1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
FACULDADE DE FARMÁCIA
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Farmacêutica
Produto Técnico N°02 /2019
Este RELATÓRIO TÉCNICO, PRODUTO TÉCNICO foi gerado a partir da dissertação Desenvolvimento e estudo de estabilidade de solução oral magistral de L-carnitina para tratamento de doenças metabólicas, sem restrição de publicação da aluna Mayra Leal Chrisóstomo Bodart, do Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Farmacêutica – Faculdade de Farmácia da UFRJ – CTECFAR-FF-UFRJ.
Orientadora: Profa. Dra. Elisabete Pereira dos Santos Coorientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Vazquez Villa
Rio de Janeiro Abril/2019
2 Título. Desenvolvimento de solução oral magistral de L-carnitina para tratamento de doenças metabólicas
Tipo de Produto Técnico. Relatório Técnico Conclusivo.
Finalidade. Este relatório tem por finalidade desenvolver e caracterizar formulações orais líquidas de L-carnitina que atendam às necessidades dos pacientes que apresentam distúrbios genéticos que levam a falhas enzimáticas causando interrupção de vias metabólicas, o que pode comprometer diversos processos celulares, descritos como erros inatos do metabolismo (EIM).
Impacto econômico ou social. O desenvolvimento de uma formulação oral líquida de L-carnitina será importante para a Farmácia Universitária da Universidade Federal do Rio de Janeiro dispensar para pacientes provenientes do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG) e de outros centros de saúde, que apresentam patologias associadas a EIM.
UFRJ. Abril de 2019.
Autores:
Empresa:
Nome: Farmácia Universitária da UFRJ
Endereço: Av. Carlos Chagas Filho, 373 – Ilha do Fundão - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ
Mayra Leal Chrisóstomo Bodart – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Farmacêutica (CTECFAR/UFRJ) / Farmácia Universitária da UFRJ
Eduardo Ricci Junior – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Farmacêutica (CTECFAR/UFRJ)
Mariana Sato de Souza de Bustamante Monteiro – Professora do Departamento de Fármacos e Medicamentos (DEFARMED) – Faculdade de Farmácia da UFRJ
Ana Lúcia Vazquez Villa – Professora do Departamento de Fármacos e Medicamentos (DEFARMED) – Faculdade de Farmácia da UFRJ
Elisabete Pereira dos Santos – Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia Farmacêutica (CTECFAR/UFRJ)
3 RESUMO
Erros inatos do metabolismo (EIM) são distúrbios genéticos que levam a falhas enzimáticas causando interrupção de vias metabólicas, o que pode comprometer diversos processos celulares. O rápido diagnóstico e tratamento das patologias associadas aos EIM evitam danos irreversíveis neurológicos e cognitivos, fornecendo uma melhor qualidade de vida aos pacientes. A administração de L-carnitina é amplamente utilizada nesse perfil de tratamento e no Brasil, apenas suplementos voltados para o público esportivo podem ser encontrados sob a fórmula líquida, não existindo formulação medicamentosa de L-carnitina voltada para o público alvo. Na Farmácia Universitária, é usualmente dispensada sob a forma de sachê, porém apresenta alta higroscopicidade o que dificulta sua pesagem e manipulação. A necessidade de multidoses diárias a pacientes pediátricos e com problemas cognitivos evidenciou a necessidade do desenvolvimento de uma solução magistral de L-carnitina.
Todavia, a escolha dos excipientes a serem utilizados para esse público alvo, que apresenta uma série de restrições e alterações metabólicas, se torna um desafio e, além disso, a L-carnitina é um excelente substrato para microrganismos, apresentando problemas em sua estabilidade. Diante disso, esse trabalho teve como objetivo desenvolver uma formulação líquida oral de L-Carnitina, com excipientes que atendam ao público alvo garantindo boa estabilidade físicoquímica e microbiológica.
Foram desenvolvidas oito formulações com duas concentrações de L-carnitina (10 e 20%) e diferentes combinações de agentes de viscosidade, acidulante e conservantes. Todas as formulações apresentaram boas características físico-químicas, mas apenas a formulação 3 apresentou estabilidade microbiológica durante o tempo proposto para validade quando mantida em temperatura ambiente.
Dessa forma, essa foi a formulação indicada para comercialização e dispensação aos pacientes da Farmácia Universitária (FU).
Palavras-chave: Carnitina. Formulação líquida. Erro inato de metabolismo.
4 1 Introdução
Os erros inatos do metabolismo (EIM) são distúrbios de natureza genética que representam uma importante causa de morbidade e mortalidade entre a população pediátrica (SHAWKY; ABD- ELKHALEK; ELAKHDAR, 2015). Resultam em anormalidades na síntese de proteínas, normalmente enzimas, alterando suas principais funções. Tal alteração pode levar a bloqueio de uma determinada via metabólica com consequente acúmulo de substratos e derivados, bem como a diminuição da síntese do produto esperado. Dependendo da rota afetada, esse bloqueio repercute de maneira clínica variável, sendo geralmente grave e muitas vezes letal (SCRIVER et al., 2002).
Embora sejam individualmente raros, eles possuem uma incidência, em conjunto, estimada em 1/1.000 nascidos vivos (ARAÚJO, 2004). Em muitos casos, as crianças parecem perfeitamente normais ao nascimento e podem demorar a apresentar manifestações clínicas. O rápido diagnóstico é essencial para impedir o agravamento e a irreversibilidade dos sintomas, podendo representar a sobrevivência do paciente em alguns casos (JARDIM; ASHTON-PROLLA, 1996). Mas, a variabilidade de sintomas clínicos, o enorme número de doenças de grande complexidade e o fato de serem considerados extremamente raros pela maioria dos profissionais podem dificultar o correto diagnóstico clínico (EL HUSNY; CALDATO, 2006).
Exemplos de patologias associadas a EIM e que possuem alta incidência, as aminoacidopatias e acidemias orgânicas são ocasionadas por deficiência severa da atividade de enzimas específicas de determinadas vias metabólicas, podendo levar ao acúmulo de substratos que, em concentrações mais elevadas que o normal, se tornam tóxicas. Elas apresentam grande impacto no sistema gastrointestinal e nervoso, podendo apresentar manifestações como: vômito, recusa alimentar, apneia, convulsão, coma, lesão cerebral e retardo mental e cognitivo (BEHRMAN, K, 2014; DEODATO et al., 2006a;
GARCÍA et al., 2002a; NADAI; PINHEIRO, 2006).
Figura 1. Estrutura da L-carnitina.
Para a maioria das aminoacidopatias e acidemias, o tratamento é feito a partir de restrição alimentar, administração de cofatores das enzimas deficientes e, principalmente, com a suplementação de L-carnitina (Figura 1). Esta substância é capaz de se conjugar e aumentar a
5 excreção dos ácidos orgânicos acumulados nessas doenças, evitando as indesejáveis manifestações clínicas ou retardando o progresso da doença (BERRY, 1998). Sendo o público alvo composto em sua grande maioria por pacientes pediátricos e, por muitas vezes, com dificuldades de deglutição, a forma farmacêutica mais indicada é a líquida. As soluções de uso oral podem ser administradas a pacientes de diferentes idades e com diferentes necessidades, conferindo maior flexibilidade na administração da dosagem correta (NUNN; WILLIAMS, 2005).
O desenvolvimento de formulações orais líquidas possui vários fatores críticos e requer cuidados para garantia da segurança e qualidade do produto. Essas preparações apresentam, em sua maioria, alto teor de água, o que pode propiciar a degradação físico-química e contaminação microbiológica (BILLANY, 2005; LACHMAN; LIEBERMAN; KANING, 2001). Além disso, a L- carnitina apresenta estrutura semelhante a de aminoácidos e pode ser utilizada por bactérias como fonte de carbono, nitrogênio e de energia, favorecendo também o crescimento microbiano (MEADOWS & WARGO, 2015).
Para isso, substâncias inertes denominadas excipientes podem auxiliar no desenvolvimento de soluções mais estáveis, eficazes e atraentes. Mas diferentes estudos apontam algumas dessas substâncias consideradas inertes como sendo responsáveis por reações adversas relacionadas a medicamentos. Além disso, pacientes com EIM apresentam uma série de restrições e, desta forma, a escolha dos excipientes da formulação não pode ser realizada ao acaso e deve ser feita de maneira criteriosa sendo o mais simples possível, no intuito de diminuir a probabilidade de reações não esperadas, mas garantindo a qualidade e estabilidade da formulação (ANSEL; POPOVICH; ALLEN JUNIOR, 2000; GUERRA, 2012).
A Farmácia Universitária da Universidade Federal do Rio de Janeiro (FU-UFRJ) recebe diariamente muitos pacientes provenientes do Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG) (e de outros centros de saúde), que apresentam patologias associadas a EIM. Eles, em sua grande maioria, fazem uso de suplementação de L-carnitina que, atualmente, não possui formulação oral líquida medicamentosa disponível no mercado brasileiro. Desta maneira, o presente trabalho buscou desenvolver e caracterizar formulações orais líquidas de L-carnitina que atendam às necessidades dos pacientes.
2 Material e Métodos 2.1 Material
As matérias-primas utilizadas foram: L-carnitina, com teor de 100,11% (Infinity Pharma);
ácido cítrico (Infinity Pharma); benzoato de sódio, com teor de 98,92% (Farmos);
Carboximetilcelulose (Farmos); metilparabeno (Farmos).
6 As análises microbiológicas foram realizadas em parceria com o Laboratório de Controle Microbiológico de Medicamentos, Alimentos e Cosméticos (LACMAC).
2.2 Desenvolvimento das formulações
Foram manipuladas diferentes formulações de L-carnitina a 10% e 20%. A técnica de preparo envolveu a dissolução da L-carnitina em veículo aquoso (água destilada), seguida da adição do agente conservante. Após total dissolução dos componentes, completou-se o volume final com o veículo e filtrou-se a formulação em papel de filtro. Após essas etapas, as soluções foram levadas ao agitador mecânico acoplado com haste em hélice e polvilhou-se o agente de viscosidade, mantendo sempre agitação constante e intensa até total incorporação nas formulações. Para ajuste do pH, foi adicionada quantidade suficiente de solução de ácido cítrico 50% até o pH indicado de cada formulação (essa etapa contou com o auxílio do potenciômetro). Antes do envase, realizou-se a conferência do volume final. Foram manipuladas 3 diferentes formulações.
As soluções foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar de 60 mL, com tampa branca de rosca e batoque e volume suficiente para preencher dois terços da capacidade do frasco e mantidas em temperatura ambiente. Antes do envase, os frascos foram lavados, higienizados com álcool 70%
(p/p) e secos (BRASIL, 2007).
2.3 Avaliação das formulações desenvolvidas
Aspectos organolépticos
Após prévia agitação da solução, observou-se cor, homogeneidade, turvação e presença de precipitado. Para determinação do odor, foram realizados movimentos circulares com a solução, próximo ao nariz, para avaliação olfativa (BRASIL, 2010; PRISTA; ALVES; MORGADO, 2003).
Determinação do pH
As determinações potenciométricas do pH foram realizadas no potenciômetro digital marca Meter modelo 922, previamente calibrado com as soluções tampão padrões. A determinação do pH foi efetuada diretamente na amostra, procedendo-se três leituras consecutivas e obtendo-se como resultado a média das leituras (BRASIL, 2010). A amostra de formulação oral de L-carnitina deve apresentar pH entre 4 e 6 (USP, 2016).
7 Avaliação microbiológica
Higienizou-se a parte externa do frasco a ser analisado com álcool 70%. Em fluxo laminar, transferiu-se 10 mL da amostra para 90 mL de solução de diluição (tampão fosfato - pH 7,2) e ajustou- se o pH da solução final para 7 com HCl 0,1 M ou NaOH 0,1 M (Solução 1:10). Repetiu-se o procedimento, transferindo 10 mL da solução recém-preparada para 90 mL de solução de diluição, fazendo o ajuste necessário para manter o pH final em 7 (solução 1:102). Repetiu-se o procedimento para obter a solução 1:10³. Esses meios foram mantidos por 24 horas para fortificação. Após esse período, transferiu-se 0,1 mL das soluções preparadas para placas de Petri contendo 15 mL de meio de cultura adequado para cada análise (Tabela 1).
Tabela 1. Discriminação do meio de cultura usado para cada teste microbiológico Teste Meio de Cultura Temperatura (ºC) Tempo
CTBA A. caseína-soja 32,5 ± 2,5° 7 dias
Fungos A. Sabouraud-dextrose 22,5º ± 2,5° 5 a 7 dias
E.coli C. MacConkey 32,5º ± 2,5° 18 a 72h
Legenda: CTBA – Contagem total de bactérias aeróbicas, E.coli – Patógeno específico Escherichia coli; A. – Ágar; C. – Caldo.
Incubou-se as placas conforme temperatura e período indicado para cada análise. Tomou-se a média aritmética das placas de cada meio e calculou-se o número de UFC/mL (Unidade Formadora de Colônia por mililitro) do produto. As analises foram realizadas no dia da manipulação, após 15 e 45 dias. Para controle de bactérias, a especificação determina que o resultado seja menor do que 100 UFC/mL e para o teste de fungos e leveduras os resultados devem ser inferiores a 10 UFC\mL (BRASIL, 2010).
2.4 Tratamento estatístico
A análise estatística foi realizada empregando o software Excel®, para Windows. Aplicou-se o teste estatístico ANOVA de análise de variância, com significância estatística determinada para 95% (p = 0,05).
8 3 Resultados e Discussão
3.1 Desenvolvimento das formulações
A escolha dos excipientes se tornou um desafio por conta da série de restrições e alterações metabólicas do público-alvo, sendo o mais indicado a utilização da menor quantidade possível de excipientes. Para desenvolvimento da formulação foi proposta a utilização do ativo, conservante, agente de viscosidade e acidulante.
Como agente conservante, selecionou-se o metilparabeno por apresentar melhor aceitação no mercado farmacêutico e largo espectro de ação. Mas além de apresentar baixa solubilidade em meios aquosos, numerosos casos de reações adversas foram associados à sua utilização e é considerado um excipiente de risco quando utilizado em soluções orais (SILVA et al., 2008). Outro agente conservante selecionado foi o benzoato de sódio, que apresenta boa solubilidade em água à temperatura ambiente (25°C), Porém, sua efetividade é potencializada em meio ácido, na faixa de pH de 2 a 5. Embora seja considerado seguro quando usado em concentrações inferiores a 0,6%, também é apontado como excipiente relacionado a reações adversas (VILAPLANA & ROMAGUERA, 2004).
Muitos pacientes portadores de EIM apresentam dificuldades de deglutição, principalmente quando as soluções possuem baixa viscosidade. Além disso, alguns pacientes com EIM possuem sondas de gastrostomia, sendo necessária a administração do medicamento pela sonda. O aumento da viscosidade da formulação ajuda na administração da solução em ambos os casos. Dessa forma, com a finalidade de proporcionar um leve aumento da viscosidade da formulação, foi utilizado carboximetilcelulose como agente promotor de viscosidade (BILLANY, 2005).
Para determinação da concentração de L-carnitina a ser utilizada no desenvolvimento da formulação, levou-se em consideração o fato da formulação ser de uso contínuo, ter a dose calculada a partir do peso corporal do paciente e que constantemente sofre ajustes. A concentração do ativo foi definida para ser flexível e atender às diferentes dosagens apresentadas pelos pacientes. Com o objetivo de fornecer uma concentração que atenda à maioria das prescrições recebidas na Farmácia Universitária, foram desenvolvidas formulações de L-carnitina a 10% (p/v) e 20% (p/v), podendo atender pacientes pediátricos, que necessitam de volumes menores, e pacientes adultos, que necessitam de grandes volumes.
Dessa forma, foram desenvolvidas três formulações de L-carnitina a 10% (p\p) com composição descrita na Tabela 2.
9 Tabela 2. Formulações desenvolvidas.
Composição F.1 F.2 F.3
L-carnitina 10% 10% 10%
Conservante MP 0,1% BS 0,3% BS 0,3%
Ácido cítrico 0,2% 0,4% 0,7%
Agente de viscosidade
CMC 0,3%
CMC 0,3% CMC 0,3%
Veículo Água qsp Água qsp Água qsp
Legenda: F.1- Formulação 1; F.2 - Formulação 2; F.3 - Formulação 3; MP - Metilparabeno; BS - Benzoato de sódio, CMC – Carboximetilcelulose, qsp – quantidade suficiente para.
3.2 Caracterização das formulações
Avaliação das características organolépticas
O resultado da avaliação das características físico-químicas da formulação (avaliação da cor, homogeneidade, turvação e presença de precipitado) pode ser visualizado na tabela abaixo (Tabela 3):
Tabela 3. Aspectos organolépticos das formulações desenvolvidas
Formulação Aspecto Odor
1 Límpidas, incolores, sem a presença de partículas e sem
grumos.
Aroma quase imperceptível, agradável.
2 3
Determinação do pH
Na Tabela 4 estão apresentados os resultados de pH das formulações desenvolvidas.
10 Tabela 4. Determinação do valor de pH.
Formulação pH
1 5,82 ± 0,01
2 5,52 ± 0,03
3 5,05 ± 0,02
Todas as formulações apresentaram resultados dentro da especificação para solução oral de L-carnitina que é de 4,0 a 6,0 (USP, 2016).
Controle microbiológico
Após análise inicial, observou-se que todas as formulações apresentavam boa compatibilidade farmacotécnica e as mesmas foram encaminhadas para análise microbiológica.
Foram feitas análises iniciais (no mesmo dia da manipulação) e após 45 dias. Os resultados microbiológicos estão apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Resultados microbiológicos.
FORMULAÇÃO 1
Tempo 0 15 45 Especificação
CTBA <10² Fora Fora <10² UFC\mL
Fungos <10 <10 <10 <10¹ UFC\mL
E. coli Ausente Ausente Ausente Ausente
FORMULAÇÃO 2
Tempo 0 15 45 Especificação
CTBA <10² <10² Fora <10² UFC\mL
Fungos <10 <10 <10 <10¹ UFC\mL
E. coli Ausente Ausente Ausente Ausente
FORMULAÇÃO 3
Tempo 0 15 45 Especificação
CTBA <10² <10² <10² <10² UFC\mL
Fungos <10 <10 <10 <10¹ UFC\mL
E. coli Ausente Ausente Ausente Ausente
Legenda: CTBA – Contagem total de bactérias aeróbicas, E.coli – Escherichia coli.
11 A L-carnitina é um excelente substrato para microrganismos, dessa forma diferentes agentes conservantes em diferentes concentrações foram avaliados. Pode-se observar que apenas a Formulação 3 apresentou estabilidade microbiológica durante o período proposto. A Formulação 2 apresentou boa estabilidade por pelo menos 15 dias após sua manipulação, e a Formulação 1 não conseguiu garantir a estabilidade microbiológica nem por 15 dias. Pode-se observar que esses resultados, quando correlacionados aos valores obtidos de pH, indicam que quanto mais baixo o valor do pH, maior é o tempo de conservação microbiológica da formulação. Mesmo sendo uma pequena variação de pH, foi o suficiente para acidificar a formulação e potencializar seu sistema conservante.
Dessa maneira o correto ajuste no pH 5,0 é importante para a estabilidade da formulação.
4 Conclusão
A partir do perfil de pacientes que a FU-UFRJ apresenta, foi identificada a necessidade do desenvolvimento de uma formulação oral de L-Carnitina. A partir das doses usuais para o público- alvo, foram determinadas as concentrações das formulações desenvolvidas. Todas as formulações apresentaram boas características físico-químicas, mas apenas a formulação 3 apresentou estabilidade microbiológica durante o tempo proposto para validade quando mantida em temperatura ambiente.
Dessa forma, essa foi a formulação indicada para comercialização e dispensação aos pacientes da FU- UFRJ.
5 Referências Bibliográficas
ANSEL, H. C.; POPOVICH, N. G.; ALLEN JUNIOR, L. V. Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems. 10. ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Health, 2014.
ARAÚJO, A. P. DE Q. C. Doenças metabólicas com manifestações psiquiátricas. Rev. Psiq. Clín., Rio de Janeiro, v. 31, n. 6, p. 285–289, 2004.
BEHRMAN, R.E.; KLIEGMAN, R.M.;JENSON, H.B.Tratado de pediatria de Nelson. 19ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, v. 1, p. 1–3033, 2014.
BERRY, G.T. Inborn errors of amino acid and organic acid metabolism. Principles of Perinatal - Neonatal Metabolism, New York: Springer, v. 2 p.799, 1998.
BILLANY, M. Soluções. Em: Delineamento de formas farmacêuticas. Porto Alegre, RS: Artmed, 2005, p. 318–329.
BRASIL. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 67, de 08 de outubro de 2007. Dispõe sobre Boas Práticas de Manipulação de Preparações Magistrais e Oficinais
12 para Uso Humano em farmácias. Diário Oficial da República Federativa do Brasil, Poder Executivo, Brasília, DF, 08 outubro de 2007.
BRASIL. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopeia Brasileira. 5.ed., 2010.
DEODATO, F. et al. Methylmalonic and Propionic Aciduria FEDERICA. American Journal of Medical Genetics Part C Semin Med Genet, v. 142C, n. 2, p. 104–112, 2006a.
EL HUSNY, A. S.; CALDATO, M. C. F. Erros Inatos do Metabolismo: Revisão de Literatura.
Revista Paraense de Medicina, v. 20, n. 2, p. 41–45, 2006.
GARCÍA, E. G. et al. Artículos originales Caracterización molecular de fenilcetonúricos. Revista Cubana de Pediatría, v. 75, n. 2, p. 101–5, 2002.
GUERRA, M.P.S.B. Desenvolvimento e estudo da estabilidade de uma formulação líquida oral de amiodarona. 2012. Dissertação (Mestrado em Farmacotecnica Avançada) - Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa, Lisboa, 2012.
JARDIM, L. B.; ASHTON-PROLLA, P. Erros inatos do metabolismo em crianças e recém-nascidos agudamente enfermos : guia para o seu diagnóstico e manejo. Jornal de Pediatria, v. 72, p. 63–70, 1996.
LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H. A.; KANING, J. L. Líquidos. In: Teoria e Prática na Indústria Farmacêutica. Fundação C ed. Lisboa: p. 783–818, 2001.
MAX, B. et al. Biotechnological production of citric acid. Brazilian Journal of Microbiology, v.
41, n. 4, p. 862–875, 2010.
MEADOWS, J. A.; WARGO, M. J. Carnitine in bacterial physiology and metabolism. Microbiology (United Kingdom), v. 161, n. 6, p. 1161–1174, 2015.
NADAI, C. P.; PINHEIRO, P. R. E. Aminoacidopatias: caraterísticas clínicas e genéticas. Revista Brasileira de Medicina, v. 64, n. 10, p. 465–473, 2006.
NUNN, T.; WILLIAMS, J. Formulation of medicines for children. British Journal of Clinical Pharmacology, v. 59, n. 6, p. 674–676, 2005.
PRISTA, L.N.; ALVES, A.C.; MORGADO, R. Técnica farmacêutica e farmácia galênica. 6. ed.
Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 2003.
SCRIVER, C. R. et al. The metabolic and molecular bases of inherited disease. Biochemistry (Moscow), v. 67, n. 5, p. 611–612, 2002.
SHAWKY, R. M.; ABD-ELKHALEK, H. S.; ELAKHDAR, S. E. Selective screening in neonates suspected to have inborn errors of metabolism. Egyptian Journal of Medical Human Genetics, v.
16, n. 2, p. 165–171, 2015.
USP. The United States Pharmacopeia Convention. 40. ed., p. 4823–24, 2016.
