UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
JANALLE ROCHA DOS SANTOS
BIOPROSPECÇÃO DE GEOPRÓPOLIS DE Melipona fasciculata SMITH
São Luís 2010
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JANALLE ROCHA DOS SANTOS
BIOPROSPECÇÃO DE GEOPRÓPOLIS DE Melipona fasciculata SMITH
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Maranhão (UFMA), como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Prof. Dra. Maria Nilce de Sousa Ribeiro
Co-orientadora: Prof. Dra. Flávia Maria Mendonça do Amaral
São Luís 2010
A comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em Ciências da Saúde, em sessão pública, realizada no dia / / , considerou a candidata
( ) APROVADA ( ) REPROVADA
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Maria Nilce de Sousa Ribeiro Doutora em Química Orgânica
(Orientadora)
Prof. Dra. Flávia Maria Mendonça do Amaral Doutora em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
(Co-orientadora)
Profa. Dra. Luce Maria Torres Brandão Doutora em Química Orgânica
(Examinadora)
Profa. Dra. Denise Fernandes Coutinho Doutora em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
(Examinadora)
Profa. Dra. Maria do Socorro Cartagenes Doutora em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos
(Examinadora)
São Luís 2010
À Deus.
À minha avó Isaura, minha grande companheira, amiga, incentivadora, exemplo de vida, de compaixão e de amor ao próximo.
Às minhas mães: Ana e Linair, pelo imenso amor que sempre me dedicaram.
Ao Rodrigo por todo afeto, e por acreditar que o amor pode sobreviver ao tempo e a distância.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, razão do meu existir, Pai misericordioso, de infinita bondade, pelo dom da vida, e por ter permitido que eu realizasse mais um sonho. Obrigada Senhor!
À professora Maria Nilce de Sousa Ribeiro, por ter sido durante esses anos mais que uma orientadora, uma grande amiga, que se preocupa, que elogia nas horas certas e chama atenção quando necessário, o verdadeiro amigo é aquele capaz de falar a verdade. Além disso, é um grande exemplo de superação e determinação a ser seguido. Obrigada professora pelos ensinamentos, apoio, paciência, e pela oportunidade!
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Maranhão.
À Capes pela concessão da bolsa de Mestrado.
À professora Flávia Maria Mendonça do Amaral pela co-orientação.
À professora Denise Coutinho e Natália Cardoso pela ajuda com a realização do ensaio de citotoxicidade.
Ao professor Lívio Martins Costa Júnior, do Centro de Ciências Agrárias e Ambientais/ UEMA, pelo ensaio carrapaticida.
À professora Cristina Andrade Monteiro, do laboratórios de micologia do Centro Universitário do Maranhão (UniCeuma), pela realização dos ensaios antifúngicos.
Aos companheiros de laboratório: Richard, Mayara, Marisa, Bruno, Natália Cardoso, Willanir e Christiane Azevedo pela ajuda com a execução de experimentos, e principalmente por sermos uma família, onde um pode contar com o outro em qualquer momento, pela maravilhosa convivência e pelo apoio, muito obrigada!
Aos colegas de turma do mestrado (2008-2010), pela amizade, pelos momentos de alegria, e pelos dias de preocupação que passamos juntos, pois pudemos compartilhar alegrias e anseios sendo solidários uns com os outros.
Aos meliponicultores da Baixada maranhense pela doação das amostras de geoprópolis.
À minha avó Isaura, pelo exemplo de vida e de fé em Deus, pelos seus valiosos ensinamentos, por agir segundo o evangelho, por me acalmar nos momentos de aflição, por
ter sido durante toda a minha vida o meu porto-seguro, por toda dedicação e carinho. Obrigada vovó!
Ao meu avô Adonias pelos momentos felizes que me proporciona, pelas brincadeiras de infância, pelo carinho a mim dedicado, e por me fazer sentir sempre uma criança feliz, por sua alegria de viver. Um velho homem de coração jovem.
À minha querida mãe Ana, um símbolo de mulher guerreira, que nunca se deixou abater pelas dificuldades que a vida lhe impôs, e mesmo nos momentos difíceis me ensinou o caminho da verdade e da justiça, e que conquistas são obtidas através de esforço. Por ter dedicado toda a sua vida e o seu tempo às suas filhas, pois sempre nos colocou em primeiro lugar.
À minha mãe (n°2), tia Linair, por me mostrar o verdadeiro sentido da vida, pelos ensinamentos, compreensão, e por sua generosidade, pelo apoio nas conquistas de cada sonho, por proporcionar que eu chegasse até aqui, sem você esta jornada seria impossível. Agradeço tamanho amor e dedicação.
À minha irmã Isabella, por ser irmã e amiga, pelo afeto e compreensão, por sempre acreditar em mim, tendo-me como exemplo aumenta a responsabilidade de sempre querer fazer melhor, e isto me faz crescer, espero nunca decepcioná-la. Sua determinação e coragem na busca de seus objetivos me orgulham e me servem de inspiração.
À minha irmã Tuane, que tão menina foi submetida a uma batalha extrema após o diagnóstico de uma doença incurável, acreditou na vida mesmo quando os médicos afirmavam a impossibilidade de sua sobrevivência. Esta foi a maior vitória que já presenciei e puder aprender que nada é impossível quando se tem fé. Tua fé nos salvou, obrigada por ter acreditado e por estar aqui conosco!
À minha irmã Danielle, que merece um agradecimento especial, pois tanto me apoiou durante a realização deste trabalho, pelas noites que ficava em minha companhia no laboratório enquanto realizava processos cromatográficos quase intermináveis, pela sua dedicação e zelo, por compartilhar dos momentos importantes da vida, Dani mesmo longe sei que torces por mim. Muita obrigada irmã, você foi o melhor presente.
Ao meu noivo Rodrigo, por ser companheiro e compreensível, por me apoiar em todas as decisões, e por ser uma pessoa extremamente íntegra em todas as suas atitudes, só tenho a agradecê-lo pela dedicação, e a Deus por tê-lo colocado em minha vida.
Às minhas madrinhas Maria Helena e Regina, pelo carinho e atenção que sempre me dedicaram.
A todos os meus primos, tios e amigos, pessoas que me apóiam e com as quais me sinto mais forte.
Enfim a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
“O Senhor é o meu pastor e nada me faltará”
Salmos 22:1
RESUMO
Os meliponíneos, abelhas sem ferrão, compreendem um diverso e abundante grupo de abelhas sociais, que habitam regiões de clima tropical do planeta, especialmente a América do Sul. No Brasil são conhecidas mais de 400 espécies de abelhas nativas, as quais são responsáveis em 90% pela polinização de vegetais nativos. Melipona fasciculata Smith (tiúba), cultivada há séculos no Maranhão pela população indígena, produz mel, cera, pólen e geoprópolis, o qual é formado pela coleta de material resinoso das plantas, misturado com cera produzida pelas abelhas e terra. O trabalho teve por objetivo realizar bioprospecção (citotóxica, fungicida, carrapaticida e antioxidante) do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata, assim como caracterizar e/ou identificar frações bioativas do respectivo extrato. Os geoprópolis de tiúba foram coletados em meliponário na localidade de Cauaçu, município de Palmeirândia, na Baixada maranhense, em março de 2008. Após análise sensorial o material foi submetido à maceração em etanol 70% por 48h em temperatura ambiente, filtrado para separação da terra e concentrado em evaporador rotativo, obtendo-se o extrato hidrolacoólico de geopropolis (EHAGP). O extrato foi submetido a teste de citotoxicidade frente à Artemia salina, teste carrapaticida, utilizando-se larvas de Rhipicephalus microplus, teste de atividade antifúngica e antioxidante, pelo método qualitativo (CCD/Revelação com DPPH) e quantitativo (método fotocolorimétrico in vitro de seqüestro de radical livre DPPH. Do extrato foram determinados por método colorimétrico os teores de flavonóides, polifenóis totais e ácidos fenólicos. O EHAGP foi fracionado através de métodos cromatográficos monitorados pela atividade antioxidante. Os resultados demonstraram que o extrato apresentou citotoxicidade frente à Artemia salina (DL50 = 74,82 µg/mL), ausência de atividade carrapaticida e antifúngica, mas com atividade antioxidante (55,73%). Os teores de flavonóides, ácidos fenólicos e fenólicos totais do extrato foram respectivamente 1,84%, 13,08% e 14,92%. O fracionamento cromatográfico do EHAGP monitorado pela ação antioxidante permitiu através de diferentes separações cromatográficas obtenção das subfrações C318 e C320, com ação antioxidante. A subfração C320 apresentou 0,17% de flavonóides, 1,33% de ácidos fenólicos e 1,51% de fenólicos totais, e juntamente com a subfração C318 foi analisada por CLAE e CLAE/EM. A análise de CLAE/EM da subfração C320 apresentou picos com m/z majoritários, cujo m/z 314,8 permitiu identificar o flavonóide kumatakenina, outros m/z como derivados da kumatakenina e outros componentes fenólicos, os quais podem estar relacionados com ação antioxidante. Os resultados encontrados demonstram um perfil de qualidade de geoprópolis de Melipona fasciculata Smith do município de Palmeirândia-MA, e ainda que o dados podem contribuir para composição do padrão de qualidade para futura legislação para produtos de abelhas sem ferrão de áreas tropicais.
Palavras-chave: Melipona fasciculata. Geoprópolis. Polifenóis. Flavonóides. Atividade antioxidante.
ABSTRACT
Meliponines, stingless bees, comprehend a diverse and abundant group of social bees, which inhabit tropical whether regions of the planet, especially South America. In Brazil, more than 400 species of native bees are known, which in 90% of the cases are responsible for the pollination of native vegetables. Melipona fasciculata Smith (tiúba), cultivated for centuries by the indigenous population of Maranhão, produces honey, beewas, pollen and geopropolis (bee glue), which is formed by collecting resinous plant material mixed with the wax produced by bees and soil. The study aimed to carry out (cytotoxic, fungicide, acaricidal and antioxidant) bioprospecting in hydroalcoholic geopropolis extract of Melipona fasciculata, as well as characterizing and/or identifying bioactive fractions of the respective extract. Geopropolis samples of Melipona fasciculata were collected in beehives in the municipal district of Palmeirândia in the State of Maranhão, in March, 2008. After the sensory analysis the sample was submitted to maceration in 70% ethanol for 48 hours at ambient temperature, filtered in order to separate soil and concentrated on rotary evaporator, obtaining the hydroalcoholic extract geopropolis (EHAGP). The extract was submitted to bioassay of toxicity with Artemia salina, acaricide test, using larvae of Rhipicephalus microplus, antifugal assay and antioxidant, qualitative method (TLC/DPPH spray) and quantitatively (photocolorimetric in vitro method for sequestering free radical DPPH). Concentration of flavonoids, total phenols and phenolic acids were determined by colorimetric method. The EHAGP was fractionated by chromatographic methods monitored by antioxidant activity. The results showed that the extract had cytotoxicity on Artemia salina (LD50= 74,82 µg/mL ),the absence of ticks and antifungal activity, but showed antioxidant activity (55,73%). The levels of flavonoids, phenolic acids and total phenolics extract were respectively 1.84, 13.08 and 14.92%. The fractionation of EHAGP monitored by the antioxidant action allowed by different chromatographic separations, obtaing the subfractions C318 and C320, with antioxidant activity. C320 subfraction showed 0.17% of flavonoids, phenolic acids 1.33% and 1.51% of total phenolics and along with C318 subfraction was analyzed by HPLC and HPLC/MS. HPLC / MS analysis of C320 subfraction showed majority m/z peaks, whose m/z 314.8 identified the flavonoid kumatakenina, and other m/z as kumatakenina derivatives and other phenolic compounds, which may be related to the antioxidant activity of the extract. The results demonstrate a quality profile of Melipona fasciculata Smith geopropolis from Palmeirândia district, and also that the data may contribute to compose the quality standard of a future legislation for products from stingless bees in tropical areas.
Keywords: Melipona fasciculata. Geopropolis. Polyphenols. Flavonoids. Antioxidant Activity.
LISTA DE FIGURAS
p.
Figura 1 –
Figura 2 –
Figura 3 – Figura 4 – Figura 5 –
Figura 6 –
Figura 7 –
Figura 8 –
Figura 9 –
Figura 10 –
Figura 11 – Figura 12 – Figura 13 – Figura 14 – Figura 15 –
Quantidade de própolis brasileira (Kg) exportada no período de 2005 a 2007... Publicações científicas e patentes sobre própolis depositadas no CAS no período de 1872 a 1979... Publicações científicas e Patentes sobre própolis no período de 1980 a 1999. Distribuição de patentes sobre própolis por área de maior freqüência ... Publicações científicas e Patentes sobre própolis no período de 2000 a 2008... Distribuição das patentes brasileiras sobre própolis por área de indexação no período de 1995 a 2008... Fracionamento cromatográfico (coluna seca-C1) do extrato hidroalocoólico de geoprópolis de MeIipona fasciculata (EHAGP)... Fracionamento cromatográfico (coluna seca - C2) da Fração A3+4, derivada do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)... Fracionamento cromatográfico (coluna úmida – C3) da subfração C2B+C2C, derivada do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata(EHAGP)... Antifungigrama do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP)frente às spécies: A – Candida albicans; B- Candida glabrata, C- Candida tropicalis; D: Candida parapsilosis... Cromatograma das subfrações C31 a C324 ... Cromatograma da subfração C318 obtido através da técnica CLAE/UV... Cromatograma da subfração C320 obtido através da técnica CLAE/UV... Estrutura química da kumatakenina... Estrutura química de flavonóide derivado da kumatakenina ...
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45 49 50 50 51 51
LISTA DE TABELAS
p.
Tabela 1 – Tabela 2 –
Tabela 3 –
Tabela 4 –
Tabela 5 –
Tabela 6 –
Tabela 7 –
Tabela 8 –
Tabela 9 –
Nomenclatura das subfrações derivadas de C3 antes e após as uniões... Local de coleta, peso e características sensoriais de geoprópolis de Melipona fasciculata GP “in natura”... Rendimento extrativo, caraterísticas sensoriais e perfil químico do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)... Índice de letalidade de Artemia salina quando submetidas ao extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)... Eficácia do teste de sensibilidade larvar em papel impregnado com extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)... Atividade antioxidante (%)* do extrato hidroalcólico da geopropólis de Melipona fasciculata (EHAGP), pelo método de sequestro do radical livre estável DPPH... Valores percentuais de ácidos fenólicos, flavonóides e fenólicos totais do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)... Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides e ácidos fenólicos Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides, ácidos fenólicos e atividade antioxidante do extrato hidroalcólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)... Valores dos conteúdos de fenólicos totais, flavonóides e ácidos fenólicos da subfração C320 derivada do extrato hidroalcólico de geoprópolis de Melipona fasciculata EHAGP...
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46
47
47
49
SUMÁRIO
p.
1 1.1 1.2 1.3 2 2.1 2.2 3 3.1 3.2 3.3 3.3.1
3.4
3.4.1
3.4.2 3.4.2.1 3.4.2.2 3.4.3 3.4.3.1 3.4.3.2 3.4.3.3 3.4.4 3.4.4.1 3.4.4.2 3.4.5 3.4.6
INTRODUÇÃO... Própolis e geoprópolis ... Panorama Atual sobre Mercado e Comercialização de Própolis... Publicações científicas e patentes sobre própolis... OBJETIVOS ... Objetivo geral ... Objetivos específicos ... MATERIAL E MÉTODOS ... Coleta e acondicionamento de geoprópolis ... Análise sensorial de geoprópolis in natura ... Obtenção do extrato hidroalcoólicos... Análise sensorial do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP) ... Biosprospecção do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP) ... Avaliação da citoxicidade do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP)... ...
Atividade carrapaticida ... Obtenção dos carrapatos ... Teste de sensibilidade larvar ... Atividade antifúngica ... Microorganismos ... Padronização do inoculo ... Teste de verificação da atividade antifúngica do extrato ... Atividade antioxidante ... Analise qualitativa via CCD/ borrifação com DDPH ... Análise quantitativa ... Abordagem química do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP)... Determinação da concentração total de flavonóides do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP) e da subfração C320 ...
14 14 19 23 28 28 28 29 29 29 29
30
30
30 30 30 31 31 31 32 32 33 33 33 34
34
3.4.7
3.4.8
3.4.9
3.4.9.1 3.4.9.2 3.4.9.3 3.4.10 3.4.10.1 3.4.10.2
4 5
Determinação da concentração de polifenóis totais do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP) e da subfração C320 ... Determinação da concentração de ácidos fenólicos do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP) e da subfração C320 ... Fracionamento biomonitorado e purificação das frações e de constituintes químicos do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP)... Cromatografia em coluna seca ... Cromatografia em camada delgada ... Cromatografia em coluna úmida ... Análise por CLAE e CLAE-EM ... Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR)... Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa acoplada a espectômetro de massa (CLAE-EM)... RESULTADOS E DISCUSSÃO ... CONCLUSÃO ... REFERÊNCIAS ... ANEXO ...
35
35
35 35 37 37 39 39
39 40
53 54 70
1 INTRODUÇÃO
1.1 Própolis e Geoprópolis
As abelhas são insetos sociais, que surgiram há mais de 40 milhões de anos, juntamente com o desenvolvimento das flores. São dentre os insetos, os polinizadores mais eficientes devido a sua consistência e fidelidade à coleta, além disso, possuem reconhecimento de cor e memória de odor, possibilitando assim a perpetuação de espécies vegetais através da polinização (APICULTURA, 2004).
Segundo a classificação de Silveira et al. (2002), as abelhas sociais pertencem à família Apidae, e encontram-se divididas em duas subfamílias: Meliponinae, conhecidas como abelhas indígenas sem ferrão, que são amplamente distribuídas em regiões de clima tropical e Apinae, tendo Apis mellifera L. como a espécie mais conhecida e estudada.
Dentre os produtos originados pelas abelhas, tais como mel, geléia real, pólen, própolis, geoprópolis entre outros, a própolis vem merecendo especial atenção, devido às suas propriedades terapêuticas diversificas (GHISALBERTH, 1979; BURDOCK, 1998). Própolis é uma resina de coloração e consistência variada produzida pelas abelhas, a partir da mistura de substâncias coletadas de diferentes partes das plantas, como brotos, botões florais e exsudados resinosos, com as secreções produzidas em seu organismo. É utilizada para fechar pequenas frestas da colméia, protegê-la contra a invasão de insetos, microorganismos e embalsamar insetos mortos (GHISALBERTI, 1979; SALATINO et al., 2005).
O uso de extratos de própolis na medicina popular data de 300 a.C. (DA SILVA et al., 2006). Os egípcios conheciam as propriedades anti-putrefativas da própolis e empregavam para embalsamar cadáveres. Além disso, foi reconhecida por suas propriedades medicinais por médicos gregos e romanos como Aristóteles, Dioscorides, Plínio e Galeno (CASTALDO; CAPASSO, 2002). Na África do Sul, na guerra ao final do século XIX, foi amplamente utilizada devido às suas propriedades cicatrizantes e na segunda guerra mundial foi empregada em várias clínicas soviéticas (PEREIRA et al., 2002).
No Brasil, o interesse pela própolis aconteceu somente na década de 80 com o trabalho pioneiro de Ernesto Ulrich Breyer, demonstrando em seu livro, “Abelhas e saúde”, as propriedades terapêuticas da própolis e sua utilização como antibiótico natural (LIMA, 2006). Estudos têm demonstrado diversas atividades biológicas de própolis, tais como antibacteriana (BURDOCK, 1998; KUJUMGIEV et al., 1999; MANTOVANI et al., 2008; CABRAL et al.,
2009; LIBERIO et al., 2009), antiinflamatória (ORSI et al., 2000; KOSALEC et al., 2005), antifúngica (KUJUMGIEV et al., 1999; ; SFORCIN et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2006; KALOGEROPOULOS et al., 2009) antioxidante (KUMAZAWA et al., 2000; DA SILVA et al., 2006; CABRAL et al., 2009), entre outras.
A atividade farmacológica da própolis está diretamente relacionada à sua composição química, onde já foram identificados mais de 300 compostos incluindo flavonóides, ácidos aromáticos e ésteres, aldeídos e cetonas, terpenóides, fenilpropanóides, esteróides, aminoácidos, polissacarídeos, hidrocarbonetos, ácidos graxos, dentre outros compostos (ROCHA et al., 2003; OZKUL et al., 2004; HU et al., 2005; HAYACIBARA et al., 2005). Sendo também relatada a presença de constituintes inorgânicos tais como o cobre, manganês, ferro, cálcio, alumínio, vanádio e silício (MARCUCCI, 1996).
A composição química deste produto é bastante complexa e variada, estando intimamente relacionada com a ecologia da flora de cada região visitada pelas abelhas (MARCUCCI; BANKOVA, 1999; PARK et al., 2002) e com o período de coleta da resina (ROCHA et al., 2003). Além disso, a variabilidade genética das abelhas rainhas também influencia na composição química (PARK et al., 1998).
O conhecimento sobre a origem geográfica e, principalmente, a origem vegetal, aliada à fenologia da planta hospedeira, se faz importante no controle de qualidade e até mesmo na padronização das amostras de própolis para uma efetiva aplicação terapêutica (GUZMÁN, 2005).
Na Europa, América do Norte e Oeste da Ásia, a fonte dominante de própolis é o exsudado do botão de álamo, Populus sp (MARKHAM et al., 1996; WOLLENWEBER; BUCHMANN, 1997), desta maneira uma menor variação da composição química é observada nestas regiões (temperadas), onde seus principais compostos bioativos são os compostos fenólicos, em especial os flavonóides (KOENING, 1985; BURDOCK, 1998; BANKOVA, 2005).
Entretanto, na América do Sul a espécie vegetal do gênero Populus não é nativa, existindo uma grande diversidade vegetal para a retirada de resina, o que dificulta a correlação da própolis com a fonte produtora.
Desta maneira a amplitudade das atividades biológicas da própolis é maior em áreas tropicais do planeta, refletindo a diversidade vegetal destas regiões. Assim, as própolis brasileiras de Apis mellifera puderam ser agrupadas em 12 grupos distintos, de acordo com a composição química e atividades biológicas (PARK et al., 2004; CABRAL, et al., 2009).
Atualmente um novo tipo de própolis de Apis mellifera proveniente de colméias encontradas ao longo das praias e dos rios do nordeste do Brasil, teve sua origem botânica identificada como uma espécie de leguminosa, Dalbergia ecastophyllum. Esta própolis, denominada de "própolis vermelha" por causa da sua coloração vermelha intensa, foi classificada como o 13º tipo de própolis brasileira, não se enquadrando nos 12 tipos previamente classificados, e tem demonstrado várias atividades biológicas em ensaios in vitro, com destaque para atividade antibacteriana (DAUGSCH, 2007; ALENCAR et al., 2007; CABRAL et al., 2009).
Própolis contém substâncias de alta atividade antioxidante como flavonóides e outros compostos fenólicos (BURDA- OLESZEK, 2001). Artepillina C, composto da classe dos fenólicos é o principal componente da própolis verde de Apis mellifera, cuja origem botânica é Baccharis dracunculifolia, e possui uma habilidade muito grande de sequestrar radicais livres (PAREDES-GUZMAN et al., 2003; SHIMIZU et al., 2004).
Outras espécies de abelha produzem própolis, entre elas os meliponíneos, abelhas sem ferrão, que compreendem um diverso e abundante grupo de abelhas sociais, habitam regiões de clima tropical do planeta, especialmente a América do Sul. No Brasil são conhecidas mais de 400 espécies de abelhas nativas, as quais são responsáveis em 90% pela polinização de vegetais nativos (KERR, 1987; BIESMEIJER et al., 1997).
Estas abelhas além de serem fundamentais na polinização da flora nativa, produzem mel, polén, própolis e geoprópolis, o qual é formado pela coleta de material resinoso das plantas, misturado com cera produzida pelas abelhas e terra (KERR, 1987; CASTALDO; CAPASSO, 2002).
Geoprópolis e produtos oriundos deste são usados popularmente para tratar fraqueza, hemorróidas, gastrites, tosses e promover cicatrização (KERR, 1987).
Os estudos científicos de produtos meliponículas são escassos quando comparados aos dados de produtos de abelhas com ferrão, principalmente de própolis de Apis mellifera (GHISALBERTH, 1979; KERR, 1987; BANKOVA; POPOVA, 2007). No entanto, nos últimos anos tem ocorrido maior interesse por pesquisas com produtos de abelhas sem ferrão, tanto em relação à sua composição química, como atividade biológica.
Compostos fenólicos de geoprópolis de cinco espécies de abelhas da Venezuela foram descritos por Tomas-Barberan et al. (1993), onde predominam substâncias do tipo benzofenonas preniladas.
Bankova et al. (1998), descrevem a constituição química de geoprópolis brasileiro (estados do Piauí e Paraná) de três diferentes abelhas espalhadas no Brasil, Melipona
compressipes, Melipona quadrifasciata anthidioides e Tetragona clavipes, onde identificaram mais de cinqüenta compostos, das classes dos ácidos graxos, ácidos aromáticos, flavonóides, diterpenos e triterpenos.
Nogueira et al. (2004a), demonstraram as características organolépticas, assim como a presença de flavonóides, terpenos e saponinas em geoprópolis de tiúba, cultivadas em municípios do Estado do Maranhão.
Dualibe (2004) e Dualibe et al. (2007) em trabalhos experimentais com o bochecho da solução do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de tiúba, diminuíram em 48,5% o número de colônias de Streptococcus mutans, na saliva de pacientes, atuando como auxiliar no tratamento e na prevenção da cárie.
Maciel (2005) utilizando extrato hidroalcoólico de geoprópolis observou atividade antimicrobiana in vitro contra patógenos orais, permitindo o uso do extrato de geoprópolis como métodos auxiliares no tratamento das doenças periodontais.
As própolis de abelhas sem ferrão, Tetragonisca angustula, Nannotrigona testaceicornis, Scaptotrigona sp., Partamona, Melipona sp, mostraram-se altamente eficazes contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli (FERNANDES JR et al., 2001; MIORIN et al., 2003).
De acordo com Velikova et al. (2000a) a própolis da abelha Melipona quadrifasciata apresenta atividade moderada contra Staphylococcus aureus.
Farnesi (2007) verificou atividade antifúngica (Tricophyton rubrum) de própolis de três espécies de abelhas sem ferrão, Melipona quadrifasciata, Melipona fasciculata e Scaptotrigona sp, duas destas coletadas no estado do Maranhão, além disso a própolis de Melipona quadrifasciata demonstrou atividade antibacteriana (Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa).
Gomes et al. (2003) e Gomes (2005) demonstraram em camundongos as atividades analgésica, antiinflamatória e antiendematogênica do extrato hidroalcoólico de geoprópolis da Melipona fasciculata Smith (tiúba).
Nogueira et al. (2004a), Costa et al. (2004) e Machado (2008) demonstraram as atividades biológicas (analgésica e antiinflamatória) assim como características físicas e físico-químicas de extratos de geoprópolis de tiúba no município de Arari – MA.
Extratos hidroalcoólicos de geoprópolis de Melipona fasciculata da região da Baixada Maranhense tem cheiro, odor e sabor característicos, são ricos em substâncias
químicas das classes dos compostos fenólicos (ácidos fenólicos e flavonóides) e triterpenos, segundo Nogueira et al. (2004b) e Dutra (2006).
Adelmann (2005) verificou maior concentração de compostos fenólicos e maior atividade antioxidante em própolis oriundas de Apis mellifera em relação às própolis de meliponíneos.
Dutra (2006) e Dutra et al. (2008) analisaram extratos hidroalcoólicos de geoprópolis de Melipona fasciculata, de três regiões geográficas do Maranhão, encontraram predominância de substâncias das classes dos compostos fenólicos e triterpenos. Os teores de fenóis e flavonóides encontrados estão acima do mínimo exigido pela legislação brasileira para a própolis de Apis mellifera produzidas no Brasil. Os perfis cromatográficos dos extratos indicaram composição e concentração química diferentes entre as amostras, sugerindo que as vegetações visitadas pelas abelhas são diferentes.
Dutra et al. (2007) e Catanhede (2008) demonstraram concentração de polifenóis e flavonóides e citotoxicidade de geopropólis de Melipona fasciculata da região da Baixada maranhense e Cerrado maranhense.
Própolis de Tetragonisca angustula (jataí), abelha sem ferrão, coletados no nordeste e sudeste brasileiro, foram analisados por EM/ESI (espectrometria de massas com ionização por eletospray) , e demonstraram constância na composição química de própolis, diferentemente da própolis de Apis melifera, cuja composição química é altamente dependente da região geográfica. Os dados sugerem que a abelha jataí utilize como fonte vegetal a espécie Sehinus terebenthifolius, planta encontrada em todo o Brasil (SAWAYA et al., 2006).
Araújo (2007) e Assunção (2008) demonstraram atividade antitumoral de extratos hidroalcoólicos de própolis e geoprópolis de abelhas sem ferrão, Scaptotrigona sp e Melipona fasciculata, cultivadas no Maranhão.
Araújo (2009) verificou que o extrato hidroalcóolico de geoprópolis de Melipona fasciculata apresentou baixa toxicidade em camundongos submetidos a tratamento oral com doses elevadas, porém induziu toxicidade hepática em tratamento subcrônico.
Farias (2009) avaliou o efeito do tratamento com extrato hidroalcoólico (EH) de própolis de Scaptotrigona aff postica (tubi) na inflamação de vias aéreas em modelo murino de asma experimental, verificando reversão completa da patologia.
Própolis de Scaptotrigona sp cultivada no Maranhão, S. depilis e S. bipunctata, cultivadas em São Paulo, mensalmente coletadas no período de um ano, demonstraram atividade antioxidante com DE50 de 43 µg/mL a 100 µg/mL, assim como essa variação é
dependente da espécie de abelha, área geográfica e espécies vegetais visitadas pelas abelhas (SAWAYA et al., 2009).
Azevedo (2009) detectou alto teor de compostos polifenólicos em geoprópolis de Melipona fasciculata da Baixada maranhense, e correlacionou com elevada capacidade antioxidante.
Os efeitos terapêuticos da própolis e geoprópolis de abelhas sem ferrão têm sido atribuídos às diversas classes de polifenóis, diterpenos e triterpenos, que as compõem (BANKOVA; POPOVA, 2007; NOGUEIRA, 2008). Estando relacionados com a localização geográfica e flora visitada pelas abelhas.
A Amazônia é a detentora da maior diversidade de meliponíneos, em especial as do gênero Melipona (SILVEIRA et al., 2002). No estado do Maranhão Melipona fasciculata já vem sendo cultivada há séculos pela população indígena para a produção de mel, sendo também produtora de geoprópolis.
O governo do estado do Maranhão, nos últimos anos inseriu a apicultura e a meliponicultura dentro dos arranjos produtivos como áreas estratégicas, para desenvolver e alavancar a agricultura familiar do estado (Programa de Desenvolvimento da Apicultura do Estado do Maranhão – BNB, 2001). Essas atividades são consideradas, hoje, uma das grandes opções para a região nordestina, especialmente para a Baixada maranhense, por sua localização geográfica, possuindo vários ecossistemas, por explorar o potencial nativo da flora, e por gerar trabalho e renda ao homem do campo.
A Baixada maranhense localiza-se na porção noroeste do estado do Maranhão, abrangendo extensas áreas sujeitas a inundações periódicas, caracterizando-se pela transição entre os climas úmidos da Amazônia e semi-árido do noroeste, com grandes precipitações nos meses de janeiro a maio, e estiagem de julho a dezembro (BRASIL, 1973). A região é formada pela tensão ecológica ente as formações de cocais ao sul, cerrado a leste, floresta amazônica a oeste, e sistemas marinhos ao norte (BRASIL, 1984).
1.2 Panorama Atual sobre Mercado e Comercialização de Própolis
O mercado de produtos de abelhas está avaliado em mais de US$ 360 milhões anuais, com expectativas demonstradas em pesquisas, podendo crescer para cerca de US$ 1 bilhão/ ano (O MERCADO, 2008).
Em todo o mundo tem crescido o interesse por produtos naturais de abelhas de alta qualidade (SEBRAE, 2008), entre estes produtos incluí-se a própolis, que é utilizada em diversos países para finalidades variadas (alimentícia, cosmética, farmacológica, entre outras). Entre os problemas tratados com própolis incluem mau hálito (halitose), eczema, infecções na garganta, abcessos, inflamações, úlceras e infecções urinárias (PEREIRA et al., 2002).
O consumo de própolis no mundo é estimado em cerca de 700-800 toneladas/ano (DA SILVA et al., 2006), sendo os maiores produtores China, Brasil, Estados Unidos, Austrália e Uruguai, segundo SEBRAE (2008), contudo dados apontam o Brasil como o terceiro produtor mundial, sendo superado pela China e Rússia respectivamente (BNDES, 2007; NUNES et al., 2008). Nota-se a falta de estatísticas oficiais sobre o volume de própolis produzido anualmente no Brasil, o que é exportado e o que é consumido pelo mercado interno. Existem apenas avaliações de produtores e exportadores que situam a produção brasileira entre 49 e 150 toneladas anuais (LUSTOSA et al., 2008).
No mercado interno, o preço da própolis situa-se entre R$ 20-100,00/kg com média de R$ 50,00/kg dependendo da origem e da qualidade do produto, sendo sua demanda embasada em suas propriedades cosméticas e terapêuticas. O Japão é o principal mercado importador da própolis brasileira, absorvendo cerca de 80% da produção (EMBRAPA, 2009). O que se tem verificado é que o baixo volume e a falta de cuidado na coleta e no acondicionamento têm feito com que própolis brasileira de algumas regiões tenham o seu preço reduzido quando da prospecção de negócios. Tais problemas podem ser mitigados com a difusão de tecnologias de coleta e pela concentração em entrepostos de cooperativas e associações (NETO; NETO, 2005).
Atualmente, a própolis é usada como um remédio popular e está disponível na forma de cápsulas, como extrato (hidroalcoólico ou glicólico), como enxaguatório bucal, na forma de pó, entre outras (CASTALDO; CAPASSO, 2002; SOARES et al., 2006). Também é empregada em cosméticos e na indústria alimentícia na forma de alimentos funcionais (SFORCIN et al., 2000; ALENCAR et al., 2005; LUSTOSA et al., 2008).
No Brasil, a maioria dos produtos comercializados à base de própolis é oriunda de própolis de abelhas africanizadas, notadamente de Apis mellifera, e possui registro no Ministério da Agricultura (baseados na Instrução Normativa nº 3 de 19/01/2001), devendo assim ser rotulada de acordo com suas propriedades nutricionais.
Devido à demanda pelo registro de produtos com indicações terapêuticas contendo, como substância ativa a própolis ou produtos associados, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) classificou os produtos contendo própolis como
medicamentos opoterápicos. Estes são medicamentos de origem animal à base de vitaminas e/ou minerais e/ou aminoácidos, isoladas ou associadas entre si, com pelo menos um dos componentes acima dos limites nutricionais estabelecidos pela Portaria n° 33 (BRASIL, 1998), posteriormente revogada pela Resolução RDC nº. 269 (BRASIL, 2005; NUNES et al., 2008).
No Brasil já foram classificadas 13 tipos distintos de própolis de Apis mellifera, com destaque comercial para a própolis verde (PARK et al., 2002; PARKK et al., 2004; DAUGSCH, 2007).
Os estados de São Paulo e Minas Gerais são produtores de própolis verde, conhecida internacionalmente como green propolis, rica em derivados prenilados do ácido cumárico (BANKOVA; MARCUCCI, 1999), cuja a principal fonte vegetal utilizada pela abelha Apis mellifera é a espécie Baccharis dracunculifolia D.C. (alecrim do campo). Esta própolis devido à sua coloração característica, origem botânica e propriedades farmacológicas, desperta grande interesse no mercado externo em relação a outros tipos de própolis brasileiras.
O Japão é o principal importador de própolis verde, sendo amplamente consumida neste país como suplemento alimentar e na profilaxia de doenças.
Dados da Federação de Apicultores de Minas Gerais revelam que a própolis produzida no Estado é considerada a melhor do mundo no mercado japonês, onde o quilograma do produto saltou de US$ 5.00 para US$ 200.00 nos últimos anos (PEREIRA et al., 2002).
A própolis de alecrim-do-campo constitui, portanto, um produto tipicamente brasileiro e, devido ao fato de ser altamente eficaz no combate a uma série de microrganismos (BASTOS, 2001; PARK et al., 2000; MARCUCCI et al., 2001; PEREIRA et al., 2002; FERRONATTO et al., 2007; LONGHINI et al., 2007; PACKER; LUZ, 2007; SIMÕES et al., 2008), é altamente valorizada no mercado internacional, sendo que, somente no Japão, movimenta um mercado da ordem de setecentos milhões de dólares ao ano (NASCIMENTO, 2005; NASCIMENTO et al., 2008).
Como pode ser visualizado na Figura 1, em 2005 o Brasil exportou 264 kg de própolis faturando com isso 30.454,00 dólares, destes US$ 30,242.00 foram obtidos com exportações para o Japão, o produto obteve neste ano cotação máxima de US$ 116.68/ Kg, sendo o estado de São Paulo responsável por toda a exportação contabilizada neste ano (SEBRAE, 2007).
Em 2006 este valor saltou para US$ 88,980.00 (exportação de 5.650,0 kg de própolis), correspondendo o Japão a 55,40% deste montante (SEBRAE, 2007), no entanto neste ano própolis obteve sua menor cotação (US$ 15.75/ Kg). Isto ocorreu em função da origem e do tipo de própolis, pois neste ano o maior exportador foi o estado do Piauí (5.000 Kg) que arrecadou US$ 36,250.00, já o estado de São Paulo exportou apenas 509 kg, e obteve lucro maior que o Piauí faturando US$ 49,298.00, desta forma a própolis piauiense foi comercializada a US$ 7.25/kg enquanto a paulista a US$ 96.85/ Kg.
Em 2007 houve diminuição da exportação de própolis, e o lucro caiu 57,28% em relação a 2006, arrecandando o Brasil US$ 38,020.00.
Anos
Figura1: Quantidade de própolis brasileira (Kg) exportada no período de 2005 a 2007.
A própolis brasileira tem características organolépticas peculiares, baixo teor de metais pesados, além de diversas propriedades farmacológicas, justificando o interesse japonês neste produto (PEREIRA et al., 2002).
Todos os estados brasileiros praticam a criação de abelhas de forma racional, em maior ou menor proporção, dada à expansão do número de enxames nativos e de apiários, apoiada na grande quantidade e variedade da flora apícola brasileira. Soma-se a esse processo, o aparecimento de diversas empresas especializadas na venda de insumos e acessórios para criação de abelhas, além da criação de diversas linhas de pesquisa sobre o tema em seus vários centros de pesquisa espalhados pelo país (NUNES et al., 2008).
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
2005 2006 2007
Quantidade de própolis (Kg)
Devido à diversidade de propriedades farmacológicas e uso nas indústrias de cosméticos, alimentícia, entre outras, aliada a grande aceitação no mercado, além da divulgação de inúmeros estudos científicos sobre a própolis, tem-se verificado o aumento do número de pedidos de patentes de própolis, fenômeno este que tem ocorrido em todos os continentes, merecendo especial atenção os países asiáticos, que possuem a maioria das patentes.
1.3 Publicações científicas e patentes sobre própolis
Em levantamento bibliográfico realizado no Chemical Abstracts (CAS) até o ano de 2008, já foram indexadas 3958 publicações científicas sobre própolis. A primeira publicação e primeira patente datam de 1872 (US 129204), trata-se de um trabalho americano que relata uma mistura contendo cera de abelhas e própolis, utilizada para melhorar fabricação de recipientes de madeira utilizados para armazenamento de ácidos (ARCHDEACON, 1872).
Até 1979 havia apenas 36 patentes e 249 publicações registradas no CAS, sendo 82 destas pertencentes a grupos de pesquisas da Rússia (Figura 2). A Romênia até então
Países
Figura 2: Publicações científicas e patentes sobre própolis depositadas no CAS no período de 1872 a 1979.
Legenda: 1= Rússia; 2= Impossível avaliar; 3= EUA; 4= Alemanha; 5= Romênia; 6= França; 7=Ucrânia; 8= Polônia; 9= Bulgária; 10= Dinamarca; 11= Tchecoslováquia
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Publicações Patentes
Nºde publicações e patentes
liderava o ranking com 11 patentes seguida da Rússia com 8. Percebe-se o domínio dos países europeus na pesquisas com própolis até então.
Nas décadas de 80 e 90 ocorreu um grande aumento no interesse global pela própolis, sendo registrados no CAS 1133 trabalhos científicos e um total de 482 patentes. Pereira et al. (2002) relataram um comportamento de crescimento quase exponencial do número total de publicações sobre própolis, observando-se um aumento substancial nas décadas de 80 e 90. Neste contexto surgem os países asiáticos, sendo o Japão o maior
representante, que publicou seu primeiro trabalho em 1985, bem como sua primeira patente (uma solução à base de própolis com atividade antibacteriana), e em menos de 20 anos, já
havia se tornado o segundo país em número de publicações, perdendo apenas para a Rússia (205 publicações) e o primeiro em posses de patentes (30%), como pode ser visualizado na Figura 3.
Com o início do domínio Asiático ocorre também mudanças na forma de divulgação dos trabalhos, até 1979 dava-se principalmente sobre a forma de artigos e as patentes não chegavam a 15% total de publicações, já nos anos 80 e 90 passaram a representar mais de 42%.
Há alguns anos a literatura científica já vinha relatando as propriedades biológicas da própolis tais como: antibacteriana (LINDENFELSER, 1967; VALDEZ et al., 1989), antiprotozoária (SCHELLER et al., 1977), antiinflamatória (GHISALBERTH, 1979), citotóxica (BAN et al., 1983), antifúngica (VALDES et al., 1987), antiviral (AMOROS et al., 1992), entre outras. Justificando-se assim o grande interesse de pesquisas com própolis, com isso esse produto natural despertou o interesse mundial e ganhou grande valor de mercado, onde segundo Pereira et al. (2002) um frasco de extrato alcoólico que era vendido no Brasil por cerca de 5 a 10 reais chegou a custar 150 dólares em Tóquio.
Figura 3: Publicações científicas
Legenda: 1= Rússia; 2= Japão; 3= China; 4= Romênia; 5= Alemanha; 6= França; 7= Polônia; 8= Hungria; 9= Coréia; 10= Brasil
Na Europa a própolis é considerada como
países como Japão ou Estados Unidos, é classificada como aditivo alimentar de baixa restrição (GREENAWAY
al., 2000), isso pode explicar o fato de a maioria das patentes
alimentos ou química de alimentos, diferentemente dos países europeus e do Brasil, onde a maioria das patentes relaciona
principais áreas relacionadas à patentes de p
Figura 4: Distribuição de patentes sobre própolis por área de maior freqüência.
Legenda: 1= China; 2= Japão; 3= Rússia; 4= Coréia; 5= Romênia; 6= Alemanha; 7= Brasil 0
50 100 150 200 250
1 2
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
1 2
Nºde publicações e patentesDistribuição percentual de patentes por área
Países
científicas e Patentes sobre própolis no período de 1980 a
: 1= Rússia; 2= Japão; 3= China; 4= Romênia; 5= Alemanha; 6= França; 7= Polônia; 8= Hungria; 9= Coréia; 10= Brasil
Na Europa a própolis é considerada como um produto medicinal e em outros países como Japão ou Estados Unidos, é classificada como aditivo alimentar de baixa restrição (GREENAWAY et., 1991; MARCUCCI, 1995; BURDOCK, 1998;
, 2000), isso pode explicar o fato de a maioria das patentes japonesas serem relacionadas a alimentos ou química de alimentos, diferentemente dos países europeus e do Brasil, onde a maioria das patentes relaciona–se com a aplicação farmacêutica. A Figura 4 demonstra as 3 principais áreas relacionadas à patentes de própolis e seus respectivos países detentores.
Países
de patentes sobre própolis por área de maior freqüência.
: 1= China; 2= Japão; 3= Rússia; 4= Coréia; 5= Romênia; 6= Alemanha; 7= Brasil
3 4 5 6 7
3 4 5 6 7
e Patentes sobre própolis no período de 1980 a 1999.
: 1= Rússia; 2= Japão; 3= China; 4= Romênia; 5= Alemanha; 6= França; 7= Polônia; 8=
um produto medicinal e em outros países como Japão ou Estados Unidos, é classificada como aditivo alimentar de baixa BURDOCK, 1998; BANKOVA et japonesas serem relacionadas a alimentos ou química de alimentos, diferentemente dos países europeus e do Brasil, onde a se com a aplicação farmacêutica. A Figura 4 demonstra as 3
rópolis e seus respectivos países detentores.
de patentes sobre própolis por área de maior freqüência.
: 1= China; 2= Japão; 3= Rússia; 4= Coréia; 5= Romênia; 6= Alemanha; 7= Brasil
8 9 10
Publicações Patentes
Óleos essenciais e cosméticos
Alimentos e química de alimentos
Insumos farmacêuticos
De 2000 a 2008 foram contabilizados 2576 publicações cinetíficas sobre própolis no CAS, sendo a maioria destas pertencentes à China (715), o que reflete a nova potência econômica mundial e o poderio chinês, com 523 patentes (figura 5) de um total de 1322, destacando-se as patentes na área farmacêutica. A primeira publicação chinesa relata os efeitos farmacológicos e aplicação clínica de própolis (ZHIBIN, 1982). Desta forma a China que iniciou as pesquisas com própolis somente na década de 80, desbancou Rússia, e Japão tanto no número de publicações, quanto na quantidade de patentes.
Países
Figura 5: Publicações científicas e Patentes sobre própolis no período de 2000 a 2008
Legenda: 1= China, 2= Japão, 3= Rússia, 4= Coréia, 5= Brasil, 6= Alemanha, 7= Itália, 8= Ucrânia, 9= França, 10= Polônia, 11= Romênia.
O Brasil teve seu primeiro trabalho científico publicado em 1984, relatando a atividade antibacteriana de própolis contra Staphylococcus aureus, em comparação a outros antibióticos (SZEWCZAK et al., 1984). Já a primeira patente brasileira foi depositada somente em 1995, tratando-se de um gel dental contendo própolis em sua formulação, indicado para promover a limpeza dos dentes e prevenir gengivites (ITICE, 1995).
Até o ano de 2008, foram indexados 73 trabalhos científicos brasileiros sobre própolis no CAS, inúmeros destes com informações concentradas nos estudos químicos e biológicos da própolis. Portanto o Brasil é considerado um dos líderes em números de publicações, no entanto observa-se apenas 31 patentes depositadas no mesmo período (Figura 6).
Pereira et al. (2002) relatam que o reduzido número de patentes brasileiras, reflete-se ao fato da universidade brasileira não ter o hábito de proteger suas atividades de
0 100 200 300 400 500 600 700 800
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
PUBLICAÇÃO PATENTE
Nºde publicações e patentes
pesquisa por meio de patentes, ao contrário do Japão que d
em relação à publicação de trabalhos. A distribuição de todas patentes brasileiras de acordo com área de indexação está ilustrada na Figura 6, onde observamos que as patentes contendo própolis predominam nas áreas dos insum
alimentos.
Figura 6: Distribuição das patentes b período de 1995 a 2008.
Considerando a importância dos produtos apícolas de abelha com e sem ferrão, e que no estado do Maranhão
produz geoprópolis, o qual
presente trabalho visa realizar bioprospecção do geoprópolis de
cultivada na Baixada maranhense, como forma de demonstrar a potencialidade biológica deste produto natural.
0 2 4 6 8 10 12 14
Quantidade de patentes
pesquisa por meio de patentes, ao contrário do Japão que deposita maior número de patentes em relação à publicação de trabalhos. A distribuição de todas patentes brasileiras de acordo com área de indexação está ilustrada na Figura 6, onde observamos que as patentes contendo própolis predominam nas áreas dos insumos farmacêuticos, óleos essenciais e cosméticos, e
Áreas das patentes brasileiras
Distribuição das patentes brasileiras sobre própolis por área de indexação no
Considerando a importância dos produtos apícolas de abelha com e sem ferrão, e que no estado do Maranhão a meliponicultura, através do cultivo de abelhas sem ferrão,
polis, o qual possui características farmacológicas e químicas presente trabalho visa realizar bioprospecção do geoprópolis de Me
cultivada na Baixada maranhense, como forma de demonstrar a potencialidade biológica deste
Insumos farmacêuticos Óleos essenciais e cosméticos Alimentos e química de alimentos
Biorreguladores agroquímicos Métodos Bioquímicos Ligas metálicas
Detergenetes e agentes ativos de superfície
eposita maior número de patentes em relação à publicação de trabalhos. A distribuição de todas patentes brasileiras de acordo com área de indexação está ilustrada na Figura 6, onde observamos que as patentes contendo os farmacêuticos, óleos essenciais e cosméticos, e
rasileiras sobre própolis por área de indexação no
Considerando a importância dos produtos apícolas de abelha com e sem ferrão, e s do cultivo de abelhas sem ferrão, possui características farmacológicas e químicas próprias, o Melipona fasciculata, cultivada na Baixada maranhense, como forma de demonstrar a potencialidade biológica deste
Insumos farmacêuticos Óleos essenciais e cosméticos Alimentos e química de alimentos
Biorreguladores agroquímicos Métodos Bioquímicos Ligas metálicas
Detergenetes e agentes ativos de superfície
2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Realizar bioprospecção do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata Smith
2.2 Objetivos específicos
• Avaliar o efeito citotóxico, eficiência carrapaticida, atividade antifúngica e ação antioxidante dos extratos hidroalcóolicos de geoprópolis de Melipona fasciculata;
• Determinar qualitativa e quantitativamente os teores de polifenóis presentes no extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata Smith;
• Identificar frações e/ou substâncias isoladas do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata Smith;
• Indicar parâmetros para agregar valores ao geopropólis de Melipona fasciculata, como forma de contribuir para o desenvolvimento do agronegócio no Estado do Maranhão.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta e acondicionamento de geoprópolis
Os geoprópolis de Melipona fasciculata Smith foram coletados em meliponário da localidade Cauaçu, no município de Palmeirândia da Baixada maranhense, durante o mês de março de 2008, utilizando-se espátula esterilizada na parte interna da colméia e acondicionados em frasco de vidro escuro esterilizados e codificados como GP (NOGUEIRA, 2005; DUTRA, 2006).
O município de Palmeirândia possui área geográfica de 525,64 Km2,dividida em 3 distritos e 95 localidades. De acordo com dados do Censo 2007, Palmeirândia possui 18.105 habitantes e densidade demográfica de 35,2 hab/Km2, com latitude de 02º 38' 43” e longitude 44º 53' 42” (IBGE, 2007).
3.2 Análise sensorial de geoprópolis in natura
Os geoprópolis GP foram submetidos à análise sensorial de: aroma, cor e sabor (MARCUCCI, 1998; BRASIL, 2001).
3.3 Obtenção do extrato hidroalcoólico
Os geoprópolis (GP) foram turbolizados, em álcool etílico a 70%, macerados por 48h, e logo depois, filtrados para separação da parte inorgânica (terra). A solução extrativa obtida foi concentrada em evaporador rotativo e o extrato foi seco até peso constante. Foi determinada a percentagem de extrativos (NOGUEIRA, 2005; DUTRA, 2006; DUTRA et al., 2008). O extrato hidroalcoólico de geoprópolis foi codificado como EHAGP, acondicionado em frasco âmbar e mantido sobre refrigeração.
3.3.1 Análise sensorial do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)
O EHAGP foi submetido à análise sensorial de aroma, cor e sabor (MARCUCCI, 1998; BRASIL, 2001).
3.4 Bioprospecção do extrato hidroalcoólico de geoprópolis de Melipona fasciculata (EHAGP)
3.4.1 Avaliação da citoxicidade do extrato hidroalcoólico de geoprópolis (EHAGP)
O bioensaio foi realizado com ovos de Artemia salina, de acordo com o método de Meyer et al. (1982), com algumas modificações. Os ovos foram incubados em salina sintética, em estado de saturação de oxigênio e em temperatura ambiente. Após 48 horas, as larvas foram separadas dos ovos remanescentes e incubadas por mais 24 horas nas mesmas condições. Em seguida, estas larvas foram colocadas em soluções dos extratos hidroalcoólicos de geoprópolis nas concentrações de 10 µg/mL , 100 µg/mL e 1000 µg/mL por 24 horas. Após esse período houve a contagem das larvas sobreviventes.
Os ensaios foram realizados em triplicatas. Para obtenção da DL50, foi utilizada a regressão linear. Cada teste foi acompanhado de controle negativo, contendo apenas as larvas em salina sintética mantidas sob as mesmas condições descritas para o extrato hidroalcoólico de geoprópolis e do controle positivo com dicromato de potássio.
3.4.2 Atividade carrapaticida 3.4.2.1 Obtenção de carrapatos
Fêmeas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus ingurgitadas foram coletadas de bezerros mestiços, Holandês X Zebu, naturalmente infestados, e alocadas em estufa BOD, com temperatura de 27 ± 1 ºC e umidade relativa ≥ 80%, por 15 dias para a postura. Os ovos (0,2g equivalente aproximadamente a 4000 ovos) foram coletados e acondicionados em seringas descartáveis modificadas, e novamente levadas à estufa por 15 dias para a eclosão das larvas.
3.4.2.2 Teste de sensibilidade larvar
Foram utilizadas larvas com idade de 14 a 21 dias de eclosão. O teste de sensibilidade sobre larvas de R. (B.) microplus foi realizado de acordo com Stone; Haydock (1962) e adaptações de Leite (1988). Cerca de 156 a 214 larvas de carrapato foram colocadas entre dois papéis de filtro (2 X 2 cm cada), e impregnado com 0,4 mL do extrato EHAGP (250 mg/mL), formando um “sanduíche”. Este sanduíche foi colocado dentro de um envelope de papel filtro não impregnado, com pregadores plásticos. O envelope foi acondicionado em estufa a 27 ºC e UR ≥ 80%, durante 24 horas quando as larvas vivas e mortas foram contadas. Foram realizadas quatro repetições, utilizando como controle negativo etanol 70% e como contole positivo cipermetrina (50 mg/mL). Os resultados do teste de sensibilidade larvar foram corrigidos de acordo com a fórmula de Abbott (1925).
3.4.3 Atividade antifúngica 3.4.3.1 Microrganismos
Os microrganismos utilizados foram isolados clínicos obtidos de vários materiais procedentes de um laboratório particular de São Luís, os quais foram previamente identificados (Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida parapsilosis) e estocados no Laboratório de Micologia do Centro Universitário do Maranhão, durante o mês de janeiro de 2010.
3.4.3.2. Padronização do inóculo
As cepas ficaram mantidas em meio agar Sabouraud dextrose-cloranfenicol a uma temperatura de 4ºC, sendo os repiques de 24 horas feitos em meio BHI (Brooth Heart Infusion - Acumedia Manufactures) ou em meio RPMI-1640 líquido e incubados a 37 ºC em estufa BOD utilizados para os testes. Após crescimento, os inóculos fúngicos foram padronizados para aproximadamente 106UFC/mL de acordo com a turbidez do tubo 0,5 da escala de McFarland (CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute – NCCLS, 2002).
3.4.3.3. Teste para verificação da atividade antifúngica do extrato
Os isolados clínicos foram inoculados em meio líquido BHI (Brain Heart Infusion - Acumedia Manufactures) e incubados a 37°C/24h, em estufa bacteriológica, a fim de se obter uma turvação equivalente a 0,5 da escala de McFarland, correspondendo a uma concentração de 106 células/mL (CLSI, 2002). Os ensaios de avaliação da atividade antifúngica do extrato de geoprópolis foram conduzidos utilizando cavidades em placas proposto por McGinnis (1980) e com recomendações do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute – NCCLS, 2002). Utilizou-se placas de Petri de 100 x 20 mm de diâmetro, nas quais foram colocados 20 mL de ágar Sabouraud Dextrose (CRITERION Dehidrated Culture Media) fundido e preparado segundo recomendações do fabricante sobre o qual, após solidificação e incubação por 24hs a 37ºC em estufa bacteriológica, foram inoculados por semeadura (SHADOMY; ESPINEL-INGROFF, 2000) 100 µL da solução padrão dos inóculos, com auxílio de swabs estéreis. Alíquotas de 50 µL das soluções de extrato diluídas foram adicionadas em perfurações de aproximadamente 6mm de diâmetro feitas no meio de cultura sólido com cânulas de vidro estéreis. As soluções do extrato para uso foram preparadas diluindo-se as mesmas em Tampão Fosfato 0,1M pH 7,4 a 5% de etanol P.A, realizando-se diluições seriadas de 1:4, 1:6, 1:8. As soluções foram esterilizadas por filtração imediatamente antes do uso por meio de uma unidade filtrante estéril 0,22 µm (Millipore) (BENOUDIA et al., 1988, SHADOMY et al., 1995; McGINNIS, 1980).
O controle positivo foi preparado usando-se solução do fungicida fluconazol em concentrações de 1µg/mL para C. albicans e Candida parapsilosis, 4 µg/mL para C. tropicalis e 32 µg/mL para C. glabrata segundo recomendações do CLSI (2002). A solução de fluconazol foi preparada em tampão fosfato 0,1M pH 7,4 a 5% de etanol P.A, segundo recomendações utilizadas rotineiramente como padrão em estudos de atividade
antimicrobiana do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute – NCCLS, 2002). Utilizou-se tampão fosfato 0,1M pH 7,4 no seu estado original como controle negativo.
A atividade antifúngica do extrato foi verificada através da medição do halo de inibição (mm) do crescimento fúngico causado pelo extrato.
Os testes foram realizados em triplicatas e após 24 horas de incubação a 37°C, realizadas as medições dos diâmetros dos halos formados. Se o extrato apresentasse indução da formação de halos seria então diluído e suas respectivas diluições usadas em testes de microdiluição para estabelecimento da CIM (Concentração Inibitória Mínima) (Clinical and Laboratory Standards Institute – NCCLS, 2002).
3.4.4 Atividade Antioxidante
3.4.4.1. Análise qualitativa via CCD/ Revelação com DPPH
O EHAGP foi submetido à cromatografia em camada delgada (CCD), utilizando como adsorvente sílica gel 60 GF254 (MERCK), e como eluente hexano/ acetona (8:2), A placa foi ativada em estufa a 110º C, durante 2 horas, e eluída em cuba cromatográfica (COLLINS, et al., 1997). O cromatograma foi visualizado em lâmpada ultra-violeta - UV (254 e 366 nm), e revelado com borrifamento de solução de DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazil) 5%, para vizualização do perfil dos componentes com atividade sequestrante de radical livre. (WAGNER; BLANDT, 1995).
3.4.4.2. Análise quantitativa
A dosagem de atividade antioxidante foi realizada pelo método fotocolorimétrico in vitro de sequetro do radical livre estável DPPH (2,2-difenil-1-picrilidrazil), segundo Brand- Willians et al. (1995). As amostras foram preparadas a partir da solução dos extratos hidroalcóolicos de geopropólis com concentração de 500 µg/mL. As diluições foram realizadas em concentrações de 10, 25, 50, 100 µg/mL. A cada diluição preparada adicionou- se 1mL da solução de DPPH (40 µg/mL em etanol) a 3,0 mL de soluções dos extratos diluídos
em etanol. Os brancos foram feitos para cada concentração, que ao invés do DPPH, adicionou-se apenas 1 mL de etanol aos extratos diluídos nas mesmas concentrações das amostras. O controle negativo foi preparado com 1 mL de DPPH e 3,0 mL de etanol. Como controle positivo foi utilizado solução padronizada de rutina que possui alta capacidade antioxidante. A solução de DPPH possui uma coloração roxa intensa e a ação antioxidante de um extrato pode ser visualizada pelo progressivo descoloramento da solução, ao final do qual a mesma torna-se amarelada. Trinta minutos após a adição de DPPH às amostras, foi realizada a leitura em espectrofotômetro de UV-Vis em 517nm. O decréscimo nos valores de densidade ótica das amostras foi correlacionado aos do controle e estabelecida a percentagem de descoloração do radical DPPH, expressa pela equação:
%de inibição = (Absorbância controle – Absorbância amostra) x 100 Absorbância controle
3.4.5 Abordagem química do extrato hidroalcóolico de geoprópolis EHAGP
O EHAGP foi submetido à abordagem química para verificação de compostos das classes dos fenólicos, alcalóides e terpenos (MATOS, 1997).
3.4.6 Determinação da concentração total de flavonóides do extrato hidroalcoólico de geoprópolis EHAGP e da subfração C320
A concentração de flavonóides foi determinada utilizando o método colorimétrico com cloreto de alumínio (AlCl3) para formar o complexo, usando espectrofotômetro Cary 50 UV-Vis a 425 nm. Concentrações de quercetina (Merck) foram usadas como padrões e os resultados obtidos foram expressos como grama (g) de quercetina por 100 mL de extrato hidroalcoólico de geoprópolis (%). (WOISKY; SALATINO, 1998; CHAILLOU et al, 2004; FUNARI; FERRO, 2006).
