Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Biologia
Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA,
1851 (Decapoda, Brachyura, Portunidae)
Lucas Leiva Zupolini
Ribeirão Preto – 2012
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia, da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (USP), como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Biologia
Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA,
1851 (Decapoda, Brachyura, Portunidae)
Lucas Leiva Zupolini
Orientador: Dr. Leonardo Antonio Gomes Pileggi
Co-orientador: Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto
Ribeirão Preto – 2012
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia, da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (USP), como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Zupolini, L.L.
“Filogenia e taxonomia do gênero de siris Arenaeus DANA, 1851 (Decapoda, Brachyura, Portunidae).”
vii+93p.
Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.
Orientador: Pileggi, L.A.G.; Co-orientador: Mantelatto, F.L.M. 1. Arenaeus 2. Portunidae 3. Taxonomia 4. Sistemática Molecular 5. Heterocronia
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life. Understanding comes only when, standing on a beach, we can sense the long rhythms of earth and sea that sculptured its land forms and produced the rock and sand of which it is composed; when we can sense with the eye and ear of the mind the surge of life beating always at its shores - blindly, inexorably pressing for a foothold”
Para se compreender a costa, não é suficiente catalogar sua vida. O entendimento só vem quando, em pé em uma praia, podemos sentir os longos ritmos da terra e do mar que esculpiram suas formas de relevo e produziram a rocha e a areia do qual é composta; podemos sentir com os olhos e os ouvidos da mente a onda de vida batendo sempre em sua costa – cegamente, inexoravelmente compelindo por um apoio.
Rachel Carson, The Edge of the Sea (1955)
“The diversity of organisms, similarities and differences between kinds of organisms, patterns of distribution and behavior, adaptation and interaction, all this was merely a bewildering chaos of facts until given meaning by the evolutionary theory”
A diversidade de organismos, similaridades e diferenças entre as espécies de organismos, padrões de distribuição e de comportamento, adaptações e interações, tudo isso era meramente uma confusão caótica de fatos até lhes ser dado significado pela teoria evolutiva.
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A todas as pessoas que seguiram comigo durante esse percurso, especialmente à minha família e aos meus pais
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Em primeiro lugar, agradeço ao Prof. Dr. Fernando L. M. Mantelatto pela oportunidade em tomar contato com o meio acadêmico, com a rotina de um laboratório de Biologia Molecular e, principalmente, com uma porção, mesmo que ínfima, da biodiversidade marinha de crustáceos. No dia em que me foi perguntado se tinha preferência por alguma linha de pesquisa e respondi, sem hesitar, que queria trabalhar com um grupo marinho, jamais tinha conhecimento que me seria oferecida a chance de trabalhar com um dos grupos dos seres mais cativantes (mesmo que eles não se considerem como tal) e ao mesmo tempo complexos. Agradeço ainda, pelo engajamento, planejamento, preocupação (com material, coletas, prazos, bolsas e muito mais) e todo o momento em que foi dedicado qualquer esforço a mim e ao projeto a mim inerente. Só não posso me esquecer ainda, de agradecer por todas e quaisquer sugestões e discussões na elaboração e no andamento do projeto e dos textos referentes a este, que muito me acrescentaram, não apenas para suas finalidades imediatas, mas também por toda minha vida.
Agradeço ao meu orientador, Dr. Leonardo Antonio Gomes Pileggi, por toda a confiança, dedicação, preocupação e paciência a mim oferecidas ao longo desses meses. Por todas as vezes que liguei ou mandei e-mails, muito frequentemente, desesperados, por não saber ligar o gás da Molecular, do PCR que não saía, do alinhamento que me confundia, dos dados que pareciam saturar, e mesmo assim, sempre fui recebido com um sorriso no rosto. A propósito, seu jeito alegre me contagiou diversos momentos em que a preocupação com os empecilhos e os prazos me consumiam a tranquilidade. Agradeço ainda por todos os ensinamentos, desde meu início na molecular, nas análises dos resultados e nos procedimentos mais diversos. E também por todas as discussões que, definitivamente, muito contribuíram à construção de minhas opniões. Muito obrigado!
Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e ao grupo Santander (processos CNPq nº 106440/2011-0 e PIBIC/Santander nº 2011.1.2786.59.4) pelos auxílios financeiros concedidos a mim durante o período de realização do projeto. Também agradeço aos projetos que proporcionaram todo o apoio financeiro e logístico, direta ou indiretamente, para o desenvolvimento desta pesquisa junto ao LBSC (Laboratório de Bioecologia e Sistemática de Crustáceos), concedidos ao e/ou coordenados do Prof. Dr. Fernando Mantelatto: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) – Processos nºs. 1998/07454-5 e 2002/08178-9 (Projetos Individuais de Pesquisa), 2010/50188-8 (Projeto Temático Biota), 2009/54931-0 (Projeto Coleções Científicas); à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Processo nº. 315/2009 (Projeto Cooperação Internacional) 02630/2009– 5 (LGP Post-Doctoral fellowship); ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – Processos nºs. 472746/2004-9, 471794/2006-6, 473050/2007-2,
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471011/2011-8 (Edital Universal, Auxílio Individual à Pesquisa), 491490/2004-6, 490122/2006-0, 490353/2007-0 (Projetos Cooperação Internacional); 301359/2007-5, 302748/2010-5 (Produtividade em Pesquisa).
Agradeço à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Riberião Preto (FFCLRP-USP) e ao Departamento de Biologia pela infra-estrutura disponibilizada para execução do projeto, e ao Instituto de Oceanografia (IO-Cananéia) pelo espaço e infra-estrutura oferecidos em parte das coletas.
Agradeço, sinceramente, aos curadores, Ingo Wehrtmann (Universidad de Costa Rica), Fernando Alvarez e José L. Villalobos (Universidad Autónoma Nacional de México), Luis Ernesto Arruda Bezerra e Jesser F. de Souza-Filho (Universidade Federal de Pernambuco), que disponibilizaram material emprestado para as análises e tornaram possível a realização do projeto. Agradeço ainda a H. Boos, R.C. Costa, A. Castilho, J. Bolaños e T.M. Dawanso pela doação de material, essencial no desenvolvimento deste trabalho, assim como também a F.L. Mantelatto, A. Costa, D. Rosa, R. Robles, F. Carvalho, N. Rossi, I. Leone e R. Amaral pelo material coletado e a todas as outras pessoas que auxiliaram nos procedimentos de coleta. Muito obrigado.
Ao Prof. Marcelo Pinheiro (UNESP - São Vicente) pelo auxílio na busca de literatura.
À Prof.ª Maria Helena de Souza Goldman (Laboratório de Biologia Molecular de Plantas – FFCLRP/USP) e à Dr. Andréa Carla Quiapim pela disponibilidade em realizar parte dos sequencimamentos e a execucação dos mesmos. Também à técnica Adga Facincani do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal (FCAV/UNESP), bem como ao próprio departamento citado, pela possibilidade de execução de parte do sequenciamento e pela realização do mesmo.
Igualmente, agradeço a Mariana Terossi e a Rafael Robles por todo momento em que lhes tomei a atenção, com dúvidas em algo e pedindo auxílio. O mesmo sentimento de gratidão devo à Tatiana Magalhães e à Ana F. Gomes (Kelps) que muito me ajudaram, especialmente, mas não apenas, no início das análises morfológicas e também moleculares. À Tati, pelo auxílio na edição das sequências, à Mari, Léo, Rafa, Gabriela Zanarotti (Gabi), Mariana Negri (Kana) e Natália Rossi pelas reações de sequenciamento, à Raquel Buranelli, Tati e Léo pela ajuda no manuseio das lupas e câmeras e à Kana por todo ensinamento e acompanhamento na submissão das sequências no GenBank. Dessa forma, aproveito para agradecer a todos que, de alguma forma me ajudaram e/ou me suportaram no LBSC. Agradeço especialmente a Kana, Raquel, Vanda, Camila e Nati, por terem dedicado seu tempo aos meus (inúmeros) questionamentos. Agradeço ainda pela companhia, pelos bons momentos compartilhados, todas as conversas e discussões com toda a galera do LBSC que muito contribuíram para o desenvolvimento do projeto e também da minha pessoa. Em
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especial, agradeço à Natália (Ligeira) pela companhia de IC e por todos os momentos felizes que me tornaram mais próximo dessa grande pessoa.
À Maira Massarani (Preta) pela disponibilidade em realizar as ilustrações, muito obrigado! A todos os meus grandes amigos e companheiros que me deram suporte todo esse tempo, em especial, Manoela Campos, Juliana Ribeiro, Cecília Rocha, Eduarda Romanini, Dalila Ribeiro, Natália Grilli, Mayra Scanzani, Rafael Gil, Talita Fernandes, Robson Amaral (Johnny), Daniel Lopes, Vinicius Katata, João Maricato e Rhanan Vareschi. Principalmente ao Johnny, a quem devo um enorme sentimento de gratidão por todos os momentos de ajuda, tranquilidade e alegria proporcionados quando o desespero me tomava conta.
A todos os mestres e professores que não apenas “deram uma aula”, mas sim me prepararam para a vida e me direcionaram para a carreira Biológica, em especial, à Biologia Marinha e Evolutiva.
Por último, à minha família, à qual um “muito obrigado” é irrisório por toda a ajuda, carinho e proteção dedicados a mim ao longo desses anos.
E a todas as pessoas que, de alguma forma, auxiliaram a criação, produção e ao desenvolvimento deste projeto, muito obrigado!
vii Resumo ... 1 Abstract ... 2 Introdução... 3 Introdução Geral ... 3 A Sistemática Molecular ... 4 O Problema Taxonômico ... 5 Objetivos ... 10 Materiais e Métodos ... 11
Obtenção dos Dados Morfológios ... 11
Obtenção dos Dados Moleculares ... 15
Análise de Saturação e Sinal Filogenético dos Dados ... 22
Análise de Distância Genética ... 23
Busca pela melhor árvore filogenética – “Maximum Likelihood” ... 24
Busca pela melhor árvore filogenética – Inferência Bayesiana ... 25
Busca pela melhor árvore filogenética – Máxima Parcimônia ... 26
Resultados ... 29 Revisão Taxonônima ... 29 Arenaeus cribrarius ... 29 Arenaeus mexicanus ... 36 Chava de Identificação ... 41 Análises Moleculares ... 49
Saturação e Sinal Filogenético dos Dados ... 49
Distância Genética ... 52
Análises Filogenéticas ... 57
Discussão ... 66
Revisão Taxonômica e Morfologia Comparativa ... 66
Variação Ontogenética e Eventos de Heterocronia ... 69
Evolução Molecular e Filogenia do Gênero ... 71
Relações Inter-Genéricas e Evolução Morfológica do Grupo ... 73
Conclusões ... 79
1 Espécies crípticas são aquelas que apresentam morfologia muito semelhante e sua distinção baseada nesse caráter se torna muito difícil e algumas vezes equivocada. O gênero de siris Arenaeus DANA, 1851 representa bem essa problemática. Apesar de ser composto por duas espécies apenas,
A. cribrarius LAMARCK, 1818 e A. mexicanus GERSTAECKER, 1858, estas apresentam
morfologia bastante semelhante e a distinção entre elas baseia-se em pequenas variações morfológicas. Enquanto A. cribrarius distribui-se ao longo da costa Atlântica americana, A.
mexicanus pode ser encontrado ao longo da costa Pacífica das Américas. Em função da escassez de
estudos taxonômicos e sistemáticos a respeito do grupo e da semelhança entre os nichos e habitats ocupados por essas espécies, levanta-se questionamentos a respeito da validade taxonômica destas entidades. Além disso, o entendimento da história evolutiva do grupo é igualmente prejudicado. Nesse contexto, o presente estudo tem o objetivo de realizar uma revisão taxonômica do grupo, abordando diversos caracteres morfológicos capazes de separar ou não essas entidades em duas espécies distintas. Além disso, análises moleculares foram processadas para averiguar a distância genética entre elas e construir uma filogenia do grupo, a partir dos métodos de “maximum
likelihood”, inferência bayesiana e máxima parcimônia, utilizando como marcadores genes
mitocondriais 16S rDNA e COI (citocromo oxidase I). As análises morfológicas revelaram consistência em grande parte dos caracteres tradicionalmente utilizados na literatura para distinção de A. cribrarius e A. mexicanus e apenas a presença de um espinho partindo do epistoma, entre as antênulas, em A. cribrarius e sua ausência em A. mexicanus, foi uma característica capaz de diferenciá-las que não aparece descrita na literatura. Além disso, as variações morfológicas entre os juvenis e indivíduos adultos de A. cribrarius, quando tomadas em conjunto, tornam a forma juvenil desta espécie bastante semelhante à forma adulta observada em A. mexicanus, sugerindo a ocorrência de um evento heterocrônico na evolução do grupo. Nas análises moleculares, ambos os genes utilizados foram capazes de separar as duas espécies em clados distintos e irmãos de forma consistente, apesar das relações externas de parentesco ainda permanecerem não completamente resolvidas. Apesar disso, é sugerida e discutida sua proximidade com os gêneros Portunus (Portunus) WEBER, 1795 e Callinectes STIMPSON, 1860. Em suma, o volume de dados aqui obtidos é suficiente para se manter a validade taxonômica de ambas as espécies, permanecendo como análogas únicas em um gênero à parte.
2 Cryptic species are those that have a very similar morphology and their distinction based upon this feature becomes very difficult and sometimes misleading. The swimming crab genus Arenaeus DANA, 1851, represents very well this problematic situation. Although consisting of only two species, A. cribrarius LAMARCK, 1818 and A. mexicanus GERSTAECKER, 1858, they resembles each other very much and their distinction is based upon tiny morphological variations. While A.
cribrarius is distributed along the American Atlantic coast, A. mexicanus may be found along the
American Pacific coast. Due to the scarcity of taxonomic and systematic studies about this group and to the similarity between the niches and the habitats occupied by these species, some questions about the taxonomic validity of these entities are raised. Moreover, the understanding about the evolutionary history of the group is equally affected. Hence, this study aimed to make a taxonomic revision about the group, encompassing several morphological characters that enable to split or not these entities into two distinct species. Furthermore, molecular analyses were processed to check the genetic distance between them and build up a phylogeny of the group, based on the maximum likelihood, Bayesian approach, and maximum parsimony methods, using as molecular markers the genes 16S rDNA and COI (cytochrome oxidase I). Morphological analyses have showed consistence in most of the characters traditionally employed in the literature to distinguish A.
cribrarius from A. mexicanus, and solely the presence of a spine standing out from the epistome,
between the antennules, in A. cribrarius and its absence in A. mexicanus, was a new and good-character to differentiate them. Besides, morphological variations between juveniles and adults from A. cribrarius, when taken as a group, render the juvenile stage of these species very similar to the adult morphology of A. mexicanus, suggesting the occurrence of a heterochronic event in the evolution of the group. In molecular analyses, both genes employed were able to split both species into two distinct sister clades in a consistent way, even though the external relationship still remains not completely resolved. Instead of this, it is suggested and discussed its relation with the genus
Portunus (Portunus) WEBER, 1795 and Callinectes STIMPSON, 1860. Summarizing, the amount
of data yielded here is enough to keep the taxonomic validity of both species, remaining them as analogous species in a separate genus.
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Introdução Geral
A taxonomia é uma ciência que pode ser definida, em poucas palavras, como “a teoria e a prática da classificação dos organismos” (Mayr, 1969), enquanto a sistemática engloba toda a “diversidade de organismos e qualquer e toda relação entre eles” (Stimpson, 1961). Entretanto, com o desenvolvimento do pensamento evolutivo, a partir da segunda metade do século XIX, passou a existir uma preocupação de que essa classificação dos organismos refletisse sua história evolutiva. Dessa forma, ambas as ciências passaram a seguir juntas.
Talvez o mais interessante destas áreas do conhecimento sejam suas contribuições não restritas a elas mesmas, mas igualmente importantes a outros ramos da biologia. Mayr (1969) traz uma breve lista da dependência de outras vertentes da biologia em relação à taxonomia e à sistemática. Por exemplo, são indispensáveis à pesquisa a respeito de organismos de interesse econômico e médico e provêm ferramentas e dados para outras áreas de estudo dos sistemas biológicos, em especial, permitindo a classificação dos indivíduos, o que é essencial para o desenvolvimento das demais áreas.
A descrição taxonômica dos organismos, que serve de base para a identificação e classificação destes, tradicionalmente, é realizada com base na morfologia dos indivíduos. Entretanto, algumas espécies, mesmo divergindo geneticamente ao longo do tempo, “falham” em adquirir diferenças morfológicas conspícuas (Mayr, 1969). Espécies morfologicamente muito semelhantes, dificilmente distinguíveis, são ditas espécies crípticas (“cryptic species” sensu Knowlton, 1986) (“sibling species” sensu Mayr, 1963; para a distinção adotada no presente trabalho entre “sibling” e “cryptic species” ver Knowlton, 1986). Normalmente, são diferenciadas por divergências comportamentais e ecológicas, padrão de coloração e diversos caracteres bioquímicos e genéticos, assim como diminutas variações morfológicas que, em alguns casos, são tomadas como diagnósticas (Knowlton, 1986). Surpreendentemente, a maior parte destes organismos foi descoberta como sendo espécies distintas a partir, não de estudos taxonômicos, mas de outros que explorassem aspectos de importância médica, genética, citológica, agrícola, entre outras (Mayr, 1969).
Essa dificuldade em se detectar e distinguir espécies crípticas com base apenas em sua morfologia externa leva à busca de caracteres alternativos para serem utilizados em sua classificação. Nesse contexto, a sistemática molecular vem exibindo destaque crescente dentro dessas ciências classificatórias.
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A Sistemática Molecular
A sistemática molecular também utiliza o método comparativo em suas análises, contudo as comparações envolvem, direta ou indiretamente, informações sobre as sequências de ácidos nucléicos e proteínas (Avise, 2004). Uma de suas características que mais atraem atenção é que, de acordo com Avise (2004), a filogenia representa o fluxo da hereditariedade (“the stream of
heredity”) e apenas os traços genéticos são genealogicamente informativos. Isso reflete a
importância desse ramo da sistemática frente às abordagens tradicionais, baseadas em características observáveis e cujas bases genéticas são, em geral, desconhecidas ou mal compreendidas.
Além disso, como se considera que os processos seletivos, que atuam durante o curso evolutivo, dependam da variabilidade genética (Mayr, 1963) e que os fatores tradicionalmente utilizados na taxonomia são bastante influenciáveis por fatores não genéticos (Avise, 2004), a sistemática molecular mostra-se como uma ferramenta de especial interesse em análises filogenéticas. E, somando-se a isso, o número de fatores que podem ser considerados nas análises é enorme, visto a proporção de informações contida no material genético (Avise, 2004).
Dentro deste contexto, genes mitocondriais têm sido utilizados como ferramentas nas resoluções de uma ampla variedade de problemas taxonômicos e filogenéticos dentro de Decapoda, como em grupos de relações controversas (Schneider-Broussard et al., 1998; Schubart et al., 2000a; Williams et al., 2001; Mantelatto et al., 2009a e b; Schubart & Reuschel, 2009; Pileggi & Mantelatto, 2010) ou mesmo em estudos em níveis taxonômicos mais amplos (Ahyong & O'Meally, 2004; Lefébure et al., 2006). Sua popularidade nessas metodologias é decorrente de uma maior facilidade em seu emprego, já que a quantidade de genoma mitocondrial em uma célula é muito superior àquela de um gene nuclear, o que torna sua amplificação menos complicada (Schubart, 2009).
Outros fatores que favorecem sua aplicação são uma maior taxa de mutação do que no genoma nuclear, permitindo que um sinal filogenético seja acumulado em um período de tempo relativamente mais curto, e pelo fato de que, por não haver recombinação e ser herdado de forma uniparental, o genoma mitocondrial pode ser interpretado de uma forma mais simplificada (Schubart, 2009). Além disso, a disponibilidade de conjuntos de “primers” universais para tais genes e do sequenciamento destes no GenBank, para diversas espécies, aumentam a preferência do emprego desses genes em estudos filogenéticos dentro de Crustacea (Toon et al., 2009).
Os genes mitocondriais mais utilizados nesses trabalhos são 16S rDNA, 12S rDNA, citocromo-oxidase I (COI) e citocromo b (cyt-b) (Schubart et al., 2000b). Enquanto os dois
5 primeiros são genes estruturais de ribossomos, não codificantes e de funções catalíticas importantes durante a síntese protéica, tanto COI como cyt-b são codificantes e essenciais na cadeia respiratória. Mesmo que de acordo com Schubart et al. (2000b), o gene 16S rDNA apresente tanto regiões variáveis como conservadas, podendo ser utilizado para eventos de especiação antigos como também recentes, seu emprego é mais comum em análises de divergência genética interespecífica, visto que para as intraespecíficas a variação encontrada pode ser muito pequena ou mesmo nula (Francisco & Galetti Jr., 2005; Vergamini et al., 2011). Nesse último caso, o gene COI tem mostrado resultados satisfatórios, demonstrando variação genética entre populações (Pileggi & Mantelatto, 2010; Vergamini et al., 2011).
Por outro lado, o próprio fato dos genes mitocondriais serem herdados de forma uniparental leva a uma perspectiva linear da evolução dentro do grupo estudado, enquanto o esperado seria um padrão reticulado, como encontrado nos genes nucleares (Neigel & Avise, 1986). Somando-se a isso, existe o fenômeno de introgressão entre os genes mitocondriais, que seria a aquisição de genes exógenos ao genoma mitocondrial de uma espécie, tornando errônea a interpretação a partir de filogenias baseadas somente nesses genes (Neigel & Avise, 1986). Portanto, atualmente considera-se a necessidade da utilização concomitante de marcadores nucleares mais conconsidera-servados junto a genes mitocondriais, ao menos na construção de filogenias em níveis taxonômicos elevados (Schubart, 2009). A utilização conjunta dos genes 16S rDNA e COI tende a ser suficientemente consistente na demonstração de divergência genética entre grupos estudados, ao menos, ao nível específico e genérico.
Considerando-se esses aspectos, genes mitocondriais, como 16S rDNA e COI, representam importantes ferramentas na diferenciação de complexos de espécies crípticas (Keenan, 1998; Lai et
al., 2010) ou de espécies de ampla distribuição geográfica que, potencialmente, constituem
complexos de espécies crípticas (Mantelatto et al., 2011). Além disso, diversos autores (Schubart et
al., 2001a e 2001b; Kitaura et al., 2002; Goetze, 2003; Reuschel & Schubart, 2006; Mantelatto et al., 2007 e 2009a e b; Robles et al., 2007; Pileggi & Mantelatto, 2010) tem mostrado a eficiência
desses genes na resolução de problemas taxonômicos associados à espécies crípticas, e há muita informação em que se basear para utilizá-los.
O problema taxonômico
Portunidae RAFINESQUE, 1815, compreende grande parte dos crustáceos popularmente conhecidos como “siris” (Ng et al., 2008; De Grave et al., 2009), entre os quais, muitos exibem grande importância econômica e ecológica, como Scylla sp. (“caranguejo da lama”) DE HAAN,
6 1833, Callinectes sp. STIMPSON, 1860 azul”), Portunus pelagicus LINNAEUS, 1758 (“siri-azul”), Portunus trituberculatus MIERS, 1876 (“gazami-crab”) e Arenaeus cribrarius (“siri-chita”) LAMARCK, 1818 (cf. Fushimi & Watanabe, 1991; Robles et al., 2007; Lai et al., 2010; Pinheiro & Hattori, 2006). A despeito dessa importância e da grande diversidade do grupo, que compreende espécies marinhas e não marinhas (i.e. estuarinas), tem-se dedicado relativamente pouco esforço às revisões taxonômicas de seus componentes (Mantelatto et al., 2009b). Os trabalhos realizados mostram diversos problemas na classificação desta família, com muitos grupos parafiléticos (Mantelatto et al., 2007; 2009b; Karasawa et al., 2008), sinonímias (Schubart et al., 2001a; Mantelatto et al., 2007; Robles et al., 2007) e complexos não resolvidos de espécies crípticas (Keenan, 1998; Mantelatto et al., 2009b; Lai et al., 2010), sendo que uma revisão mais extensa a respeito pode ser encontrada em Karasawa et al. (2008).
Arenaeus DANA, 1851, é um gênero de siris que não “escapa a essa regra”, sendo formado
apenas por duas espécies, A. cribrarius LAMARCK, 1818 (Figura 1-A) e A. mexicanus GERSTAECKER, 1858 (Figura 1-B) (Ng et al., 2008). Algumas características diagnósticas como a ausência de fendas longitudinais no palato e o formato em “V” das fissuras supraorbitais, amplamente abertas, são comumente utilizadas para distinguir o gênero de outros semelhantes, como Callinectes, Portunus WEBER, 1795 e Achelous DE HAAN, 1833 (Rathbun, 1930; Garth & Stephenson, 1966; Rodríguez, 1982; Williams, 1984; Melo, 1996). Entretanto, entre si, as espécies são distinguidas com base em pequenas variações morfológicas e exibem uma morfologia externa bastante semelhante (Figura 1).
A distribuição destas duas espécies é relativamente grande, sendo que A. cribrarius pode ser encontrado ao longo da costa oeste do Oceano Atlântico desde Vineyard Sound, Massachusetts, EUA até La Paloma, Uruguai (Juanicó, 1978; Williams, 1984), incluindo ocorrência também para a costa argentina (Scelzo, 2001) (Figura 2). No Brasil, distribui-se do Ceará ao Rio Grande do Sul (Melo, 1996). Enquanto que A. mexicanus é encontrado ao longo da costa leste do Oceano Pacífico, desde Baja California, México, até a Bahía de Ancón, Peru (Fonseca, 1970; Dexter, 1974). Contudo, a espécie já foi coletada no Chile, em períodos sob influência do evento El Niño (Guzmán & Peredo, com. pess. apud Retamal & Arana, 2000) (Figura 2).
Apesar dessa grande distribuição e ocupação de diversos ambientes, o conhecimento a respeito da biologia e história de A. cribrarius está limitado a alguns trabalhos sobre sua fisiologia (Norse, 1978), embriologia e desenvolvimento (Stuck & Truesdale, 1988; Pinheiro & Fransozo, 1993; Pinheiro & Hattori, 2002; 2006), ecologia trófica (Leber, 1982; DeLancey, 1989; Carmona-Suárez & Conde, 2005), biologia reprodutiva (Pinheiro, 1995; Pinheiro & Fransozo, 1998; 1999; 2002; Pinheiro & Taddei, 2000; Pinheiro & Terceiro, 2000), bioecologia e distribuição (Leber,
7 1982; Moreira et al., 1988; Avila & Branco, 1996; Pinheiro et al., 1997; Mantelatto & Fransozo, 2000; Carmona-Suárez & Conde, 2002; Guerra-Castro et al., 2007), principalmente devido ao interesse comercial e econômico da espécie. Enquanto que nas áreas taxonômica e sistemática os estudos são muito escassos, não tendo sido encontrada qualquer literatura mais recente nessa temática cujo enfoque seja a espécie em questão. Para o caso de A. mexicanus, o cenário é ainda mais precário, sendo ausentes estudos taxonômicos e sistemáticos e bastante escassos estudos também em outras áreas, excetuando-se algo a respeito de distribuição e ecologia da espécie (Garth, 1960; Cornejo, 1998; Retamal & Arana, 2000; Godínez-Domínguez et al., 2002; Granda et al., 2004).
Assim, além da similaridade morfológica, ambas as espécies do gênero aparentam ocupar ambientes e nichos bastante semelhantes, habitando preferencialmente regiões costeiras não muito profundas e de sedimento arenoso em diferentes oceanos, e alimentando-se majoritariamente de outros crustáceos (Garth, 1960; Garth & Stephenson, 1966; Williams, 1984; Pinheiro et al., 1997; Cornejo, 1998; Godínez-Domínguez et al., 2002; Pinheiro & Hattori, 2002; Carmona-Suárez & Conde, 2005), o que em associação à escassez de dados, levanta questionamentos a respeito do quão divergentes são.
Essa incerteza, em função da ausência de dados concretos, não se restringe ao “status” taxonômico das espécies, a própria validade do gênero já foi questionada. Stephenson et al. (1968), em um trabalho a respeito de espécies análogas de portunídeos, i.e. com um representante em cada uma das costas americanas (Pacífica e Atlântica), como as espécies de Arenaeus, aproximaram o gênero a uma das espécies de Callinectes, questionando a existência do próprio gênero.
Outros trabalhos existentes, a respeito da sistemática, não visaram à resolução das relações filogenéticas do gênero e, como consequência, não foram incluídas ambas as espécies (Weber et al., 2003; Mantelatto et al., 2007 e 2009b; Robles et al., 2007; Karasawa et al., 2008; Schubart & Reuschel, 2009). Nestes trabalhos apenas a espécie do Atlântico (A. cribrarius) foi analisada, sendo ausentes dados sobre A. mexicanus, o que inviabiliza qualquer inferência a respeito do gênero em um contexto global. Além disso, em parte destes estudos, a espécie foi utilizada apenas como grupo externo em relação às espécies de enfoque principal.
Em razão dessa problemática taxonômica observada dentro do gênero Arenaeus, faz-se de grande importância a resolução das relações internas e de uma revisão taxonômica do grupo, incluindo dados moleculares na análise quando os morfológicos disponíveis são incapazes de cumprir tal objetivo de forma clara.
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Figura 1: Espécies do gênero Arenaeus DANA, 1851. A. cribrarius LAMARCK, 1818 (A) (CCDB 754) e A.
mexicanus GERSTAECKER, 1858 (B) (CCDB 2936) são as únicas espécies que compõem o gênero e exibem
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Figura 2: Mapa das distribuições geográficas teóricas das espécies de Arenaeus. A. cribrarius (em azul) distribui-se ao
longo da costa oeste do Oceano Atlântico desde Vineyard Sound, Massachusetts, EUA, até Mar del Plata, Argentina, sendo que no Brasil, distribui-se do Ceará ao Rio Grande do Sul. Já A. mexicanus (em verde) pode ser encontrado ao longo da costa leste do Oceano Pacífico, desde Baja California, México, até o norte do Chile. Para referências consultar o texto.
10 Dentro das premissas anteriormente expostas, os objetivos do presente estudo foram:
• Realizar uma revisão taxonômica a respeito do gênero Arenaeus, incluindo exemplares das espécies componentes de diversas localidades e populações distintas;
• Obter dados moleculares de sequências parciais dos genes mitocondriais 16S rDNA e citocromo-oxidase I (COI) para análise da evolução molecular dentro do grupo e construção de filogenias;
11
Obtenção dos Dados Morfológicos
Os espécimes analisados foram obtidos por empréstimo ou doação das seguintes coleções carcinológicas: University of Louisiana at Lafayette's Zoological Collection (ULLZ); Museo de Zoologia da Universidad de Costa Rica (UCR), Museu de Oceanografia da Universidade Federal de Pernambuco (MOUFPE) e Colección Nacional de Crustáceos (CNCR) da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Material adicional foi analisado a partir de lotes já depositados na Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB) da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto (FFCLRP), Universidade de São Paulo (USP). Coletas para obtenção de material adicional ocorreram em Parnamirim (RN), Ubatuba (SP), Guarujá (SP), Peruíbe (SP), Ilha Comprida (SP) e Cananéia (SP), utilizando-se captura por meio de redes de arrasto do tipo
“otter-trawl”, em profundidades de até 20m, ou mesmo coleta manual com a utilização de puçás ou
semelhante na área de varrido do litoral. Os espécimes coletados foram fixados e preservados em álcool 80% e depositados na Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia (CCDB).
As características morfológicas analisadas basearam-se nas descrições prévias de Rathbun (1930), Garth & Stephenson (1966), Rodríguez (1982), Williams (1984) e Melo (1996). Os dados morfológicos foram obtidos por meio do estudo comparativo de indivíduos adultos, fêmeas e juvenis com um estereomicroscópio acoplado a câmara clara. A identificação de indivíduos fêmeas e machos, em Portunidae, é facilmente realizada com base na morfologia do abdome. Os machos apresentam-no em forma de “T” invertido (para gêneros como Arenaeus e Callinectes) (Figura 3-A), enquanto as fêmeas apresentam-no mais largo e arredondado, próximo a triangular (Figura 3-B). A partir dessa estrutura também se pode diferenciar um juvenil de um espécime adulto, que, quando fêmeas, apresentam abdome triangular (Figura 3-C), e, quando machos, apresentam o abdome ainda não descolado, “preso” aos esternitos torácicos, mesmo que sua configuração se assemelhe à morfologia adulta (Williams, 1974; para outras referências ver Pinheiro & Fransozo, 1993).
A realização de fotografias se deu com a utilização de uma câmera digital C-7070 da Olimpus®, um estereomicroscópio ZEISS® DiscoveryV20 acoplado a uma câmera ZEISS® Axio Cam MRc 5 ou de um estereomicroscópio LEICA® M205 C acoplado a uma câmera LEICA® DFC 295. Enquanto as medições foram realizadas com o uso de um paquímetro digital (precisão: 0,01 mm), sob a visualização de estereomicroscópio, quando possível, para maior acuracidade.
Além de se conferir a consistência das principais características diagnósticas entre as espécies (Tabela 1), outros caracteres também analisados (Figura 4) foram o padrão de coloração, tanto na carapaça, como nos apêndices (e.g. antenas e antênulas, pedúnculos oculares e quelípodos) e morfologia dos segmentos e apêndices corporais.
12 Na carapaça, considerou-se seu formato, a presença e profundidade relativa dos sulcos inter-regionais, proeminência relativa do lóbulo interbranquial, formato do ângulo posterolateral e número de dentes anterolaterais. Em relação a este último item, foram incluídos na contagem o dente orbital externo e o espinho lateral, comumente agrupados como dentes/espinhos anterolaterais nas descrições tradicionais (Rathbun, 1930; Garth & Stephenson, 1966; Williams, 1984; Melo, 1996), entretanto, foram excluídos da descrição dessas estruturas, já que mesmo sendo dentes antero-laterais, seus padrões morfológicos diferem drasticamente daquele aplicado aos demais dentes e, dessa forma, são descritas à parte. Considerou-se também o tamanho e largura relativos, tanto dos dentes como do próprio espinho lateral.
Figura 3: Morfologia dos somitos abdominais de portunídeos (e.g. gêneros Arenaeus e Callinectes), utilizada na
caracterização do sexo dos espécimes. Os machos apresentam o abdome em formato de “T” invertido (A), já as fêmeas, apresentam essa estrutura mais larga e em formato arredondado (B). Por outro lado, as formas juvenis de fêmeas exibem-na em formato triangular (C). Modificado de Pinheiro & Fransozo (1993).
Na fronte dos animais, observou-se o padrão de distribuição de cerdas entre as regiões suborbital, subepática, antenal, pterigostomial, sub-branquiais e também no epistoma, caracterizando-nas como presentes ou ausentes. Para o rostro, foram analisados seu tamanho e largura relativos, número, distribuição e formato dos dentes nele presentes e formato dos seios da região. Nas órbitas, foram caracterizados o ângulo e os dentes orbitais internos, sulcos, lóbulos, dentes e seios presentes nas bordas superior e inferior. Também foram descritas a morfologia e a presença de espinhos, tubérculos ou dentes de antênulas e antenas, quelípodos e patas, tanto as natatórias como as ambulatórias. Nos quelípodos, observou-se a presença de franja de cerdas nas superfícies interna e externa e de espinhos, dentes e outras proeminências em cada um dos artículos. Algo semelhante se deu para o formato, comprimento e largura dos artículos das patas natatórias e
13 ambulatórias. Também, fez-se uma análise dos somitos abominais e do telso, considerando o padrão de fusão dos segmentos, da presença de cerdas nas bordas e de espinhos, assim como o formato dos segmentos e do próprio telso.
Figura 4: Esquema de um portunídeo generalizado mostrando os principais termos utilizados na descrição dos
espécimes. Vista dorsal à esquerda. 1- rostro; 2- regiões orbitais; 3- região gástrica (lóbulo intermediário); 4- regiões hepáticas. Setas indicam os sulcos inter-regionais localizados entre as regiões 3 e 4. Algarismos romanos indicando o tipo de apêndice: I- quelípodo, II- patas ambulatórias e III- patas natatórias. Letras indicam o artículo, ou porção dele, dos apêndices; D- dátilo, P- palma, Pr- própodo, C- carpo, M- mero, Cx- coxa; a base e o ísquio fusionados estão indicados no desenho. Vista ventral à direita, mostrando apenas os esternitos torácicos e os somitos abdominais. T- telso; algarismos arábicos indicam o segmento abdominal. (Modificado de Rodríguez, 1982).
Por último, na análise do primeiro par de pleópodos masculinos, os gonopódios, consideraram-se suas proporções, conformação, presença e distribuição de espinhos, baseando-se nas descrições e ilustrações de Rodríguez (1982), Stephenson & Campbell (1959) e Garth & Stephenson (1966). O segundo par de pleópodos, tradicionalmente não descrito para Arenaeus, nem para gêneros próximos, foi analisado segundo a distribuição de cerdas, presença ou ausência de ornamentação e conformação da extremidade terminal.
A partir dos caracteres morfológicos observados, buscou-se criar uma chave de identificação para as espécies do gênero simplificada e bastante prática, utilizando caracteres pouco plásticos, de fácil observação e de fácil diferenciação entre as espécies.
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Tabela 1: Caracteres da morfologia das espécies de Arenaeus comumente utilizados nas diagnoses de cada uma,
segundo as descrições de Rathbun (1930), Garth & Stephenson (1966), Williams (1984) e Melo (1996). (-) Indica ausência de dados na literatura.
Caráter morfológico Arenaeus cribrarius Arenaeus mexicanus
Coloração
Carapaça
Amarelo claro em um fundo dourado ou castanho claro, ou ainda marrom vináceo claro ou marrom oliva. Cobertura densa na face dorsal com pequenas e arredondadas manchas brancas
Muito semelhante àquela de
A. cribrarius, mas as manchas
brancas são menos uniformemente distribuídas
Quelípodos
As manchas na superfície dorsal dos quelípodos são maiores que
as da carapaça
Manchas brancas presentes em menor escala do que em
A. cribrarius, podendo,
inclusive, estar ausente
Ornamentação da Carapaça
Antero-Lateral Dentes antero-laterais amplos
Dentes antero-laterais mais longos e mais estreitos que em A. cribrarius. Espinho lateral relativamente maior
Rostro Com quatro pequenos dentes Apenas dois dentes pequenos
Órbita Lóbulo intermediário estreito e subtruncado
Lóbulo intermediário mais estreito. Dente interno mais
proeminente
Quelípodos
Carpo Dois espinhos curtos, um interno
e outro externo
Espinho ou tubérculo externo reduzido
Palma Um espinho na extremidade
distal
Dois espinhos na extremidade distal
Patas natatórias Mero -
Um pouco maior em comprimento em proporção a
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Obtenção dos Dados Moleculares
Os genes 16S mtDNA e o citocromo oxidase I (COI) foram utilizados como marcadores moleculares e os dados obtidos por meio de protocolos, seguindo a metodologia de Mantelatto et al. (2007, 2009b) e Pileggi & Mantelatto (2010). Além de indivíduos de ambas as espécies do gênero em estudo, também foi extraído material de membros dos gêneros Callinectes, Achelous, Charybdis DE HAAN, 1833, e Liocarcinus STIMPSON, 1871, assim como também foram adicionadas outras sequências depositadas no GenBank de espécies selecionadas dos gêneros Portunus, Callinectes,
Achelous, Charybdis, Thalamita LATREILLE, 1829, e Liocarcinus.
A escolha de representantes, priorizando a espécie-tipo, destes gêneros seguiu filogenias prévias (Mantelatto et al., 2007 e 2009b; Karasawa et al., 2008; Schubart & Reuschel, 2009) e teve o intuito de produzir um melhor posicionamento das espécies do gênero Arenaeus e do próprio gênero como um todo em relação aos demais gêneros de siris.
Duas espécies de Liocarcinus foram selecionadas para melhor enraizar as topologias, L.
depurator LINNAEUS, 1758 e L. vernalis RISSO, 1816, já que a adição de mais sequências do
clado irmão em relação ao grupo interno melhora as chances de se obter uma topologia mais parcimoniosa (Smith, 1994). Nesse caso, Liocarcinus representa Polybiidae ORTMANN, 1893 (sensu Schubart & Reuschel, 2009), ou Carcinidae MACLEAY, 1838 (sensu Martin & Davis, 2001; Ng et al., 2008), grupo-irmão de Portunidae, que inclui todos os demais gêneros analisados e em relação aos quais se procura posicionar Arenaeus.
Os testemunhos genéticos dos quais as amostras de tecido foram retiradas para análise estão depositados em suas respectivas coleções de origem e suas sequências produzidas a partir destes, armazenadas no banco de dados do GenBank. Estes dados e os números de acesso no GenBank referentes às sequências se encontram na Tabela 2.
O tecido muscular extraído foi incubado em banho-seco a 55ºC por um período de 12-24h em 600 µL de “lysis buffer” e 200 µL de proteinase-K (500µg/mL). As proteínas em solução foram separadas com a adição de 200 µL de NH4Oac 7,5M seguida de centrifugação a 14000 rpm (18ºC) por 10 min. O material genético na solução restante foi precipitado com 700 µL de isopropanol mantido a baixas temperaturas acompanhado de centrifugação, seguindo os mesmos parâmetros descritos anteriormente. Em seguida, o “pellet” resultante foi lavado com 15 µL de etanol 70%, secos a temperaturas de 30ºC – 45ºC e ressuspendidos com 20 µL de tampão TE.
16
Tabela 2: Continua. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais e
datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.
Espécie Local e Data de coleta Número de
coleção
Número de acesso no GenBank 16S/COI
Achelous spinimanus Brasil, Ubatuba, São Paulo,
2003 CCDB 987 DQ388056
f / -
Arenaeus cribrarius Costa Rica, Isla Pajaros,
Limón, 2006
UCR
2470-10 JX123457/JX123423
Arenaeus cribrarius Costa Rica, Playa Negra,
Cahuita, 2010 CCDB 2930 JX123458/JX123424
Arenaeus cribrarius Venezuela, Fálcon, 1999 ULLZ 5173 DQ407667g/ -
Arenaeus cribrarius Venezuela, La Restinga,
2011 CCDB 3635 JX123459/JX123425
Arenaeus cribrarius Brasil, Parnamirim, Rio
Grande do Norte, 2011 CCDB 3391
JX123460/JX123426- JX123427
Arenaeus cribrarius Brasil, Maceió, Alagoas,
1981
DOUFPE
6871 - /JX123428
Arenaeus cribrarius Brasil, Macaé, Rio de
Janeiro, 2011 CCDB 3255 JX123461/JX123429
Arenaeus cribrarius Brasil, Ubatuba, Enseada de
Ubatuba, São Paulo, 2005 CCDB 2725
- / JX123430-JX123431-JX123432
Arenaeus cribrarius Brasil, Ubatuba, São Paulo,
2011 CCDB 1536
JX123462/JX123433- JX123434
Arenaeus cribrarius Brasil, Caraguatatuba, São
Paulo, 2001 CCDB 754 - /JX123435
Arenaeus cribrarius Brasil, Guarujá, São Paulo,
17
Tabela 2: Continua. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais e
datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.
Espécie Local e Data de coleta Número de
coleção
Número de acesso no GenBank 16S/COI
Arenaeus cribrarius
Brasil, Peruíbe, São Paulo,
2011 CCDB 3700 JX123464/ JX123437
Arenaeus cribrarius
Brasil, Ilha Comprida, Praia Boqueirão Norte, São
Paulo, 2011
CCDB 3208 JX123465/JX123438
Arenaeus cribrarius Brasil, Ilha Comprida, Praia Boqueirão Sul, São Paulo,
2011
CCDB 3182 JX123466/JX123439
Arenaeus cribrarius Brasil, Cananéia, São Paulo,
2011 CCDB 3241
- / JX123440-JX123441-JX123442
Arenaeus cribrarius Brasil, São Francisco do
Sul, Santa Catarina, 2010 CCDB 3516 JX123468/JX123444
Arenaeus cribrarius Brasil, São Francisco do
Sul, Santa Catarina, 2011 CCDB 1457 JX123469/JX123445
Arenaeus cribrarius Brasil, Florianópolis, Santa
Catarina, 2004 CCDB 990 JX123467/JX123443
Arenaeus mexicanus
Costa Rica, Golfo Papagayo, Guanaceste,
2005
UCR
2430-04 JX123470/JX123446
Arenaeus mexicanus Costa Rica, Playa Organo,
Puntarenas, 1991 UCR 1382 JX123472/JX123447
Arenaeus mexicanus Costa Rica, Puntarenas,
2010 CCDB 2936 JX123471/JX123448
Arenaeus mexicanus Costa Rica, 2005 CCDB 1716
JX123473/JX123449-JX123450
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Tabela 2: Continua. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais e
datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.
Espécie Local e Data de coleta Número de
coleção
Número de acesso no GenBank 16S/COI
Callinectes bocourti Brasil, São Vicente, São
Paulo, 2002 CCDB 1764 - / JX123451
Callinectes danae
Brasil, Enseada de Ubatuba, Ubatuba, São
Paulo, 2002
CCDB 1766 JX123474/ -
Callinectes danae Brasil, São Vicente, São
Paulo, 2011 CCDB 3665 JX123475/ -
Callinectes ornatus
Brasil, Enseada de Ubatuba, Ubatuba, São
Paulo
ULLZ 4178 AJ298186a/ -
Callinectes sapidus Venezuela, Zulia ULLZ 4188 AJ298190a/ -
Callinectes sapidus Brasil, São Vicente, São
Paulo, 2001 CCDB 1680 JX123476/JX123452
Callinectes sapidus Brasil, Cananéia, São
Paulo, 2011 CCDB 3242 JX123477/JX123453
Callinectes similis EUA, Louisiana ULLZ 4371 DQ407672g/ -
Charybdis hellerii Venezuela, Fálcon ULLZ 4631 DQ407666g/ -
Charybdis hellerii Brasil, Cananéia, São
Paulo, 2011 CCDB 887 - /JX123454
Liocarcinus depurator Espanha, Mar de Alborán MNHN (não
catalogado) FM208767 l
/ -
Liocarcinus depurator Portugal MNHN
MB89000354 - /JQ306215 m
19
Tabela 2: Conclusão. Espécies cujas sequências foram utilizadas nas análises moleculares com seus respectivos locais
e datas de coleta, números de catálogo das coleções de origem e de acesso no GenBank. (-) Indica ausência dos dados.
Espécie Local e Data de coleta Número de
coleção
Número de acesso no GenBank 16S/COI
Liocarcinus vernalis Itália, Monte Argentario,
Grosseto CCDB 1739 - /JX123455
Liocarcinus vernalis Itália, Fusaro, Nápoles SMF 32761 FM208768l/ -
Portunus pelagicus India, Gulf of Mainnar,
2003 ULLZ 5682 DQ388052
f / -
Portunus pelagicus - BIO
MaPrt001 - /DQ889124
e
Portunus trituberculatus Japão, Tokyo, 2002 NHMI
CDM-ZC 5916 AB093006 b
/AB093006b
Portunus trituberculatus - GQ180777i/GQ180779i
Portunus sanguinolentus Vietnã, Nha Trang - AM410531d/ -
Portunus sanguinolentus - - - /EU284144h
Thalamita danae Cingapura, Labrador, 1999 ULLZ 4760 FJ152165j/ -
Thalamita seurati Kiribati, Pacífico, 2005 FLMNH
UF10716 - /GQ260913
k
CCDB: Coleção de Crustáceos do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto, Brasil; DOUFPE: Departamento de Oceanografia da Universidade Federal de Pernambuco, Brasil; ULLZ: University of Louisiana at Lafayette's Zoological Collection, EUA; SMF : Senckenberg Museum, Frankfurt a.M, Alemanha.; MNHN: Museu Nacional de História Natural, Universidade de Lisboa, Portugal; BIO: Biodiversity Institute of Ontario, University of Guelph, Canadá. FLMNH: Florida Museum of Natural History, EUA; NHMI: Natural History Museum and Institute, China.
a Schubart et al. (2001a); b Yamauchi et al. (2003); c Pfeiler et al. (2005); d Bui et al. (2006); e Costa et al. (2007); f
Mantelatto et al. (2007); g Robles et al. (2007); h Xing & Lin (2007); i Dai et al. (2009); j Mantelatto et al. (2009); k Plaisance et al. (2009); l Schubart & Reuschel (2009); m Matzen da Silva et al. (2011)
20 O DNA genômico, extraído do tecido muscular dos exemplares obtidos, teve sua região de interesse amplificada por meio de técnica de PCR (“Polymerase Chain Reaction”) (ciclos térmicos para 16S: desnaturação inicial por 5 min a 95 °C; desnaturação, anelamento e extensão por 40 ciclos: 45 segundos a 95 °C, 45 segundos a 48 °C, 1 min a 72 °C; extensão final de 10 min a 72 °C; ciclos térmicos para COI: desnaturação inicial por 2 min a 94 °C; desnaturação, anelamento e extensão por 35 ciclos: 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 50 °C, 1 min a 72 °C; extensão final de 10 min a 72 °C) fazendo uso dos “primers” 16SL2 (5’-TGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’) e 16SH2 (5’-AGA TAG AAA CCA ACC TGG-3’) (Schubart et al., 2000b) para o fragmento de 16S, e para a porção do gene COI, LCO1-1490 (5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG-3’) e HCO1-2198 (5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’) (Folmer et al., 1994). Os resultados obtidos foram observados em eletroforese com gel de agarose 1%.
Quando necessário, a temperatura foi ajustada para melhor anelamento do “primer”, implicando em variações do protocolo (44-52 ºC para o fragmento de 16S e 46-54 ºC para o fragmento de COI). Em alguns casos, quando a simples variação da temperatura e do volume de DNA adicionado não resultou em amplificação, testou-se a variação “touchdown” de PCR (Don et
al., 1991; Korbie & Mattick, 2008). Essa técnica se baseia na propriedade exponencial de replicação
da PCR e na especificidade diferencial dos “primers” de acordo com diferentes temperaturas. A ideia é se iniciar os ciclos de amplificação a temperaturas mais elevadas, produzidos moldes bastante específicos de DNA em relação ao “template” inicial. Em seguida, a temperatura é decrescida em um valor a cada ciclo diminuindo a especificidade do “primer” e facilitando a amplificação final, sem perder a fidelidade ao “template” de DNA inicial (Don et al., 1991; Korbie & Mattick, 2008). A vantagem na utilização desta técnica reside, principalmente, no fato de que não se necessita testar diversas temperaturas até se encontrar uma adequada à amplificação, assim o número de parâmetros a se variar diminui e pode-se obter o produto de uma amplificação mais facilmente; ganha-se sensibilidade na técnica sem se perder a fidelidade ao fragmento que se deseja amplificar.
Os ciclos termais de “touchdown” seguiram o protocolo proposto por Korbie & Mattick (2008) com pequenas modificações (Tabela 3). As temperaturas de “melting” (Tm) dos “primers” foram baseadas nos valores básicos fornecidos pela plataforma OligoCalc (Kibbe, 2007) (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) e na média das Tm das fitas “forward”
e “reverse” de cada “primer”, fornecidas pelo fabricante, sendo que esses valores sofreram algumas modificações ao longo da realização das PCRs.
21
Tabela 3: Ciclos termais utilizados na técnica “touchdown” de PCR modificados a partir de Korbie & Mattick
(2008). O primeiro estágio representa a desnaturação inicial. Durante o segundo estágio a temperatura de anelamento de (Tm +10°C) é decrescida em 1°C por ciclo, até atingir o valor (Tm - 5°C). Esse valor é repetido
por mais 20 ciclos durante o terceiro estágio. Tm = temperatura de “melting” dos “primers” baseado nos valores base fornecidos pelo sítio OligoCalc (Kibbe, 2007) e a Tm das fitas “forward” e “reverse” de cada
“primer”, fornecidas pelo fabricante, de ≈ 45 °C para H2/L2 (16S) e ≈ 54 °C para LCO1-1490/HCO1-2198 (COI).
Estágio Passo Temperatura Tempo
Primeiro desnaturação 95°C 5 min
desnaturação 95°C 30 s anelamento (Tm + 10°C) -1°C/ciclo 45 s elogação 72°C 60 s desnaturação 95°C 30 s anelamento Tm - 5°C 45 s elogação 72°C 60 s elongação 72°C 10 min "holding" 4°C ∞ Término Segundo (15 ciclos) Terceiro (20 ciclos)
O material amplificado foi purificado por meio do Kit SureClean Plus® (Bioline USA Inc.), seguindo o protocolo da empresa, e sequenciado por um sequenciador automático ABI 3100 Genetic Analyzer® (“Applied Biosystems automated sequencer”) do Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo ou do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal (FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), por meio do kit de reação ABI Big Dye® Terminator Mix (PE Biosystems).
As sequências obtidas foram confirmadas pelo sequenciamento de ambas as fitas (senso e anti-senso). A edição e o consenso das sequências foram realizados manualmente através do programa BioEdit 7.0.9 (Hall, 2005). Além disso, o resultado do consenso de ambas as fitas foi comparado com outras sequências depositadas em banco de dados genéticos utilizando-se o programa de pesquisa BLASTn (“Basic Local Alignment Search Tool” - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.shtml) para confirmação dos resultados.
Em seguida, as sequências produzidas foram alinhadas em ClustalW (Thompson et al., 1994, implementado no programa BioEdit). O alinhamento múltiplo em ClustalW consiste em alinhar todos os pares de sequências e calcular uma matriz de divergência entre elas. Nessa etapa, “gaps” são introduzidos para aumentar o número de caracteres semelhantes e o programa confere uma pontuação a esse alinhamento. A cada “gap” criado existe uma penalidade na pontuação e “gaps” conseguintes recebem uma penalidade menor (Hall, 2008). Isso dificulta que sequências muito
22 distantes (i.e. não homólogas) sejam alinhadas pela introdução de muitos “gaps”. Em seguida, o algoritmo constrói uma árvore-guia com base na matriz de divergência entre elas usando o método de “neighbour-joining” (Saitou & Nei, 1987). A partir dela é realizado o alinhamento progressivo de todas as sequências, seguindo os ramos da árvore-guia e considerando a penalidade conferida pela abertura de “gaps” (Thompson et al., 1994). Esse processo é essencial para eliminar possíveis ruídos (e.g. resultados duvidosos de sequenciamento) que possam interferir nas análises (Pileggi, 2009).
A partir desse alinhamento “corrigido”, em que o tamanho das sequências foi aproximado, retirando-se outros genes, no caso de sequências de genoma mitocondrial completo adicionadas a partir do GenBank, e algumas bases das extremidades não compartilhadas entre a maior parte das sequências (i.e. bases fruto de uma amplificação de tamanhos desiguais entre os PCRs), foram realizadas as demais análises. Os “gaps” entre as sequências foram indicados por “-“ e
“missing-data” por ”?”.
Análise de Saturação e Sinal Filogenético dos Dados
Antes de se iniciar qualquer procedimento de inferência filogenética, verificou-se a qualidade dos dados em relação ao grau de saturação de transições e do sinal filogenético contido nestes.
Para se obter alguma inferência de qualidade, i.e. que tenha grande probabilidade de representar a história evolutiva de um grupo, as sequências utilizadas não podem exibir uma taxa muito baixa de substituição, insuficiente para mostrar divergência, mas também não podem ser extremamente variáveis a ponto de exibirem saturação de substituição (Xia & Lemey, 2009). A saturação pode ocorrer entre sequências bastante divergentes, em que o número de transversões supera muito o de transições e isso diminui a informação filogenética nesses dados.
Em razão disso, realizou-se a plotagem dos valores de transições e de transversões de acordo com a distância de TN93 (Tamura & Nei, 1993) no programa DAMBE (Xia & Xie, 2001) para se identificar possível saturação nos dados.
Outro fator que afeta a informação filogenética é a presença de ruído aleatório em função de taxas de alteração de bases bastante elevadas, capazes de randomizar os dados em relação à história evolutiva (Hillis, 1991). De acordo com isso, o sinal filogenético dos alinhamentos também foi testado como recomendado por Schneider (2007), pelo método da estatística G1 (Hillis, 1991; Hillis & Huelsenbeck, 1992). Esse parâmetro mede o grau de “torção” (“skewness”) de uma distribuição (Sokal & Rohlf, 1981) e plotando-se o comprimento de ramos pelo número de árvores pode-se obter uma distribuição capaz de indicar o sinal filogenético dos dados. Caso exista sinal filogenético, a
23 distribuição se mostrará “arrastada” para a direita, por outro lado, dados sem informação filogenética exibirão uma distribuição simétrica (Hillis & Huelsenbeck, 1992). Para tal foram geradas 1.000.000 árvores aleatórias no programa PAUP* 4.0b (“Phylogenetic Analysis Using
Parsimony and Other Methods”) (Swofford, 2002) com a parcimônia como critério de otimização
direta, sendo que a frequência do comprimento de ramos dessas árvores foi plotada no programa SigmaPlot® 11.0 (Systat Software, Inc.).
Entretanto, de acordo com Xia et al. (2003), esse método pode levar a se considerar a presença de sinal filogenético em um alinhamento que apresente grupos muito proximamente relacionados (e.g. espécies irmãs) mesmo quando os demais táxons apresentem completa saturação de substituição. Assim, para se tornar mais concreta a conclusão a respeito da qualidade da informação filogenética dos dados, também se calculou o índice de saturação de substituição (“index of substitution saturation”; Xia et al., 2003). Esse índice baseia-se na entropia da informação e relaciona o grau de saturação (Iss) a um valor crítico (Iss.c), a partir do qual os dados
são incapazes de retomar a filogenia verdadeira.
Análise de Distância Genética
A matriz de divergência genética foi construída com o intuito de se tornar mais facilmente visualizável a diferenciação entre os grupos e também de indicar algumas distinções nas sequências de bases nucleotídicas que não aparecem nas topologias construídas. Porém, esses dados não representam qualquer relação evolutiva entre os grupos e simplesmente indicam uma relação fenética entre eles.
O método mais simples de cálculo de distância genética é a distância-p, que se baseia na proporção observada de diferenças entre as sequências (Hall, 2008). Entretanto, esse método desconsidera a história evolutiva de cada sítio e muito subestima a diferença genética entre grupos que divergiram há bastante tempo. Uma análise a priori mostrou valores bastante semelhantes de distância genética entre clados pertencentes a subfamílias distintas (e.g. Charybdis vs. Arenaeus) em relação àquela entre grupos que divergiram mais recentemente (e.g. Arenaeus vs. Callinectes). Dessa forma, optou-se por utilizar um método de cálculo de distância que servisse melhor aos propósitos iniciais. Entre os modelos de distância, o modelo de TN93+Γ (Tamura & Nei, 1993 + Gama) é aquele que mais considera parâmetros, levando em conta múltiplas substituições, diferenças nas taxas de substituição de nucleotídeos e a desigualdade na frequência de bases (Russo
et al., 2001), com as substituições seguindo uma distribuição gama, que garante a heterogeneidade
24 subestimada em função de fatores que não podem ser vistos hoje nas sequências, como a ocorrência de múltiplas substituições que levam alguns sítios a exibirem a mesma base observada depois de diversas alterações em um contexto hereditário-temporal.
Levando esses fatos em consideração, as matrizes de divergência genética foram calculadas no programa PAUP* 4.0b com um valor de gama previamente estimado pelo programa jModelTest (Posada, 2008), no qual o modelo de substituição, que prevê o valor de gama, foi selecionado a partir do critério de informação Akaike (Akaike, 1973), como recomendado por Posada & Buckley (2004), porém corrigido para pequenas amostras (AICc) (Hurvich & Tsai, 1989).
Busca pela melhor árvore filogenética - “Maximum-Likelihood”
O método de busca “maximum likelihood” (ML) (Felsenstein, 1973; 1981) procura pela árvore que maximiza a probabilidade de se observar um conjunto de dados em questão, seguindo as taxas de substituição de um nucleotídeo para outro de acordo com o modelo evolutivo especificado (Hall, 2008). A busca foi realizada com o programa RAxML 7.2.7 (“Randomized Axelerated
Maximum Likelihood”) (Stamatakis, 2006) implementado no sistema CIPRES
(“Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research”) (http://www.phylo.org). RAxML oferece um algoritmo alternativo para realização do teste de consistência de “bootstrap” (Felsenstein, 1985), mais rápido que o tradicional (Stamatakis et al., 2008).
O algoritmo de “rapidbootstrap” (Stamatakis et al., 2008) inicia a busca por uma árvore mais parcimoniosa construída a partir do alinhamento original e em seguida otimiza os valores dos parâmetros do modelo de substituição e os comprimentos de ramos. Após este passo, inicia-se uma busca pelas réplicas de “bootstrap” durante várias gerações, comparando-as à original, e considerando que a árvore em que se baseia uma geração de réplica é aquela resultante da geração anterior. A cada 10 gerações o algoritmo retoma o alinhamento original e constrói nova árvore mais parcimoniosa e nela se baseia para novo cálculo de “bootstrap”, seguindo os parâmetros anteriormente citados. Esse procedimento favorece a velocidade no cálculo de “bootstrap” e dificulta que o algoritmo fique preso em um “local optima”, enviesando os valores de suporte (Stamatakis et al., 2008).
Apesar de compreender um algoritmo alternativo, o método de “rapidbootstrap” ainda mantém a essência do original e dessa forma, é válido esclarecer como este funciona. O método de “bootstrap” consiste em reamostrar com reposição os dados, ou seja, construir novos alinhamentos (pseudo-alinhamentos), cuja base que inicia todas as sequências não é necessariamente a primeira base que aparece no alinhamento original. Esses novos alinhamentos são construídos considerando