PRÁTICA
G I N E C O L O G I A E O B S T E T R Í C I A
Suplemento Rev N.º 21
Maio 2007
1
Clínica Universitária de Genética da Faculdade de Medicina de Coimbra. 2
Serviço de Genética Médica e Reprodução Humana dos Hospitais de Universidade de Coimbra. 3
Centro de Neurociências e Biologia Celular de Coimbra (CNC).
4
Departamento de Zoologia da Faculdade de Ciências e Tecnologia de Universidade de Coimbra.
Os ovários são órgãos pares, situados de cada lado do útero, tendo uma forma oval achatada, com 3 a 5 cm na sua maior dimensão. É neles que se processa a ovogénese. Os ovários
têm também uma função endócrina, produzindo estrogénios e proges-terona que sincronizam a actividade do tracto genital e da glândula mamá-ria com o ciclo menstrual.
No ovário identifica-se uma zona periférica designada córtex e uma central denominada medula. No cór-tex há numerosos folículos em diver-sos estádios de desenvolvimento, bem como folículos pós-ovulatórios, chamados corpus luteum e corpus albicans (o segundo formado por regressão do primeiro).
No ovário de uma mulher jovem os folículos primordiais são os mais numerosos constituindo a população a partir da qual uma coorte inicia o processo de maturação. O folículo primordial é composto por um ovóc-ito primário envolvido por uma camada de células foliculares acha-tadas. O ovócito primário tem, apro-ximadamente, 25 µm de diâmetro, apresentando um núcleo volumoso e um citoplasma relativamente reduzi-do em relação ao volume total da célula.
Quando estimulado pelas hormonas hipofisárias o folículo primordial aumenta de volume e transforma-se num folículo primário. Neste, o ovócito já tem maiores dimensões, e as células foliculares aumentam o seu tamanho e número originando as células da granulosa, algumas das quais, após a ovulação se mantêm ligadas ao ovócito formando o cumu-lus ophorus. Entre o ovócito e as células foliculares desenvolve-se uma membrana glicoproteica deno-minada zona pelúcida.
Preservação da fertilidade da mulher - Perspectivas actuais
Teresa Almeida Santos1,2, Raquel Brito2e João Ramalho-Santos3,4
Figura 1 – Esquema do ovário humano mostrando os diferentes estádios do desenvolvimento do ovócito.
Os folículos primários desenvolvem-se e originam os folículos secundários, que se encontram localizados mais pro-fundamente no córtex ovárico.
O córtex de um ovário humano apre-senta um número finito de células germinativas primordiais, o qual vai decrescendo ao longo da vida da mulher, como consequência das ovu-lações e da atrésia (Fig.2). No momento do nascimento, o número de ovócitos primários é de cerca de dois milhões, tendo a população de células germinativas atingido um máximo de sete milhões a meio da gestação. Por altura da menarca exis-tem apenas 300.000 folículos (1). A “perda “ de folículos aumenta
con-sideravelmente por volta dos 37,5 anos, existindo, nessa altura, cerca de 1000 folículos. Inicia-se, então um decréscimo da função endócrina, começando a mulher a entrar no cli-matério (2). Associada a este proces-so ocorre também uma redução da qualidade ovocitária que poderá estar associada a uma disfunção mitocon-drial (3). A data exacta da menopausa é determinada, quer pela quantidade inicial de células germinativas, quer pela sua deplecção ao longo da vida. No mundo ocidental a idade média em que ocorre a menopausa situa-se nos 51 anos (2).
Nas mulheres submetidas a tratamen-tos de quimioterapia e/ou radioter-apia por doença neoplásica pode sur-gir uma menopausa precoce, dado que estes tratamentos afectam as células em divisão, comprometendo assim, a gametogénese e mesmo a função endócrina do ovário. Este efeito gonadotóxico tem particular importância na medida em que a sobrevida das mulheres após estas tarapêuticas tem tido um aumento significativo nos últimos anos, par-ticularmente nas pacientes mais jovens (4). Usando um modelo matemático estimou-se que uma redução de 90% da população de células germinativas que ocorra por volta dos 14 anos, origina falência ovárica precoce permanente (menopausa) por volta dos 27 anos de idade (2).
A criopreservação de esperma-tozóides é uma realidade actualmente e não envolve tecnologias muito complexas. Porém, a preservação de gâmetas femininos implica grandes dificuldades de índole diversa, nomeadamente na sua obtenção e na conservação a longo prazo.
É absolutamente necessário discutir com os doentes oncológicos as opções disponíveis em termos de fer-tilidade e de possibilidades reprodu-tivas futuras. Esta realidade é parti-cularmente importante nas mulheres jovens com cancro da mama, antes de proceder a quimioterapia. Acresce que se verifica em todo o mundo desenvolvido uma tendência gene-ralizada para adiar o casamento e protelar a primeira gravidez, o que torna esta situação mais premente já
que, se não forem tomadas medidas para preservar a fertilidade antes de iniciar o tratamento, a lesão ovárica e a subsequente menopausa prematura poderão impedir uma gravidez no futuro.
1 -Estratégias para a Preservação da Fertilidade
Existem actualmente três métodos possíveis para a preservação da fertilidade nas pacientes portadoras de neoplasias em risco de falência ovárica permanente: 1) vação de Embriões; 2) vação de Ovócitos; 3) Criopreser-vação de Tecido Ovárico.
O processo de criopreservação requer, primeiramente a escolha do crioprotector ideal em consonância com um protocolo de congelação e descongelação adaptados às células que se pretende criopreservar. No caso dos gâmetas femininos, o maior problema reside na formação de cristais de gelo intracelular capazes de originar lesões que podem levar à lise da célula. Outra dificuldade advém da toxicidade dos crioprotec-tores utilizados e consequentemente o tempo de exposição das células aos mesmos.
1.1 - Criopreservação de Embriões
Em 1985 foi descrito o primeiro caso, na espécie humana, de um nascimento após transferência de embriões congelados (5). Actual-mente esta técnica encontra-se amplamente difundida e com ele-vadas taxas de sucesso.
As pacientes portadoras de doenças
oncológicas podem recorrer à estim-ulação ovárica e à punção folicular e posterior inseminação por Fecun-dação in vitro (FIV) ou por Microinjecção de espematozóides (ICSI) antes de iniciar a terapêutica ou durante um intervalo nos trata-mentos (6). Infelizmente esta técnica não é aplicável a todas as doentes com cancro sendo, por exemplo, inadequada em raparigas antes da puberdade e pouco aceitável para mulheres solteiras que não desejem o uso de esperma de um dador. Para além disto, todo o processo de estimulação hormonal pode necessi-tar de algumas semanas, podendo representar um atraso considerável nos tratamento oncológicos. Acresce que, nas doentes com tumores hor-mono-sensíveis (ex: cancro da mama), a exposição a níveis elevados de estrogénios pode ter um efeito deletério.
1.2 - Criopreservação de Ovócitos
A criopreservação de ovócitos é, teo-ricamente, uma alternativa interes-sante ao congelamento de embriões. No entanto, apesar de os resultados terem sido bastante animadores em animais (7;8), o processo de conge-lação de ovócitos humanos tem-se revelado pouco eficaz e até mesmo frustrante. As taxas de sobrevivência e fecundação pós-descongelação des-critas são muito variáveis apresen-tando valores que oscilam entre os 25 e os 69% (9;10). Por outro lado, tal como na criopreservação de embriões, também é imprescindível a esti-mulação hormonal dos ovários. A criopreservação de ovócitos
madu-ros é uma técnica bastante complexa, muito mais exigente do que a dos embriões, uma vez que os gâmetas femininos são muito sensíveis a modificações de temperatura e apre-sentam deficiente capacidade de recuperação de lesões citoplasmáti-cas (11;12). Os ovócitos humanos podem ser criopreservados no está-dio de Metafase II ou de Vesícula Germinativa (Profase I).
1.2.1. - Ovócitos Maduros (Metafase II)
Os ovócitos maduros encontram-se em metafase II. Nesta fase, a célula está altamente organizada exibindo
uma zona pelúcida, um fuso acro-mático e grânulos corticais (Fig.2). Qualquer dano que ocorra em algu-ma destas estruturas poderá produzir efeitos negativos na viabilidade e funcionalidade da célula após a descongelação. Na metafase II os cromossomas do ovócito encontram-se alinhados ao longo dos microtúbu-los do fuso acromático os quais são
sensíveis à temperatura e às soluções crioprotectoras. Os microtúbulos são responsáveis pela separação das cromátides-irmãs que ocorre na 2ª divisão da meiose. Assim, qualquer alteração nestas estruturas pode levar a processos de não-disjunção e, con-sequentemente, a um risco aumenta-do de aneuploidias ou poliploidias (13;14;15).
A criopreservação de ovócitos ma-duros apresenta-se como uma opção bastante atractiva no campo da Reprodução Medicamente Assistida. No entanto, as taxas de viabilidade e fecundação pós-congelação são bas-tante variáveis assim como as gravi-dezes documentadas (16;17;18).
Estes resultados poderão estar intimamente relacionados com as lesões resultantes dos processos de congelação/descongelação, dada a elevada sensibilidade destas células. As principais alterações associadas à congelação/descongelação podem afectar diferentes sistemas celulares sendo exemplos a ruptura na mem-brana citoplasmática do ovócito, alterações na configuração do fuso acromático e, consequentemente, alterações nos cromossomas (19). As variações nas taxas de sobre-vivência dos ovócitos descongelados estão relacionadas com factores mor-fológicos e biofísicos. A presença de cumulus oophorus parece desempen-har um papel muito importante na protecção do ovócito contra os efeitos adversos dos crioprotectores e da temperatura. O principal factor biofísico que afecta a taxa de sobre-vivência pós-congelação é a for-mação de gelo intra-celular que pode
Figura 2 – Ovócitos humanos maduros (MetafaseII). A) Ovócito rodeado pelas células do cumulus; B) Ovócito depois de desnudado sendo evidentes a zona pelúcida e o primeiro globo polar localizado no espaço perivitelino.
A
levar à lise da célula (20).
Ultimamente, têm sido descritos pro-tocolos que incluem o uso de eleva-das concentrações de sacarose junta-mente com 1,2-propanodiol. Os pro-tocolos mais antigos referenciavam concentrações da ordem de 0,1M/L de sacarose, não se tendo revelado eficazes no processo de desidratação do ovócito pré-congelação e conse-quentemente, originando gelo intra-celular. Efectivamente, concentra-ções mais elevadas de sacarose (0,3M/L) parecem ser as ideais para atingir os níveis de desidratação que impedem a formação de gelo intra-celular (21). Com estas concentra-ções são alcançadas taxas elevadas de sobrevivência pós-congelação (74% vs 35%) e de fecundação. Ficam no entanto por explicar as baixas taxas de implantação obtidas (17,18).
1.2.2 - Ovócitos Imaturos - Vesícula Germinativa
Uma alternativa à congelação de ovócitos em metafase II parece ser a utilização de ovócitos em fase de vesícula germinativa (VG).
Os ovócitos nesta fase de VG já apre-sentam o seu tamanho máximo (Fig.3) e a cromatina encontra-se em diplóteno da Profase I e, como tal, não existe fuso acromático. Mas, ao contrário dos gâmetas que sofreram maturação in vivo e se encontram em MII, os ovócitos colhidos naquele
estádio requerem um período de ma-turação in vitro pós-descongelação, prévio ao processo de fecundação. O processo de maturação in vitro de
ovócitos imaturos foi inicialmente descrito em animais tendo-se verifi-cado que ovócitos imaturos de coe-lho removidos do ovário apresen-tavam a capacidade de atingirem espontaneamente um estado de matu-ração in vitro (21). Já em 1965 foram obtidos resultados semelhantes na espécie humana (22). Esta técnica é muitas vezes utilizada na tentativa de amadurecimento (“rescue tech-nique”) de ovócitos imaturos colhi-dos para fecundação in vitro (FIV). No entanto, na maioria dos casos estes ovócitos foram previamente desnudados (isolados das células da granulosa) para uma melhor visual-ização do seu estado de maturação e, consequentemente, são colocados em cultura sem o seu “invólucro” natu-ral. Vários estudos revelaram que esta técnica induz a formação de ovócitos com potencial de fecun-dação reduzido podendo pensar-se que estes ovócitos imaturos terão à partida alterações do processo de
maturação já que, apesar de terem sido submetidos a elevados níveis exógenos de gonadotrofinas in vivo, estas células não tiveram capacidade de amadurecer, será então pouco provável que in vitro a maturação ocorra de forma fisiológica.
O recurso à utilização de ovócitos imaturos retirados de folículos que não tenham sofrido qualquer tipo de estimulação hormonal poderá ser uma alternativa a considerar (23). No entanto, os processos de maturação in vitro ainda requerem optimização ao nível da constituição ideal dos meios de maturação e da melhor téc-nica de fecundação a utilizar (fecun-dação in vitro vs microinjecção de espermatozóides). Assim, o uso destas células envolve dois problemas: um relacionado com a congelação em si, o outro com a maturação.
1.3. – Criopreservação de Tecido Ovárico
A criopreservação de tecido do
cór-tex ovárico parece ser uma aposta bastante promissora para a preser-vação da fertilidade da mulher (24). As amostras de tecido do córtex podem ser colhidas da paciente em qualquer fase do ciclo menstrual, através de laparoscopia.
O córtex do ovário alberga uma enorme quantidade de folículos pri-mordiais que por serem pequenos e pouco diferenciados, desprovidos de zona pelúcida e de células da granu-losa, apresentam uma maior tolerân-cia à criopreservação e posterior descongelação. O tecido ovárico depois de descongelado deverá repor a função endócrina e a fertilidade. Desta forma poderão ser evitados inúmeros problemas éticos e morais. Também é de realçar que nesta técni-ca não é necessária qualquer estimu-lação hormonal, nem ocorre o atraso consequente no início da terapêutica anti-neoplásica (Fig.4).
Existe, no entanto, um risco poten-cial: a possibilidade de criopreservar tecido ovárico com células
neoplási-cas. É por isso premente efectuar, por rotina, uma avaliação histológica dos fragmentos do tecido colhido antes de realizar a criopreservação.
A criopreservação de tecido ovárico começou por ser realizada em ratinh-os, ratazanas e hamsters (25;26;27) e após descongelação o tecido ovárico foi agrafado sob a pele dos animais o que originou gravidezes e descen-dência. Nestas circunstâncias o crio-protector utilizado foi o glicerol. Mais tarde, em carneiros e utilizando o dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector, em conjugação com a técnica de slow-freezing, o trans-plante do tecido pós-congelação resultou em actividade cíclica dos ovários e em gravidezes, estando documentado o nascimento de um carneiro vivo (28).
Desde então, têm sido descritos vários casos de sucesso em diferentes espécies animais, incluindo um pri-mata não humano, embora neste caso o implante de tecido tenha sido feito sem congelação (29).
Os primeiros casos descritos de crio-preservação de tecido ovárico na espécie humana remontam ao ano de 1996 (30;31).
2 – Exposição aos Crioprotectores
A primeira etapa em qualquer proto-colo de criopreservação é tentar atin-gir um equilíbrio entre as células e o crioprotector. Todos os crioprotec-tores apresentam características comuns nomeadamente o facto de serem completamente miscíveis em água e a capacidade de facilmente serem incorporados pelas
branas celulares. Existe uma enorme variedade de crioprotectores, sendo a sua principal função proteger as célu-las dos efeitos da exposição ao frio, estabilizando a estrutura celular e evitando a formação de cristais de gelo intracelular, principais cau-sadores de danos na célula. O factor que mais influencia a resposta da célula à congelação é a relação entre a área de superfície da célula e o
vo-lume da mesma. Isto é, quanto maior a célula, mais lento deve ser o arrefecimento no processo de conge-lação (Tabela I).
3 – Directrizes Clínicas para a Criopreservação de Tecido Ovárico
Devido ao crescente interesse que se tem verificado na criopreservação de tecido ovárico é necessário que sejam traçadas directrizes clínicas relativas aos diferentes procedimentos.
A criopreservação de tecido ovárico deve ser realizada como procedimen-to laboraprocedimen-torial, a título experimental, tendo em consideração os aspectos mencionados nas directrizes
interna-cionais (32;33;34). As pacientes devem ser informadas acerca das opções que existem para a preser-vação da sua fertilidade e devem ser devidamente orientadas e aconsel-hadas acerca do aspecto experimen-tal do procedimento em questão (33). A criopreservação de tecido ovárico só deverá ser oferecida a mulheres que estejam em risco perder a sua fertilidade e que apresentem um
prognóstico favorável pós-terapia oncológica.
4. - Desafios na Criopreservação de Tecido Ovárico
A criopreservação de tecido ovárico e possível transplante apresenta-se como uma alternativa promissora para a preservação da fertilidade em mulheres com doença neoplásica. No entanto, é necessário acautelar deter-minadas questões como a isquémia (por deficiente neovascularização do tecido) e o possível risco de trans-missão de células neoplásicas.
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Tabela I – Comparação de características que influenciam a criosensibilidade e a adequabilidade para o crio-armazenamento entre ovócitos em diferente estádios de desenvolvimento. (Adaptado de Shaw et al.,)
Material Tecido Ovárico Ovócito Imaturo(VG) Ovócito Maturo(MII)
Disponibilidade Inumeros; Sempre
presentes
Escassos; Apenas nos
folículos antrais Escassos
Obtenção Fácil (biópsia) Punção ovocitária Punção ovocitária
Tamanho (µm) <50 µm 80-300 µm (depende espécie)
80-300 µm (depende espécie)
Células Suporte Poucas; Pequenas Muitas corona/cumulus
Muitas corona/cumulus
Fase Nuclear Profase I;
Membrana nuclear
VG: Membrana nuclear
Metafase II; sem membrana nuclear
Zona Não Sim Sim
Grânulos Corticais Não Centrais Periféricos
Lípidos Intracelulares Poucos Podem ser abundantes
Podem ser abundantes
Taxa Metabólica Baixa Baixa Baixa
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