UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia Química
JOÃO MOREIRA NETO
MODELAGEM MATEMÁTICA DO PROCESSO DE HIDRÓLISE
ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
CAMPINAS 2016
JOÃO MOREIRA NETO
MODELAGEM MATEMÁTICA DO PROCESSO DE HIDRÓLISE
ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Tese apresentada à Faculdade de
Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Engenharia Química.
Orientador: Profa. Dra Aline Carvalho da Costa
Co-orientador: Dr. Antonio Maria Francisco Luiz Jose Bonomi
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO JOÃO MOREIRA NETO E ORIENTADA PELA PROFa. DRa ALINE CARVALHO DA COSTA.
CAMPINAS 2016
Tese de Doutorado defendida por João Moreira Neto e aprovada em 1 de junho de 2016 pela banca examinadora constituída pelos doutores:
________________________________________________ Profa. Dra. Aline Carvalho da Costa – Orientadora
________________________________________________ Prof. Dr. Rubens Maciel Filho
________________________________________________ Prof. Dr. Reginaldo Guirardello
________________________________________________ Dr. Charles Dayan Farias de Jesus
________________________________________________ Dr. Edvaldo Rodrigo de Moraes
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico este trabalho aos meus pais, Renato e Rita, pelo carinho, apoio e amor incondicional durante todos esses anos.
AGRADECIMENTOS
A DEUS por ter me ajudado a vencer mais uma etapa e sem ele nada seria possível e nunca encontraria forças para enfrentar as adversidades em minha vida.
Aos meus pais, Renato e Rita, pela educação, amor, carinho e apoio nas minhas escolhas.
Agradeço também aos meus irmãos, Renato e Caio, pela paciência e amizade durante todos esses anos de convivência.
Em especial a minha orientadora, Profa. Dra. Aline Carvalho da Costa, e co-orientador, Dr. Bonomi, pela orientação, sugestões, confiança e entusiasmo durante todos esses anos de trabalho e imensa colaboração na elaboração dessa tese.
Ao professor Dr Rubens Maciel Filho por permitir o meu acesso em seus laboratórios.
A todos os meus amigos do Laboratório de Engenharia de Processos Fermentativos e Enzimáticos (LEPFE) em especial a Luiza Helena Martins, Daniele Machado e Paula Hoyos pela grande ajuda no desenvolvimento da parte experimental dessa tese.
Aos meus amigos do Laboratório de Otimização, Projeto e Controle Avançado (LOPCA), Cristiano, Nadson, Pablo, Laura, Andrea, Johnattan e todos os outros companheiros que me ajudaram sempre que podiam tanto no aspecto profissional como nas relações de amizade.
Ao CTBE, por disponibilizar a sua infra-estrutura para realização deste trabalho.
Aos meus companheiros de república durante todos esses anos de pós-graduação, Gustavo Ponce, conhecido como Sabão, e Moisés Alves pelo companherismo e por serem grandes amigos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro, sem o qual a realização desse trabalho seria impossível.
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de um modelo cinético para predizer a hidrólise enzimática de bagaço de cana submetido aos pré-tratamentos hidrotérmico (BH) e organossolve (BO). Foram incorporados ao modelo cinético os fenômenos de adsorção das enzimas celulase e β-glicosidase no BH e BO, além da inibição enzimática pelos açúcares gerados. Os ensaios de adsorção mostraram que não houve adsorção de β-glicosidase em celulose e lignina. O aumento da concentração de sólidos não teve impacto na adsorção de celulase nas diferentes biomassas para velocidades de agitação superiores a 150 rpm e o tempo de equilíbrio de adsorção foi em torno de 2 horas para o BH e BO. As isotermas de adsorção da celulase em amostras de BH e BO coletadas em diferentes tempos de hidrólise mostraram que a adsorção máxima da enzima no substrato diminui com o decorrer da reação. Os gráficos de Lineweaver-Burk obtidos nos ensaios de velocidade inicial mostraram que o mecanismo de inibição da enzima β-glicosidase por glicose e o mecanismo de inibição da enzima celulase por glicose e xilose são ambos do tipo competitivo. A estimação simultânea dos parâmetros cinéticos do modelo foi realizada por meio do algoritmo genético PIKAIA. Os dados utilizados no procedimento de estimação de parâmetros e validação do modelo foram perfis experimentais de celulose, celobiose, glicose e xilose obtidos do processo de hidrólise enzimática em batelada com variação na concentração de sólidos (4, 6, 8, 10, 12 e 15% m/v). O modelo ajustado foi capaz predizer de forma acurada o conjunto de dados experimentais de BH e BO.
Palavras-chave: Adsorção, Bagaço de cana, Hidrólise enzimática, Modelagem de processos
ABSTRACT
The goal of this work is the development and validation of a kinetic model to predict the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse subjected to the hydrothermal (HB) and organosolv (OB) pretreatments. The phenomena of cellulase and β-glucosidase enzymes adsorption on HB and OB, as well as enzyme inhibition by sugars were considered in the kinetic model. Adsorption results showed no significant adsorption of β-glucosidase on cellulose and lignin. Increasing solids concentration had no impact on the adsorption of cellulase on the different biomasses if stirring rates higher than150 rpm are used and the adsorption equilibrium time was about 2 hours for HB and OB. Adsorption of cellulase on HB and OB samples collected at different hydrolysis times showed that the maximum enzyme adsorption on the substrate decreased during the reaction. The Lineweaver-Burk plots corresponding to the initial velocity assays have shown that the inhibition mechanism of β-glucosidase by glucose and the inhibition mechanism of cellulase by glucose and xylose are both competitive. The simultaneous estimation of kinetic parameters of the model was performed using the PIKAIA genetic algorithm. The data used in the parameters estimation procedure and validation of the model were profiles of cellulose, cellobiose, glucose and xylose obtained from the enzymatic hydrolysis batch process with variation in the concentration of solids (4, 6, 8, 10, 12 and 15% w/v). The fitted model was able to predict accurately the set of experimental data of HB and OB.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1: Representação esquemática da produção de etanol lignocelulósico
(SANTOS et al., 2012). ... 21
Figura 2.1: Ilustração esquemática da estrutura da parede celular das biomassas
lignocelulósicas (MENON e RAO, 2012). ... 26
Figura 2.2: Estrutura da cadeia linear da celulose, formada por várias unidades
consecutivas de celobiose (GURGEL, 2007). ... 28
Figura 2.3: Estrutura dos álcoois precursores da lignina (adaptado de WONG, 2009). 30 Figura 2.4: Esquema do papel do pré-tratamento na conversão dos materiais
lignocelulósicos a etanol (VOLYNETS e DAHMAN, 2011). ... 31
Figura 2.5: Evolução das estratégias de produção de etanol lignocelulósico a partir da
hidrólise enzimática (HAMELINK et al., 2005). ... 42
Figura 2.6: Representação esquemática de uma celobiohidrolase (adaptado de RAO,
2009). ... 45
Figura 2.7: Estrutrura da endoglicanase com o domínio catalítico em forma de fenda
(ANDERSEN, 2007). ... 47
Figura 2.8: Modo de ação das enzimas do complexo celulítico. NR denota os terminais
não redutores; R, os terminais redutores; C, a região cristalina; gluc, a enzima β-glicosidase; CBHI e CBHII, as celobiohidrolases; EG, a endoglicanase. (Adaptado de TEERI, 1997). ... 53
Figura 2.9: Variedades de reações usadas nos modelos (adaptado de QUIROGA, 2009).
... 58
Figura 3.1: (a) bagaço de cana antes da etapa de tratamento (b), após o
pré-tratamento hidrotérmico e (c) após pré-pré-tratamento organossolve. ... 90
Figura 3.2: Imagem de MEV para bagaço de cana antes do pré-tratamento (a, b),
bagaço pré-tratado hidrotérmico (c, d) e bagaço pré-tratado organossolve (e, f) nas ampliações de 50X e 250 X, respectivamente. ... 95
Figura 5.1: Isoterma de adsorção da celulase em bagaço hidrotérmico (BH) em
diferentes tempos de hidrólise: a) t=0 h; b) t=1 h; c) t=6 h; d) t=12 h; e) t=18 h. ... 115
Figura 5.2: Isoterma de adsorção da celulase em bagaço organossolve (BO) em
diferentes tempos de hidrólise: a) t=0 h; b) t=1 h; c) t=6 h; d) t=12 h; e) t=18 h. ... 116
Figura 5.3: Ajuste dos parâmetros da isoterma de adsorção de Langmuir para o BH em
Figura 5.4: Ajuste dos parâmetros da isoterma de adsorção de Langmuir para o BO em
função do tempo de hidrólise: a) Emax; b) Kp. ... 118
Figura 6.1: Graficos de Linewaver-Burk: a) Inibição competitiva; b) Inibição não competitiva; c) Inibição acompetitiva. ... 132
Figura 6.2: Gráfico de Linewaver-Burk para a hidrólise da celobiose (substrato) com adição de glicose como inibidor da enzima β-glicosidase. ... 133
Figura 6.3: Gráfico de Linewaver-Burk para a hidrólise da celulose de BH (substrato) com adição de glicose como inibidor da enzima celulase. ... 134
Figura 6.4: Gráfico de Linewaver-Burk para a hidrólise da celulose de BH (substrato) com adição de xilose como inibidor da enzima celulase. ... 135
Figura 7.1: Mecanismo de hidrólise enzimática de biomassa lignocelulósica contendo 4 reações. ... 137
Figura 7.2: Dependência de λ com a concentração de Lignina (L). ... 151
Figura 7.3: Dados experimentais e simulados para ensaio com concentração de bagaço pré-tratado a 4% m/v: a) BH; b) BO... 154
Figura 7.4: Dados experimentais e simulados para ensaio com concentração de bagaço pré-tratado a 6% m/v: a) BH; b) BO... 155
Figura 7.5: Dados experimentais e simulados para ensaio com concentração de bagaço pré-tratado a 8% m/v: a) BH; b) BO... 156
Figura 7.6: Validação do modelo. Dados experimentais e simulados para ensaio com concentração de bagaço pré-tratado a 10% m/v: a) BH; b) BO. ... 157
Figura 7.7: Dados experimentais e simulados para ensaio com concentração de bagaço pré-tratado a 12% m/v: a) BH; b) BO... 158
Figura 7.8: Dados experimentais e simulados para ensaio com concentração de bagaço hidrotérmico (BH) a 15% m/v. ... 159
Figura 7.9: Dados experimentais e simulados para os perfis de xilose nas concentrações de bagaço pré-tratado a 4, 6, 8, 10, 12 e 15% m/v: a) BH; b) BO. ... 160
Figura 7.10: Efeito dos parâmetros cinéticos na concentração de celulose. ... 165
Figura 7.11: Efeito dos parâmetros cinéticos na concentração de celobiose. ... 166
Figura 7.12: Efeito dos parâmetros cinéticos na concentração de glicose. ... 166
Figura 7.13: Efeito dos parâmetros cinéticos na concentração de xilana... 167
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1: Diferenças entre celulose e hemiceluloses (SILVA, 2010). ... 29 Tabela 2.2: Métodos de pré-tratamentos de materiais lignocelulósicos para hidrólise
enzimática (adaptado de KUMAR et. al., 2009 e MENON e RAO, 2012). ... 33
Tabela 2.3: Diferenças entre métodos envolvendo ácido diluído e concentrado
(TAHERZADEH e KARIMI, 2007a). ... 40
Tabela 2.4: Modelos Empíricos (BG – β-glicosidase) (adaptado de BANSAL et al.,
2009). ... 61
Tabela 2.5: Modelos baseados em Michaelis – Menten e Adorção. (M-M: Michaelis –
Menten, IP — Inibição por produto, QSS — Suposição de Estado Pseudo-Estacionário, Ads — Abordagem de adsorção, BG – β-glicosidase) (Adaptado de BANSAL et al., 2009). ... 67
Tabela 3.1: Faixa de concentração dos padrões usados na curva de calibração... 87 Tabela 3.2: Composição química do bagaço in natura e pré-tratado pelo método
hidrotémico e organossolve. ... 91
Tabela 3.3: Balanço de massa para o bagaço de cana seco antes e após o pré-tratamento
hidrotérmico e organossolve. ... 91
Tabela 5.1: Parâmetros de Langmuir para a adsorção da celulase em bagaço de cana
hidrotérmico. ... 117
Tabela 5.2: Parâmetros de Langmuir para a adsorção da celulase em bagaço de cana
organossolve. ... 117
Tabela 5.3: Valores das constantes da Equação 5.2 e coeficiente de determinação (R2) do ajuste dos parâmetros como função do tempo de hidrólise. ... 120
Tabela 6.1: Valores experimentais para os ensaios de inibição da β-glicosidase por
glicose. ... 123
Tabela 6.2: Planejamento experimental 32 para determinação da concentração de glucono-δ-lactona e tempo de incubação da celulase. ... 124
Tabela 6.3: Valores experimentais para os ensaios de inibição da celulase por
celobiose, glicose e xilose. ... 126
Tabela 6.4: Concentração de glicose obtida no planejamento 32. ... 130
Tabela 7.1: Concentração inicial de celulose, lignina e xilana presentes nos ensaios de
Tabela 7.2: Concentração de EG/CBH, BG e xilanase inicial nos ensaios de hidrólise
enzimática de BH e BO. ... 147
Tabela 7.3: Configurações técnicas selecionadas no algoritmo genético PIKAIA. .... 147 Tabela 7.4: Parâmetros cinéticos estimados pelo algoritmo genético PIKAIA para
dados de BH e BO. ... 148
Tabela 7.5: Parâmetros cinéticos estimados nas taxas de reação de hidrólise para
diferentes biomassas. ... 150
Tabela 7.6: Valores das constantes da função exponencial para a dependência de λ com
a concentração de lignina (L) e coeficiente de determinação (R2) de ajuste de parâmetros. ... 152
Tabela 7.7: Desvio padrão residual (RSD %) para caracterizar a qualidade de predição
do modelo cinético para bagaço de cana submetido ao pré-tratamento hidrotérmico. . 161
Tabela 7.8: Nível inferior (-) e superior (+) dos parâmetros utilizados no planejamento
Plackett – Burman. ... 163
Tabela 7.9: Matriz de delineamento no planejamento de Plackett-Burman contendo 17
parâmetros cinéticos do modelo desenvolvido para hidrólise enzimática do bagaço de cana. ... 164
Tabela 7.10: Efeito dos parâmetros cinéticos nas concentrações de celulose, celobiose,
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Letras latinas
C concentração de celulose (mg/mL)
E função objetivo
E1b concentração de EG/CBH adsorvida no bagaço pré-tratado (mg
proteína/mL),
E1bC concentração de EG/CBH adsorvida na celulose presente no bagaço
pré-tratado (mg proteína/mL)
E1bL concentração de EG/CBH adsorvida na lignina (mg proteína/mL),
E1f concentração de EG/CBH livre em solução quando o substrato é bagaço
pré-tratado (mg proteina/mL)
E1fL concentração de EG/CBH livre em solução quando o substrato é lignina
(mg proteina/mL)
E2f concentração de β-glicosidase livre em solução (mg proteina/mL)
E3 atividade da enzima xilanase (U/mL)
Emax quantidade máxima de EG/CBH adsorvida por unidade de massa de
bagaço pré-tratado (mg proteína/g substrato)
EmaxL quantidade máxima de EG/CBH adsorvida por unidade de massa de
lignina (mg proteína/g lignina) G concentração de glicose (mg/mL)
G2 concentração de celobiose (mg/mL)
k1r constante de taxa de reação para a hidrólise da celulose à celobiose
(mL/(mg∙h))
k2r constante de taxa de reação para a hidrólise da celobiose à glicose (∙h-1)
k3r constante de taxa de reação para a hidrólise da celulose à glicose
(mL/(mg∙h))
K1iG constante de inibição competitiva da EG/CBH por glicose em r1 (mg/mL)
K1iG2 constante de inibição competitiva da EG/CBH por celobiose em r1
(mg/mL)
K1iX constante de inibição competitiva da EG/CBH por xilose em r1 (mg/mL)
K2iG constante de inibição competitiva da β-glicosidadase por glicose em r2
K2iX constante de inibição competitiva da β-glicosidadase por xilose em r2 (mg/mL)
K2m constante de saturação da celobiose para β-glicosidadase (mg/mL)
K3iG constante de inibição competitiva da EG/CBH por glicose em r3 (mg/mL)
K3iG2 constante de inibição competitiva da EG/CBH por celobiose em r3
(mg/mL)
K3iX constante de inibição competitiva da EG/CBH por xilose em r3 (mg/mL)
K4 constante concentrada de taxa de reação de xilana a xilose (h-1)
k4 taxa máxima específica de hidrólise da xilana à xilose (h-1)
K4iX constante de inibição competitiva da xilanase por xilose (mg/mL)
kS constante de saturação para o termo de limitação por xilana (mg/mL)
Keq constante de saturação para adsorção da enzima xilanase (U/mL)
Kp constante de dissociação para a reação de adsorção/dessorção de
EG/CBH com bagaço pré-tratado (mL/mg proteina)
KpL constante de dissociação para a reação de adsorção/dessorção de
EG/CBH com lignina (mL/mg proteina) L concentração de lignina (mg/mL)
r1 taxa da reação da hidrólise de celulose a celobiose (mg/(mL∙h))
r2 taxa da reação da hidrólise de celobiose a glicose (mg/(mL∙h))
r3 taxa da reação da hidrólise de celulose a glicose (mg/(mL∙h))
r4 taxa da reação da hidrólise de xilana a xilose (mg/(mL∙h))
S concentração de bagaço pré-tratado (mg/mL)
t tempo (h)
X concentração de xilose (mg/mL) Xn concentração de xilana (mg/mL)
Letras gregas
θ vetor com os parâmetros cinéticos a serem otimizados
λ taxa de diminuição na área superficial específica de celulose (h-1 )
SUMÁRIO AGRADECIMENTOS ... 6 RESUMO ... 7 ABSTRACT ... 8 LISTA DE FIGURAS ... 9 LISTA DE TABELAS ... 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 13
SUMÁRIO ... 15
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO ... 19
1.1. Objetivo ... 23
1.2. Organização do Trabalho ... 24
CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 26
2.1. Biomassa Lignocelulósica ... 26 2.1.1. Celulose ... 27 2.1.2. Hemiceluloses ... 29 2.1.3. Lignina ... 30 2.2. Pré-tratamento ... 31 2.2.1. Pré-tratamentos Físicos ... 34 2.2.2. Pré-tratamentos Físico-Químicos ... 34 2.2.2.1. Pré-tratamento hidrotérmico ... 35 2.2.3. Pré-tratamentos Biológicos ... 37 2.2.4. Pré-tratamento Químico ... 37 2.2.4.1. Pré-tratamento organossolve ... 38
2.3. Hidrólise da biomassa lignocelulósica ... 39
2.4. Estratégias para o processo de conversão da biomassa em etanol ... 41
2.5. As Enzimas Celulolíticas ... 44
2.5.1. Endoglicanase (EGs) ... 46
2.5.2. Celobiohidrolases (CBHs)... 47
2.5.3. β-glicosidases (BGs) ... 48
2.6. Fatores que afetam a hidrólise enzimática ... 48
2.6.1. Cristalinidade (índice de cristalinidade, CrI) ... 49
2.6.2. Área superficial acessível ... 50
2.6.4. Sinergismo entre as Enzimas Celulolíticas ... 52
2.6.5. Adsorção das celulases ... 53
2.6.6. Inibição por celobiose e glicose ... 55
2.6.7. Desativação por efeitos térmicos e mecânicos ... 56
2.7. Modelagem da hidrólise enzimática em biomassa lignocelulósica ... 57
2.7.1. Classe de modelos ... 59
2.7.1.1. Modelos empíricos ... 59
2.7.1.2. Modelos semi-mecanísticos ... 64
2.7.1.3. Modelos mecanisticos ... 77
CAPÍTULO 3 – PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DAS BIOMASSAS PRÉ-TRATADAS ... 79
3.1. Matéria-Prima ... 79
3.2. Pré-tratamento da biomassa lignocelulósica ... 79
3.2.1 Pré-tratamento hidrotérmico ... 79
3.2.2 Pré-tratamento organossolve ... 80
3.3. Determinação da composição química da biomassa ... 80
3.3.1 Teor de umidade ... 81
3.3.2. Determinação de extrativos na biomassa ... 81
3.3.3. Determinação do teor de cinzas na biomassa ... 82
3.3.4. Determinação do teor de carboidratos, lignina, grupos acetil, furfural e hidroximetilfurfural na biomassa ... 83
3.3.4.1. Hidrólise ácida ... 84
3.3.4.2. Determinação de Lignina Klason (insolúvel) ... 84
3.3.4.3. Determinação de Lignina solúvel ... 85
3.3.4.4. Determinação dos carboidratos e produtos de decomposição por CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) ... 86
3.3.4.4.1. Análise dos carboidratos ... 87
3.3.4.4.2. Análise de grupos acetil ... 88
3.3.4.4.3. Análise de furfural e hidroximetilfurfural ... 88
3.4. Microscopia Eletronica de Varredura (MEV)... 89
3.5. Resultados e discussões ... 90
3.5.1. Análise da composição química do bagaço... 90
3.5.2. Estrutura supramolecular da biomassa ... 93
CAPÍTULO 4 – ADSORÇÃO DA CELULASE E β-GLICOSIDASE EM AVICEL,
LIGNINA E BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO ... 97
CAPÍTULO 5 – ESTUDO DA ADSORÇÃO DE CELULASE EM BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PRÉ-TRATADO DURANTE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA .. 109
5.1. Introdução ... 109
5.2. Materiais e Métodos ... 111
5.2.1. Substrato ... 111
5.2.2. Atividade enzimática e dosagem de proteína ... 111
5.2.3. Hidrólise enzimática e ensaios de dessorção... 111
5.2.4. Isoterma de adsorção da celulase ... 112
5.3. Resultados e Discussão ... 113
5.4. Conclusões ... 120
CAPÍTULO 6 – ESTUDO CINÉTICO NA INIBIÇÃO POR PRODUTO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO ... 121
6.1. Materiais e Métodos ... 122
6.1.1. Substrato ... 122
6.1.2. Atividade enzimática ... 122
6.1.3. Cinética de inibição da enzima β-glicosidase por glicose ... 122
6.1.4. Inibição da enzima β-glicosidase por glucono-δ-lactona ... 123
6.1.5. Cinética de inibição da celulase por xilose, glicose e celobiose. ... 125
6.1.6. Análise de açúcares por HPLC... 128
6.1.7. Determinação do mecanismo de inibição... 129
6.2. Resultados e Discussões ... 129
6.2.1. Inibição da enzima β-glicosidase por glucono-δ-lactona ... 129
6.2.2. Determinação do mecanismo de inibição das enzimas β-glicosidase e celulase por produto. ... 131
6.2.2.1. Mecanismo de inibição da enzima β-glicosidase por glicose ... 132
6.2.2.2. Mecanismo de inibição da enzima celulase por glicose, xilose e celobiose133 6.3. Conclusões ... 136
CAPÍTULO 7 – DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM MODELO CINÉTICO PARA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PRÉ-TRATADO ... 137
7.1. Desenvolvimento do modelo de hidrólise enzimática ... 137
7.2.1. Substrato ... 143
7.2.2. Atividade enzimática ... 143
7.2.3. Hidrólise enzimática ... 144
7.2.4. Análise de açúcares por HPLC... 144
7.2.5. Estimação de parâmetros ... 144
7.3. Resultados e Discussão ... 145
7.3.1. Estimação dos parâmetros cinéticos para bagaço de cana submetido ao pré-tratamento hidrotérmico e organossolve ... 145
7.3.2. Metodologia de Plackett-Burman (PB) para a seleção dos parâmetros significativos para o problema de re-estimação. ... 162
7.3. Conclusões ... 170
CAPÍTULO 8 – CONCLUSÕES ... 171
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 173
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO
O impacto ambiental negativo dos combustíveis fósseis e a necessidade estratégica de diversificação da matriz energética têm justificado a pesquisa e o desenvolvimento de processos industriais à base de matérias-primas renováveis e sustentáveis. Uma das fontes que tem potencial para atender a estes desafios de sustentabilidade é a biomassa lignocelulósica, que aparenta ser uma alternativa viável frente aos recursos fósseis para a produção de combustíveis e de produtos químicos. Em decorrência, tem sido proposto um complexo fabril similar ao de uma refinaria de petróleo, e que vem sendo chamado de ―biorrefinaria‖, para produzir produtos químicos e energia a partir de biomassa (RODRIGUES, 2011). Análoga a uma refinaria petroquímica, que produz uma variedade de combustíveis e produtos químicos intermediários utilizados para fabricação de plásticos, fibras, solventes e detergentes, uma biorrefinaria pode ser imaginada utilizando a biomassa lignocelulósica como a matéria-prima para gerar combustíveis, energia e produtos químicos através da conversão de processos químicos e biológicos (HODGE et al., 2009). Nas biorrefinarias, as operações seriam projetadas para maximizar o valor dos produtos extraídos, enquanto minimizam as correntes de resíduos pela conversão dos produtos intermediários de baixo valor e alto volume em energia. Os produtos de alto valor aumentam a rentabilidade, enquanto que os combustíveis de alto volume ajudam com a demanda de energia global (FERNANDO et al., 2006).
Para se desenvolver rotas tecnologicamente sustentáveis na biorrefinaria, toda a cadeia de produção de biomassa, desde o cultivo, colheita, pré-tratamento, conversão e os produtos devem ser considerados (MENON e RAO, 2012).
O Brasil está em uma posição privilegiada para assumir a liderança no aproveitamento integral das biomassas por apresentar grande potencial no cultivo de matérias-primas renováveis (destaque para a indústria de cana-de-açúcar), dispondo de vantagens comparativas e competitivas tais como: culturas agrícolas de grande extensão, intensa radiação solar, biodiversidade muito variada, água em abundância, diversidade de clima e pioneirismo na produção de bioetanol (SANTOS et al., 2011).
A cana-de-açúcar apresenta uma das maiores taxas de conversão fotossintética entre as culturas comerciais de grande escala, e sua produção atual é superior a 1,4 bilhão de toneladas (colmos), em mais de 100 países no mundo (SEABRA, 2008).
Há algum tempo, o etanol de cana-de-açúcar é alvo de debates relacionando a competição de biocombustíveis e alimentos pelo uso de terras cultiváveis, onde plantações de cana-de-açúcar estariam ocupando terras destinadas à produção de alimentos. Neste contexto o etanol a partir do bagaço da cana (etanol de 2° geração) aparece como uma grande oportunidade, pois pode-se conseguir um aumento significativo na produção de etanol sem aumentar a área plantada.
O uso do bagaço como matéria prima apresenta uma série de vantagens: está disponível em grandes quantidades, está pronto para uso na unidade industrial, evitando aumento de custo devido ao transporte (OLIVÉRIO e HILST, 2005), o que é um incentivo para seu aproveitamento, permitindo a coprodução de combustíveis valiosos, compostos químicos, eletricidade e calor, conduzindo a produção de energia sustentável com melhores desempenhos ambientais e econômicos, através do desenvolvimento dos conceitos de biorrefinarias (RODRIGUES, 2011).
A obtenção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos envolve a hidrólise das frações celulósicas e hemicelulósicas da biomassa em hexoses e pentoses e a sua posterior fermentação para a produção do etanol. A produção de etanol a partir da fração celulósica envolve, geralmente, quatro etapas de processamento essenciais, conforme apresentado na Figura 1.1: (1) pré-tratamento do material lignocelulósico, necessário para alterar a estrutura da biomassa e tornar a celulose mais suscetivel ao ataque enzimático; (2) hidrólise enzimática da celulose, através da qual celulases hidrolisam a celulose em açúcares fermentescíveis (por exemplo, glicose); (3) fermentação, que produz o etanol celulósico e (4) separação do etanol do caldo fermentado (ZHANG, et al. 2007; BOMMARIUS, et al. 2008).
Figura 1.1: Representação esquemática da produção de etanol lignocelulósico
(SANTOS et al., 2012).
Em geral, os materiais lignocelulósicos apresentam uma estrutura complexa e compacta, sendo necessário submeter esta biomassa à pré-tratamentos físicos e/ou químicos antes da sua hidrólise para produção de glicose. Esta etapa tem como objetivos a remoção de lignina e hemiceluloses, redução da cristalinidade da celulose e aumento da porosidade do material, de maneira a tornar a celulose susceptível à hidrólise.
Em relação à hidrólise da celulose, as rotas mais conhecidas são as que utilizam ácidos ou enzimas. A hidrólise enzimática da celulose tem vantagens sobre as técnicas de conversão química, pois as enzimas podem atingir rendimentos elevados, não catalisam reações de degradação da glicose comuns para a hidrólise ácida, as condições de processo são mais suaves (pressão atmosférica, pH 4,8 e temperatura entre 45-60
°C), há menor consumo de utilidades (eletricidade, água de refrigeração, gás) (SUN e CHENG, 2002) e apresentam baixo custo de manutenção (não há problema de corrosão) (HAMELINK et al.,2005).
A hidrólise enzimática da celulose envolve três tipos de celulases (celobiohidrolases, endoglicanases e β–glicosidases) que trabalham em sinergia. As endoglicanases hidrolisam aleatoriamente as regiões internas da celulose amorfa, reduzindo o grau de polimerização; celobiohidrolases atuam nas extremidades das cadeias da celulose, liberando a celobiose como produto principal e as β–glicosidases hidrolisam a celobiose em duas moléculas de glicose (CHAUVE et al., 2010).
A descrição quantitativa da hidrólise enzimática através de modelagem matemática é de grande importância para melhor caracterizar e compreender as interações entre as celulases e celulose, para avaliar os fatores responsáveis pela diminuição nas taxas de conversão e para o scale up dos reatores de pequena escala de laboratório para os reatores em escala comercial. Além disso, o uso da modelagem permite que sejam avaliados a priori os efeitos da alimentação de substrato sobre a conversão de açúcar e simulações do processo podem ser feitas para compreender os regimes cinéticos (CHAUVE et al., 2010; SAURA, 2011; GUPTA et al., 2012). Deve-se ressaltar ainda que há a necessidade de Deve-se deDeve-senvolver modelos para as outras etapas do processo (produção de enzimas, pré-tratamento e fermentação).
A modelagem da hidrólise enzimática da celulose é bastante complexa, já que há múltiplas enzimas envolvidas, a reação é heterogênea e as características estruturais do substrato são modificadas durante a hidrólise (ex: mudança na capacidade de adsorção das enzimas no substrato ao longo da hidrólise e distinção do substrato em relação a celulose amorfa e cristalina). Segundo BANSAL et al. (2009), os dois maiores desafios da modelagem do processo de hidrólise enzimática seriam uma maior compreensão das variáveis relevantes na interação enzima/substrato (concentração e composição do substrato, capacidade de adsorção, concentração de enzimas, composição da celulase, concentração de celulase adsorvida, sinergismo) e a identificação dos fatores limitantes da taxa de reação. Um modelo cinético rigoroso para a hidrólise enzimática de biomassas lignocelulósicas ainda pode ser desenvolvido pela incorporação dos fenômenos de adsorção (adsorção produtiva pela celulose e improdutiva pela lignina) e inibição pelos produtos da reação.
1.1. Objetivo
Nesse estudo o objetivo é o desenvolvimento e validação de um modelo cinético que incorpore os fenômenos de adsorção e de inibição enzimática pelos açúcares gerados (celobiose e glucose) para predizer a hidrólise enzimática de bagaço de cana submetido aos pré-tratamentos hidrotérmico e organossolve.
Para isso as seguintes etapas foram seguidas:
1- Estudo das características de adsorção da celulase e β-glicosidase em lignina, Avicel (celulose padrão) e bagaço de cana pré-tratado (hidrotérmico e organossolve);
2- Estudo da adsorção da celulase em bagaço de cana pré-tratado (hidrotérmico e organossolve) ao longo da hidrólise enzimática.
3- Determinação do mecanismo de inibição das enzimas (celulase e β-glicosidase) pelos açúcares gerados no processo de hidrólise enzimática do bagaço de cana pré-tratado (hidrotérmico e organossolve);
4- Determinação de perfis de celulose, celobiose, glicose e pentoses a partir de ensaios experimentais de hidrólise enzimática em batelada;
5- Determinação de um modelo fenomenológico para descrição da hidrólise enzimática;
6- Estimação dos parâmetros do modelo matemático utilizando perfis experimentais de hidrólise enzimática de bagaço de cana submetido ao pré-tratamento hidrotérmico;
7- Re-estimação dos parâmetros do modelo matemático utilizando perfis experimentais de hidrólise enzimática de bagaço de cana submetido ao pré-tratamento organossolve;
8- Determinação dos parâmetros mais sensíveis do modelo usando planejamento de Plackectt-Burman.
1.2. Organização do Trabalho
A tese está organizada da seguinte forma:
O Capítulo 2, ―Revisão Bibliográfica‖, apresenta os principais temas a serem abordados neste trabalho de pesquisa, bem como o estudo e aprofundamento dos fundamentos teóricos e novos avanços relacionados ao processo de pré-tratamento, hidrólise enzimática, estudo cinético e modelagem matemática da cinética de hidrólise enzimática.
No Capítulo 3 são abordadas as metodologias empregadas nas etapas de preparação, pré-tratamento e caracterização química do bagaço de cana-de-açúcar visando à quantificação do teor de extrativos, cinza, lignina total, celulose e hemiceluloses. Além das análises de composição química para o bagaço de cana são apresentados resultados das características morfológicas do bagaço de cana obtidas por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV).
No Capítulo 4 é apresentado um artigo publicado na revista ―Biotechnology and Applied Biochemistry‖, onde foi avaliada uma metodologia para o estudo da adsorção sem presença de reação utilizando glicose como inibidor. Foi estudado o efeito da agitação e da carga de sólidos sob a cinética de adsorção em Avicel e bagaço de cana pré-tratado (hidrotérmico e organossolve) e foram determinadas as isotermas de adsorção que foram utilizadas no desenvolvimento do modelo matemático.
No Capítulo 5 o comportamento da adsorção da celulase no bagaço de cana pré-tratado (hidrotérmico e organossolve) durante a hidrólise foi avaliado por meio de isotermas de Langmuir. Essa variação nos perfis de adsorção está relacionada com a mudança das características do substrato durante a hidrólise. Os parâmetros de Langmuir (Emax e Kp) foram correlacionados com o tempo de hidrólise e usados no desenvolvimento do modelo matemático.
O Capítulo 6 aborda a determinação do mecanismo de inibição das enzimas (celulase e β-glicosidase) pelos açúcares gerados no processo de hidrólise enzimática do bagaço de cana pré-tratado (hidrotérmico e organossolve). Nesta etapa foi desenvolvida metodologia para inibição da β-glicosidase presente no complexo celulolítico de forma que a celobiose não seja hidrolisada em glicose e não influencie nos ensaios.
No Capítulo 7 foi mostrado o desenvolvimento do modelo matemático com as considerações pertinentes, as simulações utilizando o modelo com parâmetros ajustados
aos dados de hidrólise enzimática com bagaço hidrotérmico e com posterior re-estimação dos parâmetros para representar dados provenientes da hidrólise com bagaço organossolve. Foi avaliada a influência dos parâmetros cinéticos no modelo através do planejamento de Plackett-Burman.
CAPÍTULO 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Biomassa Lignocelulósica
As biomassas lignocelulósicas constituem o material mais abundante em nosso planeta, tornando-se atrativas para produção de etanol, assim como para outros biocombustíveis. São compostos principalmente por celulose, hemiceluloses e lignina, juntamente com pequenas quantidades de pectina, proteína, extrativos (materiais solúveis não estruturais, tais como açúcares não estruturais, materiais nitrogenados, clorofila e ceras) e cinzas (KUMAR, et al. 2009).
A composição de vários materiais lignocelulósicos varia substancialmente de acordo com a fonte da biomassa. O bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) apresenta em sua composição média 25–45% de celulose, 28–32% de hemiceluloses e 15-25% de lignina) (MENON e RAO, 2012).
Celulose, hemiceluloses e lignina estão presentes em quantidades variáveis nas diferentes partes da biomassa e estão intimamente associados para formar a estrutura da parede celular vegetal (JØRGENSEN, et al, 2007), conforme apresentado na Figura 2.1.
Figura 2.1: Ilustração esquemática da estrutura da parede celular das biomassas
lignocelulósicas (MENON e RAO, 2012).
Em geral a estrutura da parede celular vegetal é subdividida em parede primária e parede secundária. Essas camadas são compostas predominantemente por celulose e as células encontram-se separadas pela lamela média, que é uma camada fina, composta por elevada concentração de lignina (MENON e RAO, 2012).
A celulose e as hemiceluloses predominam na região da parede celular enquanto que a lignina se distribui por toda a estrutura, apresentando máxima concentração na lamela média. A distribuição da celulose, hemiceluloses e lignina varia consideravelmente entre essas camadas (FENGEL e WEGENER, 1989).
A estrutura principal da parede celular é a celulose, que consiste em cadeias de glicose ligadas por ligações β-1,4 glicosídicas. Estas cadeias estão ligadas por fortes ligações de hidrogênio, as quais formam as cadeias de celulose em microfibrilas, tornando-a de natureza cristalina e muito recalcitrante à degradação. Estas fibrilas são unidas umas às outras por hemiceluloses e polímeros amorfos de diferentes açúcares, bem como outros polímeros, tais como a pectina e lignina (VAN DYK e PLETSCHKE, 2012; MENON e RAO, 2012). A lignina presente na parede celular primária confere à planta suporte estrutural, rigidez, impermeabilidade e resistência contra ataques químicos e enzimáticos (PEREZ, et al. 2002, CASTRO e PEREIRA Jr, 2010). As microfibrilas de celulose, que estão presentes na matriz hemiceluloses-lignina, estão frequentemente associadas sob a forma de feixes ou macrofibrilas. As moléculas de microfibrilas de celulose cristalina são ordenadas tão fortemente, que não apenas enzimas, mas até mesmo pequenas moléculas como a água não podem entrar na matriz estrutural. Algumas partes das microfibrilas têm uma estrutura não cristalina menos ordenada, referida como região amorfa, sendo esta mais suscetível à degradação enzimática do que a região cristalina (KUMAR, et al. 2009; MENON e RAO, 2012).
Deste modo, os dois maiores obstáculos a impedir a hidrólise da celulose de materiais lignocelulósicos são a recalcitrância da própria celulose cristalina, proveniente da estrutura linear das cadeias de celulose compactadas em microfibrilas, e a alta proteção que a lignina proporciona à estrutura celulósica, atuando como uma barreira física contra o ataque enzimático (ANDERSEN, 2007).
2.1.1. Celulose
A celulose é uma substância fibrosa, resistente e insolúvel em água, presente na parede celular dos materiais lignocelulósicos. Trata-se de um homopolissacarídeo constituído por unidades de anidroglicopiranose (β-D-glicopiranose) ligadas entre si por ligações do tipo β-(1→4) glicosídicas formando uma cadeia linear (Figura 2.2). Duas unidades adjacentes formam uma ligação glicosídica através da eliminação de uma
molécula de água, que envolve os grupos hidroxílicos dos carbonos 1 e 4. Esta estrutura dissacarídica recebe o nome de celobiose (FENGEL e WEGENER, 1989). A celobiose é definida como unidade conformacional mínima da celulose, enquanto a glicose representa tão somente a unidade fundamental das cadeias do homopolímero (TÌMÁR-BALÁZSC e EASTOP, 1998). Segundo GURGEL (2007), a cadeia de celulose consiste de uma terminação de D-glicose com um grupo C4-OH original (terminação não redutora) e a outra terminação é finalizada com grupo C1-OH original, que está em equilíbrio com a estrutura de aldeído (terminação redutora) (Figura 2.2).
Figura 2.2: Estrutura da cadeia linear da celulose, formada por várias unidades
consecutivas de celobiose (GURGEL, 2007).
Em sua estrutura supramolecular, a celulose apresenta regiões altamente ordenadas (regiões cristalinas), estabilizadas por numerosas ligações de hidrogênio intra e intermoleculares, e áreas menos ordenadas ou amorfas, onde as cadeias apresentam uma orientação randomizada (FAN et al., 1987). As duas formas ocorrem em proporções características em celuloses de diferentes origens, e o ataque enzimático pode ser preferencial em um dos tipos de estrutura (GAMA, 1996). Na região cristalina a fibra tem maior resistência à tração, ao alongamento e a solvatação, já na região amorfa, a fibra apresenta maior grau de flexibilidade (FENGEL e WEGENER, 1989).
Segundo ZHANG e LYND (2004) as características estruturais da celulose consideradas como fatores de impacto na velocidade de reação da hidrólise enzimática são: o índice de cristalinidade, grau de polimerização e a área superficial acessível às enzimas celulolíticas. A área superfícial específica é definida como a quantidade de área superfícial por massa de celulose. O índice de cristalinidade é a quantidade relativa de celulose cristalina em oposição à quantidade de celulose amorfa.
2.1.2. Hemiceluloses
As hemiceluloses são estruturas amorfas e ramificadas formadas por heteropolímeros que incluem hexoses (D-glicose, D-galactose and D-manose) bem como pentoses (D-xylose e L-arabinose), ácidos hexurônicos (ácido D-glucurônico, ácido metilglucurômico) e desoxi-hexoses (L-ramnose, L-frucose). Os resíduos agrícolas como palha de milho, palha de arroz, palha de trigo e bagaço de cana, contém cerca de 20–40% de hemiceluloses (SAHA, 2003).
A xilana é o principal polissacarídeo componente das hemiceluloses, trata-se de um heteropolissacarídeo composto por ligações 1,4-glicosídicas de resíduos de β-D-xilopiranose. Além da xilose, as hemiceluloses podem conter ácido glucurônico ou seu éter 4-O-metilglucurônico, arabinose, ácido acético, ácido ferúlico e ácido p-cumárico. A frequência e a composição das ramificações dependem da fonte das hemiceluloses. O grau de polimerização das hemiceluloses de madeiras duras (150–200) é maior que o de madeiras macias (70–130) (SAHA, 2003).
Devido à sua estrutura ramificada, as hemiceluloses são mais solúveis que a celulose, podendo ser isoladas da madeira por extração. Hemiceluloses são facilmente hidrolisadas por ácido forte, deixando a celulose e lignina praticamente intactas (LIU e WYMAN, 2005; LLOYD e WYMAN, 2005), ou por base forte (FAN et al., 1982). Em muitos casos pré-tratamentos com ácido diluído (0.5-1.0 % H2SO4) sob temperaturas elevadas (140-190 °C) hidrolisaram a maioria das hemiceluloses em pentoses e hexoses solúveis (LLOYD e WYMAN, 2005).
A Tabela 2.1 resume as principais características apresentadas pela celulose e hemiceluloses.
Tabela 2.1: Diferenças entre celulose e hemiceluloses (SILVA, 2010).
Celulose Hemiceluloses
Unidades de glicose ligadas entre si; Unidades de diferentes pentoses e hexoses ligadas entre si;
Alto grau de polimerização (1000 a 15000 unidades de glicose);
Baixo grau de polimerização (60 a 300 unidades de açúcares);
Forma arranjo fibroso; Não forma arranjo fibroso; Apresentam regiões amorfas e
cristalinas;
Apresentam somente regiões amorfas; É atacada lentamente por ácido
inorgânico diluído a quente;
É atacada rapidamente por ácido inorgânico diluído a quente; É insolúvel em álcali É solúvel em álcali
2.1.3. Lignina
A lignina é uma macromolécula com uma estrutura tridimensional muito complexa ligada via ligações covalentes à xilana (porção de hemiceluloses). A lignina confere rigidez e alto nível de compactação à parede celular dos materiais lignocelulósicos e atua ainda como barreira contra degradação enzimática e/ou microbiana da parede celular (FENGEL e WEGENER, 1989; LIMAYEMA e RICKE, 2012).
A complexa estrutura da lignina é derivada de unidades fenilpropânicas (unidades C9) repetidas de forma irregular, que têm sua origem na polimerização desidrogenada dos álcoois coniferílicos. Os alcoois cumarílicos são diferenciados entre si pelas substituições que apresentam no anel aromático (Figura 2.3) (RABELO, 2010):
Álcool cumarílico, sem substituição, precursor das unidades p-hidroxifenílicas (H);
Álcool coniferílico, com grupo metoxílico na posição 3 do anel aromático, precursor das unidades de guaiacila (G);
Álcool sinapílico que dá lugar às unidades de siringila (S) e apresenta os grupos metoxílico nas posições 3 e 5 do anel aromático.
Figura 2.3: Estrutura dos álcoois precursores da lignina (adaptado de WONG, 2009).
As ligninas de madeiras duras apresentam em sua composição, além de grupos guaiacil (derivado do álcool coniferílico), proporções mais altas de grupos siringil (derivado do álcool sinapílico), enquanto as ligninas de madeiras moles são mais ricas em grupos guaiacil. Como conseqüência desta diferença química, as ligninas de
madeiras duras são menos condensadas e mais susceptíveis à conversão química e biológica que as de coníferas (FENGEL e WEGENER, 1989; FERNANDEZ et al., 1990; FAIX et al., 1992).
A lignina, tal como as hemiceluloses, normalmente começa a se dissolver na água em torno de 180 °C, sob condições neutras (BOBLETER, 1994). A solubilidade da lignina em ambiente ácido, neutro ou alcalino depende, contudo, do precursor (p-cumarílico, coniferilíco, sinapílico ou uma combinação deles) da lignina (GRABBER, 2005).
2.2. Pré-tratamento
Os açúcares do bagaço, assim como aqueles de qualquer outro material lignocelulósico, encontram-se na forma de polímeros (celulose e hemiceluloses) associados entre si e recobertos por uma macromolécula aromática complexa (lignina), formando a microfibrila celulósica. Esta, por sua vez, constitui a parede celular (fibra) vegetal, uma estrutura recalcitrante difícil de ser desestruturada e convertida em monossacarídeos fermentescíveis (CHANG et al., 1998). Em vista disso uma etapa de pré-tratamento é necessária para alterar a estrutura dos resíduos agrícolas, bem como sua composição química, de forma que a hidrólise dos carboidratos em açúcares monoméricos pela ação das enzimas seja alcançada mais rapidamente e com maiores rendimentos (KUMAR et al., 2009).
Figura 2.4: Esquema do papel do pré-tratamento na conversão dos materiais
lignocelulósicos a etanol (VOLYNETS e DAHMAN, 2011).
A Figura 2.4 representa o esquema das transformações que sofre a biomassa lignocelulósica durante o pré-tratamento com alteração da estrutura e aumento da acessibilidade da celulose para as enzimas na etapa de hidrólise enzimática.
Um pré-tratamento eficaz é caracterizado por vários critérios como: reduzir o grau de cristalinidade da celulose, dissociar a matriz lignina-celulose-hemiceluloses, aumentar a área superficial da biomassa, evitar a necessidade de reduzir o tamanho das partículas da biomassa, preservar as pentoses, maximizando os rendimentos em açúcares, evitar ou minimizar a formação de compostos que são inibidores do processo tanto na etapa de hidrólise quanto na etapa de fermentação, permitir a transposição para a escala industrial. Além disso, o pré-tratamento deveria ser sustentável no que diz respeito ao consumo de energia e impacto ambiental (MOSIER et al.,2005; JØRGENSEN et al.,2007; PIENKOS e ZHENG, 2009a).
A eficiência do pré-tratamento depende das propriedades físico-químicas da matéria-prima. Ao contrário de biomassa lenhosa, resíduos agrícolas como palha de milho e bagaço de cana, que têm baixo teor de lignina, são mais facilmente pré-tratados e não requerem tanta energia quanto biomassas lenhosas que contêm maiores quantidades de lignina e apresentam uma parede celular mais rígida (GREGG et al., 1998; WINGREN et al., 2003; LIMAYEMA e RICKE, 2012)
Vários métodos de pré-tratamento de biomassas lignocelulósicas têm sido sugeridos ao longo das duas últimas décadas. Em relação à sua natureza, estes podem ser classificados em três grupos principais: físicos, químicos, biológicos, além de várias combinações entre eles (SUN e CHENG, 2002; MOSIER et al., 2005; TAHERZADEH e KARIMI, 2008; HENDRIKS e ZEEMAN, 2009; MENON e RAO, 2012).
Geralmente a combinação de métodos é mais efetiva que um único método, entretanto em alguns casos um segundo pré-tratamento não aumenta a digestibilidade do substrato tratado pelo primeiro. Comparando com uma única etapa de pré-tratamento, o capital investido e os custos de processo de uma técnica de pré-tratamento combinada envolveria equipamentos adicionais e em alguns casos mais reagentes químicos (HSU, 1996).
A Tabela 2.2 apresenta algumas das técnicas de pré-tratamento mais promissoras para os materiais lignocelulósicos a fim facilitar a hidrólise enzimática.
Tabela 2.2: Métodos de pré-tratamentos de materiais lignocelulósicos para hidrólise
enzimática (adaptado de KUMAR et. al., 2009 e MENON e RAO, 2012).
Pré-tratamento Vantagens Limitações e desvantagens Mecânico Reduz a cristalinidade da
celulose
Consumo de energia geralmente maior que a energia inerente à biomassa
Hidrólise ácida hidrolisa hemiceluloses a xilose e outros açúcares; altera a estrutura da lignina
Alto custo; corrosão de equipamentos; formação de inibidores
Hidróxido de Cálcio
Remove hemiceluloses e lignina, baixo custo do reagente
Altos tempos de reação, necessidade de neutralização antes da hidrólise
Peróxido de Hidrogênio
Remove boa parte da lignina e hemiceluloses, baixa
necessidade de energia, biomassa fica altamente susceptível à hidrólise enzimática
Alto custo do reagente
Organossolve Hidrolisa lignina e hemiceluloses
Solventes precisam ser drenados do reator, evaporados,
condensados e reciclados; alto custo
Hidrotérmico Remove as hemiceluloses tornando a celulose acessível às enzimas
Pouca lignina removida
Explosão CO2 Aumenta a área superficial acessível; não causa formação de compostos inibidores; relação custo benefício
Não modifica lignina ou hemiceluloses
Explosão a vapor Causa degradação das hemiceluloses e alteração na estrutura da lignina
Destruição de uma porção da fração de xilana; ruptura incompleta da matriz lignina-carboidrato; geração de
componentes inibidores na etapa de fermentação
Ozonólise Reduz o teor de lignina; não produz resíduos tóxicos
Grande quantidade de ozônio requerida; alto custo
Tabela 2.2: Métodos de pré-tratamentos de materiais lignocelulósicos para hidrólise
enzimática (adaptado de KUMAR et. al., 2009 e MENON e RAO, 2012) (continuação). Pré-tratamento Vantagens Limitações e desvantagens
AFEX Aumenta a área superficial acessível; remove lignina e hemiceluloses até um ponto; não causa formação de compostos inibidores
Não é eficiente para biomassas com altos teores de lignina
Biológico Degrada lignina e hemiceluloses; baixa necessidade de energia
A taxa de hidrólise é muito lenta
2.2.1. Pré-tratamentos Físicos
Os pré-tratamentos físicos são tecnologias que visam à redução do tamanho de partícula da biomassa lignocelulósica para facilitar os pré-tramentos subsequentes. A redução do tamanho de partícula da biomassa favorece a hidrólise enzimática, pois pode reduzir a cristalinidade e o grau de polimerização da celulose favorecendo a transferência de massa (FAN et al.,1982; MTUI, 2009; MENON e RAO, 2012). Os pré-tratamentos físicos mais comuns são: moagem, irradiação (usando raios gama, radiações de microondas, etc) e extrusão. Estas mudanças estruturais resultam em um material que pode ser mais acessível a tratamentos subseqüentes, porém os pré-tratamentos físicos demandam elevado consumo de energia e tempo, sendo, portanto, pouco viáveis para aplicações industriais. Na maioria dos casos em que a única opção disponível para pré-tratamento é o físico, a energia requerida é maior do que o conteúdo de energia teórica disponível na biomassa (MENON e RAO, 2012).
2.2.2. Pré-tratamentos Físico-Químicos
Nesta categoria incluem-se misturas de pré-tratamentos físicos tais como a explosão a vapor com reagentes químicos. Os processos mais importantes deste grupo incluem: explosão a vapor, explosão a vapor catalisada com SO2 ou CO2, AFEX (Ammonia Fibre Explosion) e hidrotérmico. Nestes processos, a biomassa é tratada com vapor saturado a altas pressões, amônia líquida ou CO2 e então a pressão é rapidamente reduzida, fazendo com que os materiais sofram uma descompressão explosiva (MTUI, 2009; MENON e RAO, 2012).
Na explosão a vapor a biomassa lignocelulósica é aquecida a altas temperaturas (cerca de 250 °C) e a pressão é liberada rapidamente, levando à redução do tamanho das partículas. Em razão da alta temperatura empregada, há degradação das hemiceluloses e transformação da lignina, beneficiando a etapa de hidrólise (SUN e CHENG, 2002). Estas alterações podem resultar em uma melhor acessibilidade para os tratamentos posteriores, mas as severas condições também geram produtos de degradação que podem inibir a hidrólise e a fermentação, o que não é interessante para o processo de conversão do material em etanol.
Dentre os vários tipos de pré-tratamentos físico-químicos abordados, foi explanado em maiores detalhes o pré-tratamento hidrotérmico por ser usado no presente trabalho.
2.2.2.1. Pré-tratamento hidrotérmico
O pré-tratamento hidrotérmico consiste em manter por tempo adequado o material lignocelulósico à alta temperatura e pressão na presença de água e tem como objetivos solubilizar principalmente as hemiceluloses, tornar a celulose mais acessível para a ação das enzimas celulolíticas e evitar a formação de inibidores (HENDRIKS e ZYMAN, 2009). No pré-tratamento hidrotérmico, a pressão é utilizada para manter a água no estado líquido em temperaturas elevadas (160–240°C) e provocar alterações na estrutura da lignina. O pré-tratamento hidrotérmico não requer descompressão rápida, não necessita de adição de catalisador ou produtos químicos, o que diminuiria o custo na construção do reator devido ao baixo potencial de corrosão (ALVIRA et al., 2010). Além disso, o pré-tratamento hidrotémico tem uma necessidade muito menor de produtos químicos para a neutralização do hidrolisado produzido e produz quantidades bem inferiores de resíduos de neutralização em comparação com muitos processos, tais como o pré-tratamento com ácido diluído (TAHERZADEH e KARIMI, 2008; MENON e RAO, 2012).
Durante o pré-tratamento hidrotérmico, a quebra de grupos O-acetil e ácido urônico das hemiceluloses produz ácido acético e outros ácidos orgânicos. A formação destes ácidos orgânicos ajuda a catalisar a hidrólise dos polissacarídeos da biomassa e em especial as hemiceluloses em oligossacarídeos solúveis em primeiro lugar, e em seguida, açúcares monoméricos. Sob condições ácidas, estes açúcares monoméricos são
parcialmente degradados em aldeídos, como o furfural, que é inibidor para os microrganismos fermentativos (MOSIER et al., 2005; ZHENG et al., 2009b). Para evitar a formação de inibidores, o pH deve ser mantido acima de 4 e abaixo de 7 durante o pré-tratamento, porque nesta faixa de pH os açúcares provenientes das hemiceluloses são mantidos na forma de oligômeros e a formação de monômeros é minimizada (MOSIER et al., 2005; ALVIRA et al., 2010).
A diferença entre o pré-tratamento hidrotérmico e o pré-tratamento por explosão a vapor consiste na quantidade e concentração dos produtos solubilizados. No pré-tratamento hidrotérmico temos uma maior quantidade de produtos solubilizados, enquanto que a concentração de produtos solubilizados é menor quando comparada ao pré-tratamento com explosão a vapor. Isto se deve ao fato de que a quantidade de água usada no pré-tratamento hidrotérmico é maior do que a usada no pré-tratamento por explosão a vapor (HENDRIKS e ZYMAN, 2009; MANON e RAO, 2012).
LASER et al. (2002) comparou o desempenho dos pré-tratamentos hidrotérmico e por explosão a vapor no bagaço de cana-de-açúcar, o qual foi usado para a produção de etanol por SFS (Sacarificação e fermentação simultâneas). Ambos os pré-tratamentos foram conduzidos em um reator de 250 mL em 1% a 8% de concentração de sólidos, temperatura na faixa de 170-230 °C e variando o tempo de pré-tratamento de 1-46 minutos. Os resultados mostraram que ambos os métodos geraram fibras mais suscetíveis à hidrólise, o que levou a uma conversão SSF maior ou igual a 90% em relação à celulose residual e produção de etanol teórico, entretanto, o pré-tratamento hidrotérmico resultou numa recuperação de xilana muito maior do que o pré-tratamento com explosão a vapor.
O pré-tratamento hidrotérmico é capaz de remover principalmente hemiceluloses e melhorar a digestibilidade enzimática de resíduos agrícolas, tais como palha de milho (MOSIER et al., 2005) e bagaço de cana (LASER et al., 2002). A lignina é parcialmente despolimerizada e solubilizada durante o pré-tratamento hidrotérmico, mas a deslignificação completa não é possível utilizando somente água quente por causa da recondensação da molécula de lignina (ALVIRA et al., 2010). Um processo em 2 estágios combinando o tratamento hidrotérmico com um pré-tratamento para deslignificação (ex: organossolve) seria uma boa alternativa para otimizar a recuperação de açúcares hemicelulósicos e para melhorar o rendimento da hidrólise enzimática (TAHERZADEH e KARIMI, 2008).
2.2.3. Pré-tratamentos Biológicos
Pré-tratamentos biológicos envolvem o uso de microrganismos como fungos de decomposição parda (brown-rot-fungi), branca (white-rot-fungi) e branda (soft-rot-fungi) assim como bactérias para modificar a composição química e/ou estrutural da biomassa lignocelulósica, de modo que esta seja mais susceptível à digestão enzimática. Os fungos de degradação parda atacam principalmente celulose, enquanto fungos de degradação branda e branca atacam tanto celulose quanto lignina. A degradação da lignina pelos fungos de degradação branca ocorre por meio da ação de enzimas degradantes da lignina como peroxidases e lacases (KUMAR et al, 2009). Várias pesquisas vêm sendo feitas no intuito de encontrar microrganismos mais seletivos, de forma que possam degradar a lignina com maior eficiência e especificidade. Os fungos de degradação branca são considerados os mais promissores e também são os mais estudados (MENON e RAO, 2012).
Dentre as vantagens do pré-tratamento biológico destacam-se: a não exigência de reagentes químicos, baixa demanda energética, condições brandas de processo e facilidade de operação. No entanto, as suas desvantagens são tão aparentes como as suas vantagens, dado que o pré-tratamento biológico é muito lento e requer o controle cuidadoso das condições de crescimento e grande quantidade de espaço para realizar o tratamento (MENON e RAO, 2012). Além disso, a maioria destes tipos de microrganismos não é seletiva e além de degradar hemiceluloses e lignina também degradam a celulose (SUNG e CHENG, 2002).
2.2.4. Pré-tratamento Químico
O tratamento químico é a técnica de tratamento mais estudada. Os pré-tratamentos químicos podem ser definidos como técnicas que envolvem agentes químicos tais como ácidos, bases e solventes orgânicos. Um tratamento químico tem como objetivo aumentar a superfície do substrato por entumescimento das fibras, reduzir o grau de polimerização (GP) e cristalinidade da celulose e a modificação ou a remoção das hemiceluloses e/ou da lignina para tornar a celulose mais accessível para hidrolise enzimática (HSU, 1996; MOISER et al, 2005; MENON e RAO, 2012). Dentre os pré-tratamentos mais estudados temos: a hidrólise alcalina (hidróxido de sódio, hidróxido de cálcio, sulfito de amônio), hidrólise ácida (ácido sulfúrico, ácido fosfórico,
ácido clorídrico), agentes oxidantes (peróxido de hidrogênio, oxidação úmida, ozônio) e o proceso organossolve.
Dentre os vários tipos de pré-tratamentos químicos abordados, foi explanado em maiores detalhes o pré-tratamento organossolve por ser usado no presente trabalho.
2.2.4.1. Pré-tratamento organossolve
O pré-tratamento organossolve é um processo de extração da lignina de materiais lignocelulósicos utilizando solventes orgânicos ou uma solução aquosa-orgânica destes, podendo ainda ter a adição de catalisadores ácidos ou básicos no processo. Neste processo, a biomassa lignocelulósica é misturada com o solvente orgânico e água e então aquecida à temperatura entre 100–250°C para solubilizar a lignina e parte das hemiceluloses, deixando a celulose reativa na fase sólida (TAHERZADEH e KARIMI, 2008; ZHAO et al., 2009). A principal vantagem do processo organossolve frente aos demais pré-tratamentos químicos é a recuperação da lignina praticamente pura como subproduto (ZHAO et al., 2009).
Os solventes orgânicos usados no processo organossolve incluem metanol, etanol, acetona, etilenoglicol, trietilenoglicol, álcool tetrahidrofurfuril, glicerol, ésteres, cetonas e fenóis (THRING et al., 1990; SUN e CHENG, 2002; TAHERZADEH e KARIMI, 2008; ZHAO et al., 2009).
Os solventes usados no processo são sempre caros e por isso, precisam ser removidos do reator, evaporados, condensados e reciclados, porém isto aumenta o consumo energético (SUN e CHENG, 2002; ALVIRA et al., 2010). Além disso, o processo organossolve deve ser conduzido sob condições de controle bem rígidas, pois os solventes são voláteis e qualquer vazamento poderia levar a incêndios e risco de explosão (ZHAO et al., 2009). A remoção dos solventes da celulose pré-tratada é necessária, pois os solventes podem ser inibidores do crescimento de organismos, hidrólise enzimática e da fermentação (DUFF e MURRAY, 1996; SUN e CHENG, 2002).
Ácidos orgânicos como o ácido oxálico, acetilsalicílico e salicílico podem também ser usados como catalisadores no processo organossolve (SUN e CHENG, 2002). Segundo DUFF e MURRAY (1996), para a maioria dos processos organossolve onde o pré-tratamento é conduzido a altas temperaturas (185–210°C) não há
necessidade de adição de ácidos, pois os ácidos orgânicos liberados da biomassa atuam como catalisadores para a ruptura da matriz lignina-carboidrato.
Os alcoóis de baixo peso molecular (principalmente metanol e etanol) são os solventes orgânicos mais usados no processo organossolve. Isso se deve ao custo destes alcoóis serem relativamente mais baixos, serem completamente miscíveis em água e ao seu baixo ponto de ebulição o que torna a recuperação por destilação simples mais fácil e requer menor consumo de energia (ZHAO et al., 2009) .
Segundo ZHAO et al. (2009), o processo organossolve para o tratamento de biomassas envolvendo metanol/H2O ou etanol/H2O pode ser conduzido de 2 formas: a biomassa é tratada com catalisador em baixas temperaturas (abaixo de 180°C) ou sem catalisador (auto-catálise) em temperaturas mais altas (185–210°C). Depois da deslignificação, o pré-tratado sólido é lavado com metanol ou etanol antes da lavagem com água para evitar a precipitação da lignina dissolvida no material pré-tratado. Após o pré-tratamento, a fração orgânica é drenada do reator para a recuperação do solvente e o licor negro condensado é diluído com água para precipitação da lignina. Os principais produtos do pré-tratamento são: as fibras celulósicas, com quantidades variáveis de lignina e hemiceluloses; lignina sólida, obtida após o solvente ser removido do licor negro por destilação e uma solução aquosa de açúcares das hemiceluloses.
Comparado com o pré-tratamento com metanol, o pré-tratamento com etanol é mais seguro porque é menos tóxico que o metanol. Para o Brasil, por ser um dos maiores produtores mundiais de etanol e pela possibilidade de integração com usinas de açúcar e álcool, o processo organossolve etanol/água ainda é mais interessante do ponto de vista econômico e ambiental.
2.3. Hidrólise da biomassa lignocelulósica
A etapa de hidrólise envolve a quebra dos polímeros de celulose e hemiceluloses em seus monômeros. A hidrólise completa da celulose resulta em glicose, enquanto que as hemiceluloses pode gerar diversas pentoses e hexoses. Os métodos mais comuns para a hidrólise dos materiais lignocelulósicos podem ser classificados em dois grupos: a hidrólise química e a enzimática.
A hidrólise pela rota química envolve a exposição da biomassa a um agente químico (predominantemente um ácido) por um período de tempo numa temperatura