Código: Formato: 50411002 3 x 12 testes
Chlamydia trachomatis IgA
Somente para Uso Diagnóstico in Vitro
Uso Pretendido
O kit ImmunoComb® Chlamydia trachomatis IgA é um teste EIA rápido para a determinação qualitativa de anticorpos IgA para
Chlamydia trachomatis, em soro ou plasma humano. Podem ser
realizados trinta e seis testes com um kit.
Introdução
As Chlamydias são bactérias Gram negativas, sem motilidade, com um ciclo de vida intracelular obrigatório em células eucarióticas. O gênero Chlamydia inclui 4 espécies: C.
trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae e C. pecorum, que em
largo espectro causam doenças humanas e animais bem conhecidas e caracterizadas. As quatro espécies possuem um antígeno lipopolissacarídeo (LPS) gênero específico comum, além de antígenos protéicos de membrana espécie-específicos. A Chlamydia trachomatis é conhecida como o agente causador do tracoma. Entretanto, a infecção genital devido à C. trachomatis é a doença sexualmente transmitida (DST) mais comum em muitos países. Os tipos mais freqüentes de DST induzidas por C.
trachomatis são: infecções urogenitais, especialmente a uretrite
não-gonocócica (UNG) e epididimite nos homens e doença inflamatória pélvica (DIP) nas mulheres. Embora geralmente assintomática, a infecção não diagnosticada nas mulheres pode levar a salpingite aguda, com alto risco de gravidez ectópica ou infertilidade tubária. Também foram reportadas conjuntivite neonatal e pneumonia, provavelmente adquiridas durante a passagem através do canal de nascimento infectado.
O processo tradicional para diagnóstico laboratorial para C.
trachomatis é o isolamento em cultura de células. Entretando, a
cultura exige condições rigorosas de coleta e transporte, bem como técnicas especializadas e equipamentos caros. Os métodos de detecção direta de antígenos, tais como o imunoensaio enzimático (EIA) e o ensaio de imunofluorescência direto (IFD) ainda são influenciados pela carência de amostras adequadas que afetam o desempenho do teste, principalmente a sensibilidade. A hibridização baseada em ácidos nucléicos e testes de amplificação fornecem altos níveis de especificidade e sensibilidade. Além disso, os métodos moleculares são caros e requerem um alto nível de habilidade para realizar e analisar o teste corretamente.
A detecção sorológica de anticorpos para Chlamydia é um meio mais conveniente e altamente sensível para diagnosticar as infecções por Chlamydia. Este método também facilita o diagnóstico em casos de acesso físico problemático. Entretanto, na maioria dos testes, a reação cruzada entre as espécies impede a interpretação clínica significativa dos resultados. O teste de microimunofluorescência (MIF), que permite a discriminação entre
as espécies, requer um alto nível de habilidade para ser realizado e interpretado adequadamente.
Os anticorpos IgA anti-C. trachomatis indicam o estado ativo em infecções agudas, crônicas ou recorrentes por Chlamydia. Eles confirmam os resultados positivos de IgG anti-C. trachomatis e podem ajudar no acompanhamento do tratamento com antibiótico. Além disso, estudos clínicos sugerem um alto grau de correlação entre o nível de IgA anti-Chlamydia e a presença atual de antígenos de Chlamydia.
O kit ImmunoComb® Chlamydia tracomatis IgA utiliza amplamente os antígenos sorotipo L2 que reagem fortemente com outros sorotipos para a identificação e quantificação de anticorpos IgA anti-C. trachomatis.
Princípio do Teste
O teste ImmunoComb® Chlamydia trachomatis IgA é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções (“dentes”). Cada dente está sensibilizado na superfície em duas posições:
Ponto superior – anticorpos de cabra para IgA humana (Controle Interno)
Ponto inferior – antígenos de C. trachomatis inativados
A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo o Pente de fileira a fileiracom incubação em cada etapa.
Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-C.trachomatis, se presentes na amostra, ligam-se especificamente aos respectivos antígenos de Chlamydia no ponto inferior de cada dente do Pente (figura 1). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, as IgA anti-C. trachomatis capturadas nos pontos inferiores dos dentes e as imunoglobulinas humanas dos pontos superiores (Controle Interno), reagem com anticorpos anti-IgA humana marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada reage com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente.
Ligação do conjugado IgA anti-hum ana; 20 min
Reação enzim ática de cor; 10 min Anticorpo anti-C. trachom atis
Substrato crom ogênico Conjugado IgA anti-hum ana
FA FA
FA
Form ação do com plexo
anticorpo-antígeno C. trachom atis; 40 m in
Figura 1. Princípio do Teste
O kit inclui um Controle Positivo (anticorpos IgA anti-C.trachomatis) e um Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto inferior bem fraco. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar que o kit está funcionando adequadamente e que o teste foi realizado corretamente.
Conteúdo do Kit
Pentes
O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente é sensibilizado com duas áreas reativas:
Ponto superior – anticorpos de cabra para IgA humana (Controle Interno)
Ponto inferior – antígenos C. trachomatis inativados
Figura 2. Pente
Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante.
Placas Reveladoras
O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio.
Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada.
O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra Fileira B Solução de lavagem
Fileira C Anticorpos de cabra anti-IgA humana marcados com fosfatase alcalina
Fileira D Solução de lavagem Fileira E Solução de lavagem
Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazólio (NBT)
Figura 3. Placa Reveladora
Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,5 mL de
plasma humano inativado pelo calor, diluído a um título ImmunoComb de 1:8 para IgA anti- C. trachomatis.
Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,4 mL de plasma
humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para Chlamydia.
Perfurador – para a perfuração da folha de alumínio que cobre as
cavidades da Placa Reveladora.
Segurança e Precauções
• Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes.
• Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos de laboratório aceitos para trabalhar com soro ou plasma. • Não pipetar com a boca.
• Descartar todas as amostras, Pentes* , Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante.
• Não misturar reagentes de lotes diferentes. • Não usar o kit após o vencimento.
Armazenamento e Estabilidade do kit
• O kit é fornecido de 2-8 ºC. Durante o transporte o kit podeser conservado a ≤30ºC por períodos curtos de tempo não excedendo o total de 48 horas.
• Armazenar os componentes na embalagem original de 2-8ºC. • Não congelar o kit.
* A menos que sejam armazenados para documentação posterior. • Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser
armazenados de 2-8ºC.
• O desempenho do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do kit, quando armazenado de 2-8ºC.
• Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser utilizados mais do que três vezes.
Manipulação de Amostras
• Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação.
• As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2-8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a -20 ºC ou inferior.
• Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a 10.000 g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
• Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio.
Procedimento do Teste
Material Necessário
• Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 25 µL.
• Tesoura.
• Cronômetro ou relógio de laboratório.
Preparando o Teste
Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22-26 ºC.
Preparando a Placa Reveladora
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22–26 ºC) por 3 horas. Trazer todos os componentes (Pentes, controles e amostras) à temperatura ambiente.
2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora.
Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste.
Preparando o Pente
Precaução: Para assegurar o funcionamento apropriado do teste,
não tocar nos dentes do pente.
1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente.
2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente:
a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número “11” do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados.
b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (n0 de testes + 2 controles).
c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2–80C para uso posterior.
ImmunoComb®
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Figura 4. Quebrando o Pente
Instruções do Teste
Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11
ImmunoComb®
1. Pipetar 25 µL de uma amostra. Perfurar a cobertura de
alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando a ponteira com a solução repetidamente. Descartar a ponteira.
2. Repetir o passo 1 para as outras amostras e para os dois controles. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle.
3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles.
Agitar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes.
b) Deixar o Pente na fileira A por 40 minutos. Ajustar o cronômetro. Próximo ao término dos 40 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário.
c) Ao final dos 40 minutos, retirar o Pente da fileira A.
Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em
papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes.
Primeira Lavagem (Fileira B)
4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c.
Ligação do Conjugado (Fileira C)
5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 3a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e
absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D)
6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.
Terceira Lavagem (Fileira E)
7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e
absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F)
8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos, retirar o Pente.
Reação de Parada (Fileira E)
9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre.
Armazenamento da parte não utilizada
do kit
Placa Reveladora
Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso futuro:
• Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada.
Outros materiais do kit:
• Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit.
Armazenar a 2-8 ºC.
Resultados dos Testes
Validação
Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as quatro condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5).
1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do
Pente.
2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior
(Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados.
3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior
(Controle interno).
Se alguma destas quatro condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e os controles devem ser retestados.
Controle Positivo
Controle
Negativo NulosResultados
Figura 5. Validação dos testes
Leitura e Interpretação dos Resultados
TriagemComparar a intensidade do ponto inferior do dente de cada amostra com o ponto inferior no dente do controle positivo (Figura 6).
• Um ponto com coloração mais intensa ou igual a do
controle positivo é considerada um resultado positivo com
título no ImmunoComb maior ou igual a 1:8, indicando uma infecção ativa por Chlamydia.
• Nenhum ponto ou um ponto com coloração menos intensa deve ser considerado um resultado negativo.
Figura 6. Resultado dos Testes
Documentação dos resultados
Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior.
* Os títulos ImmunoComb geralmente são comparáveis aos títulos MIF.
Limitações
Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros testes laboratoriais realizados com o paciente.
Em adição, o resultado obtido deve ser confirmado por um segundo teste com uma amostra adicional do paciente três semanas após o primeiro teste.
Características de Desempenho*
O desempenho do kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis
IgA foi comparado com técnicas diferentes pelo teste total com
670 amostras.
Tabela 1. Resultados do Testes de Amostras Negativas Testadas em Avaliações Clínicas
Tipo de Amostras Nº de Amostras Especificidade
Doadores de Sangue 100 97 % (EIA*) Mulheres 6 dias pós-parto 107 95% (MIF*) Pacientes Hospitalizados 11 (MIF*)
Tabela 2. Resultados dos Testes de Amostras Positivas Testadas em Avaliações Clínicas
Tipos de Amostras Nº de amostras Sensibilidade
EIA* MIF*
Mulheres com
esterilidade das trompas falopianas 195 87% 81% Mulheres com esfregação cervical positivo 218 55% 58%
Pacientes Hospitalizados 39 N/A 97.5% * Técnica de Referência
As seguintes características foram calculadas com MIF e EIA como referência:
• Especificidade – 96% (MIF/EIA)
• Sensibilidade – 87% (EIA) – 81% (MIF) para amostras de mulheres com esterilidade das trompas falopianas.
• Sensibilidade – 55% (EIA) – 58% (MIF) para amostras de mulheres com esfregaço cervical positivo.
Resultado Negativo
Positivo Controle
Anticorpos IgA contra
≤
no título ImmunoComb ≥ 1:8• Sensibilidade – 97.5% (MIF) para amostras de pacientes
hospitalizados.
* Informação detalhada disponível mediante solicitação.
Repetibilidade
10 pentes foram escolhidos aleatoriamente de várias partes de um lote de produção. Um soro foi testado 12 vezes nestes pentes. Em todos os casos foram detectadas as amostras positivas.
Reprodutibilidade
Quatro amostras foram testadas em pentes retirados de 3 diferentes lotes de produção.
Em todos os casos foram detectadas as amostras positivas.
Reação Cruzada
A reação cruzada com amostras positivas para Hepatite C, EBV, Toxoplasmose, Mycoplasma ou Coxiella burnetti foi considerada insignificante. Interferências muito pequenas com amostras positivas para Chlamydia penumoniae, HIV ou CMV não podem ser excluídas.
Interferência
Não foram observadas interferências com amostras hemolíticas (hemoglobina acima de 10 mg/ml); lipêmicas (colesterol acima de 281,6 mg/dl); triglicérides (381,0 mg/dl) e bilirrubina elevada (acima de 20 mg/dl).
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Registro e Distribuição:
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Santo Agostinho- CEP: 30.170-020
Belo Horizonte-MG
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CONSERVAR ENTRE 2-8ºC
Lote Vide Embalagem
Data de Validade Vide Embalagem
SOMENTE PARA USO
DIAGNOSTICO in vitro
Versão: 50411002/B9/OR (05/2010)Resumo dos Principais Procedimentos do Teste
1
2
3
4Incubação prévia da placa reveladora: 3 horas à temperatura ambiente ou 20 min. a 37ºC.
Retire amostras e controles. Adicione amostras e controles à coluna A. Misture.
Retire o pente da embalagem.
5
6
7 8Inserir o pente na coluna A e misture. Incube.
Abra a coluna B. Absorva o líquido aderente dos dentes.
Inserir o pente na coluna B e agite. Incube.
Depois misture/agite e incube nas
colunas C, D e E... 9
10
Reação de cor na coluna F. Resultados.
