FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA. Dissertação de Mestrado

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA PRÉ·TRATADO

POR EXPLOSÃO A VAPOR: IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES

POTENCIAIS DE PROCESSOS FERMENTATIVOS E

ENZIMÁTICOS

Hellen Cristiane Maciel Cunha

Lorena - SP - Brasil

1999

Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca Universitária em Junhoi2004

Proc, n" .202/04

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DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÔS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO POR EXPLOSÃO A VAPOR: IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES POTENCIAIS DE

PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS

Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Dr. Flávio Teixeira da Silva (presidente) Dr. José Domingos Fontana

Dr. Adilson Roberto Gonçalves

Estudante:

Hellen Cristiane Maciel Cunha

Lorena - SP - Brasil 1999

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA PRÉ-TRATADO POR EXPLOSÃO A VAPOR: IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES POTENCIAIS DE

PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS

Este exemplar corresponde a versão final da dissertação de mestrado

aprovada pela banca examinadora.

Lorena - SP - Brasil 1999

A Deus, que me ilumina e me guia.

Ao Dr. Flávio Teixeira, por sua amizade e por ter me aceito sob sua orientação.

Aos Drs. Adilson Roberto Gonçalves e André Ferraz pelas sugestões e críticas apresentadas durante a realização deste trabalho.

À Cleyde, que me iniciou na vida científica e ensinou muito do que aprendi no laboratório.

Aos meus amigos de muitos anos, Andersen, Régis, Márcia, Luane, Luciane, Sirlene, José Carlos, José Moreira, Jussara, Larissa e Denise.

Aos demais funcionários do DEBIQ e aos outros grupos de pesquisa que me deram oportunidade de utilizar alguns aparelhos.

BSTFA = N, 0-bis(trimetilsilil)fluoroacetamida CLAE = Cromatografia Líquida de Alta Eficiência DP = Grau de Polimerização

FA1 = Fase Aquosa 1 F A2 = Fase Aquosa 2 FA3 = Fase Aquosa 3

FIO= Detector de Ionização de Chama F01 = Fase Orgânica 1

F02 = Fase Orgânica 2 F03 = Fase Orgânica 3 F04 = Fase Orgânica 4 FOS = Fase Orgânica 5 F06 = Fase Orgânica 6

GC/MS = Cromatografia Gasosa acoplada a Espectroscopia de Massas HPSEC = Cromatografia de Exclusão por Tamanho

TIC = Cromatograma de Íons Reconstituído TMS = Trimetilsilil

Lista de tabelas i

Lista de figuras iii

Resumo viii

Abstract. ix

1. INTRODUÇÃ0 1

1.1. ASPECTOS GERAIS 1

1.2. CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 2

1.2.1. CELULOSE 2

1.2.2. POLIOSES 3

1.2.3. LIGNINA 5

1.2.4. ESTRUTURA DO TECIDO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

E A ASSOCIAÇÃO ENTRE CELULOSE, POLIOSES E LIGNINA. 5

1.3. SEPARAÇÃO DOS COMPONENTES DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS 8

1.4. INIBIDORES PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÓSIC0 15

2. OBJETIVOS 32

3. MATERIAIS E MÉTODOS 33

3.1. PREPARAÇÃO DO BAGAÇO DE CANA 33

3.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO BAGAÇO DE CANA. 35

3.2.1. DETERMINAÇÃO DOS EXTRAÍVEIS 35

3.2.2. DETERMINAÇÃO DE LIGNINA KLASON INSOLÚVEL EM MEIO ÁCID0 35

3.2.3. DETERMINAÇÃO DE LIGNINA KLASON SOLÚVEL EM MEIO ÁCID0 36

3.2.4. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CINZAS NO BAGAÇO DE CANA 36

3.2.5. DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS E ÁCIDOS ORGÂNICOS POR CLAE 37

3.2.6. DETERMINAÇÃO DE FURFURAL E HIDROXIMETILFURFURAL.. 38

3.3. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO A VAPOR A

190ºC POR 15 MIN 38

3.4. IDENTIFICAÇÃO DOS OLIGÔMEROS DE GLICOSE E XILOSE POR CLAE 41

3.4.1. HIDRÓLISE DE XILANA E CELULOSE 41

3.5. DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLAR DOS COMPOSTOS PRESENTES NO

HIDROLISAD0 42

3.5.1. CURVAS DE CALIBRAÇÃO PARA A DISTRIBUIÇÃO DA MASSA

MOLAR DOS COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISAD0 43

3.6. SEPARAÇÃO DE CARBOIDRATOS E COMPOSTOS AROMÁTICOS

PRESENTES NO HIDROLISAD0 44

3.6.1. SEPARAÇÃO EM CARTUCHOS DE EXTRAÇÃO SÓLIDA (SEP-PAK C18) .44

BAIXA MASSA MOLAR PRESENTES NO HIDROLISAD0 48 3.8.1. DERIVATIZAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA ANÁLISES DE GC/MS E GC/FID .48 3.8.2. CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSAS .48 3.8.3. CROMATOGRAFIA GASOSA/DETECTOR DE IONIZAÇÃO DE CHAMA 49

4. RESULTADOS E DISCUSSÃ0 51

4.1. PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO A VAPOR. 51

4.2. DETERMINAÇÃO DE OLIGÔMEROS DE XILOSE E GLICOSE POR CLAE 55

4.3. IDENTIFICAÇÃO DE COMPLEXOS LIGNINA-CARBOIDRATO PRESENTES NO

HIDROLISADO DO PRÉ-TRATAMENTO DO BAGAÇO DE CANA POR EXPLOSÃO

AVAPOR 60

4.4. FRACIONAMENTO DOS COMPOSTOS PRESENTES NO HIDROLISADO POR

EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUID0 68

4.4.1. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA

DE MASSAS 69

4.4.2. ESPECTROSCOPIA NO INFRA VERMELH0 85

4.4.3. CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE OS COMPOSTOS IDENTIFICADOS

POR GC/MS 88

5. CONCLUSÕES 91

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 92

Tabela 1. Concentração de alguns compostos identificados no hidrolisado de carvalho vermelho e seus efeitos inibitórios na subseqüente fermentação de

xilose a etanol (TRAN e CHAMBERS, 1986) 22

Tabela 2. Compostos derivados de lignina identificados em hidrolisados de

álamo, switchgrass e com stover (FENSKE et ai., 1998) 28

Tabela 3. Proteínas utilizadas na calibração da coluna cromatográfica e suas

respectivas massas molares .43

Tabela 4. Programas de temperatura da coluna para análises das frações

orgânicas nas análises de GC/MS e GC/FID 49

Tabela 5. Balanço de massa do pré-tratamento do bagaço de cana a 190ºC, 15

min. Quantidades expressas em relação a 100 g de bagaço seco 51

Tabela 6: Balanço de massa do pré-tratamento do bagaço de cana a 190ºC, 15 min. Quantidades expressas em relação a 100 g de bagaço seco (SILVA,

1995) 52

Tabela 7. Composição do bagaço de cana pré-tratado a 190ºC por 15 min

comparada aos dados obtidos por SILVA (1995) 53

Tabela 8. Distribuição dos compostos identificados no hidrolisado do pré-

tratamento por explosão a vapor a 190ºC por 15 min. Quantidades expressas

em relação a 100 g de bagaço 54

Tabela 9. Tempos de retenção dos açúcares identificados no hidrolisado hemicelulósico obtido por explosão a vapor (190ºC/15 min) analisado na coluna

xilotriose 57

Tabela 11. Tempos de retenção dos xilo-oligômeros obtidos por hidrólise de xilana (25ºC/7min) e analisados na coluna Aminex HPX 42A 58

Tabela 12. Tempos de retenção dos gluco-oligômeros obtidos por hidrólise de celulose (45ºC/7min) e analisados na coluna HPX 42A 59 Tabela 13. Rendimento das frações obtidas no procedimento de extração

líquido-líquido 68

Tabela 14. Atribuição dos picos e quantificação dos compostos identificados na

fração F O 1 71

Tabela 15. Atribuição dos picos e quantificação dos compostos identificados na

fração F02 7 4

Tabela 16. Atribuição dos picos e quantificação dos compostos identificados na

fração F03 77

Tabela 17. Atribuição dos picos e quantificação dos compostos identificados na

fração F 04 80

Tabela 18. Atribuição dos picos e quantificação dos compostos identificados na

fração FOS 83

Tabela 19. Quantidade total de cada composto identificado por GC/MS no hidrolisado obtido do pré-tratamento do bagaço de cana por explosão a

Figura 1. Estrutura da celulose. Parte central da cadeia molecular (FENGEL e

WEGENER, 1989) 3

Figura 2. Fórmula dos açúcares presentes nas polioses (FENGEL e

WEGENER, 1989) 4

Figura 3. Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando alguns grupos substituintes. Xyl = 1,4-0-xilopiranose; Ara = L-arabinofuranose; (4-Me)-GlcA = ácido (4-0-metil)-D-glucopiranurônico; Ac = acetil; FA = ácido ferúlico; DDFA = ácido desidroferúlico (McDOUGAL, 1993) .4

Figura 4. Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (1) álcool p- cumárico; (li) álcool coniferílico; (Ili) álcool sinápico (FENGEL e WEGENER,

1989) 6

Figura 5. Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por Adler

(FENGEL e WEGENER, 1989) 6

Figura 6: Microscopia eletrônica de transmissão das células de madeira mostrando as camadas da parede celular: ML= lamela média, P= parede primária, S1= parede secundária, S2= parede secundária, T= parede terciária e W= camada de verrugas. (a) (Picea abies) (b) (Fagus sy/vatica) (FENGEL e

WEGENER 1989) 7

Figura 7: Corte ilustrativo do sistema de camadas na parede das células da

madeira (FENGEL e WEGENER, 1989) 7

Figura 8. Representação esquemática do processo de separação dos componentes do bagaço de cana por explosão a vapor 34

Figura 9. Representação esquemática do sistema de pré-tratamento de materiais lignocelulósicos por explosão a vapor, em escala de bancada .40

Figura 10. Curva de calibração da coluna cromatográfica Asahipak-320H

eluída com água bidestilada a 1,0 mUmin 44

Figura 11. Representação esquemática do processo de extração do

hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana com diferentes solventes .47

Figura 12. Hidrolisado hemicelulósico obtido por explosão a vapor (190ºC/

15 min) analisado na coluna Aminex HPX 42A, para a determinação de

oligômeros 55

Figura 13. Cromatograma de uma amostra padrão contendo xilose, xilobiose e

xilotriose 56

Figura 14. Xilana hidrolisada com H2SQ4 72% a 25º C e analisada na coluna

Aminex HPX-42A, em um detector de Índice de Refração '. 57

Figura 15. Celulose hidrolisada com H2S04 72% a 45º C e analisada na coluna

Aminex HPX-42A, em um detector de indice de Refração 59

Figura 16. SEC da fração do hidrolisado filtrada somente em membrana, para

retirada de sólidos ;.61

Figura 17. SEC da fração do hidrolisado hemicelulósico filtrada em cartucho de

extração sólida Sep-Pak C18 61

Figura 18. SEC da fração do hidrolisado hemicelulósico retida em cartuchos de

eluído em uma série de cartuchos de extração sólida Sep-Pak C18. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da matéria orgânica presente no

hidrolisado liofilizado 63

Figura 20. Espectros FTIR de transmissão de Euca/yptus regnans e seus

componentes (MICHEL, 1988) 65

Figura 21. Espectro de infravermelho dos compostos presentes no hidrolisado

adsorvido em uma série de cartuchos de extração sólida Sep-Pak C18, dessorvido com etanol e concentrado a pressão reduzida. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da matéria orgânica presente no

hidrolisado adsorvido e seco 66

Figura 22. Espectro FTIR da lignina de bagaço de cana pré-tratado por

explosão a vapor e extraída com NaOH 1 % a 1 OOºC. Espectros tirados de pastilhas de KBr com 0,5% de lignina (SILVA, 1995) 67

Figura 23. Cromatograma reconstituído (TIC) dos compostos presentes na

fração orgânica F01 após derivatização com BSTFA e detectados por

espectrometria de massas 70

Figura 24. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica F01

após derivatização com BSTFA e detectados por ionização de chama

(FID) 70

Figura 25. Cromatograma reconstituído (TIC) dos compostos presentes na

fração orgânica F02 após derivatização com BSTFA e detectados por

Figura 26. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica F02

após derivatização com BSTFA e detectados por ionização de chama

(FID) 73

Figura 27. Cromatograma reconstituído (TIC) dos compostos presentes na

fração orgânica F03 após derivatização com BSTFA e detectados por

espectrometria de massas 76

Figura 28. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica F03

após derivatização com BSTFA e detectados por ionização de chama

(FID) 76

Figura 29. Cromatograma reconstituído (TIC) dos compostos presentes na

fração orgânica F04 após derivatização com BSTFA e detectados por

espectrometria de massas 79

Figura 30. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica F04

após derivatização com BSTFA e detectados por ionização de chama

(FID) 79

Figura 31. Cromatograma reconstituído (TIC) dos compostos presentes na

fração orgânica FOS após derivatização com BSTFA e detectados por

espectrometria de massas 82

Figura 32. Cromatograma dos compostos presentes na fração orgânica FOS

após derivatização com BSTFA e detectados por ionização de chama

(FID) 82

Figura 33. Cromatograma reconstituído (TIC) da fração orgânica 6 evaporada

Figura 34. Espectro de infravermelho da fração fenólica F01 obtida por

extração com solventes do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F01 86

Figura 35. Espectro de infravermelho da fração ácida F02 obtida por extração

com solventes do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F02 86

Figura 36. Espectro de infravermelho da fração total F04 obtida por extração

com solventes do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F04 87

Figura 37. Espectro de infravermelho da fração neutra F06 obtida por extração

com solventes do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Espectro obtido a partir de pastilhas de KBr com 0,5% da F06 87

identificação de inibidores potenciais de processos fermentativos e enzimáticos. Hellen Cristiane Maciel Cunha. Dissertação de mestrado.

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Flávio Teixeira da Silva (CP 116, 12600000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. José Domingos Fontana e Dr. Adilson Roberto Gonçalves. Dezembro de 1999.

Resumo

O pré-tratamento de bagaço de cana por explosão a vapor produz hidrolisados contendo polioses solúveis em H20, além de compostos inibidores de processos fermentativos e enzimáticos, tais como ácido acético e produtos de degradação de açúcares e lignina. Neste trabalho, o bagaço de cana foi pré- tratado a 190ºC por 15 min. O pré-tratamento solubilizou 34% do bagaço de cana. As frações obtidas (bagaço pré-tratado e hidrolisado hemicelulósico) foram caracterizadas quimicamente. Açúcares livres e seus oligômeros foram determinados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), em uma coluna Aminex HPX-87H e HPX-42A, respectivamente. Lignina e cinzas foram determinadas por gravimetria. A análise qualitativa do hidrolisado mostrou a presença de oligômeros de xilose com grau de polimerização variando de 2 a 6, com predominância de xilobiose e xilotriose. Os resultados de HPSEC mostraram que a massa molar média dos carboidratos presentes no hidrolisado foi menor que a dos compostos aromáticos. Tal resultado foi confirmado por CLAE e infravermelho, mostrando que na fração adsorvida em C18 houve a formação de complexo lignina-carboidrato. O uso de C18 foi efetivo para separar os compostos de baixa massa molar derivados da lignina e complexo lignina-carboidrato, mas ineficaz para identificação dos compostos de baixa massa molar por CG/MS. As frações orgânicas obtidas da extração líquido-líquido dos compostos presentes no hidrolisado foram analisadas por CG/MS e quantificadas por CG/FID. Nas frações ácidas (F02 e F03) foram identificados os ácidos trans-cumárico (4,01 % e 2,56%) e ferúlico (0,04% e 0,32%) como principais compostos, além dos ácidos p-hidroxibenzóico (0,05%), vanílico (0,01%), siríngico (0,39%) e cis-cumárico (0,51%), vanilina (0,40%) e siringaldeído (0,36%). Os produtos contidos nas frações fenólicas (F04 e F05} foram similares aos encontrados na fração ácida, sendo o ácido cumárico (0,05% e 2,99%) o principal produto, além dos ácidos ferúlico (O, 14% e 0,45%), p-hidroxibenzóico (0,06%), vanílico (0,67%), cis-cumárico (0,64%), p-hidroxibenzaldeído (1,5%) e siringaldeído (0,51 %). Na fração neutra (F06) nenhum composto foi identificado.

identification of potencial inhibitors for enzimatic and fermentative process. Hellen Cristiane Maciel Cunha. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Flávio Teixeira da Silva (CP 116, 12600000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. José Domingos Fontana e Dr. Adilson Roberto Gonçalves. Dezembro de 1999.

Abstract

Sugarcane bagasse pretreatment by steam explosion produces hydrolysates containing polyoses soluble in H20, as well as compounds that are inhibitors of the fermentative and enzymatic processes, such as acetic acid and products of sugar and lignin degradation. ln this study, sugarcane bagasse was pretreated at 190ºC for 15 min. The pretreatment solubilized 28% of the sugarcane bagasse. The fractions obtained (pretreated bagasse and hemicellulosic hydrolysate) were chemically characterized. Free sugars and their oligomers were determined by HPLC in two Aminex columns: HPX-87H and HPX-42A, respectively. lignin and ashes were determined by gravimetry. The qualitativa analyses of the hydrolysate showed the presence of xylose oligomers with polimerization degrees ranging from 2 to 6, xylobiose and xylotriose being predominant. HPSEC results showed that the average molar mass of the carbohydrates present in the hydrolysate was smaller than that of the aromatic compounds. This was confirmed by HPLC and infrared, showing that in the fraction in C 18 these was the formation of lignin-carbohydrate complex. The use of C 18 was effective for separating the low molecular weight compounds derived from lignin and lignin-carbohydrate complex, but ineffective for identifying low molecular weight compounds by GC/MS. ln the acid fractions (F02 and F03), the coumaric acid (4.01% and 2.56%) and ferulic acid (0.04% and 0.32%) were identified as the main compounds, besides of them p- hydroxybenzoic acid (0.05%), vanilic acid (0.01%), siring acid (0.39%), eis- coumaric acid (0.51 %), vanilin (0.4%) and syringealdehyde (0.36%). The products contained in the phenolic fractions were similar to those found in the acid fraction, the coumaric acid (0.05% and 2.99%) being the main product, besides of them ferulic acid (0.14% and 0.45%), p-hydroxybenzoic acid (0.06%), vanilic acid (0.67%), cis-coumaric acid (0.64%), p- hydroxybenzaldehyde (1.5%) and syringealdehyde (0.51 %). ln the neutral fraction no compound was identified.

1.1. ASPECTOS GERAIS

O bagaço de cana é freqüentemente citado na literatura como um material lignocelulósico promissor para a obtenção de açúcares, que podem ser transformados em etanol ou outros compostos químicos (SASKA E OZER,

1995).

A cana-de-açúcar, uma gramínea pertencente ao gênero Saccharum, é originária da Índia. Com o decorrer do tempo, sua cultura expandiu-se por várias regiões do mundo e foi introduzida no Brasil logo após seu descobrimento (PAIVA, 1980).

A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) cresce na maioria dos países tropicais e subtropicais e é usada principalmente para a obtenção de açúcar e álcool. Após sua moagem, o principal subproduto é o bagaço, que representa de 12% a 14% da massa seca da cana (ICIDCA, 1987).

Em 1998 foram produzidas no Brasil 287 milhões de toneladas de cana de açúcar, que foram convertidos em açúcar e álcool, gerando quantidades superiores a 40 milhões de toneladas de bagaço (MA TIOLI et ai., 1998). Esse bagaço tem sido utilizado principalmente para geração de vapor e energia, que são consumidos nas próprias usinas (ARMAS e BIANCHI, 1990). Mesmo assim, é produzido um grande excedente. Estima-se que é gerado um excesso de cerca de 1 milhão tonlano, que causa sérios problemas de estocagem e impacto ao meio ambiente.

Entretanto, o preço do bagaço de cana é baixo e pode ser aproveit_ado para fins mais nobres, pois é uma fonte abundante de carboidratos com um alto potencial para ser hidrolisado e fermentado a etanol (MARTIN et ai., 1999). Em muitos países do mundo, inclusive no Brasil, o bagaço já está sendo usado na produção de polpa celulósica, papel e papelão (ATCHISON,1993).

MARTIN et ai. (1999) estimaram que as usinas de açúcar e álcool podem liberar de 30% a 50% do bagaço produzido para usos alternativos, com a produção de compostos de maior valor econômico, empregando-se a

tecnologia já existente (CASTRO et ai., 1995; DESCHAMPS et ai., 1996; LACORTE et ai .. 1986).

1.2. CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS DOS MATERIAIS LIGNOCELULÔSICOS

A dificuldade de se converter o bagaço de cana e outros materiais lignocelulósicos em insumos químicos é atribuída às suas características químicas e morfológicas. Esses materiais são um compósito de microfibrilas de celulose envolvidas em uma matriz amorfa de polioses e lignina. Esta matriz amorfa age como uma barreira natural ao ataque de microrganismos e/ou enzimas e torna esses materiais estruturalmente rígidos e poucos reativos (FENGEL e WEGENER, 1989).

A compreensão da complexidade estrutural e da reatividade dos materiais lignocelulósicos requer o conhecimento das características e das propriedades de cada um de seus componentes.

1.2.1. CELULOSE

A celulose é um polímero linear de subunidades de glicose associadas por ligações J3-(1-A), sendo a celobiose a unidade repetitiva do polímero (figura 1 ). As cadeias de celulose se encontram agregadas paralelamente para formar as fibrilas elementares, que são insolúveis em água e apresentam regiões cristalinas e amorfas (FENGEL e WEGENER, 1989; PARHAM, 1993). As pontes de hidrogênio inter- e intramolecular são responsáveis pela manutenção das regiões cristalinas, e tornam a celulose altamente resistente à hidrólise ácida, alcalina ou enzimática (WOOD e SADDLER, 1988; CONVERSE e WARE, 1994).

H 00

?°'2~

H 00

'0J,;-~,t-~:'-(º~c1

Hl~o./"''~ H~O.,/\

HOH ~~ Hai ~~

lndade de Celobiose ---

Figura 1. Estrutura da celulose. Parte central da cadeia molecular (FENGEL e WEGENER, 1989).

1.2.2. POLIOSES

As polioses diferem substancialmente da celulose por serem amorfas, com estrutura ramificada e compostas pela combinação de vários açúcares (pentases, hexases, ácidos hexurônicos e deoxiexoses) (figura 2) (PARHAM, 1993; FENGEL e WEGENER, 1989). As polioses são classificadas basicamente de acordo com os açúcares presentes na cadeia principal do polímero: xilanas, glucomananas e galactanas.

A cadeia principal pode ser um homopolímero, como no caso das xilanas, ou um heteropolímero, como no caso das glucomananas e podem apresentar arabinose, galactose, ácido 4-0-metilglucurônico e grupos acetil ligados à cadeia principal. As madeiras moles apresentam maior proporção de galactogluco-mananas do que de xilanas, enquanto as madeiras duras são mais ricas em xilanas (PARHAM, 1993). A composição de xilanas de gramíneas foi estudada por vários autores, entre eles por McDOUGALL et ai. (1993). A representação esquemática de uma xilana típica de gramíneas está representada na figura 3.

Pentases Hexases Acides Hexurõnicos Deoxi-hexoses ~OH p- D - Xilose ~VOH Ho"~ HO~OH CH3 H H p-D -Glicose HOQOH OH H

a-L -Arabinopiranose p-D-Manose ácido a-D-4-0-Metilglucurônico a-L-Fucose

"º",º~~

~q. ~~

a-L -Arabinofuranose a-D -Galactose ácido a-D -Oalacturônico

Figura 2. Fórmula dos açúcares presentes nas polioses (FENGEL e WEGENER, 1989).

(4-M e )-G lcA (4-M e )-G lcA

Ac 1 Ac Ac 1 Ac

I

ai

1

1

ai

I

2 2 3 3 2 2

-Xyl -p -Xyl- p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl- p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p -Xyl- p -Xyl-

3 3 3 3 3

ai

Llgnina

1

af

ai

ai

ai

1 1 1 1 1

Ara D-Ara Ara D-Ara Llgnlna -FA-Ara

D

I

D

F Ac _F

FA -Ara A-Ara A-Ara Ara

1 1 1 1

ai

ai

ai

ai

3 3 3 3

-Xyl-p-Xyl-p -Xyl-p -Xyl-p-Xyl-p-Xyl-p-Xyl- p-Xyl-p-Xyl-p-Xyl-p-Xyl-p -Xyl-

2 3 3 2 2

1

1

1

ai

ai

Ac Ac Ac 1 Ac

(4-Me)-GlcA

Figura 3. Representação esquemática de uma xilana de gramínea mostrando alguns grupos substituintes. Xyl = 1,4-D-xilopiranose; Ara = L-arabinofuranose;

(4-Me)-GlcA

=

ácido (4-0-metil)-D-glucopiranurônico; Ac

=

acetil; FA

=

ácido

1.2.3. LIGNINA

Depois da celulose, a lignina é a macromolécula orgânica mais importante e abundante do reino vegetal. A lignina aumenta a resistência mecânica das plantas, de tal forma que árvores de mais de cem metros podem se manter em pé (FENGEL e WEGENER, 1989).

A lignina é uma macromolécula altamente complexa e ramificada, gerada pela polimerização desidrogenativa dos álcoois hidroxicinamílicos: p- cumarílico (1), coniferílico (li) e sinapílico (Ili) (figura 4). A lignina é principalmente constituída de unidades fenilpropano associadas por ligações estáveis do tipo C-C, aril-éter e aril-aril, sendo as mais abundantes ~-(O-A) e a-(0--A) (40-60%), ~-5 (10%), ~-1 (5-10%), 5-5 (10%), ~-~ (5%) e 4-0~5 (5%) (HIGUCHI, 1985). Um modelo proposto para a estrutura da lignina de abeto é mostrado na figura 5.

1.2.4. ESTRUTURA DO TECIDO DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS E A ASSOCIAÇÃO ENTRE CELULOSE, POLIOSES E LIGNINA

Na parede celular vegetal, celulose, polioses e lignina, organizam-se formando diferentes camadas (figura 6): parede primária (P), secundária (5) e terciária (T). As diferentes células encontram-se separadas pela lamela média (ML), que é uma camada fina que mantém as células coesas e é responsável pela integridade estrutural do tecido das plantas. A parede primária (P) é a camada mais fina da parede celular e a primeira a ser depositada nas células. Do lado de dentro da parede primária é formada a parede secundária, em uma seqüência de três lamelas, 51, 52 e 53(ou T). Nestas regiões as microfibrilas de celulose possuem distintas orientações com respeito ao eixo longitudinal da célula. A parede mais espessa é a 52, na qual as microfibrilas de celulose se encontram orientadas de forma quase paralela ao eixo axial da célula. As fibrilas de celulose próximas ao lúmen da célula compreendem a camada terciária e estão orientadas quase perpendicularmente ao eixo da célula.

CH:zOH CH20H Cf'20H 1 1

1

CH CH CH

li

li

li

CH CH

*

~ ~OCH3 u3co oca, OH OH OH 1 II III

álcool p-cumaríllco álcool conlferíllco álcool slnapíllco

Figura 4. Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (1) álcool p-

cumarílico; (li) álcool coniferílico; (Ili) álcool sinapílico (FENGEL e WEGENER, 1989). H2COH Y ! HC-o- l3 1 HCOH

H

CO

₃

J@

₁ HOCH~ 1 4 HC---0 1 HCOH C=O 1 1 H3CO~OCH3 OH OH [o e]

Figura 5. Estrutura da lignina de abeto (Picea abies) proposta por Adler

Na parede celular, as fibrilas elementares estão separadas umas das outras por uma camada de polioses, formando as microfibrilas, que são envolvidas em uma matriz de lignina, formando a parede celular (FENGEL e WEGENER, 1989).

A maior quantidade de lignina é encontrada na camada 82, porém se apresenta em concentração mais elevada na lamela média. A figura 7 apresenta um modelo da construção da parede celular dos materiais lignocelulósicos, ilustrando a descrição acima.

Figura 6: Microscopia eletrônica de transmissão das células de madeira

mostrando as camadas da parede celular: ML= lamela média, P= parede primária, 81= parede secundária 1, 82= parede secundária 2, T= parede terciária e W= camada de verrugas. (a) (Picea abies) (b) (Fagus sy/vatica) (FENGEL e WEGENER 1989).

Figura 7: Corte ilustrativo do sistema de camadas na parede das células da

1.3. SEPARAÇÃO DOS COMPONENTES DOS MATERIAIS LIGNOCELULÓSICOS

Para se obter uma conversão simples e efetiva dos três pnnctpars componentes dos materiais lignocelulósicos (celulose, polioses e lignina) em produtos de maior econômico, é necessário a separação seletiva dos mesmos. Há, portanto, a necessidade de se romper o complexo lignina-celulose-poliose e remover cada fração por técnicas de pré-tratamento e deslignificação (SILVA,

1995).

Várias técnicas de pré-tratamento baseadas na combinação de processos mecânicos, físicos, químicos e biológicos estão associadas aos processos de separação e aproveitamento desses componentes (FERRAZ

et

ai., 1996; McMILLAN, 1994a). Nestas, inclui-se o emprego de álcalí, hidrólise ácida, explosão a vapor e uso de fluídos supercríticos, todas usadas ou propostas com o objetivo de produzir combustíveis renováveis e insumos químicos a partir de biomassa (McMILLAN, 1994a).

A tendência atual está baseada no desenvolvimento e no estudo de processos para o .aproveitamento integral dos materiais lignocelulósicos (SILVA, 1995). A produção, prtncipalmente de etanol, através da fermentação de açúcares obtidos a partir desses materiais, tem sido sistematicamente estudada (CLARK e MACKIE, 1984; DELGENES,

et

ai., 1996; HAHN- HÃGERDAL et ai., 1991; HAHN-HÃGERDAL, 1996; MARTÍN et ai., 1995; McMILLAN, 1994a;b; PALMQVIST, et ai., 1996a;b; 1997; PFEIFER et ai., 1984; PRIOR et ai., 1989; RIVARD et ai., 1996; WILSON et ai., 1989). Uma das vantagens do uso etanol como combustível, por exemplo, é que o dióxido de carbono produzido não representa um acréscimo de C02 na atmosfera, como no caso da combustão dos compostos fósseis.

A utilização dos materiais lignocelulósicos requer que o processo de pré- tratamento proporcione um fracionamento completo ou parcial da biomassa, como por exemplo, nos processos usados nas indústrias de papel e celulose (HAHN-HÃGERDAL

et

ai., 1991 ). O pré-tratamento deve ser eficiente do ponto de vista energético e químico, para que o processo seja economicamente vantajoso e deve promover ou proporcionar a conversão efetiva dos carboidratos a açúcares fermentáveis, para se obter o produto final com alto

rendimento. Logo, a degradação ou a perda de carboidratos devem ser evitadas, bem como a formação de compostos inibidores do metabolismo celular ou da ação de enzimas usadas nos processos de conversão da biomassa (McMILLAN, 1994a).

O processo de explosão a vapor tem sido considerado um processo viável no pré-tratamento de biomassa para a produção econômica de insumos químicos, combustível, alimentos e polímeros. A explosão a vapor permite a recuperação de grande parte dos componentes dos materiais lignocelulósicos, minimizando a sua degradação (AVELLAR e GLASSER, 1998). Além disso, é uma técnica que tem sido proposta como uma possível alternativa para o tratamento termo-mecânico dos materiais lignocelulósicos (FOCHER et ai.,

1998).

No processo de explosão a vapor, os materiais lignocelulósicos sofrem inicialmente reações de hidrólise (EXCOFFIER et ai., 1991; LORA e WAYMAN, 1978). As ligações poliose-lignina são clivadas, solubilizando as polioses e parte da lignina (AVELLAR e GLASSER, 1998). A ruptura das ligações ~- (1-+4) entre as unidades de xilose da cadeia principal do polímero com adição de uma molécula de água (FENGEL E WEGENER, 1989), produzem xilose livre (equação 1) e seus oligômeros (equação 2) (SADDLER et ai., 1993).

A arabinose é formada pela hidrólise das ligações a-(1~3) (equação 3), formada entre uma unidade de arabinose e a cadeia principal da xilana (figura 3). H20,H+ e/ou CALOR ... ~ H OH OH + equação 1

CO OH ~ "·: 0~H _H

-<E(º

_-Ac --- o ~ H equação 2 OH HO",C... r-lH

'Q~A

_o

OH

+

C':OOH OH OH OH OH equação 3

Essas reações de hidrólise são catalisadas pela presença do ácido acético liberado das reações de hidrólise dos grupos acetil (BOUCHARD et ai.,

1990 e 1991; FOCHER et ai., 1998; SADDLER et ai., 1983; MARTÍN et ai.,

1995), que encontram-se ligados aos átomos de carbono C2 e C3 das unidades

OH COOH

",~

OOCCH3

~º

•'6-oç•

!

H20, H+ e/ou CALOR

+

~º'6-oÇ•

OH COOH

_"

·

-~4à~

OH

+

HOOCCH3 equação 4

A presença de furfural deve-se às reações de desidratação das pentasanas ( arabinose I xilose) hidrolisadas durante o pré-tratamento ( equação 5) (SILVA, 1995; PALMQVIST, 1996b). Entretanto, devido à instabilidade do furfural, este tende a sofrer polimerização, formando compostos não identificados (equação 6). Da mesma forma, parte da glicose formada sofre desidratação para hidroximetilfurfural ( equação 7), que por sua vez também é degradado a compostos não identificados ( equação 8 ).

~HO

o

-~~:~~0~'ºR~u-·~

COMPOSTOS NÃO IDENTIFICADOS

equação 6

OH

equação 7

ÍQ1

~~~ ....

COMPOSTOS NÃO IDENTIFICADOS

HOH2C~~~CHO

equação 8

Com o decorrer da hidrólise das polioses, há o aumento da susceptibilidade da celulose, que sofre hidrólise das ligações glicosídicas, principalmente da fração amorfa, para formar glicose ( equação 9) e oligômeros (equação 10).

~o.w

fk-ºv)

.... cdlt

n ~

º"

equação 9 HOH C H20 H+

ç

OH HOH ' ~ O O 2 e/ou CALOR " ~"

+ ~ ...

H~c ~ equação 10

Paralelamente às reações de hidrólise, desidratação e degradação dos carboidratos, ocorrem também as reações de hidrólise da lignina,

principalmente sobre as ligações a-(0~) e J3-(0~), com a formação de compostos de baixa massa molar ( equação 11 ). Essas reações ocorrem ainda concomitantemente às reações de condensação da lignina (equação 12).

\ LIGt-.lNA HC"H 2 l _{B)CO ~}~ _OCH) "'T~CHJ HCI o acl ' º~ o-cu CH1 ~

*

HzCO.H ~ I oca, se-o U3CC o e as

-

-

-

equação 11

As polioses e a celulose degradam-se através da hidrólise das ligações glicosídicas, enquanto a lignina degrada-se através de reações que alguns autores afirmam ser de natureza radicalar (FOCHER et ai., 1998; TANAHASHI et ai., 1989; 1990), enquanto outros postulam que a lignina degrada-se através de reações de hidrólise (MICHALOWICZ et ai., 1991; AVELLAR e GLASSER, 1998; EXCOFFIER et ai., 1991 ).

K,COH - 1 o R: -- -rn, Rz<X>H f f

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*

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*

ff:,COH Q li::

o

O 11::1_ ca,

s::bt

octt,- 11,co H,

*

11 ; H,<X> Clfi LIGNINA _O

\

LIGNINA

+

PRODUTOS DA DECOMPOSIÇÃO DOS AÇÚCARES H+ E/OU CALOR PRODUTOS DE CONDENSAÇÃO equação 12

As reações citadas anteriormente são interrompidas pela descompressão súbita do reator. Neste momento, o material é desfibrado e reduzido a partículas menores, devido às forças de cisalhamento do processo. (BARNET et ai., 1989; MICHALOWICZ et ai., 1991; AVELLAR e GLASSER, 1998; EXCOFFIER et ai., 1991; GLASSER e WRIGHT, 1998; MARTÍN et ai.,

1995).

Enquanto o efeito térmico da explosão a vapor causa variações estruturais nos componentes dos materiais lignocelulósicos, o efeito mecânico, devido à expansão adiabática da água presente nos poros do material, provoca variações a níveis morfológicos, aumentando a acessibilidade e a área superficial do material (FOCHER et ai., 1998). Ocorrem mudanças na macroestrutura (tamanho das partículas) e na microestrutura (distribuição dos poros) desses materiais. A macroestrutura é modificada em função do desfibramento, que reduz o tamanho das partículas e a microestrutura em função do tratamento com vapor, que causa a abertura de microporos (SILVA,

1995). Esse fato facilita a ação posterior de reagentes químicos e: de enzimas para a hidrólise enzimática da celulose (MICHALOWICZ et ai., 1991).

Em geral, tanto a velocidade quanto a extensão da hidrólise enzimática dos materiais pré-tratados aumentam com o aumento do tempo de duração do _{,· .•. ~} pré-tratamento. Isto, porém, só é verdade quando a sacarificação enzimática se processa sobre o material pré-tratado e lavado. A biomassa pré-tratada bruta contém produtos de degradação que são inibidores das enzimas e que devem ser removidos antes da hidrólise enzimática e subseqüente fermentação. Assim, embora a extensão e a velocidade de hidrólise enzimática dos sólidos pré-tratados e lavados aumente com a severidade do tratamento, o rendimento de sacarificação global pode cair devido à remoção dos açúcares solubilizados na lavagem, como os provenientes da hidrólise das polioses (McMILLAN, 1994a).

O rendimento total de carboidratos é o fator mais importante nos processos de conversão de biomassa em escala comercial. Estudos para melhorar os processos de pré-tratamento devem ser direcionados para minimizar ou eliminar os produtos de degradação dos carboidratos presentes na biomassa, bem como os derivados da degradação da lignina e dos extrativos. Os extrativos consistem em um grande número de compostos que podem ser extraídos da madeira por solventes polares e apoiares. A concentração desses compostos são maiores em certas regiões das árvores, como nos galhos, raízes e cascas (FENGEL e WEGENER, 1989).

1.4. INIBIDORES PRESENTES NO HIDROLISADO HEMICELULÔSICO

Hidrolisados hemicelulósicos provenientes do tratamento de biomassa por explosão a vapor contêm carboidratos como principais produtos. Entretanto, esses açúcares são contaminados com pequenas quantidades de uma grande variedade de outros compostos, que inibem a fermentação e o crescimento de microrganismos. Esses inibidores podem ser divididos em grupos, em função de sua origem (FENSKE, 1998, HAHN-HAGERDAHL, 1996, McMILLAN, 1994b):

( 1) Compostos liberados durante o pré-tratamento.

Ex:

ácido acético; (2) Produtos de degradação dos açúcares.

Ex:

furfural e

hidroximetilfurfural;

(3) Produtos de degradação da lignina. Ex: siringaldeído e vanilina;

(4) Íons metálicos liberados pela corrosão dos equipamentos usados no processo. Ex: crômio, ferro, etc.;

(5) Produtos de fermentação.

Ex:

etanol e subprodutos, como ácido acético, acetaldeído, ácido fórmico e ácido lático.

A identificação e quantificação dos inibidores potenciais dos processos fermentativos e de sacarificação enzimática podem auxiliar na escolha do processo ou das condições de pré-tratamento mais apropriadas para um dado material lignocelulósico (PALMQVIST et ai., 1996a;b). Há uma relação entre a concentração desses compostos e o efeito inibitório que estes causam no meio fermentativo.

A presença de compostos inibidores da ação de microrganismos nos processos de bioconversão dos componentes de madeira pré-tratada com vapor tem sido relatada por vários autores (ANDO et ai., 1986; MES-HARTREE e SADDLER, 1983). Geralmente, estes inibidores são compostos de baixa massa molar, solúveis em água e incluem ácido acético (1), derivados de açúcares e produtos de degradação da lignina (PULS et ai., 1985; SILVA, 1995). A natureza e a concentração desses inibidores variam com as condições de pré-tratamento e com a matéria-prima usada. O ácido acético (1) é liberado durante o pré-tratamento através da hidrólise dos grupos acetil presentes nas polioses de madeiras duras e gramíneas; o furfural (2) e o hidroximetilfurfural (3) são formados pela desidratação das pentases e hexases, produzidas na hidrólise das polioses e da celulose, respectivamente; e os produtos de degradação da lignina incluem uma grande variedade de compostos aromáticos, que serão mostrados ao longo deste trabalho.

2 HJC-COOH

SINEIRO et ai. (1997) reportaram a inibição da atividade de celulases de Trichoderma reesei por compostos fenólicos, na extração aquosa de óleo de girassol. O ácido clorogênico (4), testado a concentrações que variaram de 1,20 mM a 4,50 mM, foi o composto que apresentou a menor capacidade inibitória, seguida pelos ácidos caféico (5) (0,22 mM - 0,70 mM), ferúlico (6) (0,58 mM- 2,00 mM) e sinápico (7) (0,83 mM - 1,64 mM). Nas concentrações testadas, a inibição causada pelos ácidos sinápico (7) e ferúlico (6) foi 100 e 1 O vezes maior do que a do ácido clorogênico (4), respectivamente. A inibição causada por fenóis e polifenóis foi muito maior que a causada pela glicose, pelo etanol e mesmo pela celobiose, que é considerada um· inibidor forte de celulases em processos de sacarificação enzimática. O ácido sinápico (7), por exemplo, apresentou um poder inibitório 1000 vezes maior do que a celobiose (HOLTZAPPLE et ai., 1990; SINEIRO et ai., 1997).

CHCOOH

li

_H : ~-- OH OH 5 COOH 1

ílH

CH ~OCTD OH 6 COOH 1 CH

li

CH H3CO~OCH3 OH 7

EXCOFFIER et ai. (1991) mostraram que as reações de sacarificação enzimática de madeira de álamo pré-tratada por explosão a vapor (20-50 bar e 210-260ºC, usando H2S04 0,4% (massa /massa do substrato)) são afetadas pela inativação das celulases causada por lignina e fenóis solúveis em água. O rendimento da hidrólise de celulose cristalina por celulases de Trichoderma

reesei foi reduzido em até 24% na presença de lignina. Adicionalmente, esses autores demonstraram a adsorsão e a inativação de endo-1,4-f3-glucosidases por ligninas. Eles também isolaram e estudaram a ação sobre a atividade das celulases de ácidos triidroxibutíricos (THBA) (8) e fenóis formados durante o processo de pré-tratamento. Os resultados mostraram uma diminuição no rendimento de glicose, o que pode ser explicado pela inibição das

f3-

glucosidases pelos fenóis e pelos THBA, mesmo em baixas concentrações. Os THBA podem formar lactonas em soluções aquosas, cuja ação inibitória sobre as reações de sacarificação enzimática de substratos lignocelulósicos já foi descrita por DEKKER (1986).

C3H4(0H)3COOH

8

MES-HARTREE e SADDLER (1983) estudaram o efeito de inibidores produzidos no pré-tratamento por explosão a vapor sobre a hidrólise enzimática de celulose usando celulases de Trichoderrna harzianum. Como substrato, usaram palha de trigo e madeira de álamo. A sacarificação enzimática da celulose presente nos substratos pré-tratados a 250°C por 20 s com e sem a impregnação dos cavacos com H2S04 só foi eficiente após a remoção dos compostos de baixa massa molar, através da lavagem dos substratos com água.

Furfural (2) e hidroximetilfurfural (3) foram durante muito tempo considerados os principais inibidores produzidos durante o pré-tratamento de lignocelulósicos. MES-HARTREE e SADDLER (1983) testaram esses compostos nas concentrações normalmente encontradas nos hidrolisados: 0, 1 g/L - 0,5 g/L em hidrolisado de palha de trigo e 0,01 g/L - 0,05 g/L em hidrolisado de madeira de álamo e não constataram a inibição das reações de sacarificação. Testaram também xilana e xilose nos níveis produzidos durante hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos. Nenhum efeito inibitório foi constatado. Aparentemente as xilanas foram usadas em parte como substrato para enzimas hemicelulolíticas presentes nos extratos enzimáticos. Por outro lado, a adição suplementar do extrato aquoso, isolado do hidrolisado, no substrato das reações de sacarificação, reduziu drasticamente a produção de

glicose, sem afetar significativamente a quantidade de açúcares redutores totais, o que indica inibição das ~-glucosidases.

PALMQVIST et ai. (1996a) estudaram o efeito inibitório de compostos solúveis em água sobre a hidrólise enzimática e a fermentação para etanol da madeira de salgueiro, pré-tratada com vapor, na presença de

80

2 a 205ºC por 6 min. Os sólidos foram separados do hidrolisado por filtração. O filtrado foi fracionado por destilação a vácuo para render duas frações, uma de voláteis e outra de não voláteis, que foram usadas para a determinação do potencial inibitório dos compostos presentes em cada fração. Os resultados mostraram que os compostos voláteis não afetaram nem a hidrólise enzimática nem a fermentação subsequente da glicose para etanol. Por outro lado, a fração do hidrolisado contendo os compostos não voláteis afetou não só a sacarificação, mas também a fermentação de glicose usando Saccharomyces cerevisiae.

A susceptibilidade de diferentes microrganismos a um mesmo hidrolisado contendo inibidores de fermentação foi estudado por BUCHERT et at. (1988; 1989). Em um desses trabalhos, madeira de bétula foi pré-tratada à 200ºC por 15 min (BUCHERT et at., 1989). Uma parte do extrato aquoso foi pós-hidrolisado por enzimas de Tricoderma reesei e outra por ácido sulfúrico. Xilose pura e os pós-hidrolisados foram usados como substrato para a produção de ácido xilônico (9), etanol e proteína unicelular por Gluconobacter oxydans, Fusarium oxysporum e Candida utilis, respectivamente. Todos os microrganismos fermentaram eficientemente xilose pura. Entretanto, quando os pós-hidrolisados foram usados como fonte de carbono, a fermentescibilidade foi sofrível. Candida uti/is apresentou tolerância aos inibidores nos experimentos contendo xilose a concentrações de até 20 g L-1. Por outro lado,

Fusarium oxysporum e Gluconobacter oxydans sofreram forte inibição por parte dos compostos presentes nos dois hidrolisados. Além disso, a inibição variou de um microrganismo para outro em função da concentração de inibidores no hidrolisado. Apesar de terem sido identificados vanilina (10), siringaldeído (11), álcool coniferílico (12), álcool sinapílico (13), furfural (2), hidroximetilfurfural (3) e alguns ácidos orgânicos nos hidrolisados, nenhum teste de toxicidade foi efetuado com esses compostos purificados.

COOH 1 HC-OH 1 HO-CH 1 HC-oH 1 H2C-OH 9

~

lliC040Clli

OH OH

10

11

CH20H 1 CH

li

_H CH3 H3CO 12 OH 13

Os processos fermentativos são mais sensíveis aos inibidores do que os processos de sacarificação enzimática. Em um artigo sobre a fermentação de D-xilose a etanol por Candida shehatae e Pichia stipitis, PRIOR et ai. (1989) relacionaram a eficiência das fermentações a fatores nutricionais, temperatura,

pH, concentração de substrato e produto, presença de outros açúcares, demanda de oxigênio e compostos tóxicos presentes em hidrolisados hemicelulósicos. Mostraram, por exemplo, que para diferentes cepas de uma mesma levedura, açúcares outros que a D-xilose, como D-galactose, D- celobiose, L-arabinose, D-glucose e D-manose, podem funcionar tanto como co-substratos quanto inibidores. Entretanto, segundo ANDO et ai. (1986) e McMILLAN (1994b), os maiores problemas dessas fermentações são causados por outros compostos presentes nos hidrolisados, tais como, ácido acético (1), furfural (2), hidroximetilfurfural (3) e ácidos, álcoois e cetonas derivados de lignina, que inibem a fermentação por leveduras.

A forma de ação de alguns inibidores tem sido descrita na literatura. WEIGERT et ai. (1988), citado em PRIOR et ai. (1989), descobriu que furfural

(2) inibiu diretamente a respiração e o crescimento de P. stipitis e foi imediatamente reduzido a álcool furfurílico (14),

o

qual também diminuiu a velocidade da produção de etanol .

14

O ácido acético (1) é, em geral, um inibidor de leveduras e o seu grau de toxicidade é dependente do pH (HERRERO et ai., 1985), mesmo para microrganismos modificados geneticamente (LAWFORD e ROUSSEAU, 1993a).

A forma de ação de outros inibidores, diferentes dos compostos furânicos e ácido acético (1), tem sido pouco descrita na literatura. Entretanto, alguns autores têm estudado de forma sistemática a ação de alguns compostos aromáticos derivados da lignin~ (ANDO et ai., 1986; BUCHERT et ai., 1988, 1989; CLARK e MACKIE, 1984; DELGENES et ai., 1996; NISHIKAWA et ai., 1988;. PFEIFER et ai., 1984; TRAN e CHAMBERS, 1986a,b ).

TRAN e CHAMBERS (1985) investigaram a fermentescibilidade, por Pichia stipitis, de hidrolisados de xilose produzidos no pré-tratamento de madeira de carvalho na presença de H2S04. Identificaram e examinaram o efeito inibitório de compostos modelo derivados das polioses, lignina e extrativos dessa madeira. Foram identificados e quantificados no hidrolisado, vanilina (10)-, siringaldeído (11); ácido vanílico (15), álcool coniferílico (12), ácido siríngico (1&); aldeído sinapíiico (17); álcool diidroconiferílico (18), siringilmetilcetona (19), álcool diidrosinapHico (20)

e

álcool f3-oxisinapílico (21), todos derivados da lignina. Dos extrativos foram identificados os ácidos capróico (22), pelargônico (23), caprílico (24)

e

palmítico (24): Além desses compostos, o hidrolisado continha outros não identificados.

Cada um desses compostos foram misturados a soluções contendo 50 g/L de xilose e nutrientes (como controle) antes da esterilização e fermentação. Os resultados da inibição por esses compostos podem ser vistos na tabela 1.

-

--

Tabela 1. Concentração de alguns compostos identificados no hidrolisado de

carvalho vermelho e seus efeitos inibitórios na subseqüente fermentação de xilose a etanol (TRAN e CHAMBERS, 1985).

Composto [ ] (gil) Etanol (gil)

Controle 22,3 Furfural 1,32 20,2 Ácido acético 12,14 5,4 Vanilina 0,086 10,2 Siringaldeído 0,213 6,2 Ácido vanílico 0,084 16,7 Ácido siríngico 0,092 19,9 Ácido capróico 0,022 19,4 Ácido caprílico 0,019 18,3 Ácido pelargônico 0,014 17,4 Ácido palmítico 0,016 21,9

Os resultados mostraram que o furfural (2) foi mais inibitório que o ácido acético (1). Dos modelos de lignina, siringaldeído (11) foi menos tóxico que vanilina (10)

e

ácido siríngico (16) menos tóxico que o ácido vanílico (15). O efeito inibitório em ordem decrescente foi: vanilina > siringaldeído > ácido vanílico > ácido siríngico. Isto significa que os ácidos aromáticos foram menos tóxicos que os aldeídos e que um grupo metoxílico adicional reduziu a toxicidade dos derivados da lignina. Entre os extrativos, os ácidos caproíco (22), caprílico (24)

e

pelargônico (23) foram mais inibitórios do que o ácido palmítico (25). O efeito inibitório em ordem decrescente foi: ácido pelargônico > ácido caprílico > ácido capróico > ácido palmítico. Esses resultados mostram que o aumento de tamanho das moléculas é inversamente proporcional ao efeito inibitório. Esses compostos modelo foram testados a concentrações similares às encontradas no hidrolisado de carvalho e o estudo sugeriu que os efeitos inibitórios seriam cumulativos.

COOH ~ OH 15 COOH ₁ CH

li

CH H3CO~OCH3 OH 17 OH 16 H2IOH CH ijH

":rrb

_r----Y'ocH3

H O OH 18 HÍOH CH ~H H:r CH20

6

~OCH3 ----o CH3-(CH2)4-COOH 22 20 CH3-(CH2)7-COOH 23 OH CH3-(CH2 )6-COOH 24 CH3-(CH2)14-COOH 25

Em outro trabalho, TRAN e CHAMBERS (1986b) estudaram a fermentescibilidade de manose para butanodiol por Klebsiella pneumoniae, além de identificar e examinar o efeito inibitório dos derivados de lignina e dos extrativos de madeira de pinho pré-tratada com vapor e ácido sulfúrico. Foram testados como compostos modelo derivados de lignina: vanilina (10), ácido vanílico (15), ácido p-hidroxibenzóico (26), ácido protocatecóico (27) e

protocatecoldeído (28), álcool coniferílico (12)

e

álcool diidroconiferílico (18); como modelos dos extrativos: campesterol (29), a-pineno (30), 0-limoneno

(31 ), bomeol (32), pirogalol (33), p-sitosterol (34), estigmastanol (35)

e

os

ácidos linoleico (36), abiético (37) e palmítico (25). Todos os compostos modelo derivados de lignina exibiram efeito inibitório sobre a fermentação de manose. Os ácidos protocatecóico (27) e p-hidroxibenzóico (26) foram os mais tóxicos. A vanilina (10) apresentou a menor toxicidade e a ordem decrescente do efeito inibitório foi: ácido p-hidroxibenzóico > ácido protocatecóico > álcool coniferílico >protocatecaldeído »ácído vanílico >álcool diidroconiferílico > vanilina. A combinação de todos os compostos modelo causou toxicidade cumulativa sobre a fermentação de manose a butanodiol. A toxicidade dos compostos modelo dos extrativos decresceu na seguinte ordem: esteróis > resinas ácidas > ácidos graxos > monoterpenos > álcoois mono- ou triterpênicos. Para os compostos em específico a ordem foi: ácido linoléico >

13-

sitosterol > ácido abiético > 0-limoneno > a-pineno > campesterol > ácido palmítico > bomeol > estigmastanol > pirogalol. A comparação dos resultados mostrou ainda que os derivados da lignina foram mais tóxicos do que os extrativos. COOH _COOH ~ CH3 OH OH

27

₂₈

Cf-b 31

LiYOH

32 OH 33 36 H3C-{CH2 )1-CH=CH-CH2-CH=CH-{CH2)4-COOH 37

Esses autores compararam os resultados de fermentação do hidrolisado sem e com a presença dos compostos citados acima por diferentes métodos. A remoção dos inibidores proporcionou uma melhora no rendimento das fermentações.

Além dos compostos modelo testados, TRAN e CHAMBERS (1986b) identificaram vários derivados da lignina: 4-hidroxi-3-metoxifenilacetaldeído (38), álcool vanílico (39), aldeído coniferílico (40)

e

álcool (3-oxiconiferílico (41 ). Também identificaram os seguintes derivados dos extrativos: a-terpineol (42), D-verbenona (43), os ácidos nonanóico (= pelargônico) (23), oléico (44),

esteárico (45) e desidroabiético (46). Apesar de não terem estudado a

toxicidade desses compostos, postularam, com base nos estudos com compostos modelo, que os mesmos devem apresentar efeito inibitório sobre a fermentação de manose para butanodiol.

CHO 1

fCHO

f

fr

CH

9'0CHa

OCH3 _OCH3 OH _OH 38 39 OH 40 CHO 1 c=o CH3 lH

9'0CH3

OH H3

~o

CH3 OH _{42 43} 41 H3C-(CH2)1 s-COOH 45 H3C-(CH2)1-CH=CH-(CH2)1-COOH 44 46

NISHIKAWA et ai. (1988) estudaram a influência de produtos de degradação da lignina sobre a fermentação de xilose para etanol em meio sintético, a partir do mesmo microrganismo (K/ebsie/la pneumoniae) estudado por TRAN e CHAMBERS (1986b). Ácido p-hidroxibenzóico (26); p- hidroxibenzaldeído (47), ácido vanílico (15), vanilina (10), álcool vanílico (39), ácido siríngico (16), siringaldeído (11) e dimetoxibenzeno (48) foram testados em concentrações de O, 1 a 0,6 g/L. O ácido p-hidroxibenzóico (26) e o p- hidroxibenzaldeído (47) foram mais inibitórios ao crescimento dos

microrganismos e à produção de etanol do que os derivados do tipo guaiacil e

siringil. Logo, o efeito inibitório pode estar associado com a ligação desses compostos com enzimas, através das posições 3 e 5 do anel aromático.

CHO

9

OH

47

lEE e McCASKEY (1983) testaram o efeito de uma mistura de

siringaldeído (11)

e

vanilina (10) no crescimento da levedura Pachysolen

tannophilus usando como substrato, hidrolisado de Pinus radiata e concluíram

que o crescimento foi completamente inibido a uma concentração de 2,5 gil, com 50% de inibição a 1,0 g/L. Os autores também testaram a toxicidade da

vanilina (10)

e

ácido vanílico (15) na fermentação com S. cerevisiae e os

resultados mostraram que ocorreu uma inibição completa pela vanilina (10) a 5,0 g/l, enquanto 50% da inibição correspondeu a 1,3 g/L. Ácido vanílico (15) foi menos inibitório com 50% de inibição a 3, 7 g/L.

DElGENES et ai. (1996) estudaram o efeito dos produtos de degradação da lignina na fermentação a etanol de glicose e xilose por S.

cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipitis e Candida shehatae. Para Pichia stipitis e Candida shehatae, a intensidade da inibição é fortemente relacionada

com a concentração inicial dos compostos testados. Vanilina (10) apresentou o maior efeito inibitório. Tanto crescimento quanto a produção de etanol foram totalmente inibidos a uma concentração inicial de vanilina (10) de 1,0 g/L. Uma comparação dos compostos modelos de lignina indicaram que siringaldeído

(11) foi menos tóxico que p-hidroxibenzaldeído (47) para as duas cepas. S.

cerevisiae foi significativamente inibida pela presença de furfurat (2),

hidroximetilfurfural (3) e vanilina (10), a qual inibiu a ação dessa levedura

quando presente em concentrações muito baixas (0,5 g/l). Zymomonas

mobilis foi fortemente inibida na fermentação de glicose por p-

hidroxibenzaldeído (47) (0,5 gil).

RANATUNGA et ai. (1997) estudaram a fermentação de xilose para obtenção de etanol pela bactéria Zymomonas mobilis usando como sustrato, o hidrolisado de uma mistura de madeiras ( carvalho vermelho, carvalho branco e álamo amarelo). Vários compostos fenólicos foram testados. Vanilina (10) e

siringaldeído (11), com concentrações de 43 mg/L e 130 mgll, respectivamente, apresentaram os mais altos níveis inibitórios. Ácido vanílico

(15) (84 mg/L) e ácido siríngico (16) (93 mg/L) tiveram efeitos inibitórios fracos.

FENSKE et ai. (1998) testaram os efeitos inibitórios de alguns compostos derivados de lignina em três substratos diferentes: madeira de álamo, "switchgrass" e "com stover". Os compostos testados foram ácido p- hidroxibenzóico (26), ácido cumárico (49), siringaldeído (11)

e

vanilina (10)

e

as concentrações desses compostos estão mostradas na tabela 2.

IOOH

CH

li

~ OH 49

Tabela 2. Compostos derivados de lignina identificados em hidrolisados de

álamo, switchgrass e com stover (FENSKE et ai., 1998).

:s:

[ ] (mg/L) Acido p- [ ] (mgll) [

₁

(mgll) [ ] (mgll) hidroxibenzóico Ácido Siringaldeído Vanilina

cumárico s AI amo 11, 1 n.d. 29,3 15,1 "Switchgrass" n.d. 7,7 n.d. 16,5 "Com stover" n.d. 10,9 10,0 19,6 n.d.

=

não detectado.

Os compostos identificados nos três hidrolisados são conhecidos por inibir fermentação de Pichia stipitis e são: vanilina (10), siringaldeído (11), ácido acético (1)

e

furfural (2). Os compostos derivados de lignina, como siringaldeído (11)

e

vanilina (10), são particularmente mais inibidores da

produção de etanol e do crescimento microbiano, especialmente quando comparados a ácido acético ou compostos de degradação de açúcares. A vanilina (10), um composto contendo grupo guaiacil, foi mais inibitório que compostos contendo grupos siringil e hidroxibenzil.

ANDO et ai. (1986) também relacionaram os diferentes grupos funcionais dos derivados de lignina

à

toxicidade. Identificaram e determinaram quantitativamente vários compostos aromáticos em hidrolisado de madeira de álamo pré-tratada por explosão a vapor a 205ºC por 1 O min. A influência desses compostos sobre a fermentação de glicose a etanol por Saccharomyces cerevisiae foi estudada em meio sintético. Siringaldeído (11 ), ácido m-hidroxibenzóico (50)

e

ácido siríngico (16) em concentrações de até 0.1 % (massa /massa seca da madeira pré-tratada) não afetaram a fermentação. Vanilina (10) apresentou inibição moderada e foi maior do que o ácido p-hidroxibenzóico (26), que por sua vez foi maior que do p- hidroxibenzaldeído (47). O ácido cinâmico (51)

e o

cinamaldeído (52) interromperam a fermentação quase completamente e promoveram um efeito tóxico nas leveduras durante a incubação. A vanilina (10) afetou a fermentação no estágio inicial da incubação, mas após 25 h a fermentação foi recuperada e o rendimento final de etanol foi o mesmo do controle. Considerando os resultados de fermentação, os autores estimaram valores emplricos para o grau de inibição de cada substituinte presente nos compostos aromáticos examinados: CH=CH = +3,0; CHO = +1,5; p-OH = +1,0; COOH = +0,5; m-OH = O e OCH3 = -1,0. Segundo esses autores, os valores atribuídos a cada grupo funcional ligado a um composto podem ser usados para simular o poder inibitório do mesmo sobre a fermentação. Os resultados obtidos na simulação mostraram-se concordantes com os resultados das fermentações.

CHO

[

HCCOOH ₁

li

CH

li

HC ~ _~

50

OH

51

52

Os trabalhos acima trataram, em sua grande parte, do efeito inibitório dos compostos formados em diferentes processos de pré-tratamento sobre a fermentescibilidade de xilose. Resultados semelhantes foram obtidos em fermentações alcoólicas de hidrolisados contendo glicose como substrato, usando-se diferentes microrganismos (CLARK e MACKIE, 1984; DELGENES

et ai., 1996; PFEIFER et ai., 1984). Entretanto, não encontramos nenhum

trabalho sistemático envolvendo os possíveis inibidores formados nos processos de pré-tratamento do bagaço de cana.

O processo de separação dos componentes do bagaço de cana por explosão a vapor, com ou sem catalisadores, tem sido sistematicamente estudado em nosso grupo e pesquisa (SILVA, 1995; SILVA et ai. 1997, MATTOS e SILVA, 1999). Na ausência de catalisador, os melhores resultados foram alcançados nos pré-tratamentos a 190ºC por 15 min (SILVA, 1995).

Nessas condições, cerca de 36% do bagaço de cana foi solubilizado. 86% da glucana foi recuperada como celulose no bagaço pré-tratado, 3,2% foi hidrolisado a glicose, O, 12% foi decomposto a hidroximetilfurfural e 11 % a compostos desconhecidos. 73% das xilanas foram hidrolisadas a arabinose (2,5%), a arabinose ligada às xilanas (1%), a xilose (7,4%), a furfural (2,8%), a oligômeros de xilose (51%) e a compostos não identificados (8,3%). Os grupos acetil foram hidrolisados a ácido acético (39%) e a grupos acetil ligados às xilanas (36% ); 12% permaneceram no bagaço pré-tratado e 13% foram perdidos como compostos não identificados. A quantidade de lignina hidrolisada a produtos solúveis foi de 20%. Pré-tratamentos sob condições mais brandas mostraram-se ineficientes quando se buscou altos rendimentos na recuperação das polioses hidrolisadas e, sob condições mais drásticas, promoveram reações de condensação entre a lignina, o hidroximetilfurfural e o furfural. Os resultados obtidos no pré-tratamento de 1 O kg de bagaço (base seca) a 190°C, 15 min, em um reator de 240 L foram muito próximos daqueles alcançados em escala de laboratório (SILVA, 1995). Nessas condições, a quantidade de celulose presente no bagaço pré-tratado foi superior à dos experimentos de bancada. A quantidade de xilana e dos grupos acetil, recuperados no licor como compostos conhecidos foi menor, mostrando que as polioses sofreram maior decomposição em escala piloto. Por outro lado, a