UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

GIOVANA FUCINA

DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTO FITOTERÁPICO

SEMISSÓLIDO CONTENDO EXTRATO SECO PADRONIZADO DE

Sphagneticola trilobata (L.) PRUSKI

PROGRAMA DE PÓS-GRAUDAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

GIOVANA FUCINA

DESENVOLVIMENTO DE MEDICAMENTO FITOTERÁPICO

SEMISSÓLIDO CONTENDO EXTRATO SECO PADRONIZADO DE

Sphagneticola trilobata (L.) PRUSKI

Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Tania Mari Bellé Bresolin Coorientadora: Profa. Dra. Ruth Meri Lucinda Silva

Ao Laboratório Farmacêutico Elofar pela oportunidade e incentivo.

Aos professores Dr. Valdir Cechinel e Dra. Tania Bresolin por acreditarem que o ambiente de pesquisa pode ser diverso e vivido além dos muros da universidade.

Às minhas orientadoras Dra. Tania M. B. Bresolin e Dra. Ruth M. Lucinda da Silva pela atenção, confiança e carinho dispensados.

Este trabalho é fruto da perseverança. Então, além da força divina que me acompanha e anima, algumas pessoas precisam ser citadas para que se registre sua participação na conclusão esta etapa.

À minha família: pai Domingos (palavras doces mesmo em tempos difíceis), mãe Neili (orações; meu porto seguro), irmão Jonathan (amigo para todas as horas), sogra dona Kika (acalanto e café quentinho)...

Ao meu escudeiro, parceiro, amigo e amor Marcelo pela compreensão nos momentos de ausência, carinho e conforto quando eu estava cansada.

Aos professores Ruth, Nara, Daisy, Angélica, Angela, Rene pela atenção e auxílio na elaboração desta pesquisa.

Aos amigos de desenvolvimento do Laboratório Farmacêutico Elofar: Thiago, Maria, Francieli, Paula, Juliana, Emanoelle, Fernanda, Marcio... pelas ideias, trocas, compreensão, auxílio e palavras de incentivo.

Aos amigos de desenvolvimento da UNIVALI: Luciana, Lilian, Sabrina, Bruninho pela oportunidade de aprender com vocês.

Aos colegas de mestrado, professores e técnicos da UNIVALI pela convivência e amizade.

Aos que por ventura não citei, mas que de alguma forma contribuíram com o trabalho.

"Gostaria de te desejar tantas coisas.

Mas nada seria suficiente.

Então, desejo apenas que você tenha muitos desejos.

Desejos grandes.

E que eles possam te mover a cada minuto, ao rumo da sua felicidade!"

SEMISSÓLIDO CONTENDO EXTRATO SECO PADRONIZADO DE

Sphagneticola trilobata (L.) PRUSKI

Giovana Fucina

Julho/2012 Orientadora: Profa. Tania Mari Bellé Bresolin, Dra. Coorientadora: Profa. Ruth Meri Lucinda Silva, Dra.

Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 118

A Sphagneticola trilobata (L.) Pruski, também conhecida como Acmella brasiliensis e Wedelia paludosa é uma planta nativa e tradicionalmente utilizada como analgésica, anti-inflamatória e hipoglicemiante. Entre os compostos ativos relatados na literatura, destaca-se o ácido caurenoico (AC). Este trabalho visou desenvolver um medicamento fitoterápico semissólido tópico contendo o extrato seco, previamente desenvolvido a partir das partes aéreas da S. trilobata e a metodologia para o controle de qualidade do derivado vegetal e do fitoterápico. Foram desenvolvidos semissólidos em base gel, gel-creme, creme aniônico e não iônico, contendo o extrato seco padronizado a 1, 2, 3 e 5% (m/m) os quais foram biomonitorados através da atividade anti-inflamatória tópica (modelo de edema de orelha em camundongos). O AC foi selecionado como marcador e quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) empregando coluna C18, com fase móvel contendo acetonitrila: água acidificada pH 3,0 em uma corrida gradiente de 50 min, a 1,0 mL/min, 35 °C, com detecção em 210 e 338 nm. O método por CLAE mostrou uma resolução adequada (R >1,0) para o AC (que eluiu em 38 min), cuja assimetria de pico foi < 1,5. O método foi validado, mostrando ser seletivo e indicativo de estabilidade para o AC, com linearidade na faixa de 4,5 a 30,0 µg/mL, exato (recuperação média de AC de 98%), preciso (DPR < 2% para repetibilidade e precisão intermediária e DPR < 8% para a reprodutibilidade) e robusto. O extrato seco não foi estável frente à luz visível e UV, assim como ao meio ácido. O semissólido em base não iônica (Steareth21) mostrou melhor ação anti-inflamatória (inibição de 68,46% do edema) com 1% de extrato seco padronizado (5,5-6,5 mg/g de AC). Esta formulação foi quantificada empregando o método por CLAE previamente validado para o extrato seco. A metodologia foi seletiva (ausência de interferência dos excipientes) e linear na faixa de 4,5-52,5 µg/mL de AC. A recuperação média do marcador foi de 97,57% com uma boa precisão (DPR de 0,34 e 1,51% para a repetibilidade e precisão intermediária, respectivamente). Portanto, o método por CLAE desenvolvido para o extrato seco e fitoterápico foi validado com sucesso e pode ser empregado em estudos futuros e o fitoterápico desenvolvido poderá ser analisado quanto aos aspectos de segurança e eficácia para futuro registro na ANVISA.

Palavras-chave: Sphagneticola trilobata; ácido caurenoico; validação analítica;

STANDARDIZED DRYED EXTRACT OF Sphagneticola trilobata (L.)

PRUSKI

Giovana Fucina

July/2012 Supervisor: Prof. Tania Mari Bellé Bresolin, Dr. Co-supervisor: Prof. Ruth Meri Lucinda Silva, Dr.

Area of Concentration: Natural Products and Bioactives Naturals and Synthetic Substances

Number of Pages: 118

Sphagneticola trilobata (L.) Pruski, also known as Acmella brasiliensis and Wedelia paludosa, is a native plant that is traditionally used as an analgesic, anti-inflammatory and hypoglycemic. Among the active substances reported in the literature is kaurenoic acid (KA). This work developed a topical semisolid phytomedicine containing a previously developed spray-dried extract from aerial parts of S. trilobata, and also, to develop a methodology for quality control of the herbal preparations and herbal product. Semisolid products were developed with gel, cream-gel, anionic and nonionic cream bases, containing standardized dried extract at 1, 2, 3 and 5% (w/w). These products were submitted to biomonitoring by anti-inflammatory topical activity (ear edema model in rats). KA was selected as the marker, and quantified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) using a C18 column, with mobile phase containing acetonitrile: acidified water pH 3.0 in a gradient run of 50 min, at 1.0 mL/min, 35 °C, with detection at 210 and 338 nm. The HPLC method showed adequate resolution (R >1.0) for KA (which eluted at 38 min), which peak asymmetry was < 1.5. The method was validated and proved be selective and indicative of stability for KA, with linearity in the range of 4.5 – 30.0 µg/mL of KA, accurate (KA average recovery of 98%), precise (RSD% values for the intra- and inter-day precision studies were < 2.0 and < 8.0% for inter-laboratorial study) and robust. The dried extract was not stable under visible light and UV, or in acid medium. The semisolid with nonionic base (Steareth21®) containing 1% of standardized dried extract (5.5-6.5 mg/g of KA) showed better anti-inflammatory activity (edema inhibition of 68.46%). This formulation was quantified by HPLC, previously validated for dried extract. The methodology was selective (absence of interference from excipients) and linear in the range of 4.5-52.5 µg/mL of KA. The average recovery of marker was 97.57% with good precision (RSD of 0.34 and 1.51% for repeatability and intermediate precision, respectively). Thus, the HPLC developed method for dried extract was successfully validated and can be used in future stability studies, and the herbal product developed can be analyzed for its safety and efficacy for future registration with ANVISA.

Keywords: Sphagneticola trilobata; kaurenoic acid; analytical validation; HPLC;

Figura 1 Procedimentos gerais para a obtenção de compostos biologicamente ativos a partir de plantas medicinais... 33

Figura 2 Partes aéreas da Sphagneticola trilobata (L.) Pruski... 37

Figura 3 Estrutura química a) ácido caurenoico; b) luteolina e c) ácido grandiflorênico... 37

Figura 4 Estrutura química a) ácido 3α-tigloiloxicar-16-en-19-óico; b) ácido 3α-cinamoiloxicar-16-en-19-óico; c) paludolactona... 38

Figura 5 Distribuição granulométrica do extrato seco de S. trilobata (lote 3453) por tamisação... 76

Figura 6 Fotomicrografia eletrônica de varredura do extrato seco de S. trilobata, lote 3453, com aumento de 101x (a) e 500x (b)... 76

Figura 7 Comportamento da higroscopicidade do extrato seco de S. trilobata, lote 3453... 77

Figura 8 Perfil cromatográfico em 210 nm do: a) padrão de ácido caurenoico; b) solução amostra do extrato seco de S. trilobata; c) solvente, d) corrida sem injeção de amostra; e perfil cromatográfico em 338 nm: e) solução amostra do extrato seco de S. trilobata... 79

Figura 9 Perfis em CLAE das soluções amostra de extrato seco de S. trilobata, em 210 nm, após degradações em meio ácido, básico e oxidativo... 84

Figura 10 Perfis cromatográficos das soluções amostra de extrato seco de S.

trilobata, em 210 nm, após serem submetidas às degradações fotolíticas... 85

Figura 11 Determinação gráfica da curva de linearidade relativa à solução

padrão de AC (Curva A) e à curva analítica de padrão adicionado na matriz do extrato seco (Curva B) (solução amostra)... 86

Figura 12 Gráficos de resíduos das regressões lineares das curvas: a (solução

padrão) e b (padrão adicionado na matriz do extrato seco)... 86

Figura 13 Efeito das formulações semissólidas em base gel, contendo 1% de

extrato seco padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha

induzido por óleo de cróton (2,5% em acetona; 20 μL)... 94

Figura 14 Efeito das formulações semissólidas em base creme, contendo 1%

de extrato seco padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha induzido por óleo de cróton (2,5% em acetona; 20 μL)... 95

Figura 15 Efeito das formulações semissólidas em base creme Lanette N®, acrescido de promotor de absorção e contendo 1% de extrato seco padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha induzido por

óleo de cróton (2,5% em acetona; 20 μL)... 95

Figura 16 Efeito das formulações semissólidas em base creme Polawax® com promotor de absorção, contendo 1% de extrato seco padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha induzido por óleo de cróton

(2,5% em acetona; 20 μL)... 96

Figura 17 Efeito das formulações semissólidas em base gel-creme e creme

Ceteth20 -1, contendo 1% de extrato seco padronizado de S.

trilobata sobre o edema de orelha induzido por óleo de cróton (2,5% em acetona; 20 μL)... 97

Figura 18 Efeito das formulações semissólidas em base creme (Ceteth20 – 2;

Steareth21 – 4 e Steareth21 - 5), contendo o extrato seco

padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha induzido por

óleo de cróton (2,5% em acetona; 20 μL)... 98

Figura 19 Efeito das formulações semissólidas em base creme, Ceteth20,

contendo promotores de absorção e 1% de extrato seco padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha induzido por óleo de cróton

(2,5% em acetona; 20 μL)... 99

Figura 20 Efeito das formulações semissólidas em base creme, Steareth21,

contendo promotores de absorção e 1% de extrato seco padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha induzido por óleo de cróton

(2,5% em acetona; 20 μL)... 99

Figura 21 Efeito das formulações semissólidas em base creme, sendo A:

Ceteth20-1 e B: Steareth21-5, contendo, 1%, 2%, 3% e 5% de extrato seco padronizado de S. trilobata sobre o edema de orelha

induzido por óleo de cróton (2,5% em acetona; 20 μL)... 101

Figura 22 Perfil cromatográfico em 210nm: a) padrão de AC; b) solução

amostra de creme Steareth21-5; c) placebo do creme Steareth21-5; d) solução branco; e) fase móvel; e perfil cromatográfico em 338nm: f) solução amostra de creme Steareth21-5... 103

Figura 23 Determinação gráfica da linearidade relativa à solução padrão

(Curva A) e à curva analítica de padrão adicionado ao creme contendo 1% p/p de extrato seco (solução amostra) (Curva B)... 106

Quadro 1 Gradiente de distribuição da fase móvel utilizada no método analítico, desenvolvido por CLAE, para quantificação de AC no extrato seco e no fitoterápico de S. trilobata... 51

Quadro 2 Diluição da solução “mãe” para curva analítica de AC (padrão

isolado) (Curva A) e para a curva analítica de padrão adicionado na matriz do extrato seco (curva B) de S. trilobata... 55

Quadro 3 Ensaio de exatidão pelo método de adição de solução padrão na matriz de extrato seco de S. trilobata... 56

Quadro 4 Condições de exposição do extrato seco padronizado de S. trilobata para estudo de degradação por hidrólise ácida, alcalina, por oxidação e fotólise... 60

Quadro 5 Formulações semissólidas contendo 1% de extrato seco padronizado de S. trilobata... 64

Quadro 6 Formulações contendo 1%, 2%, 3% e 5% de extrato seco de S. trilobata... 64

Quadro 7 Diluição da solução “mãe” para curva analítica de padrão isolado

(Curva A) e para a curva analítica de padrão adicionado na matriz de creme contendo 1% de extrato seco de S. trilobata (Curva B).... 71

Quadro 8 Distribuição das amostras para o ensaio de recuperação (exatidão) de AC em creme contendo extrato seco de S. trilobata. 72

Tabela 1 Parâmetros cromatográficos e teor de ácido caurenoico (AC) nas amostras de extrato seco de S. trilobata submetidas às diferentes condições de degradação... 83

Tabela 2 Parâmetros cromatográficos e percentuais de recuperação de AC no ensaio de exatidão no método por CLAE para o extrato seco de S. trilobata... 87

Tabela 3 Resultados do ensaio de precisão em dois níveis: repetibilidade e precisão intermediária (interdias), do método de quantificação do AC no extrato seco de S. trilobata... 88

Tabela 4 Resultados do ensaio de precisão interlaboratorial (Reprodutibilidade) do método de quantificação do AC no extrato seco de S. trilobata... 89

Tabela 5 Parâmetros cromatográficos e resultados alcançados nas corridas analíticas para avaliação da robustez do método de quantificação de AC no extrato seco de S. trilobata... 90

Tabela 6 Parâmetros cromatográficos e resultados alcançados nas corridas analíticas realizadas para avaliar a estabilidade das soluções analíticas... 91

Tabela 7 Resultados da quantificação do teor de AC nos lotes de extrato seco produzidos pela Anidro do Brasil... 92

Tabela 8 Resultados dos ensaios de biomonitoramento para escolha da melhor base para a formulação do fitoterápico, realizados com semissólidos contendo 1% de extrato seco padronizado de S. trilobata... 100

Tabela 9 Lotes das formulações utilizadas para os ensaios farmacológicos de dose-dependência e os respectivos resultados alcançados... 101

Tabela 10 Resultados do ensaio de recuperação de AC nos cremes contendo

0,5%; 1,0% e 1,5% de extrato seco padronizado em 6,3 mg/g de AC... 106

Tabela 11 Resultados da precisão em dois níveis: repetibilidade e precisão

intermediária (interdias), do método de quantificação do AC em creme contendo 1% de extrato seco de S. trilobata, padronizado em 6,3 mg/g de AC... 107

Tabela 12 Resultados obtidos para o tempo de estabilidade das amostras

para avaliação do teor de AC em creme contendo 1% de extrato seco padronizado de S. trilobata... 108

AC - Ácido Caurenoico

CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CCD - Cromatografia em Camada Delgada DAD – Detector de Arranjo de Diodos DPR - Desvio Padrão Relativo

EMA - European Medicines Agency EPM - Erro Padrão da Média

FDA - Food and Drug Administration IV - Infravermelho

LQ - Limite de Quantificação

LPS - Lipopolissacarídeo de membrana de Escherichia coli MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura

NIQFAR - Núcleo de Investigações Químico Farmacêuticas OMS - Organização Mundial da Saúde

PNPMF - Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos R - Resolução

RDC - Resolução da Diretoria Colegiada Rf - Fator de Retenção

RPM - Rotações por minuto

RMN - Ressonância Magnética Nuclear SR - Solução Referência

UR - Umidade Relativa UV - Ultravioleta

1 INTRODUÇÃO

2 OBJETIVOS

3 REVISÃO DA LITERATURA

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1.1 Reagentes, soluções e matérias primas... 45

4.1.2 Equipamentos e acessórios... 46

4.1.3 Derivado vegetal....... 47

4.1.4 Ácido caurenoico....... 48

4.2 Métodos... 48

4.2.1 Controle de qualidade do extrato padronizado... 48 4.2.1.1 Características organolépticas... 49 4.2.1.2 Perfil em cromatografia de camada delgada (CCD)... 49 4.2.1.3 Determinação da granulometria e morfologia do pó do extrato seco... 50 4.2.1.4 Determinação da higroscopicidade e perda por dessecação ... 50

4.2.2 Otimização e validação do método de análise quali e quantitativo do extrato seco padronizado de S. trilobata por CLAE...... 51 4.2.2.1 Solução padrão... 52 4.2.2.2 Solução amostra... 52 4.2.2.3 Procedimento de doseamento do teor de ácido caurenoico no extrato seco... 52 4.2.2.4 Adequabilidade do sistema... 53 4.2.2.5 Validação analítica... 53

trilobata... 58

4.2.3 Preparações semissólidas contendo extrato seco padronizado da planta S. trilobata... 61 4.2.3.1 Formulações em base gel... 61 4.2.3.2 Formulações em base gel-creme... 62 4.2.3.3 Formulações em base creme... 62 4.2.4 Avaliação das formulações semissólidas... 65 4.2.4.1 Aspecto... 65 4.2.4.2 Determinação de pH... 65 4.2.4.3 Centrifugação... 65 4.2.4.4 Biomonitoramento... 66 4.2.4.4.1 Animais... 66 4.2.4.4.2 Modelo de edema de orelha em camundongos... 67

4.2.5 Desenvolvimento e validação da metodologia analítica para controle de qualidade do fitoterápico selecionado... 67 4.2.5.1 Solução padrão... 68

4.2.5.2 Solução amostra... 68

4.2.5.3 Doseamento do teor de AC no creme contendo 1% de extrato seco de S. trilobata... 69 4.2.5.4 Validação analítica... 69

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO...

5.1 Controle de qualidade do extrato seco padronizado por spray

drying... 75

5.2 Desenvolvimento da metodologia analítica por CLAE para o extrato seco... 77 5.3 Validação do método analítico para determinação do teor de ácido caurenoico em extrato seco padronizado de S. trilobata (L.) Pruski... 80 5.3.1 Seletividade/especificidade... 81 5.3.2 Linearidade... 85 5.3.3 Exatidão... 87

5.3.5 Robustez... 89

5.4 Preparações semissólidas contendo o extrato seco de S.

trilobata...

92

5.4.1 Preparações semissólidas em base gel... 92

5.4.2 Preparações semissólidas em base gel-creme... 93

5.4.3 Preparações semissólidas em base creme... 93

5.5 Biomonitoramento (atividade anti-inflamatória)... 93

5.6 Desenvolvimento do método analítico para quantificação de AC no creme contendo 1% de extrato seco de S. trilobata... 102 5.7 Validação do método analítico para quantificação de AC no creme contendo 1% de extrato seco de S. trilobata... 105 5.7.1 Seletividade/especificidade... 105 5.7.2 Linearidade... 105 5.7.3 Exatidão... 106 5.7.4 Precisão... 107 5.7.5 Estabilidade das soluções ... 107

6 CONCLUSÕES ...

REFERÊNCIAS

1 INTRODUÇÃO

As plantas que inicialmente foram usadas na sua forma natural, na preparação de chás, unguentos, emplastros e outros, mais tarde, especialmente no início do século XIX, serviram como fonte para obtenção de matéria-prima para a síntese de fármacos. Atualmente, as plantas emergiram como peças chave para o descobrimento de protótipos que servem como base racional para o desenvolvimento de medicamentos (VILEGAS; CARDOSO; QUEVEDO, 2009).

Apesar de ser o detentor de uma diversidade que cataloga cerca de 20% da flora mundial, o Brasil deixa de gerar cerca de US$ 5 bilhões por ano por não conseguir transformar sua flora em medicamentos (FUNARI; FERRO, 2005; MIOTO, 2010). Com mercado considerado promissor, os fitoterápicos representam cerca de 15% do capital da indústria farmacêutica mundial, no qual, cerca de 40% dos medicamentos existentes tem origem direta ou indireta em fontes naturais (NIERO, 2010). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) 80% da população mundial emprega a medicina tradicional, incluindo o uso de plantas medicinais, todavia, transformar este potencial em benesse para saúde requer investimentos e esforços de equipes multidisciplinares (CALIXTO, 2005; CRAGG; NEWMAN, 2012).

O fitoterápico advém de uma transformação da planta medicinal em uma formulação específica, baseada no conhecimento da eficácia e dos riscos do seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2005). São definidos como medicamentos fitoterápicos os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, com eficácia e segurança validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de utilização, documentações tecnocientíficas ou evidências clínicas (BRASIL, 2010a).

Para tal, a escolha da espécie vegetal que será estudada pode valer-se de diversas estratégias. Em regiões com alto grau de diversidade e endemismo a coleta pode ser ao acaso. Podem ser coletadas espécies de gênero com atividade terapêutica conhecida. A escolha pode ocorrer a partir da observação do hábito alimentar de animais ou através da etnofarmacologia, esta última tem representado um potencial maior de acerto (CARLINI et al., 2007).

Além da estratégia de escolha da planta deve-se considerar que existe uma grande necessidade de novos tratamentos para a aplicação terapêutica ou

preventiva, visto que das 2000 doenças agudas e crônicas conhecidas, apenas 30 – 40% são curáveis. As doenças ou síndromes para as quais se buscam novos fármacos, mais eficientes e com menores efeitos colaterais, estão o câncer, doenças infecciosas, cardiovasculares, doenças do sistema nervoso central e inflamatórias (WAGNER, 2012).

Dentre as inúmeras espécies vegetais de interesse medicinal, que se enquadram neste contexto, está a Sphagneticola trilobata (L.) Pruski, uma planta utilizada popularmente para tratar a dor nas costas, cãibras musculares, reumatismo, feridas persistentes, úlceras e inchaços, artrite e dor nas articulações (MALDINI et al., 2009), assim como dores de cabeça, febres e patologias do trato respiratório (MICHALAK, 1997; ROQUE et al., 1987).

A partir dos estudos realizados com a planta envolvendo aspectos fitoquímicos, de cultivo e identificação botânica, de isolamento de marcadores e desenvolvimento das soluções extrativas e do extrato seco, bem como a atividade biológica, a presente pesquisa busca estabelecer uma forma farmacêutica semissólida tópica, contendo o extrato seco padronizado da planta, que reproduza os efeitos farmacológicos já evidenciados nos estudos realizados com o extrato bruto e com alguns de seus marcadores (CEZEPULA, 2006; DE CARLI, 2007; DE CARLI et al., 2009). Bem como, o desenvolvimento e a validação do método de controle de qualidade que demonstre a estabilidade do produto intermediário, o extrato seco, bem como da forma farmacêutica, um semissólido de uso tópico, com o objetivo de se obter um fitoterápico, que atenda a legislação vigente (BRASIL, 2010a).

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Desenvolver medicamento fitoterápico semissólido contendo extrato seco padronizado de Sphagneticola trilobata (L.) Pruski e estabelecer a metodologia para controle de qualidade do mesmo.

2.2 Objetivos Específicos

- Caracterizar o extrato seco padronizado de S. trilobata através de métodos físicos e físico-químicos;

- Validar a metodologia desenvolvida por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para determinação do teor de ácido caurenoico em extrato seco de S. trilobata;

- Realizar estudo de pré-formulação das formas farmacêuticas semissólidas contendo extrato seco padronizado de S. trilobata através de estudos físicos, físico-químicos e farmacológico pré-clínico (atividade anti-inflamatória tópica);

- Desenvolver e validar a metodologia por CLAE para análise quali e quantitativa da apresentação semissólida escolhida.

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Medicamentos fitoterápicos

O registro da prática do uso de plantas com objetivo medicinal é tão antigo quanto à espécie humana (MACIEL; PINTO; VEIGA JR., 2002). Segundo alguns autores, remontam 3000 a.C., na obra Pen T’sao do chinês Shen Nung. Todavia outros afirmam que estes registros são datados por volta de 2600 a.C. em placas de argila oriundas da Mesopotâmia (FELTRIN; CHORILLI, 2010).

Independentemente da forma, o uso popular contribui para a divulgação das virtudes terapêuticas das plantas e assim mantém a prática do consumo das mesmas em todo o mundo (MACIEL; PINTO; VEIGA JR., 2002).

Há décadas a OMS reconhece a importância da utilização de plantas medicinais e seus extratos nos cuidados básicos de saúde, chegando a indicar percentuais de aceitação deste tipo de terapia pela população. A partir deste reconhecimento a OMS vem incentivando a identificação de plantas disponíveis localmente de modo a adicioná-las em listas nacionais de medicamentos (FARNSWORTH, et al. 1985; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2009). Isto devido à pobreza, a falta de acesso aos centros de atendimento hospitalares, obtenção de exames e medicamentos. Por outro lado, a fácil obtenção e tradição de uso, favorecem a utilização de plantas medicinais por estas populações (CALIXTO, 2000; VEIGA JR.; PINTO, 2005). Mas não é somente nos países em desenvolvimento que o uso da fitoterapia torna-se relevante. Em países industrializados, o uso de plantas medicinais constitui cerca de 20% do total de prescrições médicas (FELTRIN; CHORILLI, 2010). A Alemanha, por exemplo, consome metade dos extratos vegetais comercializados em toda a Europa (VEIGA JR.; PINTO, 2005) e atualmente é o maior produtor de medicamentos fitoterápicos no mundo (SCARAMUZZO, 2012).

Este tipo de cultura medicinal desperta o interesse de pesquisadores de múltiplas áreas como a botânica, farmacologia e fitoquímica (MACIEL; PINTO; VEIGA JR., 2002). Na área farmacêutica as plantas e os derivados vegetais são fonte de matéria-prima para obtenção de fármacos, adjuvantes, ou medicamentos fitoterápicos elaborados à base de extratos vegetais, padronizados e com eficácia,

segurança e qualidade comprovados (CALIXTO, 2000; SIMÕES; SCHENKEL, 2002).

O mercado de medicamentos fitoterápicos movimenta globalmente US$ 21,7 bilhões por ano (CARVALHO et al., 2008). Dados de 2002 sugerem que o mercado para terapias à base de plantas medicinais movimentava na Europa e Estados Unidos da América, no ano de 2000, cifras que alcançavam cerca de US$ 8,5 e 6,3 bilhões, respectivamente (SIMÕES; SCHENKEL, 2002). No Brasil, estimavam-se valores em torno de US$ 160 milhões por ano e o ritmo de crescimento nas vendas internas girava na casa dos 15%, contra 4% de evolução nas vendas de medicamentos sintéticos (CARVALHO et al., 2008).

Em 2011, o mercado de fitoterápicos movimentou cerca de R$ 1,1 bilhão no Brasil, aumento de 13% em relação ao ano anterior, comercializando cerca de 45 milhões de unidades. No acumulado dos últimos cinco anos, o segmento de fitoterápicos cresceu 10,5% (SCARAMUZZO, 2012).

O crescimento do mercado nacional de fitoterápicos exigiu estruturação legal no país. Para obter-se o registro de um medicamento fitoterápico, atualmente, se faz necessário cumprir as exigências legais que visam garantir a segurança e eficácia destes produtos (BRASIL, 2010b). Tratar um medicamento fitoterápico de forma semelhante aos medicamentos sintéticos significa enfrentar problemas ligados à própria complexidade de sua composição e à variabilidade na qualidade das drogas vegetais obtidas a partir de uma mesma espécie (KLEIN et al., 2009). Elucidar estes aspectos exprime a necessidade de estudos prévios sob os aspectos botânicos, agronômicos, fitoquímicos, farmacológicos, toxicológicos e de desenvolvimento de metodologias analíticas (CARLINI et al., 2007; TOLEDO et al., 2003).

A regulamentação específica sobre registro de fitoterápicos no Brasil existe desde 1967, porém o marco regulatório mais recente data de abril de 2010. Publicada na forma de Resolução, a RDC 14/2010 estabelece os requisitos para o registro de medicamento fitoterápico. Nesta resolução são apresentados conceitos para droga vegetal, como sendo planta medicinal, ou suas partes, que tem a ou as substâncias com ação terapêutica, após o processo de coleta e estabilização, podendo estar íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada. O derivado vegetal é o produto da extração da planta medicinal ou da droga vegetal. Pode ser extrato seco, tintura, alcoolatura, óleo fixo ou volátil. E medicamento fitoterápico é aquele obtido

com o emprego exclusivo de matérias primas ativas vegetais, com eficácia e segurança comprovados (BRASIL, 2010a).

Sabendo o potencial da biodiversidade local e buscando garantir à população brasileira o acesso seguro e racional às plantas medicinais e fitoterápicos, o governo brasileiro aprovou por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006, a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF). Esta política constitui parte essencial das políticas públicas de saúde, meio ambiente, desenvolvimento econômico e social, capazes de promover melhorias na qualidade de vida da população brasileira (BRASIL, 2006). De acordo com as estratégias governamentais, através de um grupo de trabalho interministerial, foi elaborado o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos que se propõem a aperfeiçoar o marco regulatório relacionado às plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia no SUS. Também estão previstas ações para fomentar a pesquisa de tecnologias e inovações, buscando o desenvolvimento sustentável das cadeias produtivas; fortalecimento da indústria farmacêutica nacional e o uso sustentável da biodiversidade. O Programa também reconhece a importância das práticas populares e tradicionais, e busca promover a inclusão da agricultura familiar nas cadeias e nos arranjos produtivos (BRASIL, 2007).

Atualmente o país conta com cerca de 400 medicamentos fitoterápicos, todavia, a grande maioria advém de plantas exóticas (SCARAMUZZO, 2012). O primeiro fitoterápico com ação anti-inflamatória totalmente nacional foi lançado em 2005. Desenvolvido pelo Laboratório Aché, o investimento foi de aproximadamente R$ 15 milhões para sua pesquisa e desenvolvimento (CECHINEL FILHO; NIERO; YUNES, 2012), e no momento está com seu faturamento na casa dos R$ 22 milhões por ano (SCARAMUZZO, 2012).

Para que outros exemplos possam ser citados, um plano de investimento conjunto entre os órgãos de fomento governamentais e privados foram lançados. Tratam-se de valores na ordem de R$ 88,6 bilhões. Conjuntamente com esta ação percebe-se uma movimentação no intuito de implementar o Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (CECHINEL FILHO; NIERO; YUNES, 2012).

3.1.1 Etapas do desenvolvimento

Conduzir pesquisas a partir da indicação de plantas utilizadas por comunidades pode encurtar o tempo de descobrimento, pois este levantamento etnofarmacológico aumenta a probabilidade da descoberta de novas substâncias bioativas. A descrição do histórico do uso da planta como recurso terapêutico eficaz, pode se traduzir em economia de tempo e dinheiro, dois fatores perseguidos pelas economias ocidentais (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; MACIEL; PINTO; VEIGA JR., 2002).

Após a escolha da planta, a etapa de coleta permite sua identificação, com registro em um museu ou herbário, para que prossigam os estudos botânicos do vegetal e assim possam ser estabelecidas as características que permitirão evitar equívocos durante o controle de qualidade do material vegetal (TOLEDO et al., 2003). Os estudos agronômicos que se seguem objetivam o aumento da biomassa e dos constituintes ativos, sem deixar de preservar a espécie e preocupar-se com a biodiversidade (KLEIN et al., 2009).

A etapa de estudos fitoquímicos compreende o isolamento, a elucidação estrutural e a identificação dos constituintes mais importantes da planta, principalmente, metabólitos secundários, responsáveis ou não pela ação biológica (SONAGLIO et al., 2010; TOLEDO et al., 2003). Embora uma planta possa conter centenas de metabólitos secundários, apenas os compostos presentes em maior concentração são geralmente isolados e estudados pela fitoquímica clássica (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998). Estes estudos fitoquímicos permitem identificar e caracterizar as frações ou substâncias bioativas, conjuntamente com ensaios de atividade biológica (TOLEDO et al., 2003). A Figura 1 ilustra a interdisciplinaridade entre a fitoquímica e a farmacologia, necessária para elucidar os compostos bioativos do material vegetal (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).

Figura 1 - Procedimentos gerais para a obtenção de compostos biologicamente ativos a partir de plantas medicinais.

Fonte: Cechinel Filho e Yunes, 1998.

A avaliação biológica inclui a investigação farmacológica e toxicológica das substâncias isoladas, de frações ou extratos totais obtidos da droga vegetal (SONAGLIO et al., 2010). O objetivo desta sequência de testes é comprovar o efeito que motivou o estudo do novo medicamento e selecionar as ações farmacológicas específicas que devem ser exploradas. Bem como, identificar o farmacógeno ou as substâncias que podem apresentar a atividade farmacológica propriamente dita. Isto permite antecipar os efeitos tóxicos, além de permitir o cálculo da frequência de administração necessária para manter a concentração plasmática em nível terapêutico (LAPA et al., 2010).

Para o desenvolvimento do fitoterápico, o estabelecimento de marcadores químicos é indispensável para padronização do derivado vegetal. Assim como a definição da dose a ser administrada, o monitoramento da estabilidade do produto durante as ações de transformação tecnológicas empregadas na obtenção do medicamento, indicando que, se o marcador estiver presente em quantidade apropriada, os demais componentes estarão igualmente representados. Estes marcadores podem ou não ter ação farmacológica, mas, através destes compostos,

métodos de padronização podem ser desenvolvidos (BRASIL, 2010b; CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; SONAGLIO et al., 2010; TOLEDO et al., 2003).

A agência responsável pelas regulamentações na área da saúde na Europa, o European Medical Agency (EMA), tem publicado normas e critérios a respeito da escolha dos marcadores e de sua determinação em drogas e derivados vegetais. Da mesma forma que na legislação brasileira, os marcadores são empregados para propósitos de controle de qualidade na droga vegetal, no derivado e no fitoterápico, independentemente de serem os responsáveis pelo efeito farmacológico, de modo a monitorar inclusive a estabilidade do produto final. Devido à complexidade da matriz vegetal, os estudos de estabilidade devem ser compostos não somente pelo comportamento de um marcador, mas também do comportamento das demais substâncias presentes sendo recomendado a elaboração de cromatogramas que demonstrem o fingerprint do fitoterápico. O EMA diferencia marcadores analíticos como sendo aqueles utilizados nos procedimentos analíticos, dos marcadores ativos que são aqueles que contribuem para a ação farmacológica. Sempre que conhecidos os marcadores ativos eles devem ser os escolhidos para os procedimentos analíticos de identificação e quantificação (EMA, 2008). Há diferenciação também entre derivados vegetais padronizados, quantificados e outras preparações. Os derivados vegetais padronizados são ajustados para ter um determinado conteúdo aceitável de seu(s) constituinte(s) com atividade terapêutica conhecida. Essa padronização é obtida pela adição de adjuvantes ou pela mistura de lotes de droga vegetal usados no processo de fabricação. Os derivados vegetais quantificados são ajustados para uma faixa de constituintes (marcadores ativos). Nesse caso, o conteúdo de marcador(es) ativo(s) é(são) indicado(s) em uma faixa. Há ainda uma terceira classificação como “outros” que seriam derivados vegetais definidos pelo seu processo de fabricação e especificações. Nestas preparações nem os constituintes com atividade terapêutica conhecida, nem os marcadores ativos são conhecidos (EMA, 2010).

Os métodos analíticos desenvolvidos para análise de matrizes vegetais podem ser classificados como métodos bioanalíticos (ANVISA, 2012) e devem estar validados de acordo com a legislação vigente (BRASIL, 2003) na qual os limites de aceitação para métodos bioanalíticos são mais amplos em relação aos métodos analíticos. Considerando a forma farmacêutica e os excipientes, a metodologia utilizada para o controle de qualidade da droga vegetal e do derivado pode ser

adaptada para a avaliação do fitoterápico (SILVA; COUTO; BRESOLIN, 2012). Os métodos desenvolvidos nesta fase serão utilizados para posterior estudo de estabilidade da formulação e para que se estabeleça um prazo de validade e período de utilização do produto, respeitadas as condições de embalagem e de armazenamento especificadas (BRASIL, 2005).

A etapa farmacêutica está relacionada ao preparo da forma farmacêutica para administração. Desenvolver um fitoterápico padronizado agrega um valor tecnológico à forma farmacêutica contendo plantas medicinais. Esta padronização procura atender aos requisitos de qualidade, reprodutibilidade e estabilidade preconizados para produção de medicamentos, pois estas preparações durante o desenvolvimento do novo medicamento fitoterápico serão utilizadas nos testes pré-clínicos e pré-clínicos (KLEIN et al., 2009; LAPA et al., 2010).

Nos testes pré-clínicos, onde são utilizados apenas animais, buscam-se evidenciar os riscos de intoxicação aguda, crônica, ou ainda dados sobre a embriotoxicidade, fertilidade e capacidade produtiva, carcinogenicidade e mutagenicidade (KLEIN et al., 2009). Para os fitoterápicos de uso tópico são necessários os ensaios de toxicidade aguda, crônica, genotoxicidade, conforme o caso, e ainda sensibilização dérmica, irritação cutânea e ocular (BRASIL, 2010b). Os estudos pré-clínicos sobre a farmacocinética do fitoterápico procura elucidar a relação quantitativa entre o tempo (variável independente) e a concentração (variável dependente), envolvidos nos processos de absorção, distribuição biotransformação e excreção. A farmacodinâmica, também estudada nesta fase pré-clínica, procura informar sobre os efeitos bioquímicos e fisiológicos do fitoterápico e seus possíveis mecanismos de ação. (BRASIL, 2010b). Se bem sucedido nesta fase o fitoterápico será submetido aos ensaios clínicos.

Os testes clínicos, que envolvem seres humanos, são divididos em quatro fases sequenciais, realizadas apenas se existirem indicações de segurança sobre o benefício que superem os riscos de toxicidade. A chamada fase I, realizada com um número reduzido de voluntários sadios, obtém dados sobre farmacodinâmica, farmacocinética, possíveis alterações no local de aplicação, biodisponibilidade e posologia. A fase II, aplicada a pacientes em número reduzido e por curto período de tempo, testa a efetividade e toxicidade do medicamento na patologia para a qual está indicado. Na fase III um maior número de pacientes está envolvido e o tempo de tratamento também é maior. Procura-se determinar a menor dose eficaz e

utilizam-se placebos para avaliações comparativas de eficácia. Estas conclusões estão baseadas em comparações estatísticas. Durante a fase IV, um grande número de pacientes está envolvido para comprovação clínica da indicação terapêutica e da dose anteriormente definidas para o produto. Visa controlar a segurança terapêutica em parcela representativa da população (BRASIL, 2010b; LAPA et al., 2010).

3.2 Sphagneticola trilobata

A planta S. trilobata (L.) Pruski (1996) primeiramente denominada (basônimo) Silphium trilobatum L. (1759), pertence à família Asteraceae e possui dentre as demais sinonímias Acmella brasiliensis e Wedelia paludosa (TROPICOS, 2010). É espécie nativa do Brasil, encontrada crescendo de forma espontânea em regiões litorâneas, especialmente nos estados de Pernambuco, Bahia, Minas Gerais, São Paulo e Santa Catarina (BATISTA et al., 2009; KISSMANN; GROTH, 1992). Segundo informações do Jardim Botânico de Missouri, há uma ocorrência maior de registros da planta em países da América Central (TROPICOS, 2010).

A S. trilobata é conhecida popularmente por pseudo-arnica, margaridão, picão da praia, Vedélia, pingo d’ouro, mal-me-quer-do-brejo, entre outros (BATISTA et al., 2009; BLOCK, 1997; CECHINEL FILHO, 2000; CORRÊA, 1984). No Pacífico, mais precisamente na Austrália, é conhecida popularmente como Singapore daisy (DA SILVA et al., 2012; MEENA et al., 2011) e está adaptada às áreas úmidas, tolerando um certo grau de sombreamento. Cresce de modo a formar um colchão verde e uniforme (Figura 2), apresentando vistosas flores amarelas durante quase todo o ano, dependendo da intensidade da irradiação solar que receber. Produz excelente efeito ornamental (KISSMAN; GROTH, 1992). É utilizada popularmente para combater problemas respiratórios, processos infecciosos, inflamações e dores (CORRÊA, 1984). Como tintura é utilizada para combater hematomas, machucaduras e inflamações em geral (MICHALAK, 1997).

O uso popular refere-se ainda ao emprego da espécie como analgésico, febrífugo, antisséptico, para o tratamento de amenorréia, mordidas, parto, tosse, disenteria, febre, gripe, gastrosis, infecção, nefrose, dor, picada de cobra, ferimentos e dor de dente (DUKE, 2009). Além disso, na medicina popular, S. trilobata é utilizada para tratar dor nas costas, cãibras musculares, reumatismo, feridas persistentes, inchaços e dor nas articulações artríticas (ARVIGO; BALIK, 1993). O

uso da infusão aquosa de S. trilobata em parte do sul do Brasil no manejo da diabetes foi investigada por Kade e colaboradores (2010) em estudos pré-clínicos.

Figura 2: Partes aéreas da Sphagneticola trilobata (L.) Pruski

Fonte: FERREIRA1

Estudos realizados anteriormente com extratos obtidos de todas as partes da planta, indicaram alguns compostos como prováveis responsáveis pelos efeitos versados pelo uso popular. Dentre estes estão o ácido ent-caur-16-en-19-óico (ácido caurenoico, Figura 3a) (ROQUE et al., 1987), identificado através de métodos espectroscópicos usuais em fração hexano do extrato etanólico da planta inteira (raízes e partes aéreas) (BLOCK et al., 1998a), o ácido grandiflorênico (Figura 3c) (BATISTA et al., 2009), assim como o composto 5,7,3’,4’-tetrahidroxi flavona (luteolina, Figura 3b) identificado na fração de diclorometano de extrato etanólico, sendo este isolado pela primeira vez da S. trilobata (BLOCK et al., 1998a).

Figura 3 - Estrutura química a) ácido caurenoico; b) luteolina e c) ácido grandiflorênico

Fonte: b) BLOCK et al.,1998a; a) e c) BATISTA, et al., 2009.

Para avaliar melhor a constituição fitoquímica da S. trilobata, a presença dos compostos acima citados foi pesquisada em extratos produzidos a partir das diversas partes da planta, separadamente. Todos os extratos mostraram a presença

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de esteroides, terpenoides, e compostos fenólicos (flavonoides) e ausência de alcaloides (BLOCK et al., 1998b). Os resultados encontrados sugerem que o ácido caurenoico (AC) está presente em todas as partes da planta, mas é o composto majoritário nas raízes (BLOCK et al., 1998b; BRESCIANI; CECHINEL FILHO; YUNES, 2000), sofrendo variação sazonal e tendo sua concentração aumentada durante o outono (BRESCIANI et al., 2004). A luteolina está presente nas flores e folhas, mas em pequena quantidade e o estigmasterol encontra-se em todas as partes da planta em baixa concentração (BLOCK et al., 1998b).

A análise fitoquímica ainda indicou que as flores produzem diferentes flavonoides, que não são encontrados nas outras partes. Um destes flavonoides foi identificado como a chalcona coreopsina (CHECHINEL FILHO, 2000). Foram identificados dois ácidos caurânicos (ácido tigloiloxicar-16-en-19-óico, e ácido 3α-cinamoiloxicar-16-en-19-óico, Figuras 4a e 4b) (VIEIRA; TAKAHASHI;

BOAVENTURA; 2001); estigmasterol, uma mistura de

3βO-β-D-glicopiranosilsitosterol e 3β-O-β-D-glicopiranosilestigmasterol, uma mistura de três ésteres 3β-O-aciloleanoicos (CARVALHO et al., 2001) e uma nova lactona eudesmanolide, a paludolactona (CECHINEL FILHO et al., 2004) (Figura 4c).

Figura 4 - Estrutura química a) ácido 3α-tigloiloxicar-16-en-19-óico; b) ácido 3α-cinamoiloxicar-16-en-19-óico; c) paludolactona.

Fonte: a) e b) Vieira, Takahashi e Boaventura, 2001; c) Cechinel Filho et al., 2004

Os estudos já realizados para avaliar a atividade farmacológica dos compostos indicaram que a atividade antinociceptiva da planta se deve a compostos polares e apolares. O efeito mais pronunciado foi observado com as frações mais apolares (hexano e diclorometano) de extratos de S. trilobata (BLOCK et al., 1998a). Este aspecto sugere que os responsáveis por esta atividade possam ser compostos como o AC, que é um conhecido diterpeno com diferentes atividades biológicas, tais como

antifúngica (SARTORI et al., 2003), antibacteriana, larvicida, tripanocida e como um potente estimulador das contrações uterinas (BLOCK et al., 1998a).

Bresciani e colaboradores (2004) mostraram que maior concentração de AC está nas raízes e caules durante o outono e os autores sugerem que este componente seja responsável, ao menos em parte, pelo potencial hipoglicemiante desta planta. A atividade anti-inflamatória tópica do AC foi demonstrada por De Carli e colaboradores (2009). Assim como, o composto 5,7,3’,4’-tetrahidroxi flavona (luteolina, Figura 3b) exibe efeitos antioxidantes. Ambos os compostos foram submetidos a modelos de avaliação de atividade antinociceptiva e demonstraram grau significante de inibição para o modelo de contração abdominal induzida por ácido acético (BLOCK et al., 1998a). Choi e colaboradores (2011) demonstraram a resposta do AC em modelos in vitro e in vivo de inflamação. Para os modelos in vitro foram utilizadas linhagens de macrófagos estimulados com LPS (lipopolissacarídeo de membrana de Escherichia coli), e in vivo utilizaram o modelo de edema de pata induzido pela injeção subcutânea de carragenina 1%. Os resultados alcançados sugeriram que o AC poderia ser utilizado contra colites, artrite reumatoide, asma e gastrite.

Outros pesquisadores buscaram demonstrar os efeitos citotóxicos e genotóxicos de compostos presentes na S. trilobata. Foram observados os efeitos do AC sobre a taxa de crescimento embrionário em ovos de ouriço do mar. Nestes ensaios, embriões expostos a doses de 10 μM de AC apresentaram redução na taxa de diferenciação celular. Enquanto que doses na faixa 30 – 300 μM demonstraram efeito destrutivo sobre as células embrionárias. O AC foi aplicado em modelos de células tumorais humanas (células mamárias, de cólon e leucêmicas), cujos resultados demonstraram seu efeito citotóxico e antiproliferativo (COSTA-LOTUFO et al., 2002). Cavalcanti e colaboradores (2006) utilizaram células V79 (fibroblastos de pulmão de cobaia) para avaliar o potencial genotóxico do AC e seus resultados sugerem dose dependência e aumento significativo do dano celular quando o AC está na faixa de concentração de 30 – 60 μg/mL. A presença de AC e ácido grandiflorênico na fração diclorometano do extrato de S. trilobata foram apontados como causadores dos efeitos citotóxicos observados no teste de toxicidade sobre Artemia salina (BATISTA et al., 2009).

Visando o possível desenvolvimento de um novo fitoterápico, Baccarin e colaboradores (2009) realizaram a análise morfoanatômica das partes aéreas da S. trilobata, estabelecendo os critérios para controle de qualidade macro e microscópico da planta. O método analítico utilizado para quantificação de AC no derivado vegetal (extrato mole) foi desenvolvido e validado por Zanella e colaboradores (2006). Empregou-se um método por CLAE, isocrático, com fase móvel composta por acetonitrila:metanol:água acidificada (pH 3,5) com ácido fosfórico (40:45:15), com fluxo de 1 mL/min, utilizando uma coluna C18, mantida a 35 °C. Foi demonstrada a linearidade no intervalo de 10-80 μg/mL com boa sensibilidade e limite de quantificação de 3,8 μg/mL. A exatidão do método foi adequada permitindo recuperações médias de 100,4% de AC, pelo método de adição de padrão nos extratos e de 111,3% em creme de polietilenoglicol contendo 3,0 % de extrato mole de S. trilobata.

Lucinda-Silva e colaboradores (2011) estudaram o manejo e cultivo da S. trilobata de modo a avaliar o perfil químico sazonal. Avaliaram o teor de flavonoides totais por UV e o teor AC, por CLAE, usando método isocrático (ZANELLA et al., 2006) e realizaram ensaios de atividade anti-inflamatória, utilizando o modelo de edema de orelha em camundongos. Puderam concluir que os lotes de S. trilobata cultivados no sol renderam conteúdos mais elevados de flavonoides e de AC, comparado com o cultivo sombreado (uso de sombrite). O verão e outono, com tempo de rebrota de 3 meses, foram as melhores estações para colheita da planta rendendo maior concentração de AC nos extratos.

A otimização e a padronização do processo de obtenção dos extratos de S. trilobata na forma hidroalcoólica foram estudados por Baccarin (2007). Esses extratos moles hidroalcoólicos foram incorporados em formas farmacêuticas semissólidas e sua atividade anti-inflamatória foi confirmada (CZEPULA, 2006). Prevendo a necessidade de um aumento de escala na produção do derivado vegetal, foi desenvolvido o processo de obtenção de extratos secos de S. trilobata (FUCINA et al., 2011) cuja técnica foi posteriormente repassada a empresa Anidro do Brasil Extrações (Botucatu, SP) para a ampliação de escala de produção do derivado vegetal suficiente para as demais etapas do desenvolvimento do fitoterápico. Tais estudos propiciaram o depósito conjunto de uma patente nacional, fruto da parceria entre a UNIVALI e o Laboratório Farmacêutico Elofar (Florianópolis, SC), o qual foi publicado recentemente (CECHINEL et al., 2011).

3.3 Aplicação tópica

A aplicação de substâncias medicinais na pele é um conceito tão antigo quanto a humanidade. Registros do Egito antigo e Galeno na Roma antiga, por exemplo, descrevem vários desses tratamentos e alguns daqueles que seriam os precursores dos modernos cremes cosméticos (BLOCK, 2004).

Considerada o órgão mais extenso do corpo, anatomicamente, a pele pode ser descrita como um órgão estratificado com três diferentes camadas de tecido, sendo a epiderme, a derme e a camada subcutânea de gordura. A epiderme é a camada mais externa e comporta-se como uma membrana coesa e rígida, pois abrange as células epiteliais escamosas estratificadas. A derme é feita de tecido frouxo e contém glândulas exócrinas, vasos sanguíneos, músculos e extremidades nervosas. Já a hipoderme, camada mais interna, contém tecido adiposo, os principais vasos sanguíneos e os nervos que estendem suas ramificações para a derme (BLOCK, 2004; SILVERTHORN, 2003).

Os fármacos aplicados topicamente podem objetivar o efeito local na superfície da pele, como os agentes antissépticos, antifúngicos e anti-inflamatórios. Também podem pretender um efeito mais profundo exigindo uma penetração na epiderme e derme. Ou ainda um efeito sistêmico, resultante da aplicação de quantidade suficiente de fármaco para permear através da epiderme e da derme até os vasos sanguíneos a fim de alcançar concentrações terapêuticas sistêmicas, por exemplo, os adesivos transdérmicos (BLOCK, 2004; SILVERTHORN, 2003; YORK, 2005). Segundo Allen Jr., Popovich e Ansel (2007) é importante diferenciar quando as preparações tópicas têm efeito local para tratar alterações dérmicas e a pele é o órgão alvo, e quando o que se deseja é a liberação do fármaco através da pele, para efeito sistêmico, sendo que, neste caso, a pele deixa de ser o órgão alvo.

A absorção percutânea resulta da passagem direta, passiva, através do estrato córneo que é uma das camadas que compõem a epiderme. O estrato córneo é formado por células achatadas, parcialmente dessecadas que formam uma camada com 10 a 15 µm de espessura. A velocidade desta passagem é limitada pelas resistências disfuncionais encontradas. O mecanismo de permeação do fármaco através da pele íntegra de seres humanos envolve a via intercelular ou transcelular no estrato córneo e, em geral, os compostos lipofílicos são transferidos

para a fase intercelular lipoide de estrato córneo, enquanto que compostos hidrofílicos são transferidos para o domínio intracelular do estrato córneo (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2007; BLOCK, 2004).

O principal objetivo do desenvolvimento de formas farmacêuticas é obter uma resposta terapêutica conhecida em relação a um fármaco incorporado em uma formulação, que pode ser preparada em ampla escala, com qualidade reprodutível (YORK, 2005). As formas farmacêuticas permitem a obtenção da dose exata de fármaco de modo seguro e proporcionam maior estabilidade para o fármaco por meio dos excipientes e adjuvantes empregados (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2007).

Ao delinear uma formulação para a aplicação tópica de um fármaco, muitos fatores devem ser considerados. O formulador deve preocupar-se em obter uma composição na qual o fármaco seja estável, não irrite ou sensibilize o local da aplicação. Isto é, uma preparação que seja segura, que tenha estabilidade e eficácia preservativa efetiva, combinadas com a distribuição otimizada do fármaco na formulação total (BLOCK, 2004). A base de uso tópico mais adequada para receber um fármaco é determinada individualmente, dependendo de características do próprio fármaco ou da intenção de aplicação, de modo a favorecer a velocidade de liberação e texturas ideais. De modo geral, para a aplicação tópica têm-se sistemas semissólidos chamados pomadas, cremes, loções, géis e pastas, ou ainda pós secos, aerossóis e soluções (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2007). A escolha da base no desenvolvimento de fitoterápicos semissólidos é fundamental para promover a penetração dos ativos na pele, bem como garantir a estabilidade e segurança do medicamento. Isto deve ser levado em consideração também no momento da escolha do tipo de extrato que será incorporado à base escolhida (SILVA; COUTO; BRESOLIN, 2012).

Os sistemas semissólidos de interesse diferem em sua constituição sendo as pomadas constituídas de fase única, na qual se pode dispersar sólidos e líquidos. Elas podem ser hidrofóbicas, de absorção, ter bases removíveis com água ou serem hidrossolúveis. Os cremes por sua vez são sistemas multifásicos, constituídos de uma fase lipófila e outra aquosa. A composição de sua fase externa determina se são sistemas água em óleo, ou óleo em água. Géis, no entanto, são preparações formadas por líquidos gelificados por agentes apropriados e pastas são preparações

semissólidas com alta quantidade de sólidos dispersos em sua base (ALLEN JR; POPOVICH; ANSEL, 2007; HERRÁEZ; CASTELLANO, 2001).

O interesse do mercado nacional por novos medicamentos e inovação tem intensificado a busca por formas farmacêuticas fitoterápicas, incluindo as de uso tópico. Dentre os fitoterápicos com aplicação tópica são citados na literatura géis contendo Aloe barbadensis para o tratamento da acne, Calendula officinalis em formulações de gel e pomada para tratar processos inflamatórios e cicatrização (MACHADO et al., 2010; ROVERONI-FAVARETTO; LODI; ALMEIDA, 2009). Encontram-se géis e cremes com Curcuma longa ou com Hamamelis virginiana para tratar prurido, dermatite, inflamação e acne; Cordea verbenacea para inflamações (SILVA; COUTO; BRESOLIN, 2012). Ainda, Sechium edule em géis sendo testado para atividade antibacteriana e antifúngica (ORDÕNEZ et al., 2009) e Symphytum officinale em cremes para o tratamento de osteoartrite (SMITH; JACOBSON, 2011). Independentemente da forma farmacêutica testada há sempre uma preocupação com o controle de qualidade e a garantia de segurança e eficácia dos fitoterápicos pretendidos (SILVA; COUTO; BRESOLIN, 2012).

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Materiais

4.1.1 Reagentes, soluções e matérias primas

- Acetato de etila PA (Quimex); - Acetona PA (Quimex, lote 31547);

- Acetonitrila grau HPLC (Tedia e J.T. Baker); - Ácido acético glacial PA (Vetec);

- Ácido clorídrico PA (Vetec); - Ácido fosfórico PA (Lafan); - Ácido sulfúrico (Vetec);

- Álcool cetoestearílico 30/70 (fabricante: Sasol Germany, lote: 09222 e 10181); - Álcool estearílico (ALKONAT 1898P®, fabricante: Oxiteno, lote: 081205C00135); - Álcool metílico grau HPLC (Tedia)

- Aminometilpropanol (AMP ULTRA PC2000®, fabricante: Angus Chemical Company, lote: YC024801Z1);

- Base autoemulsionante aniônica (Lanette N®, fabricante: COGNIS, lote: CD83210002);

- Base autoemulsionante não iônica (Polawax®, fabricante: CRODA, lote: 0000406235);

- Butilparabeno, etilparabeno, metilparabeno, fenoxietanol, propilparabeno (Chemynol®, fabricante: Chemyunion, lote: CN128-0608 );

- Butilidroxitolueno (BHT, fabricante: Sterlitamak Petrochemical, lote: 55); - Carbômer (Carbopol Ultrez21®, fabricante: Lubrizol, lote: 0100765053); - Cera branca de abelha (fabricante: Koster Keunen Holland BV, lote: 4952); - Citrato de sódio di-hidratado (fabricante: Cargil; lote: FUCST7010A);

- Dexametasona grau farmacêutico (Galena) - Diclorometano grau HPLC (Tedia);

- Edetato dissódico (fabricante: Akzo Nobel, lote: 58712L2081); - Éter dietílico PA (Merck, lote: K38215321);

- Glicerol (fabricante: RAZZO, lote: 423); - Hexano PA (Vetec);

- Hidróxido de sódio (fabricante: Vetec; lote: 0905727);

- Metilparabeno (fabricante: UENO Fine Chemicals, lote: IB0311); - Miristato de isopropila (Fabricante: Dhaymers; lote: 8860);

- Monooleato de glicerila (DHAYTAN GMO-M®, fabricante: Dhaymers, lote: 9216); - Oleato de decila (CETIOL® V PH, fabricante: COGNIS, lote: CE92040016); - Oleato de isodecila (DHAYTAN ID, fabricante: Dhaymers, lote: 8974); - Óleo de cróton (Sigma Aldrich, lote: 065K1429);

- Peróxido de hidrogênio 30% (Dinâmica);

- Petrolato líquido (fabricante: FAVAB, lote: F-090406);

- Polyoxyl 6 cetoestearyl ether (Cremophor A6®, fabricante: BASF; lote: 07025475L0);

- Polyoxyl 21 cetoestearyl ether ou Steareth21 (Licopol S-21®, fabricante: LIPO CHEMICALS INC, lote: P-2363D08);

- Polyoxyl 20 cetyl ether ou Ceteth-20 (Licopol C20®, fabricante: LIPO CHEMICALS, lote: P-1855H09);

- Polyoxyl 40 hydrogenated castor oil (Cremophor HR40®, fabricante: BASF, lote: 07279347G0);

- Propilenoglicol (fabricante: Dow Brasil, lote: 232556);

- Propilparabeno (fabricante: UENO Fine Chemicals, lote: HF2511);

- Triglicerídeos dos ácidos cáprico e caprílico – Caprylic/capric Triglyceride (CRODAMOL® GTCC, fabricante: CRODA, lote: 000044670)

4.1.2 Equipamentos e acessórios

- Agitador mecânico (Fisaton®, mod. 712); - Agitador vibratório (Bertel®);

- Balança analítica (CELTAC®, mod. FA2104N);

- Balança eletrônica analítica (Toledo®, mod. ARD110); - Balança de Infravermelho (Mettler Toledo®, mod. HB43); - Balança ultra-micro analítica (Shimadzu®, mod. AUW220D); - Câmara de Fotoestabilidade (Mecalor, modelo EC/0,2/AR-F); - Centrífuga (Nova Técnica®, mod. NT812);

- Coluna cromatográfica (Phenomenex®, mod.LUNA C18 250 mm x 4,6 mm, empacotada com octadecilsilano, quimicamente ligado à sílica porosa de 5 µm de diâmetro);

- Compactador (Erweka®, mod. SVM 12);

- Cromatógrafo líquido de alta eficiência Agilent® HPLC1200 series, equipado com detector Agilent G1315D, forno Agilent G1330B, sistema de bomba Agilent G1311A, software Chemstation CS, sistema de injeção automático (looping 100 μL).

- Cromatógrafo líquido de alta eficiência Proeminence (LC-20AT), acoplado a

detector de arranjo de diodos SHIMADZU DAD SPD-M20A; auto injetor SHIMADZU SIL-20AHT, degaseificador in line SHIMADZU DGU-20A5, comunicador SHIMADZU CBM-20A e forno de coluna SHIMADZU CTO-10AS VP;

-Estufa (Nova Ética®, mod. 420-1D);

- Filtro de membrana PTFE modificado, com tamanho de poro de 0,45 μm (Millex® ) - Geladeira (TECNAL®, mod. TE391);

- Micrômetro digital (Mitutoyo®, modelo APB-2D);

- Peneiras com abertura de 250 μm; 180 μm; 125 μm; 75 μm; 53 μm; 38 μm; 20 μm (Bertel®);

- pHmetro (GEHAKA®, mod. PG1800);

- Placa cromatográfica de sílica gel (Merck®); - Pré-coluna cromatográfica (C18 4,0 x 3,0 mm).

4.1.3 Derivado vegetal

Foram utilizados lotes de extrato seco por spray drying, produzidos pela empresa Anidro do Brasil Extrações Ltda (Botucatu-SP), a partir de lotes de planta cultivadas no Horto Medicinal do campus da Universidade do Vale do Itajaí (Itajaí, SC). As partes aéreas das plantas foram coletadas, secas em estufa de ar circulante a 35 °C, acondicionadas em sacos de plásticos com revestimento de papel e encaminhadas para obtenção do extrato seco. Uma exsicata foi depositada no Herbarium Barbosa Rodrigues, no município de Itajaí, sob código V.C. Filho, 002 e outra no Herbarium da Universidade Estadual de Maringá (HUEM-24139).

Cada lote de extrato foi produzido a partir de cerca de15 kg de planta seca, que foi moída (tamis 2 mm) e submetida à maceração dinâmica com etanol-água 60:40 (v/v), com relação planta:solvente de 10% (m/v), com agitação por 8 h na