Caracterização das proteinas TIPRL e alfa4, reguladores de fosfatases 2A

INSTITUTO DE BIOLOGIA

Tese apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção do Título de Doutor em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética Animal e Evolução.

Orientador: Prof. Dr. Nilson Ivo Tonin Zanchin

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA – UNICAMP

Título em inglês: Characterization of the type 2A phosphatase regulatory proteins, TIPRL and

alpha4.

Palavras-chave em inglês: Proteins – Analysis; Yeast two-hybrid; TIP41 protein; TAP42

protein; Protein phosphatase 2A.

Área de concentração: Genética Animal e Evolução. Titulação: Doutora em Genética e Biologia Molecular.

Banca examinadora: Nilson Ivo Tonin Zanchin, Aline Maria da Silva, Sergio Schenkman, Kleber

Gomes Franchini, Jörg Kobarg.

Data da defesa: 17/03/2009.

Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular.

Smetana, Juliana Helena Costa

Sm39c Caracterização das proteínas TIPRL e alpha4,

reguladoras de fosfatases 2A / Juliana Helena Costa Smetana. – Campinas, SP: [s.n.], 2009.

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin.

Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

1. Proteínas - Análise. 2. Duplo-híbrido de levedura. 3. Proteína TIP41. 4. Proteína TAP42. 5. Proteína fosfatase 2A. I. Zanchin, Nilson Ivo Tonin. II.

Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

A

Agradeço ao LNLS pela oportunidade de desenvolver este projeto e pela excelente infra-estrutura oferecida, e ao CNPq e à FAPESP pelo apoio financeiro.

Ao meu orientador, Nilson I. T. Zanchin, por me aceitar em seu grupo e acreditar em meu potencial como pesquisadora.

Às funcionárias do LBM, que oferecem todo apoio e mantêm nosso laboratório funcionando - Adriana C. Alves Pinto, Celisa C. Tonoli, Margareth S. Navarro, Elaine C. Teixeira, Givanil L. Garrido, Maria Eugenia Camargo, Tereza C. Lima Silva. Agradeço à Adriana, Elaine, e Tereza também pela grande contribuição a este projeto e pelas missões impossíveis que aceitaram.

Ao programa de pós-graduação em Genética e Biologia Molecular da UNICAMP e à secretária Lourdes pelo apoio.

Aos colegas de laboratório Beatriz S. C. Alves, Thais H. Vaz, Patricia P. Coltri, Daniela S. Razolli, Sandra M. N. Scapin, Flavia R. G. Carneiro, Juliana F. Oliveira, Carlos R. C. Paier, Luis Gustavo Morello, Cédric Hesling, Deivid L. Migueleti, Tiago V. Seraphim pela amizade e excelente convivência. Agradeço também à Sandra, ao Carlos e à Daniela pela colaboração direta neste projeto, e ao Cédric pelos primeiros ensinamentos na arte de cultivar células.

Aos colegas da sala ao lado - Daniel M. Trindade, Gustavo C. Bressan, Daniel C. F. Lanza, Alexandre J. C. Quaresma, Marcos Alborguetti, e Flavia C. Nery pela amizade e troca constante de experiências.

Aos membros das bancas de qualificação e pré-banca - Alessandra Alves de Souza, Jörg Kobarg, Maria Cristina C. G. Marcondes, Sandro R. Valentini, pelas ótimas sugestões sobre o desenvolvimento deste trabalho, e aos membros da banca de tese (página III) por aceitar este convite.

Aos ex-estagiários Romenia R. Domingues, Helder A. Silva e Leandro Vieira pela ajuda na expressão e purificação de proteínas.

pela ajuda na interpretação dos dados de dicroísmo circular.

À minha família, e em especial à minha mãe Valquíria Edna Costa, que sempre me apoiou em todas as minhas decisões. E ao pequeno mestre Alysson Fernandes Mazoni, que fez tudo valer a pena.

Í

LISTA DE ABREVIAÇÕES 8

RESUMO 14

ABSTRACT 15

1.INTRODUÇÃO 1

1.1. Vias de sinalização celular 1

1.2. As fosfatases do tipo 2A 2

1.3. Participação das fosfatases 2A na via de sinalização da quinase TOR em

levedura 5

1.4. Participação das fosfatases 2A na via de sinalização da quinase mTOR em

mamíferos 11 1.5. As proteínas α4 e TIPRL 14 1.6. Referências bibliográficas 20 2.OBJETIVOS 28 3.RESULTADOS 29 3.1 31

Low resolution structure of the human α4 protein (IgBP1) and studies on the stability of α4 and of its yeast ortholog Tap42

3.2. 43

Identificação de proteínas que interagem com TIPRL no sistema do duplo-híbrido em levedura

3.3 63

Interaction analysis of the heterotrimer formed by the phosphatase 2A catalytic subunit, α4 and the mammalian ortholog of yeast Tip41 (TIPRL)

3.4 79

Estudos funcionais das proteínas TIPRL e α4 em culturas de células humanas

4.DISCUSSÃO 99

AGRADECIMENTOS IV

VIII XIV XV

4.3. Significado funcional do complexo ternário α4:PP2Ac:TIPRL 104

4.3. Participação de α4 e TIPRL na via de sinalização da quinase mTOR 106

4.4. Envolvimento de α4 e TIPRL no controle da expressão gênica 109

4.5. Referências Bibliográficas 111

5.CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 115

6.ANEXO 117

L

A

Proteína de ligação ao fator de início da tradução 4E (4E Binding Protein 1) Adenina

Família das quinases PKA, PKG e PKC

Homólogo do oncogene viral de timoma de camundongo/ proteína quinase B (Murine thymoma viral oncogene homolog/ protein kinase B)

Proteína quinase ativada por 5’ AMP (5' AMP-Activated Protein Kinase ) Proteína Ativadora-1 (Activator Protein 1)

Fator de transcrição ativador (Activating transcription factor)

Quinase mutada na ataxia telangiectasia (Ataxia Telangiectasia Mutated

kinase)

Adenosina Trifosfato

Quinase relacionada a ATM e Rad3 (ATM- and Rad3-Related Kinase) Adere vorazmente a TOR2 (Adheres Voraciously (to TOR2))

5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato

Parceiro de ligação de Tor2p (Binding Partner of Tor2p)

Cepa BL21 de E. coli com o bacteriófago DE3 em estado lisogênico Ferramenta de busca de alinhamento local básica (Basic Local Alignment

Search Tool)

Albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin) Domínio básico com zíper de leucina

Homólogo do oncogene viral de mielocitomatse celular (Cellular

myelocytomatosis viral oncogene homolog)

Extremidade carboxi terminal

Cromossomo 1, quadro de leitura aberta (open reading frame) 124 Cromossomo 9, quadro de leitura aberta (open reading frame) 39 Componente 1 do complemento, subcomponente q (Complement

component 1, q subcomponent)

Proteína de ligação a C1q (C1q Binding Protein) Família das calmodulina quinases

Calmodulina quinase II

Agregado de diferenciação 4/8 (Cluster of differentiation 4/8) Ciclo de divisão celular 5 (Cell Division Cycle 5)

Quinase dependent de ciclina (Cyclin Dependent Kinase) DNA complementar

3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanossulfonato Inibidor celular de PP2A (Cellular Inhibitor of PP2A)

CMV CR2 CRE Cre CREB CTD DAPI DNA DTT ECL EDTA EF-1α EF-2 eIF2α eIF4E ESI FITC FKBP FRAP FRB Gcn2/4 Gln3 GSK3 GST GTP GTPase HDAC3 HEAT HEK293 HIS3 HSB IgBP1 Citomegalovirus

Região conservada 2 de Tap42

Elemento de resposta AMP cíclico (Cyclic AMP Responsive Element) Cre recombinase

Proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMP cíclico Domínio C-terminal (C-Terminal Domain)

4',6-diamidino-2-fenilindol

Ácido Desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid) 1,4-ditiotreitol

Quimioluminescência aprimorada (Enhanced Chemoluminescence) Ácido etilenodiaminotetraacético

Fator de elongamento da tradução 1α (Elongation Factor 1A) Fator de elongamento da tradução 2 (Elongation Factor 2)

Subunidade α do fator de início de tradução eucariótico 2 (Eukaryotic

Initiation Factor 2α)

Fator de início da tradução eucariótico 4E (Eukaryotic Initiation Factor 4E) Ionização por electrospray (Electrospray Ionization)

Fluoresceína

Proteína de ligação a FK506 (FK506 Binding Protein)

Proteína associada a FKBP e rapamicina (FKBP-rapamycin-associated

protein), mTOR

Ligação a FKBP12 e rapamicina (FKBP12 Rapamycin Binding)

Controle geral não desrepimível 2/4 (General Control Nonderepressible 2/4) Metabolismo de glutamina 3 (Glutamine metabolism 3)

Quinase da sintase de glicogênio 3 (Glycogen synthase kinase 3) Glutationa S-transferase

Guanosina trifosfato

Enzima que catalisa a hidrólise de guanosina trifosfato Histona deacetilase 3

Huntingtina, EEF3, subunidade A de PP2A, TOR1

Linhagem de rim embrionário humano 293 (Human Embrionic Kidney 293) Gene que codifica a enzima imidazolglierol-fosfato desidratase

Tampão de alta concentração de sal (High Salt Buffer)

Int-6 IPTG IRF-1 IRS IκB JAK kDa KOG1 LazZ LCMT-1 lexA LoxP LSB LST8 MafB MALDI MAPK MARE MEM MBP mDAP-3 MDM2 MEK3 MID1/2 mRNA MS Msn2/Msn4 mTOR mTORC1/2 MWCO N-terminal NBT

Sítio de integração 6 do vírus de tumor de glândula mamária de camundongo

Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo

Fator regulador de interferon 1 (Interferon Regulatory Factor 1) Substrato do receptor de insulina (Insulin Receptor Substrate) Inibidor de NF-κB

Quinase Janus (Janus Kinase) Quilodaltons

Controlador do crescimento 1 (Kontroller of Growth 1) Gene que codifica a enzima β-galactosidase

Leucina carboxil metiltransferase 1 (Leucine Carboxyl Methyltransferase-I) Repressor lexA

Locus de crossing-over P1 (Locus of X-over P1)

Tampão de baixa concentração de sal (Low Salt Buffer) Letal com Sec treze 8 (Lethal with Sec Thirteen 8)

Família do oncogene de fibrosarcoma musculoaponeurótico V-maf (V-maf

musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene family)

Dessorção/ionização assistida por matriz (Matrix Assisted Laser

Desorption/Ionization)

Proteína quinase ativada por mitógeno (Mitogen Activated Protein Kinase) Elemento de reconhecimento de Maf (Maf Recognition Element)

Meio mínimo essencial alfa (Minimum Essential Alpha Medium) Proteína básica de mielina (Myelin Basic Protein)

Proteína associada à morte de mamíferos 3 (Mammalian Death Associated

Protein 3)

Double minute de camundongo 2 (Mouse Double Minute 2)

Proteína quinase da quinase ativada por mitóenos 3 (Mitogen-activated

protein kinase kinase 3)

Linha média 1/2 (Midline 1/2) RNA mensageiro

Espectrometria de massas (Mass Spectrometry)

Supressor de múltiplas cópias da mutação de SNF1 (Multicopy suppressor

of SNF1 mutation)

Alvo da rapamicina de mamíferos (Mammalian Target of Rapamycin) Complexos 1 e 2 da quinase mTOR

Limiar de massa molecular (Molecular Weigth Cutoff) Extremidade amino terminal

Nf-κB Npr1 O-GlcNAcase OGT PBS PCAF PCR PDK1 PEG pH PI3K PIAS1 PKA PKC PKG PMA PME-1 PMSF PNPP PP1 PP2A PP2B PP2C PP4 PP4R1/2/3/4 PP6 Pph21/22 Pph3 PPP PSIPRED factor-like phosphatase)

Fator nuclear κB (Nuclear Factor κB)

Reativador de permease de nitrogênio 1 (Nitrogen Permease Reactivator 1) ß-N-acetilglicosaminidase

Uridina difosfo-N-acetilglicosamina:polipetídeo L-N-acetilglicosaminiltransferase

Solução salina tamponada com fosfato (Phosphate Buffered Saline) Fator associado a p300/CBP (p300/CBP-associated factor)

Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) Quinase da desidrogenase de piruvato, isoenzima 1 (Pyruvate

Dehydrogenase Kinase, isozyme 1)

Polietilenoglicol

Potencial hidrogeniônico Fosfatidilinositol 3-quinase

Proteína inibidora de STAT1 ativado (Protein Inhibitor of Activated STAT1) Proteína quinase A (Protein Kinase A)

Proteína quinase C (Protein Kinase C) Proteína quinase G (Protein Kinase G) Forbol 12-Miristato 13-Acetato

Metilesterase de PP2A 1 (PP2A methylesterase-1) Fluoreto de fenilmetilsufonila

p-nitrofenil fosfato

Proteína fosfatase 1 (Protein Phosphatase 1) Proteína fosfatase 2A (Protein Phosphatase 2A) Proteína fosfatase 2B (Protein Phosphatase 2B) Proteína fosfatase 2C (Protein Phosphatase 2C) Proteína fosfatase 4 (Protein Phosphatase 4) Subunidades regulatórias de PP4

Proteína fosfatase 6 (Protein Phosphatase 6)

Proteína fosfatase 21/22 (Protein Phosphatase 21/22) Proteína fosfatase 3 (Protein Phosphatase 3)

Fosfatase de fosfoproteína (Phospho Protein Phosphatase)

Servidor de predição de estrutura de proteínas (Protein Structure Prediction

Q-TOF Rac1 RACK1 RAFT1 RalA Raptor RBCC Rbp1 Rheb Rho Rictor RNA RTqPCR S6 S6K SAPs SAXS SD SDS-PAGE SF2/ASF SFRS Sit4 SMN SR STAGA STAT1 STE

Quadrupolo-tempo de voo (Quadrupole-Time of Fligth)

Substrato C3 da toxina botulínica relacionado a Ras 1 (Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1)

Receptor da quinase C ativada 1 (Receptor of Activated C Kinase 1) Alvos de rapamicina e FKBP12 1 (Rapamycin and FKBP12 Targets 1), mTOR

Homólogo v-Ral do oncogene viral de leucemia de símios delacionado a Ras A (v-Ral simian leukemia viral oncogene homolog A (ras related)) Proteína regulatória associada a mTOR (Regulatory Associated Protein of

mTOR)

Domínio RING-finger B-box coiled-coil

Proteína ligadora de rapamicina 1 (Rapamycin Binding Protein 1) Homólogo de Ras enriquecido no cérebro (Ras Homolog Enriched in

Brain)

Família gênica de homólogos de Ras (Ras homolog gene family) Companheiro de mTOR independente de rapamicina (Rapamycin

Independent Companion of mTOR)

Ácido Ribonucléico (Ribonucleic Acid)

Reação em cadeia da polimerase/transcrição reversa quantitativa em tempo real

Proteína ribossomal da subunidade menor 6 Quinase da proteína ribossomal S6

Proteínas associadas a Sit4 (Sit4 Associated Proteins)

Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (Small Angle X-Ray Scattering) Meio definido sintético (Synthetic Defined)

Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (Sodium

Duodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis)

Fator de splicing 2/ Fator de splicing alternativo (Splicing factor 2/

Alternative Splicing Factor

Fator de splicing rico em arginina e serina (Splicing factor,

arginine/serine-rich)

Transcrito induzido por esporulação 4 (Sporulation-Induced Transcript 4) Sobrevivência de neurônios motores (Survival of Motor Neurons)

Domínio rico em serinas (Serine Rich)

Complexo que contém SPT3-TAF9-GCN5 (SPT3-TAF9-GCN5-containing

complex)

Transdutor de sinal e ativador da transcrição 1 (Signal Transducer and

Activator of Transcription 1)

Tap42 TBP TBS TEV TFIID TFTC Tip41 TIPRL TIPRLΔC TIPRLΔN TIPRLΔNC TK TLK TOR TPA Tpd3 TRE tRNA TSC1/TSC2 X-Gal YNB

Proteína associada a fosfatase 2A, 42 kDa (Two-A Associated Protein, 42

kDa)

Proteína ligadora de TATA box (TATA-binding protein) Solução salina tamponada com Tris (Tris Buffered Saline)

Protease do vírus do tabaco (Tobacco Etch Virus protease)

Fator de início da transcrição IID (Transcription Factor IID)

Complexo que contém TAF e não contém TBP (TBP-free TAF containing

complex)

Proteína que interage com Tap42 de 41 kDa (Tap42-interacting protein of

41 kDa)

Proteína semelhante ao regulador da via TOR (TOR Signaling Pathway

Regulator like), hTip41

TIPRL com deleção da extremidade C-terminal TIPRL com deleção da extremidade N-terminal TIPRL com deleção das extremidades N e C-terminais Quinases de tirosina (Tyrosin Kinases)

Quinases relacionadas a quinases de tirosina (Tyrosin Kinase Like) Alvo da rapamicina (Target of Rapamycin)

2-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato

tRNA Processing Deficient, Regulatory subunit A of the heterotrimeric protein phosphatase 2A

Elemento de resposta a TPA (TPA Responsive Element) RNA transportador

Complexo da esclerose tuberosa (Tuberous Sclerosis Complex) 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo

R

As células respondem constantemente a uma enorme variedade de estímulos, que são interpretados e integrados por meio de redes de sinalização, dando origem a uma resposta biológica. Defeitos nesses circuitos são a causa de diversas doenças, incluindo muitos, se não todos os tipos de câncer. As fosfatases, enzimas que removem grupamentos fosfato dos substratos de quinases, dependem principalmente de subunidades regulatórias para definir sua especificidade. As fosfatases do tipo 2A constituem a subfamília PPP, que é formada por PP2A, PP4 e PP6. PP2A é a principal fosfatase solúvel de fosfosserina e fosfotreonina em células animais e é encontrada predominantemente como uma holoenzima formada por uma subunidade catalítica (C), uma subunidade regulatória (B, B', B'' ou B''') e uma de ancoragem (PR65⁄A). Em levedura, as fosfatases 2A desempenham um importante papel na via da quinase TOR, o que ocorre por meio da proteína essencial Tap42. A proteína Tip41 foi identificada como um parceiro de interação de Tap42 e regulador da via da quinase TOR em levedura. A homóloga de Tap42 em mamíferos, chamada de α4, está envolvida na regulação de diversos processos celulares, como diferenciação, desenvolvimento, migração celular e apoptose, por meio de seu papel conservado de regulador de fosfatases 2A. A homóloga em mamíferos de Tip41, chamada TIPRL, é uma proteína ainda pouco caracterizada. Este trabalho teve como objetivo analisar a função das proteínas α4 e TIPRL humanas e esclarecer seu papel na regulação de fosfatases 2A. A caracterização estrutural de α4 e Tap42, usando dados de SAXS, dicroísmo circular e proteólise limitada, mostrou que essas proteínas apresentam um domínio N-terminal compacto formado por α-hélices e um domínio C-terminal desestruturado. Em uma triagem de interações com a proteína TIPRL humana, identificamos as fosfatases PP2Ac, PP4c e PP6c como seus parceiros de interação, assim como os fatores de transcrição MafB e TAF10. Ao contrário do esperado a partir do modelo de levedura, α4 e TIPRL não interagem diretamente, mas formam um complexo ternário com PP2Ac. Uma triagem de substratos de fosfatases 2A regulador por TIPRL identificou os fatores de splicing SF2/ASF e SF2p32. Nossos resultados sugerem um modelo estrutural para a regulação das fosfatases 2A por α4 e mostram que TIPRL é um novo regulador comum dessas fosfatases com funções na regulação da expressão gênica.

through signaling networks, giving rise to biological responses. Defects in this circuitry are a cause of many diseases, including cancer. Protein phosphatases are enzymes which remove phosphate groups from kinase substrates, relying mainly on regulatory subunits for their substrate specificity. Type 2A phosphatases belong to the PPP subfamily, which is formed by PP2A, PP4 and PP6. PP2A is the major soluble serine/threonine phosphatase in animal cells and is found predominantly as a heterotrimer composed of a catalytic (C), a regulatory (B, B', B'' or B''') and a scaffold (PR65⁄A) subunit. Type 2A phosphatases play a major role in the yeast TOR signaling pathway through their interaction with the essential protein Tap42. Tip41 was identified as a Tap42 interacting protein and regulator of the TOR pathway. α4, the mammalian orthologue of Tap42, regulates many cellular processes such as differentiation, development, cell migration and apoptosis as a conserved type 2A phosphatase regulator. TIPRL, the mammalian orthologue of Tip41, is still poorly characterized. The objective of the present work was to analyse the function of α4 and TIPRL and improve the understanding of their role as type 2A phosphatase regulators. The structural characterization of α4 using SAXS analyses, circular dichroism and limited proteolysis, showed that these proteins are formed by an α-helical N-terminal domain and an unfolded C-terminal domain. A screen for TIPRL interacting proteins identified PP2Ac, PP4c and PP6c and also the transcription factors MafB and TAF10. Unlike their yeast conterparts, α4 and TIPRL do not interact directly, but rather form a ternary complex with PP2A. A search for type 2A phosphatase substrates regulated by TIPRL identified the splicing factor SF2/ASF and its regulatory protein SF2p32. Our results suggest a structural model for the regulation of type 2A phosphatases by α4 and show that TIPRL is a novel common regulator of these phosphatases which functions in regulation of gene expression.

1.

I

1.1. Vias de sinalização celular

As células respondem constantemente a uma enorme variedade de estímulos externos, que são interpretados e integrados por meio de redes de sinalização, dando origem a uma resposta biológica - por exemplo, diferenciação, apoptose ou migração. Em organismos multicelulares, esses estímulos geralmente consistem em sinais químicos que são recebidos por proteínas de membrana ou por receptores intracelulares e processados por meio de eventos de fosforilação reversível, que alteram o estado de ativação e localização de fatores de transcrição específicos, resultando na alteração da expressão gênica. Defeitos nesses circuitos são a causa de diversas doenças, incluindo muitos, se não todos os tipos de câncer.

As quinases, enzimas que catalisam a transferência de um grupamento fosfato por meio da hidrólise de ATP, são peças-chave nesses processos. O genoma humano contém 518 genes que codificam quinases, dos quais 478 fazem parte de uma única superfamília dividida em sete grandes famílias (Manning, et al. 2002). Essas enzimas apresentam especificidade para resíduos de tirosina ou serina e treonina, e cada uma delas reconhece esses resíduos dentro de uma sequência consenso específica. As quinases atuam nas redes de sinalização de forma sequencial, propagando sinais na forma de cascatas de fosforilação.

Tão importantes quanto as quinases nas redes de sinalização celular são as fosfatases que, ao remover os grupamentos fosfato das quinases e de seus substratos, permitem que os sinais tenham duração limitada e assim promovem a homeostasia celular. Em contraste com a grande diversidade de quinases, observa-se um número reduzido de genes que codificam fosfatases (cerca de 140 no genoma humano). As fosfatases em eucariotos se dividem em quatro famílias: as famílias PPP (Phospho Protein Phosphatase) e PP2C de fosfatases de fosfosserina e fosfotreonina, a família PTP (Phospho Tyrosine Phosphatase) das fosfatases de fosfotirosina ou de dupla especificidade, e a família NIF (NLI interacting factor-like phosphatase) de fosfatases

ainda maior: existem 388 genes que codificam quinases com essa especificidade no genoma humano, e apenas 38 codificam fosfatases. Já que ambos os grupos respondem pela mesma diversidade de substratos, devem existir mecanismos compensatórios para a reduzida variedade de fosfatases - o que se observa na grande diversidade de subunidades regulatórias que estas apresentam. O fato de as fosfatases dependerem de subunidades regulatórias para definir sua especificidade, em contraste com os motivos lineares identificados pela maioria das quinases, dificulta o uso de ferramentas de bioinformática e exige maior esforço experimental na identificação de seus substratos. Em consequência dessas dificuldades, assim como fatores históricos, as fosfatases têm sido menos estudadas que as quinases, o que se reflete também em uma relativa escassez de informações disponíveis sobre essas proteínas. Este trabalho se concentra no papel de duas proteínas reguladoras, α4 e TIPRL, envolvidas no controle de diversos processos celulares por meio das fosfatases do tipo 2A.

1.2. As fosfatases do tipo 2A

As fosfatases do tipo 2A fazem parte da subfamília PPP e compreendem PP2A, PP4 e PP6, as ortólogas em mamíferos das fosfatases de levedura Pph21⁄22, Pph3 e Sit4, respectivamente. Além da similaridade de sequência, essas fosfatases compartilham a sensibilidade à inibição por ácido ocadáico (em concentrações da ordem de nanomolar) e a metilação em um resíduo de leucina conservado no extremo C-terminal da subunidade catalítica, que regula a associação de outras subunidades. Essas fosfatases apresentam uma ampla gama de substratos e atuam em vários processos celulares, como a transcrição, tradução, regulação do ciclo celular e apoptose. As subunidades catalíticas das fosfatases 2A são encontradas em complexos com outras subunidades (Figura 1.1).

PP2A é a principal fosfatase solúvel de fosfosserina e fosfotreonina em células animais e é encontrada predominantemente como uma holoenzima formada por uma subunidade catalítica (C), uma subunidade regulatória (B, B', B'' ou B''') e uma de ancoragem (PR65⁄A) (Eichhorn, et al. 2008; Goldberg 1999; Zabrocki, et al. 2002; Zolnierowicz 2000). As subunidades catalítica e de ancoragem humanas apresentam duas isoformas cada uma (α e β) e, juntas, formam o "core"

enzimático. A subunidade PR65/A é formada por repetições HEAT (Huntingtin, EEF3, A subunit

of PP2A, TOR1), que se enovelam formando um solenóide de formato alongado (Groves, et al. 1999; Kobe, et al. 1999). As subunidades regulatórias pertencem a quatro famílias distintas, sendo cada uma delas composta por diversas isoformas, e determinam a localização subcelular, estado de ativação e especificidade de substrato da holoenzima. A montagem da holoenzima é regulada por modificações pós-traducionais do extremo C-terminal da subunidade catalítica, incluindo a metilação da leucina 309, que é catalisada pela enzima LCMT-1 (leucine carboxyl

methyltransferase-I) e removida por PME-1 (PP2A methylesterase-1).

PP2A também é alvo de regulação por outras proteínas celulares e várias proteínas virais. Diversos estudos têm apontado PP2A como um supressor tumoral que age desfosforilando e inibindo a atividade de produtos de proto-oncogenes como o fator de transcrição c-Myc, a quinase Akt/PKB e a GTPase RalA. A inativação de PP2A por mutações, antígenos tumorais virais (SV40 small T) ou proteínas celulares (CIP2A - cellular inhibitor of PP2A) é um passo

Figura 1.1 Representação esquemática dos complexos das subunidades catalíticas das fosfatases

PP2A (A), PP4 (B) e PP6 (C) com suas respectivas subunidades regulatórias ou de ancoragem. Algumas das funções celulares desempenhadas por essas fosfatases são citadas abaixo de cada uma delas.

Uma forma da holoenzima contendo a subunidade regulatória B56/PR61 teve sua estrutura cristalográfica resolvida recentemente em dois trabalhos independentes (Cho and Xu 2007; Xu, et al. 2006) (Figura 1.2). A conformação da subunidade A no complexo heterotrimérico difere daquela observada na proteína isolada (Groves et al. 1999) ou no complexo dimérico com a subunidade catalítica (Xing, et al. 2006), assumindo uma forma de ferradura que permite a interação simultânea com as subunidades B e C. A subunidade B56/PR61 apresenta uma estrutura semelhante à subunidade A, sendo formada por repetições pseudo-HEAT. A subunidade catalítica se assemelha estruturalmente às fosfatases PP1 e PP2B, e apresenta uma cauda C-terminal desestruturada que interage com uma região carregada negativamente entre as subunidades A e B. Essa observação sugeriu um mecanismo de regulação da montagem do complexo baseado na neutralização de cargas negativas promovida pela metilação do extremo C-terminal da enzima (Cho and Xu 2007). O sítio ativo encontra-se na face oposta à subunidade A e forma uma interface com a subunidade B, que pode dessa maneira regular a especificidade da holoenzima. Diversas mutações previamente descritas em tumores foram localizadas na interface entre as subunidades, sugerindo que seu efeito tumorigênico poderia resultar da desestabilização estrutural da holoenzima (Cho and Xu 2007).

As fosfatases PP4 e PP6 são menos estudadas que PP2A, mas evidências recentes sugerem que a organização heterotrimérica também é observada para essas fosfatases. PP4 é uma fosfatase envolvida na maturação do centrossomo em células animais e na montagem do spliceossomo por meio de sua interação com membros do complexo SMN (Survival of Motor

Neurons), o que é coerente com sua localização nuclear e pericentriolar (Cohen, et al. 2005). Três

subunidades provavelmente formadas por repetições HEAT foram descritas para esta fosfatase (PP4R1, PP4R2 e PP4R4), provavelmente desempenhando papel semelhante ao da subunidade A de PP2A (Chen, et al. 2008; Cohen et al. 2005), e uma terceira subunidade chamada PP4R3 foi descrita formando um complexo sensível a cisplatina com o heterodímero PP4c-PP4R2 (Gingras, et al. 2005). Os alvos celulares descritos para PP4 incluem Nf-κB (Hu, et al. 1998), HDAC3 (Zhang, et al. 2005), NDEL1 (Toyo-oka, et al. 2008) e γ-H2X (Chowdhury, et al. 2008; Nakada, et al. 2008). PP6 apresenta três subunidades de ancoragem (PP6R1, PP6R2 e PP6R3) que

compartilham um domínio conservado de associação a Sit4 chamado SAPS (Stefansson and Brautigan 2006), e uma possível subunidade regulatória formada por repetições "ankyrin" foi descrita recentemente (Stefansson, et al. 2008). A função celular de PP6 ainda é pouco conhecida, mas dados recentes sugerem um envolvimento na progressão do ciclo celular (Stefansson and Brautigan 2007) e na resposta a citocinas inflamatórias por meio de IκB (Stefansson and Brautigan 2006) e TAK1 (Kajino, et al. 2006).

1.3. Participação das fosfatases 2A na via de sinalização da quinase TOR em

levedura

O controle do crescimento celular em resposta a nutrientes em células eucarióticas é mediado por uma via de sinalização que atua sobre diversos processos celulares e é coordenada pela quinase TOR (Target Of Rapamycin). Essa quinase foi identificada inicialmente em

Figura 1.2. Representação do tipo cartoon da estrutura cristalográfica do heterotrímero formado por

PP2Acα (magenta), PR65/Aα (azul) e B56γ1 (verde). As esferas em cor cinza ligadas à subunidade catalítica correspondem a dois íons de magnésio, e o inibidor microcistina aparece ligado ao sítio atívo (marcado com uma seta). São mostradas uma visão "frontal" (esquerda) e uma visão "de cima", rotacionada de 90º (direita). As dimensões aproximadas do complexo são 90 x 90 x 70 Å. Figura modificada de (Cho and Xu 2007).

Streptomyces hygroscopicus encontrada na ilha de Páscoa (Rapa Nui) que apresenta propriedades

antifúngicas, imunossupresoras e antitumorais. Dois genes, TOR1 e TOR2, codificam duas quinases de 280 kDa que apresentam 67% de identidade de sequência e são compostas de seis domínios (Figura 1.3). Dois domínios N-terminais formados por repetições HEAT participam de interações entre proteínas, assim como o domínio FAT. O domínio catalítico, que apresenta similaridade com PI3K, localiza-se na região C-terminal e é seguido por uma pequena região conservada denominada FATC, que é encontrada apenas em combinação com o domínio FAT e parece ser importante para a atividade catalítica. A rapamicina, em complexo com seu receptor celular Rbp1/FKBP1, interage com o domínio FRB (Fragment Rapamycin Binding). A quinase TOR é encontrada em dois complexos distintos, TORC1 e TORC2. TORC1 é formado por TOR1 ou TOR2, LST8, KOG1 e TCO89, e é responsável pela organização temporal do crescimento, isto é, determinar se a célula cresce ou não. Seus alvos incluem a regulação da biogênese de ribossomos, o controle da tradução, a renovação de transportadores de nutrientes, a inibição da autofagia e da transcrição de genes de resposta a estresse. Já o complexo TORC2 é formado por TOR2, LST8, AVO1-3 e BIT61, e atua no controle espacial do crescimento por meio do citoesqueleto de actina (Loewith, et al. 2002). Apenas TORC1 é inibido por rapamicina, e o mecanismo dessa inibição ainda não é completamente entendido, mas parece envolver a interação com os alvos da quinase e não sua atividade enzimática.

As fosfatases 2A desempenham um importante papel na via da quinase TOR em levedura, o que ocorre por meio da proteína essencial Tap42 (Two-A Associated Protein, 42 kDa). Tap42 foi isolada como um supressor de alto número de cópias de uma mutação termossensível de Sit4, a ortóloga em levedura de PP6c (Di Como and Arndt 1996). Tap42 interage fisicamente com Sit4 e também com Pph21/22, ortóloga de PP2Ac, e forma com essas fosfatases um complexo que independe de outras subunidades regulatórias e se dissocia na presença de rapamicina. A superexpressão de Sit4 ou de Pph21/22 resulta em uma redução da taxa de crescimento, que é ainda mais pronunciada em combinação com a superexpressão de Tap42, sugerindo que esta seja um regulador positivo das fosfatases. TOR fosforila Tap42 diretamente, e sua desfosforilação

depende de Pph21/22 na sua forma heterotrimérica com as subunidades A (Tpd3) e B (Cdc55) (Jiang and Broach 1999).

Grande parte das funções celulares controladas por TOR são mediadas por Tap42 (Figura

1.4A). A inibição da transcrição de genes de resposta a estresse e escassez de nutrientes depende

do confinamento dos fatores de transcrição Msn2/Msn4 e Gln3 no citoplasma, impedindo seu acesso aos genes alvo, e no caso de Gln3 esse confinamento depende de sua fosforilação promovida por TOR por meio de Tap42 (Beck and Hall 1999). Outra função de TOR é controlar a

Figura 1.3. Representação esquemática da composição de domínios da quinase TOR de levedura e

dos dois complexos de proteínas que contêm essa quinase. TORC1 (esquerda) é composto por TOR1 ou TOR2, LST8, KOG1 e TCO89, responde a nutrientes e é inibido por estresse e rapamicina. Entre seus alvos estão a promoção da biogênese de ribossomos por meio da transcrição de genes ribossomais, o início da tradução e o transporte de nutrientes por meio de permeases de alta afinidade. TORC1 inibe vias relacionadas ao estresse e à falta de nutrientes, como a autofagia e a transcrição de genes de resposta a estresse. TORC2 (direita) é composto por TOR2, LST8, AVO1-3 e BIT61 e regula a organização do citoesqueleto de actina em resposta a estímulos ainda desconhecidos. Tanto TORC1 quanto TORC2 são encontrados na forma de dímeros. Figura traduzida de (Wullschleger, et al. 2006).

afinidade. Na presença de nutrientes, TOR promove a fosforilação e inativação da quinase Npr1 por meio de Tap42, inibindo a degradação do transportador de triptofano de alta afinidade Tat3 (Schmidt, et al. 1998). Tap42 também é essencial na ativação do início da tradução promovida por TOR (Di Como and Arndt 1996), e um mecanismo proposto envolve a fosforilação e inativação da quinase Gcn2, responsável pela fosforilação do fator de início da tradução eIF2α. A fosforilação de eIF2α por Gcn2 ocorre diante da escassez de aminoácidos e resulta na redução da tradução em geral e no aumento da tradução do mRNA que codifica Gcn4, um ativador transcricional de genes envolvidos na biossíntese de aminoácidos. Na presença de aminoácidos, a quinase Gcn2 seria inativada por TOR via Tap42 resultando em um aumento na tradução em geral (Cherkasova and Hinnebusch 2003). Tap42 também atua na organização do citoesqueleto de actina por meio da GTPase Rho2 (Wang and Jiang 2003), na diferenciação das células de levedura em pseudo-hifas (Cutler, et al. 2001) e no silenciamento transcricional do transposon Ty1(Jiang 2008), sendo todos eventos regulados por TOR.

Na maior parte dos casos descritos acima, Tap42 promove a fosforilação de seus alvos, sugerindo uma função inibitória na regulação das fosfatases 2A. No entanto, análises genéticas sugeriram que Tap42 regula positivamente as fosfatases (Di Como and Arndt 1996; Jiang and Broach 1999), o que gerou interpretações controversas a respeito de sua função. O fato de Tap42 ser essencial para a função de Sit4 e Pph21/22 (Wang, et al. 2003) também não é coerente com uma função inibitória. Uma alternativa para conciliar esses dados seria supor que Tap42 age como um regulador positivo, mas não da atividade das fosfatases, e sim da proteção dos sítios fosforilados, agindo como uma antifosfatase (Jiang and Broach 1999). Outra hipótese, decorrente da análise global de alvos de Tap42 no controle da transcrição, sugere que Tap42 atua como um inibidor da fosfatase quando se encontra fosforilada e como um ativador quando se encontra desfosforilada (Düvel, et al. 2003). Essa idéia é coerente com dados recentes que mostram que o complexo entre Tap42 e Sit4 encontra-se associado à membrana e interage com TORC1 na presença de nutrientes, sendo liberado para o citoplasma após o tratamento com rapamicina ou na ausência de nutrientes (Yan, et al. 2006). Esses modelos são representados nas figuras 1.4B e

tratamento com rapamicina é um evento secundário, ocorrendo lentamente após a liberação do complexo para o citoplasma.

Outra proteína envolvida na regulação de fosfatases 2A em levedura, chamada Tip41 (TAP42-interacting protein of 41 kDa), foi identificada em uma triagem pelo método do duplo-híbrido como um parceiro de interação de Tap42 (Jacinto, et al. 2001). Ao contrário de Tap42, Tip41 não é uma proteína essencial, e sua deleção confere resistência à rapamicina e suprime uma mutação termossensível de Tap42, sugerindo uma participação de Tip41 na via da quinase TOR antagonizando a função de Tap42. A interação de Tip41 com Tap42 é estimulada por rapamicina e faz parte de uma alça de feedback que ativa rapidamente a fosfatase Sit4 em condições que inativam a quinase TOR. Na presença de nutrientes, TOR é ativada e fosforila Tip41, que então se

Figura 1.4. Funções do complexo Tap42/Fosfatase 2A (PPase) na via de sinalização da quinase TOR

em levedura. A: Representação esquemática dos eventos celulares regulados por TOR via Tap42, como descrito no texto. B, C: modelo do mecanismo de regulação de Tap42/Fosfatase 2A por TOR. Na presença de nutrientes (B), o complexo TORC1 encontra-se ativo e fosforila Tap42, que inibe a fosfatase 2A. Todas as proteínas envolvidas encontram-se em um grande complexo associado à membrana. Na ausência de nutrientes ou na presença de rapamicina (C), a quinase TOR deixa de fosforilar Tap42, que é desfosforilada, provavelmente por PP2A na sua forma heterotrimérica. O

dissocia de Tap42 e permite sua associação com Sit4. Na ausência de nutrientes ou na presença de rapamicina, Tip41 é desfosforilada por Sit4 e se associa a Tap42, deixando livre a fosfatase Sit4, que então se associa às SAPs (Sit4 Associated Proteins) e desfosforila seus alvos na célula, como o fator de transcrição Gln3 e a quinase Npr1 (Figura 1.5). Esse mecanismo de regulação parece ser ainda mais importante que a fosforilação direta de Tap42 por TOR, já que a deleção da Tip41 confere resistência à rapamicina (Jacinto et al. 2001). A ortóloga de Tip41 em

Schyzosaccharomyces pombe também foi caracterizada como um regulador de fosfatases 2A

(Fenyvuesvolgyi, et al. 2005). Ainda não está claro como a proteína Tip41 se encaixaria nos modelos mais recentes da regulação de Sit4 por Tap42.

Figura 1.5. Modelo proposto originalmente por Jacinto et al. (2001) para a função da proteína Tip41

em levedura. As setas representam regulação positiva, e as barras, regulação negativa. A seta pontilhada indica que a fosforilação de Tap42 por TOR tem um papel menos importante na regulação de Sit4 do que a fosforilação de Tip41.

1.4. Participação das fosfatases 2A na via de sinalização da quinase mTOR em

mamíferos

A quinase TOR é conservada em todos os eucariotos e, em mamíferos, é conhecida como mTOR, FRAP ou RAFT1 (Brown, et al. 1994; Sabatini, et al. 1994). mTOR é encontrada em dois complexos, mTORC1 e mTORC2, que conservam em grande parte a composição de proteínas, a sensibilidade a rapamicina e os processos celulares regulados pelos complexos TOR1 e TOR2 em levedura (Figura 1.6). As proteínas Kog1 e Avo3, encontradas nos complexos TORC1 e TORC2, respectivamente, apresentam ortólogas em mamíferos denominadas Raptor e Rictor (Kim, et al. 2002; Sarbassov, et al. 2004). Lst8, presente nos dois complexos, também é conservada e em mamíferos é conhecida como mLst8/GβL. A quinase mTOR age como um integrador de diversos sinais celulares na regulação do crescimento. Além de responder à presença de nutrientes (aminoácidos), mTOR responde também aos níveis de energia, por meio da quinase AMPK, a diversos tipos de estresse, e a fatores de crescimento, pela via PI3K/PDK1/Akt. Seus alvos mais bem caracterizados são a quinase S6K e a proteína 4E-BP1, envolvidas no controle da tradução. S6K é fosforilada e ativada por mTORC1 e fosforila a proteína ribossomal S6, promovendo o início da tradução. Já 4E-BP1 é fosforilada e inativada por mTORC1, e dessa forma libera da inibição o fator de início da tradução eIF4E, responsável pelo reconhecimento de mRNAs com

cap.

O complexo mTORC2 é considerado insensível a rapamicina, mas na verdade apresenta uma sensibilidade reduzida que se torna aparente em alguns tipos celulares e após longas exposições à droga. Seu principal alvo na célula é o citoesqueleto de actina, controlado por meio das GTPases Rho, Rac e da quinase PKC. Outro importante substrato de mTORC2 é a quinase Akt/PKB, que é fosforilada e ativada por esse complexo na serina 473, localizada no motivo C-terminal hidrofóbico (Sarbassov, et al. 2005). Para a ativação completa de Akt/PKB, é necessária também a fosforilação por PDK1 na treonina 308 na alça de ativação. Apesar de Akt/PKB ser um ativador de mTORC1, não se observa a ativação de mTORC1 em resposta à ativação de

Figura 1.6. Modelo da via de sinalização da quinase mTOR. O complexo mTORC1, sensível a

rapamicina, responde a fatores de crescimento, estresse, níveis de energia e nutrientes, e controla diversos processos celulares envolvidos no crescimento, como síntese de proteínas, biogênese de ribossomos e transcrição, e inibe a autofagia. Os fatores de crescimento semelhantes a insulina ligam-se a receptores extracelulares e ativam a via das quinases PI3K - PDK1 - Akt/PKB, ativando o complexo mTORC1 por meio do complexo TSC1/TSC2 e da GTPase Rheb. Os nutrientes (aminoácidos, principalmente leucina) ativam mTORC1 por meio de GTPases Rag, não mostradas. Os níveis de energia são sentidos por meio da quinase dependente de AMP cíclico (AMPK). O complexo mTORC2 regula a quinase Akt/PKB e também o citoesqueleto de actina por meio das GTPases Rac e Rho e da quinase PKC. Não se sabe ao certo o que regula o complexo mTORC2. As setas representam ativação e as barras, inibição. Figura traduzida de (Wullschleger et al. 2006).

ativador de mTORC1 sejam diferentes. Ao contrário de mTORC2, mTORC1 funciona como um regulador negativo de Akt/PKB por meio de um feedback negativo envolvendo a inibição da expressão do substrato do receptor de insulina (IRS) pela quinase S6K.

Um grande número de tumores malignos em humanos apresenta a via de mTORC1 desregulada, e alguns análogos de rapamicina (CCI-779 e RAD001) já tiveram seu uso aprovado como drogas contra o câncer. O complexo mTORC2 também pode estar envolvido em alguns tipos de câncer por meio da ativação de Akt/PKB, e sua sensibilidade ao tratamento prolongado com rapamicina também o torna um possível alvo dessas drogas (Sabatini 2006). O complexo TSC1/TSC2 (Tuberous Sclerosis Complex) é um regulador negativo da via de mTORC2 e supressor tumoral, agindo como um ativador da troca de GTP para a GTPase Rheb, e mutações nos genes que codificam essas proteínas resultam em uma síndrome caracterizada pelo aparecimento de tumores. A fosfatase PTEN (Phosphatase and Tensin Homologue) é outro regulador negativo da via de mTORC1 que também funciona como supressor tumoral.

Assim como em levedura, as fosfatases 2A também são alvos da sinalização por mTOR, o que é evidenciado pelo aumento na atividade dessas fosfatases em células tratadas com rapamicina (Peterson, et al. 1999). Porém, apesar de Tap42 ser uma proteína conservada, o papel de sua homóloga α4 na via da quinase mTOR ainda é controverso. Os alvos mais estudados do complexo Tap42/fosfatase em levedura (Npr1, Gln3, Msn2/4) não são conservados em mamíferos, indicando que um possível papel de α4 na via de mTOR deve envolver outros substratos, sendo os principais candidatos S6K e 4E-BP1. PP2Ac interage diretamente com S6K e parece ser necessária para sua ativação mediada por mTORC1 (Peterson et al. 1999). α4 participa de um complexo com PP2Ac e S6K em linfócitos B (Yamashita, et al. 2005), mas não há evidências de que regulação da atividade de S6K por PP2Ac/α4 seja importante em outros tipos celulares. 4E-BP1 também já foi descrito como um possível alvo de α4/PP2A, mas não está claro se α4 inibe (Nanahoshi, et al. 1998) ou promove sua desfosforilação por PP2A (Nien, et al. 2007). Independentemente de sua possível participação na via de mTOR, sabe-se que α4 está envolvida na regulação de diversos processos celulares, como diferenciação, desenvolvimento,

migração celular e apoptose, por meio de seu papel conservado de regulador de fosfatases 2A

(Figura 1.7).

1.5. As proteínas α4 e TIPRL

A proteína α4 foi identificada inicialmente em camundongos como uma fosfoproteína associada ao complexo receptor de linfócitos B por meio da interação com a proteína MB-1/Igα, e ficou conhecida também como IgBP1 (Immunoglobulin Binding Protein 1) (Kuwahara, et al. 1994). A associação da subunidade catalítica da PP2A com a α4 não ocorre simultaneamente à associação com as subunidades A e B (Murata, et al. 1997), sendo promovida pela ausência de fosforilação (Tyr307) e de carboximetilação (Leu309) na subunidade catalítica (Chung, et al. 1999). Tap42 e α4 de camundongo apresentam 24% de identidade de sequência e 37% de similaridade (Figura 1.8A) e pertencem a uma família única, sem similaridade significativa com outras proteínas ou domínios conhecidos. Nenhuma informação estrutural sobre essas proteínas

Figura 1.7. Visão geral dos processos celulares regulados por α4. Os processos mostrados não

ocorrem necessariamente em um mesmo tipo celular, mas são mostrados em uma única célula por simplicidade. Setas indicam ativação e barras indicam inibição. Ver texto para detalhes.

estava disponível na literatura até o início deste trabalho. Homólogas de α4/Tap42 já foram descritas em ratos (Too 1997), Arabidopsis thaliana (Harris, et al. 1999) Drosophila

melanogaster e Schizosaccharomyces pombe, e provavelmente são encontradas em todos os

organismos eucariotos.

A identificação de α4 em associação com o receptor de linfócitos B, sua capacidade de ser fosforilada em resposta ao ativador de PKC forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) e sua associação física com quinases de tirosina sugeriram um papel na ativação desses linfócitos (Kuwahara et al. 1994), que foi confirmado em trabalhos posteriores. Camundongos com

knockout condicional do gene IgBP1 pelo sistema Cre/Lox P são deficientes na proliferação em

resposta a estimulantes de células B, na mudança de isotipo, na formação de centros germinais e na hipermutação somática da região V, e também apresentam redução na atividade da quinase S6K e menor sensibilidade à rapamicina (Inui, et al. 2002). A mesma abordagem experimental em linfócitos T mostrou que a falta da proteína α4 resulta em baixa proliferação celular e desorganização do timo, com a parada do desenvolvimento dos timócitos no estágio CD4/CD8 duplo negativo (Hua, et al. 2003).

Em células linfoides, α4 participa ainda da sinalização celular em resposta à prolactina, que nessas células funciona como um estímulo à proliferação por meio de uma cascata de sinalização envolvendo a via JAK/STAT. O mRNA que codifica α4 foi isolado em uma triagem em busca de genes com expressão diferencial em células linfoides Nb2 de rato dependentes ou independentes de prolactina, juntamente com os mRNAs que codificam o fator de elongamento EF-2 e uma proteína semelhante a Cdc5 (Too 1997). A expressão do mRNA de α4 diminui em resposta ao tratamento com prolactina em células dependentes desse hormônio, mas é constitutiva em células independentes de prolactina. O tratamento com prolactina em células dependentes provoca ainda a fosforilação de α4 e sinergiza com o efeito do TPA (2-O-tetradecanoil-forbol-13-acetato), um ativador de PKC (Boudreau, et al. 2002). α4 tem localização predominantemente nuclear nessas células e encontra-se glicosilada (Boudreau et al. 2002; Dauphinee, et al. 2005). Sua super-expressão inibe a ativação do promotor IRF-1 (Interferon Regulatory Factor 1) em

(Boudreau et al. 2002; Nien et al. 2007). Essas evidências indicam que α4 é um regulador negativo da resposta a prolactina nessas células.

α4 também está envolvida na regulação do desenvolvimento embrionário em mamíferos por meio da sua interação com as proteínas MID1 e MID2 (de midline), pertencentes à família RBCC (RING-finger B-box coiled-coil) (Liu, et al. 2001; Trockenbacher, et al. 2001). Essas proteínas são ubiquitina-ligases associadas a microtúbulos que atuam no estabelecimento da linha média do embrião, e mutações nos genes que as codificam estão relacionadas à síndrome de Opitz G/BBB, caracterizada por malformações congênitas na linha média como fenda palatina, hipertelorismo ocular, retardamento mental e anomalias cardíacas. As anomalias observadas nessa síndrome estão diretamente relacionadas com a associação de MID1 aos microtúbulos, uma vez que mutações isoladas de seus portadores provocam o acúmulo de MID1 em grânulos citoplasmáticos (Schweiger, et al. 1999). A interação com MID1 sugeriu que α4, que é produto de um gene localizado no cromossomo X (Onda, et al. 1997), poderia estar relacionada a algumas formas da síndrome de Opitz G/BBB ligadas ao X, e de fato uma nova síndrome ligada ao X e com sobreposição de características com Opitz G/BBB foi mapeada no gene IgBP1 (Graham, et al. 2003). Essa síndrome se caracteriza por coloboma de íris e nervo ótico, testa alta, retrognatia severa, retardamento mental e agênese do corpo caloso, e se associa a uma dupla mutação na região promotora do gene IgBP1(-57delT e T-55A), provavelmente resultando em um padrão de expressão anormal da proteína α4 (Graham et al. 2003).

α4 interage com o domínio B-Box de MID1 por meio de sua região C-terminal e promove uma regulação cruzada entre MID1 e PP2Ac. Por meio da associação com α4, MID1 promove a ubiquitinação e degradação da fração de PP2A associada a microtúbulos (Trockenbacher et al. 2001), enquanto PP2Ac catalisa a desfosforilação de MID1 e promove sua dissociação dos microtúbulos (Liu et al. 2001), regulando também seu transporte ao longo dos microtúbulos mediado por dineína e quinesina (Aranda-Orgillés, et al. 2008a). MID1 e α4 fazem parte de um grande complexo ribonucleoprotéico que inclui o fator de elongamento EF-1α e várias proteínas envolvidas no transporte de mRNA e tradução, incluindo RACK1, Anexina A2, nucleofosmina e

algumas proteínas ribossomais, sugerindo um papel para essas proteínas no controle da tradução associada ao citoesqueleto (Aranda-Orgillés, et al. 2008b).

Outro importante papel de α4 relaciona-se à sobrevivência de células de mamíferos, tanto diferenciadas quanto em desenvolvimento, já que sua deleção ativa a via intrínseca de apoptose (Kong, et al. 2004). Após a deleção condicional do gene que codifica α4, mediada pela infecção com um retrovírus codificando a recombinase Cre em células modificadas geneticamente para ter esse gene flanqueado por sítios loxP, observa-se um aumento na transcrição de genes-alvo de p53 como p21, Noxa, MDM2, ciclina G, e Stk11, e também de genes que participam da via mitocondrial de apoptose como mDAP-3, Siva e endonuclease G. Observa-se também um aumento dos níveis de fosforilação dos fatores de transcrição c-Jun e p53, indicando que α4 promove a desfosforilação e inibição desses fatores (Kong et al. 2004). O efeito antiapoptótico de α4 depende da sua interação com MEK3, uma das MAP quinase quinases que fosforilam a MAP quinase p38 em uma via de apoptose ativada por estresse ou citocinas (Roux and Blenis 2004). A inibição direta da ativação de MEK3 por α4, por meio de sua desfosforilação mediada por PP2A, inibe também a fosforilação e ativação de seus alvos diretos ou indiretos, incluindo p38 e c-Jun, e assim inibe essa via de apoptose (Prickett and Brautigan 2007). Outros processos regulados por α4 incluem a migração celular, regulada por meio da GTPase Rac1 (Kong, et al. 2007), e a formação de memórias no cérebro por meio da quinase CaMKII (Yamashita, et al. 2006).

Apesar da quantidade crescente de informações sobre o papel de α4 em diversos processos celulares, algumas questões fundamentais sobre sua função como regulador de fosfatases 2A e sua participação na via da quinase mTOR permanecem controversas. De acordo com o modelo proposto inicialmente para o complexo entre Tap42 e fosfatases 2A em levedura, a inibição da quinase TOR promoveria a dissociação desse complexo, liberando a fosfatase do efeito inibitório de Tap42 e permitindo assim a desfosforilação de seus alvos. Diversos trabalhos tentaram reproduzir esse modelo em células de mamíferos, gerando resultados contraditórios, já que em alguns casos se observa a dissociação rápida do complexo α4:PP2Ac após o tratamento com rapamicina, enquanto em outros se observa uma dissociação lenta ou nenhuma dissociação.

utilizados, ou ainda que a dissociação do complexo ocorreria apenas em células sensíveis a rapamicina, porém as diferentes estratégias experimentais empregadas dificultam a comparação desses resultados. Modelos mais recentes da regulação das fosfatases 2A por Tap42 em levedura ainda não foram reproduzidos em mamíferos. Outra questão ainda não esclarecida é o mecanismo de regulação de α4 por mTOR. Apesar de ser amplamente aceito que α4 é substrato de mTOR e que sua fosforilação promove a associação com PP2Ac, esses fatos são deduzidos a partir do modelo de levedura sem comprovação direta em células de mamíferos. Uma importante evidência contrária à extrapolação do modelo de levedura para outros organismos é o fato de que a inativação do gene que codifica Tap42/α4 em Drosophila melanogaster não produziu defeitos visíveis na via de sinalização da quinase TOR (Cygnar, et al. 2005).

A descoberta da proteína Tip41 de levedura como peça chave no mecanismo de regulação de Sit4 por Tap42 sugeriu que essa proteína pouco caracterizada poderia esclarecer algumas das lacunas a respeito da regulação das fosfatases 2A por α4 em células de mamíferos. Tip41 é uma proteína conservada (Figura 1.8B) e sua ortóloga humana, chamada de TIPRL, era uma proteína de função totalmente desconhecida na época de início deste trabalho, e ainda permanece pouco caracterizada. TIPRL é o produto de um gene localizado em 1q23.2 e apresenta duas isoformas de

splicing, TIPRL1 e TIPRL2, que apresentam 272 e 178 resíduos de aminoácidos,

respectivamente. Tip41 de levedura e TIPRL humana apresentam 35% de identidade de sequência (Jacinto et al. 2001). Assim como Tap42, Tip41 e suas homólogas não apresentam semelhança com proteínas de outras famílias ou domínios conhecidos.

Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo central de caracterizar o papel das proteínas α4 e TIPRL na regulação de fosfatases 2A. O interesse inicial sobre a proteína α4 em nosso grupo de pesquisa resultou de sua identificação em uma triagem de interações com a proteína Int-6, uma subunidade do fator de início da tradução eIF3 (F. R. G. Carneiro e N. I. T. Zanchin, dados não publicados). Apesar de essa interação não ter sido confirmada, os estudos com α4 prosseguiram devido a sua possível função no controle da tradução na via da quinase TOR. Devido à quantidade relativamente grande de informações funcionais disponíveis na literatura, o trabalho sobre α4 se concentrou inicialmente nos aspectos estruturais da proteína, que eram ainda

Figura 1.8. Alinhamento das sequências de aminoácidos das proteínas Tap42/α4 (A) e Tip41/TIPRL

(B) de camundongo (Mus musculus), humanos (Homo sapiens), peixe (Danio rerio), mosca das frutas (Drosophila melanogaster), planta (Arabidopsis thaliana) e levedura (Saccharomyces cerevisiae). A intensidade da cor indica o grau de conservação da sequência. Alinhamento feito com o programa Clustal W (www.ebi.ac.uk/clustalw).

A

totalmente desconhecidos. Os resultados dessa caracterização estrutural são apresentados na seção 3.1 na forma de um artigo publicado. Já a para a proteína TIPRL, a escassez tanto de dados funcionais quanto estruturais nos levou a priorizar a triagem de interações como forma de obter as primeiras informações sobre a função dessa proteína. Os resultados dessa triagem são apresentados nas seções 3.2 e 3.3. Resultados preliminares sobre a caracterização funcional de α4 e TIPRL oriundos de experimentos em em cultura de células são mostrados na seção 3.4, e os resultados das tentativas de cristalização de TIPRL são apresentados na forma de um anexo (seção 6).

1.6. Referências bibliográficas

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