18.
Com a presença local de macrófagos e a produção e liberação dos mediadores químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é intensificada11. Essas células
são os principais componentes do tecido de granulação, elas migram das margens da ferida para o seu centro11. Isto ocorre pela matriz provisória formada e seguindo a orientação do
gradiente químico11. Com o aumento do número de fibroblastos ativados para a produção
de colágeno no local, a matriz extracelular começa a ser substituída por um tecido conjuntivo mais forte e mais elástico12. Este processo é denominado de fibroplasia e para
a sua eficiência é necessária a ocorrência de neovascularização da região11. Com as
modificações na matriz extracelular, os fibroblastos passam a se engajar na síntese proteica e o processo de contração da ferida alcança a sua eficiência máxima11.
A Fase de remodelagem envolve a migração e proliferação de queratinócitos19. O
crescimento e a diferenciação de queratinócitos são regulados principalmente por fatores de crescimento, dos quais os membros da família do fator de crescimento epidérmico (EGF) são os mais importantes para a cicatrização de feridas20. Estes fatores de crescimento se
ligam a seus receptores iniciando a proliferação e migração de queratinócitos, com consequente reepitelização 21.
1.4- Diabetes e a cicatrização da pele
De acordo com a literatura, na ferida do paciente diabético não é observado distinção clara entre as fases de cicatrização, quando comparado ao processo de cicatrização de um indivíduo sem diabetes22.Em detrimento da cicatrização, a resposta inflamatória é
prolongada mantendo a liberação de citocinas pró-inflamatórias, tais como, interleucina-1 (IL-1) e TNF-α23-25.A expressão dos fatores de crescimento e seus níveis funcionais tem
12
sido encontrado reduzidos em feridas de pacientes diabéticos26,27.Os fibroblastos exibem
uma diminuição na proliferação e na habilidade de migração combinado ao aumento da apoptose25,28.
Os queratinócitos, na presença do diabetes, demonstram características anormais, tais como, aumento da proliferação, diminuição de sua diferenciação e prejuízo em sua habilidade de migração. Há também aumento de atividade da Matrix de metaloproteinases (MMPs) e redução dos seus inibidores, diminuição da síntese de colágeno, deficiência na migração de fibroblastos e atraso na repitelização29. O conjunto destes fatores contribui
para o reparo lento da ferida22,25.
1.5- Membrana de Quitosana e Alginato
A cobertura ideal para as lesões de pele tem como finalidade principal protegê-las do ambiente externo, sendo também desejável a capacidade de manter a umidade, atuação como isolante térmico, possibilidade de remoção sem danos ao tecido viável, ser livre de partículas e toxinas, estimular reconstituição tecidual e absorver o exsudato30.
O tratamento de feridas evoluiu nas últimas três décadas a partir da introdução dos primeiros curativos oclusivos simples para medicamentos e materiais biológicos31,32.
Estudos demonstram que curativos com biomateriais adequados melhoram o processo de cicatrização da ferida por oferecer proteção contra colonização/infecção, proporcionar um ambiente úmido, evitar traumas, além de possibilitar a liberação de substâncias bioativas33,34. A literatura aponta o uso de polímeros biorreabsorvíveis de origem natural
como quitosana, alginato, gelatina, celulose e seus derivados com uso combinado ou não para o cuidado em feridas30,35,36. Evidências demonstram que coberturas com a quitosana
e alginato modulam a cicatrização de feridas por meio de suas propriedades antibacterianas, estímulo a deposição de colágeno e da epitelização34. Estudo que
investigou o reparo tecidual em animais saudáveis com a membrana de quitosana e alginato concluiu que esta foi capaz de modular a fase inflamatória, a fibroplasia e colagênese, contribuindo para o processo de cicatrização37.
A quitosana, obtida por desacetilação parcial de quitina, pode ser encontrada no exoesqueleto de crustáceos35 é um polissacarídeo formado por dois monômeros, a
D-glicosamina e N-acetil-D-D-glicosamina39,40. Ela é um composto biologicamente renovável,
melhorando as funções de células inflamatórias, macrófagos e fibroblastos41-43. A
resistência mecânica da quitosana é baixa, assim como a capacidade de absorver fluidos corpóreos; a alternativa para auxiliar esta limitação é a combinação da quitosana com outros materiais43, tais como, heparina44 xantana45 e alginato, ou mesmo a polímeros
sintéticos como a policaprolactona44,45.
O Alginato, um polímero hidrofílico aniônico, pode ser extraído a partir de algas marinhas marrons, sendo biocompatível e biodegradável sob condições fisiológicas normais, capaz de manter um microambiente fisiologicamente úmido que promove a formação de tecido de granulação41,42,46,47. O processo básico de obtenção do alginato e seus sais começa com
sua extração alcalina da massa de algas, alcançando-se um extrato contendo alginato de sódio solúvel e resíduos insolúveis de algas que podem ser removidos por filtração47. Ao
filtrado (solução de alginato de sódio solúvel) adiciona-se cloreto de cálcio ou ácido clorídrico, em seguida precipitando-se o polímero na forma de alginato de cálcio ou de ácido algínico, que pode ser adicionalmente processado47. Os curativos a base de alginato são
bem aceitos na prática clínica devido suas características benéficas. Eles atuam na troca iônica ente os íons de cálcio da solução do alginato e os íons do sódio do exsudato formando um gel. O gel mantém a umidade do leito da ferida, contribuindo para manutenção da temperatura em níveis desejados, evitando trauma do tecido em formação, o que promove a formação de tecido de granulação, reepitelização e contração da lesão. O alginato também minimiza a dor do paciente48.
Em comparação com os compostos isolados, a junção da quitosana com o alginato forma complexos polieletrolíticos (PEC), este complexo é capaz de mudar a tendência da ferida em edemaciar, observando-se melhora na resistência estrutural e na estabilidade mecânica37. O interesse pela utilização de PEC de quitosana e alginato tem aumentado nas
áreas de coberturas para feridas, e na formulação de tecidos moles que funcionem como estruturas para migração, proliferação e organização de células no microambiente da ferida48,50. Adicionalmente, a interação entre quitosana e alginato, protege a ferida contra a
entrada de microrganismos contaminantes, visto que tal membrana não se mostra permeável às bactérias tipicamente encontradas em lesões de pele51.
O tratamento de feridas é um processo dinâmico e cada fase do reparo tecidual demanda uma cobertura específica, por isso vários grupos de pesquisadores investem no desenvolvimento de matrizes de quitosana e alginato para área de coberturas. Dentre estes
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grupos encontra-se o Laboratório de Engenharia de Biorreações e Colóides da Faculdade de Engenharia Química (FEQ) da Unicamp, o qual forneceu a tal cobertura para a atual pesquisa.
Uma vez que a cicatrização de feridas se encontra prejudicada nos animais diabéticos, aventamos a hipótese de que tal processo seja otimizado pela membrana de quitosana e alginato por meio de suas inúmeras propriedades benéficas descritas.
2. Objetivos
2.1- Objetivo geral
Avaliar o efeito do tratamento tópico da membrana de quitosana e alginato no processo de cicatrização de camundongos diabéticos.
2.2- Objetivos específicos
Investigar os efeitos da membrana de quitosana e alginato na modulação das citocinas inflamatórias durante o processo de cicatrização.
Analisar os efeitos da membrana de quitosana e alginato na produção das fibras de colágeno durante o processo de cicatrização.
3. Métodos 3.1- Materiais
A membrana de quitosana e alginato foi desenvolvida pelo Laboratório de Engenharia de Biorreações e Colóides da FEQ/Unicamp sob a responsabilidade da Profa. Dra. Ângela Maria de Moraes e foi fornecida pelo mesmo.
3.2- Tipo de estudo
Trata-se de um estudo experimental, no qual foi investigada a evolução de feridas cutâneas provocadas na região dorsal de camundongos.
3.3- Amostras
Foram utilizados 52 camundongos Black-57 isogênicos/C57BL/6/JUinb (Mus muscullus), machos, de idade adulta (8-10 semanas) e com o peso aproximado de 25g. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas de polietileno com tampa de aço inox forradas com maravalha auto-clavada, trocadas três vezes por semana. A temperatura ambiente foi mantida em torno de 20°C à 25°C, com umidade relativa do ar e a quantidade de ruído mantido em condições ideais. O foto-período foi controlado para prover luz durante 12 horas diárias (6:00 às 18:00 horas). Foi disponibilizada ração padrão para a espécie e água potável ad libitum.
3.4- Indução do diabetes
O diabetes foi induzido em camundongos com 6 semanas de idade com cinco doses consecutivas de 60 mg/Kg de estreptozotocina intra-peritoneal (Sigma ® - ST Luis, MO U.S.A) (STZ) diluída em de tampão citrato 0,1M pH 4,5 49. Após 14 dias o nível glicêmico
de cada animal foi avaliado por meio de amostra de sangue da veia caudal, com o glicosímetro (Accu-chek Active), após 4 horas de jejum. Foram incluídos no estudo os animais com glicemia ≥ 250 mg/dl.
Os animais foram divididos em dois grupos, Grupo CAM, formado por animais tratados com membrana de quitosana e alginato previamente umedecidos com salina 0,9% e CG, formado por animais tratados somente com solução salina 0,9%. As feridas de todos os animais de ambos os grupos foram hidratadas diariamente com soro fisiológico a 0,9% (500μl). Os animais foram tratados até o fechamento completo das feridas.
3.6- Procedimento cirúrgico
O procedimento cirúrgico (realização das feridas) ocorreu quando os animais completaram 8 semanas. Para todos os procedimentos dolorosos foi administrada anestesia geral, feita por aplicação intra-peritonial de 180 mg/Kg de Cloridrato de Ketamina e 8 mg/Kg de Cloridrato de Xilazina53. Antes da realização das lesões foi realizada a tricotomia com
auxílio de lâmina de barbear e logo após, foi feita a antissepsia do local com álcool 70% para posterior realização da lesão. As feridas foram realizadas com auxílio de punch (Miltex® Inc. York, PA 17402 USA) metálico de 8 mm, com lâmina cortante na borda. As
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feridas (duas) foram confeccionadas na região dorsal dos animais e retirada a pele e a tela subcutânea até a exposição da fáscia muscular. Para a confecção das feridas, os animais foram mantidos em decúbito ventral. Imediatamente após a realização da ferida, foi aplicada a membrana de quitosana e alginato previamente hidratada com soro fisiológico 0,9% ou somente soro fisiológico 0,9% dependendo do grupo randomizado. Após a cirurgia, os animais receberam analgésico cloridrato de tramadol (20 mg/kg)54 intraperitoneal por 2 dias
com intervalo de 12 horas; os animais foram colocados em gaiolas individuais, com ambiente enriquecido com canos de PVC e aquecidos para evitar hipotermia.
3.7- Análise macroscópica das feridas
O processo de cicatrização foi avaliado por meio de fotografias tiradas com câmera digital Canon power shot® (modelo SX400 IS). As fotografias foram feitas pelo mesmo avaliador, nos dias zero, 1º, 2º, 4°, 6° e 10° pós-lesão. Para capturar as imagens sem estressar o animal foi realizada narcose com isoflurano (BioChimico) embebido em algodão e acondicionado em uma caixa de acrílico adaptada para este fim. As imagens foram digitalizadas e a área das feridas, mensurada por meio da utilização do software ImageJ 1.49v (Nacional Institutes of Health, USA, JAVA).
O fechamento da ferida foi expresso em porcentagem (%), calculada pela seguinte fórmula matemática55:
[(Área diária) × 100 (Área inicial) ]
3.8- Coleta de tecido
Acesso e retirada dos tecidos: Os animais foram colocados em decúbito ventral e a região da ferida foi retirada com o auxílio de uma pinça dente de rato, punch metálico de 8 mm de diâmetro e uma tesoura ponta fina pequena para remoção da área demarcada. Ao término do experimento os animais sofreram eutanásia com uma overdose de anestésico seguido por deslocamento cervical.
Período pós-incisão: Durante cada dia do experimento os animais foram observados em relação a: atividade motora, aceitação alimentar, aspectos da ferida e óbitos.
3.9- Técnicas de análise
Histologia: A pele removida foi posicionada em pedaços de cortiça e fixada em paraformaldeído 4% (Merk) por 8 horas, em temperatura ambiente. As amostras foram desidratadas e diafanizadas em baterias de etanol 70% (overnight), 95% (I e II), e 100% (I e II) e de Xilol (I e II), cada passagem com uma hora de duração, e incluídas em parafina. Cortes de 5 μm de espessura foram obtidos em micrótomo rotatório manual (Zeiss® Microtome) e estendidos sobre lâminas e coradas com hematoxilina e eosina para análise histológica.
Fibras colágenas: As lâminas para análise das fibras de colágeno foram coradas com Picrossírius-Red e a análise foi realizada pela técnica de birrefrigência. A avaliação da organização e maturação de fibras colágenas foi realizada por meio da tipificação da birrefrigência da área da ferida por meio da coloração com Picrussírius-Red sob a luz polarizada. As fibras de colágeno foram determinadas de acordo com seu padrão de birrefrigência (esverdeado/amarelo-esverdeado ou laranja/laranja-avermelhado) e a aparência morfológica (ondulada ou esticada, fina ou grossa, curta ou longa). As lâminas foram visualizadas utilizando microscópio (Olympus BX51) com objetiva de 10X, câmera Olympus DP72 e quantificadas utilizando software ImagePro Plus® (Versão 6.0)53. Os
resultados obtidos constituíram de observação semiquantitativa das fibras e qualitativa por meio de fotomicrografias.
Multiplex: A determinação das citocinas foi feita através da técnica de Bio-plex (Bio-plex Pro Assays da Bio-Rad). As amostras do tecido da área da lesão foram coletadas, no 1ª, 2º, 5º e 10º dia foram imediatamente acondicionadas em nitrogênio e mantidos no freezer (-80°C). Posteriormente foram homogeneizadas com tampão PBS com inibidores de proteinases (Complete, Roche), sonificadas durante um minuto e centrifugadas a 1200 rpm, a 4 °C, durante 10 minutos. O sobrenadante foi recolhido e armazenado a -80 °C. As citocinas foram avaliadas por meio do método de de plex (plex Pro Assays da Bio-Rad Laboratories, Life Science Group). Os valores foram normalizados pela quantidade de proteínas nas amostras, determinada pelo método de Bradford (1976). As análises das concentrações das citocinas pró-inflamatórias IL-1α, IL-1β, TNFα e G-CSF e anti-inflamatória IL-10 foram realizadas posteriormente e determinadas conforme recomendação do Kit acima descrito.
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3.10- Análise Estatística
Para o cálculo das dimensões das feridas e sua evolução ao longo do período, área das fibras colágenas e concentração de proteínas foi utilizado o teste de t de Student, foi utilizado o o software IBM SPSS Statistics 20. O nível de significância adotado foi de p<0,05.
3.11- Aspectos Éticos
De acordo com a Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008, no inciso VII do § 1o do art. 225 da Constituição Federal, que estabelece os procedimentos para o uso científico de animais, este projeto foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais da UNICAMP sob o Protocolo de n° 3950-1, sendo aprovado em agosto de 2015 (ANEXO I). Todos os experimentos foram conduzidos seguindo-se os princípios éticos e procedimentos de cuidado com o uso de animais experimentais de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos órgãos supracitados.
4. Resultados
4.1 Análise morfométrica e histológica (H&E)
A análise morfométrica das áreas das feridas mostrou que a CAM modulou o processo de cicatrização dos camundongos diabéticos quando comparado aos animais diabéticos tratados somente com solução salina. No 6º dia após lesão, a área da ferida dos animais do grupo CAM foi significantemente menor (p-Valor=0,042) (Figura 1B) quando comparado ao CG.
Figura 1A
D0 D1 D4 D6 D10 CAM
Figura 1B
Figura 1. (A) Imagens da cicatrização das feridas dos animais do CAM e CG, nos dias 0, 1, 2, 4, 6 e 10 após a lesão. (B) Área das feridas em porcentagem nos dias 0, 2, 4, 6 e 10 após a lesão; no 6º dia CAM vs. CG (*p-Valor <0,05) (n= 5 por grupo). Os dados foram expressos como média ± SD, de acordo com o t-Student.
Na avalição histológica do 10º dia após a lesão, o CG apresentou maior quantidade de infiltrado inflamatório quando comparado ao grupo CAM. Além disso, todos os animais do CAM obtiveram reepitelização completa, no 10º dia, diferente do CG (Figura 2).
Figura 2 0 20 40 60 80 100 120 140 D0 D2 D4 D6 D10 % ár ea in ic ia l d a l es ão CAM CG D1 D2 D5 D10
*
CG CAM20
Figura 2. Imagem das seções coradas com Eosina e Hematoxilina, com grupos CAM e CG, nos dias 1, 2, 5, 8 e 10 após a lesão. Objetiva de 10X.
4.2 Análise das fibras colágenas
Na avaliação das fibras colágenas, por meio da coloração com Picrossírius-Red sob luz polarizada, no 5º dia de tratamento o grupo CG apresentou, sem diferença estatística, maior quantidade de fibras elásticas (soma vermelhas e verdes) em comparação ao grupo CAM. No 10º dia de tratamento, grupo CAM demonstrou, sem diferença estatística, maior quantidade de fibras colágenas (soma vermelhas e verdes) em relação ao outro grupo. Neste período do 10º dia o grupo CAM mostrou maior organização das fibras de colágenos associado a um aspecto mais compacto em relação ao CG (Figura 3A e 3B).
Figura 3A
CG
CAM
Figura 3B
Figura 3 (A) Imagem das seções coradas com Picrossírius-Red sob luz polarizada seguida por seções sem polarização dos grupos, CAM e CG no 5º e 10º dias após a lesão. (B) Quantificação das fibras colágenas (soma vermelhas e verdes) nos 5º e 10º dias após a lesão. Objetiva de 10X. Os dados foram expressos como média ± SD, de acordo com o t-Student. 0 50000 100000 150000 200000 250000 CAM CG Áre a d e c o lá g e n o
Fibras de colágeno (Vermelhas e verdes)
0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 CAM CG Áre a d e c o lá g e n o
Fibras de colágeno (Vermelhas e verdes)
5 Dias
22
4.3 Análise das citocinas pró-inflamatórias (IL-1α, IL-1β, TNF-α, G-CSF) e anti-inflamatória (IL-10) no homogenato da ferida no 1º, 2º, 5º e 10º dias pós-lesão Os níveis de citoquinas foram mensurados no homogenato da ferida nos dois grupos estudados por meio do Multiplex. A concentração de IL-1α e IL-1β foi estatisticamente significante (p. 0,037), (p. 0,013) respectivamente, no grupo CAM um dia após o ferimento quando comparado ao CG (Figuras 4A e 4B). Verificamos que após dois dias da ferida houve maior concentração de G-CSF no grupo CAM (p ≤ 0,01, Figura 4C), TNFα (<0,05) quando comparado ao CG (Figura 4D). No 5º dia após a ferida houve diminuição significante na concentração do G-CSF (p. 0,031) do grupo CAM quando comparado ao CG (Figura 4F). Foi observado diminuição significante da concentração de IL-10 (p. 0,025) e TNF-α (p. 0,004) no grupo CAM quando comparado ao CG no 10º dia após a lesão (Figuras 4G e 4H). Figura 4 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 CAM CG pg /m l
1 Dia - IL-1α
CAM CG 0 1 2 3 CAM CG p g/m l1 Dia - IL-1β
CAM CG 0 1 2 3 CAM CG p g/m l2 Dias - G-CSF
CAM CG * 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 CAM CG pg /m l2 Dias - TNF-α
CAM CG *B.
A.
D.
C.
* *
Figura 4. Concentração das proteínas no homogenato da ferida tratadas de 0 a 10 dias com CAM e solução salina. Foi empregado o método de multiplex para quantificação das citocinas IL-1α (A), IL-1β (B) com um dia de tratamento, G-CSF (C) e TNF-α (D) com dias de tratamento, G-CSF (E) com cinco dias de tratamento e com 10 dias de tratamento, IL-10 (F) e TNF-α (G). * p-Valor <0,05 vs, CG, n=5 animais por grupo. Os dados foram expressos como média ± SD, de acordo com o t-Student.
5. Discussão
A incidência do diabetes entre a população adulta mundial quase quadriplicou nos últimos 30 anos. Nesta população, a incidência de úlceras de pés diabéticos é de 4% a 10%, com risco de ulceração em 1 a cada 4 pessoas durante a vida57. Frente a esta realidade uma
variedade de curativos sintéticos e biológicos têm sido desenvolvidos na busca por propriedades ideais para o tratamento de feridas41. Curativos biológicos produzidos a base
de polímeros como celulose, alginato e quitosana tem demonstrado bastante êxito no tratamento de feridas58 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 CAM CG pg /m l
5 Dias - TNF-α
CAM CG 0 0,5 1 1,5 2 CAM CG pg /m l5 Dias - G-CSF
CAM CG 0 0,01 0,02 0,03 CAM CG pg /m l10 Dias - IL-10
CAM CG * 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 CAM CG pg/m l10 Dias - TNF-α
CAM CG *F.
E.
*H.
G.
24
Os curativos de quitosana são capazes de acelerar o processo de cicatrização de feridas ao ativar macrófagos, aumentar o número de fibroblastos, a diferenciação celular e a reepitelização da pele 41,59,60. Em sua despolarização a quitosana libera, a partir da hidrólise,
oligômeros de N-acetil-β-D-glicosamina, um amino-açúcar comum ao organismo que entra na via metabólica inata para ser incorporado as glicoproteínas estas são responsáveis por rápida proliferação de fibroblastos e deposição ordenada de colágeno41,60,61. Os oligômeros
oriundos da quitosana estimulam e modulam a síntese do ácido hialurônico natural que desempenha importante papel na morfogênese e inflamação, promovendo maior motilidade celular, adesão e proliferação62,63.
O alginato possuí a capacidade de trocar íons de cálcio do biomaterial com o sódio presente nas feridas, isso leva à formação de um gel estável capaz de absorver a umidade e manter um microambiente apropriado para a granulação tecidual41,58,63-65.
A associação da quitosana com o alginato origina complexos polieletrolíticos. Este complexo pode ser processado de várias formas, possibilitando a confecção de membranas (ou bofilmes) para aplicação no tratamento de feridas de difícil cicatrização66,67.
Na presença do Diabetes Mellitus o processo de cicatrização pode ser afetado por um ou mais mecanismos biológicos, estes são desencadeados por hiperglicemia, inflamação crônica, micro e macro disfunções circulatórias e hipóxia68.
A hiperglicemia levar à glicação não enzimática do colágeno de outras proteínas e à formação de produtos finais da glicação avançada. Estes produtos reduzem a solubilidade da matriz extracelular e perpetuam as alterações inflamatórias observadas no diabetes69,70.
A fase inflamatória prolongada é caracterizada por sustentada expressão e aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1, IL-6 e TNF-α 26,71.
Estudos em animais diabéticos mostraram que há abundância de neutrófilos e macrófagos em feridas que não cicatrizam. Os neutrófilos produzem um grande número de espécies reativas de oxigênio e proteases que danificam o tecido da ferida, sendo assim, os neutrófilos podem também contribuir para os prejuízos na cicatrização observadas no diabetes72.
Os fibroblastos apresentam diminuída proliferação, aumento da apoptose e diminuição da habilidade de migração na presença do diabetes22,28, enquanto que a expressão dos fatores
Em nosso estudo foi observado que as feridas que receberam o tratamento com a CAM apresentaram menor área da lesão no 6º dia após o ferimento e aumento da concentração de citocinas pró-inflamatórias IL-1β e IL-1α, no 1º dia após a ferida. Essas citocinas, liberadas principalmente pelos macrófagos, desempenham diversas ações durante a resposta inflamatória, dentre elas, ativação do fator de transcrição NF-kB25. Este, quando
ativado, transloca para o núcleo e atua na célula endotelial aumentando a expressão de moléculas de superfícies que intercedem na adesão de leucócitos73.
Os mediadores inflamatórios apresentam importante papel na cicatrização de feridas e reconstrução de tecidos74, observamos no 2º dia após a lesão o aumento de TNF-α e
G-CSF no grupo CAM. O TNF-α é uma citocina pleiotrópica, pró-inflamatória, com a capacidade de afetar quase todos os tecidos e órgãos75. Esta proteína é quimiotática para
macrófagos, promove sua ativação e estimula a angiogênese76 e a proliferação de
fibroblastos75. Os maiores níveis de concentração do TNF- α são observados a partir das
12 às 24 horas após a ferida, sendo sua principal função estimular o recrutamento de neutrófilos e monócitos para o local da infecção e ativar essas células para erradicar os microrganismos58. Em nossos resultados a maior concentração desta citocina foi dois dias
após a ferida, e não foram detectados no 5º dia. Esses achados estão de acordo com a literatura.
O G-CSF é um fator estimulante da produção de colônias de granulócitos que são produzidos por monócitos, fibroblastos e células endoteliais78,79. Além disso, as células
progenitoras derivadas da medula óssea são mobilizadas para circulação por meio do G-CSF78,70. Estudo realizado in vitro e posteriormente in vivo observou que este fator foi um
potente agente mobilizador de células tronco com ação angiogênica sobre as células endoteliais80. Outro estudo recente que investigou feridas de animais em choque
hemorrágico demonstrou que o G-CSF foi capaz de melhorar a angiogênese e atenuar a apoptose celular destes animais81. A angiogênese é uma fase importante para cicatrização
adequada, oxigenação do tecido, chegada de nutrientes e desenvolvimento e crescimento celular82. Este processo dinâmico é regulado pela interação de diversas citocinas, fatores
de crescimento entre diferentes tipos de células73. Nossos resultados mostraram que a
concentração do G-CSF estava aumentada no 2º dia após a ferida no grupo CAM, o que pode ter contribuído para uma melhor resolução da fase inflamatória e da contração da área da ferida no 6º dia após o ferimento.
26
Em nosso estudo, a cura da ferida foi obtida no 10º dia pós lesão nos animais do grupo CAM. Neste mesmo período observamos uma diminuição da concentração da IL-10 no grupo CAM. O mesmo ocorreu quando analisamos a concentração do o TNFα. Por outro lado, no CG foi observado uma alta concentração desta citocina pró-inflamatória, indicando uma importante relação sinérgica entre essas duas citocinas na contribuição da reepitelização83.
O colágeno é o maior componente da derme84. As fibras de colágeno desempenham um
papel vital para a manutenção da integridade estrutural, na determinação da função do tecido e orientação no seu desenvolvimento85,86. A técnica de coloração com
picrossírus-red associada a luz polarizada tem sido amplamente utilizada para determinar a espessura e o arranjo das fibras de colágenos. Desta forma, as fibras de coloração vermelha e amarela possuem um arranjo mais compacto e fibras mais espessas enquanto que as fibras de coloração verde apresentam um arranjo alargado e fibras delgadas86. Estudo em animais
diabéticos demonstrou que o tecido de granulação é prejudicado devido a redução da proliferação de fibroblastos, menor deposição de colágeno e redução na contração da ferida87. Na análise das fibras de colágenos nosso estudo evidenciou que no 10º dia de
tratamento, o grupo CAM apresentou maior quantidade de fibras vermelhas em relação ao grupo CG. As fibras de colágeno, no grupo CAM, no 10º dia, apresentaram um aspecto mais delgado e organizado. Esta observação vai ao encontro ao resultado do H&E do 10º dia, no qual as feridas do grupo CAM mostraram um aspecto mais organizado do tecido conjuntivo. Estes resultados sugerem a efetividade do complexo polieletrolítico de quitosana e alginato na fibroplasia. Achados estes evidenciados anteriormente no estudo de Caetano et al. 37 e Dai36, nos quais foi observado a presença de fibras de colágeno mais
organizadas e maduras em animais saudáveis tratados com a CAM.
Assim, nosso estudo avança na compreensão dos efeitos da CAM na ferida de animais diabéticos demonstrando que o tratamento melhora o processo de cicatrização modulando, principalmente, a fase inflamatória e favorecendo a reepitelização da ferida.
6. Conclusão
A membrana de quitosana e alginato diminuiu o tempo de cicatrização em feridas de camundongos diabéticos, modulou a fase inflamatória e aumentou o número e a organização das fibras de colágeno favorecendo a reepitelização.
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