Diagnóstico Imunológico das Hepatites Virais

(1)

Diagnóstico Imunológico das

Hepatites Virais

(2)

O Fígado

• Limpa o sangue

• Regula os hormônios

• Ajuda na coagulação sanguínea

• Produz bile

• Produz proteínas importantes

• Mantém o nível de açúcar

sanguíneo

• Etc

(3)

Definição

Hepatite viral é a hepatite causada por infecção viral

Hepatite é a inflamação do fígado

(4)

Inflamação do fígado

Presença do vírus faz com que o

sistema imune ataque o fígado,

resultando em inflamação e perda

de função

(5)

Causas da Hepatite

Aguda:



Hepatite Viral



Infecção não viral (bactéria,

fungo, protozoários)



Álcool



Toxinas



Drogas



Isquemia



Doenças auto-imune



Doenças metabólicas

Crônica:



Hepatite Viral



Álcool



Drogas



Doenças auto-imune



Genética

(6)

Agentes da Hepatite Viral

Vírus hepatotrópicos • HAV • HBV • HDV • HCV • HGV • HEV • TTV • SEN-V • SAMBAN • YOMBAN • Etc Outros vírus • Epstein-Barr • Citomegalovírus • Herpes simplex • Adenovírus • Rubéola • Varicella • Coxsackie B • Echovírus • Febre amarela • Etc

(7)

Manifestações Clínicas (sintomas) das Hepatites Virais

Anictérico (sem sinais de icterícia) • Astenia (fraqueza) • Anorexia • Febre • Mal estar • Náusea • Vômito

• Mialgia (dor muscular) Ictérico

• Colúria (urina escura) • Acolia fecal (fezes claras)

• Icterícia (coloração amarelada da pele e mucosas)

(8)

Hepatites Virais

Hepatite A B C D E

Agente Etiológico HAV HBV HCV HDV HEV

Família Picornaviriae Hepadnaviridae Flaviviridae Não classificado Caliciviridae

Marcadores para Diagnóstico Anti-HAV IgM; Anti-IgG ou total HBs Ag; Anti-HBc total; Anti-HBc IgM; HBeAg; Anti-HBe; Anti-Hbs Anti-HCV; Antígeno do core HBs Ag; Anti-HBc IgM; Anti-HDV IgG; Anti-HDV IgM Anti-HEV IgM; Anti-HEV IgG Testes RT-PCR PCR; b-DNA RT-PCR; NASBA; b-DNA RT-PCR RT-PCR

(9)

Transmissão das Hepatites Virais

Os 5 tipos principais

HAV: transmissão fecal-oral

HBV: fluidos corporais e sangue

HCV: sangue

HDV: co-infecção com HBV

HEV: transmissão fecal-oral

(10)

Hepatite A

• Transmissão fecal-oral (mas pode

ser também por alimentos

contaminados e relações sexuais)

• Incubação de 2 a 6 semanas

• A proporção da forma sintomática

e complicações aumentam com a

idade (crianças são geralmente

assintomáticas)

• Prevenção: higiene, medidas

sanitárias, imunização, cozinhar

bem os alimentos

• Tratamento: não específico, dieta

controlada e descanso

(11)

Hepatite A

Vírus HAV

• Picornavirus (RNA fita simples)

• Humanos são os únicos

hospedeiros naturais

• Sorotipo viral único (diferença

antigênica entre cepas

insignificante)

• Antígeno imunodominante:

• Conformacional

• Localizado no capsídeo viral

• Envolvido na neutralização

(12)

Hepatite A

Diagnóstico

Curva sorológica da hepatite A

Meses após a infecção

0 1 2 3 4 5 6 12 24 Sintomas

Viremia HAV

(13)

Hepatite A

Diagnóstico

Curva sorológica da hepatite A

0 1 2 3 4 5 6 12 24 Sintomas

Viremia HAV

fezes

ALT (alanina aminotransferase)

• Indicador de dano hepático • Soro ou plasma

(14)

Hepatite A

Diagnóstico

Curva sorológica da hepatite A

0 1 2 3 4 5 6 12 24 Sintomas

Viremia HAV

fezes

ALT (alanina aminotransferase)

IgM anti-HAV

• 1 a 3 semanas após o início dos sintomas

(15)

Hepatite A

ELISA Captura de IgM

Anticorpos anti-IgM humana adsorvidos IgM liga-se ao anticorpo lavagens Anti-HAV IgM E Antígeno HAV+ anticorpo acoplado à uma enzima Um segundo anticorpo, acoplado à uma enzima

(peroxidase), liga-se ao complexo IgM-anticorpo lavagens S S S Substrato é adicionado e convertido pela enzima em

um produto com uma determinada cor. A coloração é proporcional à

quantidade de IgM lavagens

(16)

Hepatite A

Diagnóstico

Curva sorológica da hepatite A

0 1 2 3 4 5 6 12 24 Sintomas

Viremia HAV

fezes

ALT (alanina aminotransferase)

IgM anti-HAV

IgG anti-HAV

(17)

Hepatite A

ELISA Indireto de IgG

Antígenos de HAV adsorvidos IgG liga-se ao antígeno Anti-HAV IgG lavagens Um anticorpo, acoplado à uma enzima

liga-se ao complexo antígeno-anticorpo

E

lavagens E

Substrato é adicionado e convertido pela enzima em

um produto com uma determinada cor. A coloração é proporcional à quantidade de IgG S S S lavagens E S P E

(18)

Hepatite B

• 2 bilhões de

infectados; ~400

milhões com doença

crônica; ~1 milhão de

mortes por ano

• 90% dos adultos

saudáveis infectados

irão se recuperar e

desenvolver

anticorpos contra

futuras infecções

• Transmissão: sangue,

fluidos corporais,

sexual (pode ocorrer

semanas antes dos

sintomas)

• Incubação: 1-6 meses

Percent of Acute Hepatitis B Cases Developing Chronic Hepatitis B

Infants 90%

Children 50%

Adults 5-10%

(19)

Hepatite B

Resposta Imune

• Eficiente

: elimina o vírus mas causa

lesões celulares

• Deficiente

: não elimina o vírus e dão

poucos sintomas (crônicos)

(20)

Hepatite B

Vacina e tratamento para HBV

• Vacina efetiva

• Adultos: 0, 1m e 6m

• Bebês:

• Parto, 1-2m; 6-18m (mãe HBsAg -)

• Parto (+Hep B ac), 1-2m;<6m (mãe HBsAg +)

• Opções de Tratamento:

• Interferon Alfa

• Lamivudine

(21)

Hepatite B

Hepatitis B

Crônica

Cirrose

Insuficiência

hepática

Câncer de

fígado

• 25% das pessoas com hepatite B crônica terminarão com cirrose e/ou câncer de fígado sem nenhuma intervenção

(22)

Hepatite B

Sintomas na fase aguda:

• Início insidioso

• Febre, mal estar e

anorexia

• Náusea, vômito,

desconforto

abdominal e calafrios

• Icterícia, colúria,

acolia fecal

• Declínio da febre e

volta de apetite

(23)

Hepatite B

Sintomas na fase crônica:

• Variável

• Fadiga, mal-estar, perda

de apetite

• Surtos de icterícia

• Hepatomegalia e

esplenomegalia

• Transaminases

aumentadas

(24)

Hepatite B

Vírus HBV

• DNA dupla fita (parcial)

• Replicação envolve a

transcriptase reversa

• Antígenos principais:

• HBsAg = proteína de

superfície (coat) (4

subtipos: adw, adr, ayw e

ayr)

• HBcAg = proteína interna

do core (sorotipo único)

• HBeAg = proteína

secretada (função

desconhecida)

(25)

Hepatite B

Vírus HBV

• DNA dupla fita (parcial)

• Replicação envolve a

transcriptase reversa

• Antígenos principais:

• HBsAg = proteína de

superfície (coat) (4

subtipos: adw, adr, ayw e

ayr)

• HBcAg = proteína interna

do core (sorotipo único)

• HBeAg = proteína

secretada (função

desconhecida)

• Antígeno HBsAg é o primeiro marcador detectado: 30-45 dias após infecção (antes da ALT) e permanece até 4 meses

• Partículas contendo HBsAg são liberadas no soro de pessoas infectadas (100 a 1000 vezes mais abundantes que o vírus completo)

• São imunogênicas e foram usadas como a primeira vacina comercial contra HBV

(26)

Hepatite B

Vírus HBV

• DNA dupla fita (parcial)

• Replicação envolve a

transcriptase reversa

• Antígenos principais:

• HBsAg = proteína de

superfície (coat) (4

subtipos: adw, adr, ayw e

ayr)

• HBcAg = proteína interna

do core (sorotipo único)

• HBeAg = proteína

secretada (função

desconhecida)

• Anti-HBc-IgM: indicador de hepatite aguda e é o primeiro anticorpo detectado

• Anti-HBc-IgG: positivo por toda a vida (marcador de infecção prévia)

(27)

Hepatite B

Vírus HBV

• DNA dupla fita (parcial)

• Replicação envolve a

transcriptase reversa

• Antígenos principais:

• HBsAg = proteína de

superfície (coat) (4

subtipos: adw, adr, ayw e

ayr)

• HBcAg = proteína interna

do core (sorotipo único)

• HBeAg = proteína

secretada (função

desconhecida)

• Antígeno HBeAg surge após o antígeno HBsAg e indica intensa replicação viral (~2,5 meses)

• Anti-HBe associado com dramático dimunição da replicação viral

(28)

Hepatite B: Algoritmo para diagnóstico de infecção por HBV

HBsAg / anti-HBc total

- / - + / - + / + - / +

Negativo Incubação Hepatite B Anti-HBs

Imunidade Janela + - Anti-HBc-IgM

HBeAg / anti-HBe

Hepatite Aguda Hepatite Crônica

+ -

+ / - : Aguda com replicação viral

- / + : Soroconversão para anti-HBe

- / + : Crônica sem replicação (bom prognóstico)

+ / - : Crônica com replicação (mau prognóstico)

(29)

Incubação

Hepatite B

Curva sorológica da hepatite B Aguda

3 6 9

Infecção aguda tardia Infecção aguda

recente Imunidade/cura

HBsAg

_HBeAg

Anti-HBe

Anti-HBc IgM

Anti-HBs

Anti-HBc IgG

(30)

Incubação

Hepatite B

Curva sorológica da hepatite B: soroconversão tardia

3 6 9

Infecção crônica Infecção aguda

recente

HBsAg

HBeAg

_Anti-HBe

(31)

Incubação

Hepatite B

Curva sorológica da hepatite B: sem soroconversão

3 6 9 Infecção crônica Infecção aguda recente

HBsAg

HBeAg

(32)

Hepatite B: Algoritmo para diagnóstico de infecção por HBV

- / - + / - + / + - / +

Imunidade Janela + -

(33)

Hepatite B: Algoritmo para diagnóstico de infecção por HBV

- / - + / - + / + - / +

Imunidade Janela + - Anti-HBc-IgM

(34)

Hepatite B: Algoritmo para diagnóstico de infecção por HBV

+ / +

Hepatite B

Anti-HBc-IgM

HBeAg / anti-HBe

+ -

+ / - : Aguda com replicação viral

- / + : Soroconversão para anti-HBe

- / + : Crônica sem replicação (bom prognóstico)

+ / - : Crônica com replicação (mau prognóstico)

(35)

ELISA Sandwich para HBsAg

Anticorpos anti-HBsAg adsorvidos anti-HBsAg Antígeno liga-se ao anticorpo HBsAg lavagens Um segundo anticorpo, acoplado à uma enzima

(peroxidase), liga-se ao complexo antígeno-anticorpo E lavagens E E Substrato é adicionado e convertido pela enzima em

um produto com uma determinada cor. A coloração é proporcional à quantidade de antígeno S S S lavagens E E S P

(36)

Resultados falsos para HBsAg

Falsos-positivos

• Plasma heparinizado

• Hemoglobina ou bilirrubina • Infecções agudas ou crônicas • Doenças auto-imunes

• Doença hepática crônica • Grávidas

Falsos-negativos • Janela do core

• Baixos níveis de HBsAg • Mutante do gene S

(37)

Interpretação dos marcadores sorológicos

HBsAg Anti-HBc total Anti-HBc IgM HBeAg Anti-HBe Anti-HBs Interpretação

+

-

Hepatite B aguda

+

-

Incubação

+/+- +

-

+

-

Sorocoversão anti-HBe

-

+

-

+

Imune após infecção natural

-

+

Adivinhem

+

-

+

-

Crônico: mau prognóstico

+

-

+

-

Crônico: bom prognóstico

-

+

-

Possível mutante

-

+

-

Janela sorológica do core

+

-

+

-

Adivinhem

(38)

Interpretação dos marcadores sorológicos

HBsAg Anti-HBc total Anti-HBc IgM HBeAg Anti-HBe Anti-HBs Interpretação

+

-

Hepatite B aguda

+

-

Incubação

+/+- +

-

+

-

Sorocoversão anti-HBe

-

+

-

+

Imune após infecção natural

-

+

Imune por vacinação

+

-

+

-

Crônico: mau prognóstico

+

-

+

-

Crônico: bom prognóstico

-

+

-

Possível mutante

-

+

-

Janela sorológica do core

+

-

+

-

Possível imunodeficiência

-

+

-

Infectado no passado, recém-nascido – mas mãe +, baixa viremia, falso positivo

(39)

Hepatite C

• 170 milhões no

mundo

• Transmissão: sangue

(raramente

sexualmente

transmitidas)

• Incubação: 2 a 6

meses

• Infecção 1+ semanas

antes dos sintomas

(mas 75% são

assintomáticos)

• Crônicos permanecem

infecciosos

• 20% dos crônicos

podem progredir para

cirrose em 40 anos

(40)

Hepatite C

Vírus HCV

• Família Flaviviridae

• RNA fita-simples

• Grande diversidade

genômica e muitos

subtipos

• Difícil de tratar

(41)

Hepatite C

Vírus HCV

• Genoma de 9.600nt que codifica uma única poliproteína de 3.000aa (que é clivada): • Core, E1 e E2: Proteínas estruturais

• NS2 a NS5: Proteases, helicases e RNA polimerase (não-estruturais) • Regiões conservadas: 5’ e 3’ não-codificadora

(42)

Hepatite C

Dificuldades de se desenvolver vacinas

• Diversidade genômica • Não propagável in vitro

• Sem modelo animal adequado (apenas humanos e chimpanzés) • Imunidade de um genótipo não protege contra outros genótipos

(43)

HCV RNA

Diagnóstico para Hepatite C

Curva sorológica da hepatite C

0 1 2 3 4 5 6 12 24 Sintomas

IgG anti-HCV

(44)

Diagnóstico para Hepatite C

Triagem:

Detectar anti-HCV (ELISA, Immunoblot)

0 1 2 3 4 5 6 12 24

IgG anti-HCV

Falsos positivos: • Doença auto-imune • Hepatite alcóolica • Hipergamaglobulinemia Falsos negativos:

• Janela sorológica (~6 semanas para se detectar anticorpos) • Imunossupressão (imuno

deficiência, transplante, hemodiálise)

(45)

HCV RNA

Diagnóstico para Hepatite C

0 1 2 3 4 5 6 12 24

IgG anti-HCV

Testes confirmatórios:

(46)

HCV RNA

Diagnóstico para Hepatite C

0 1 2 3 4 5 6 12 24

IgG anti-HCV

Testes para monitorar danos e função hepática:

Enzimas hepáticas (ALT, AST, GGT, LDH), Função (albumina, bilirrubina), Biópsia, Ultrasom

(47)

Diagnóstico para Hepatite C

anti-HCV

Não reagente Reagente

Immunoblot

Positivo Indeterminado Negativo

PCR quantitativo Carga viral

e

(48)

Diagnóstico para Hepatite C

ELISA (3

a

_geração)

anti-HCV

Immunoblot

PCR quantitativo Carga viral e Genotipagem Antígenos (C22-3p + C33c + C100-3 + NS5) Sensibilidade ~99% Janela de 66 dias

(49)

Diagnóstico para Hepatite C

Immunoblot (Western blot)

Immunoblot

e

Genotipagem

Identifica anticorpos específicos

Teste é interpretado como positivo (2+ antígenos), indeterminado (1 antígeno) e negativo (0 antígenos) Não é mais utilizado nos EUA

(50)

Diagnóstico para Hepatite C

Testes moleculares

e

Genotipagem

Quantitativo (carga viral) e Qualitativo (presença ou ausência de RNA viral)

Janela 11 a 16 dias

Pode ser usado para avaliar a resposta do tratamento

Problemas: grande variabilidade genética e necessidade de padronização internacional que permita normalizar os títulos virais em UI/ml (OMS)

anti-HCV

(51)

Diagnóstico para Hepatite C

Testes moleculares

e

Genotipagem

COBAS Amplicor HCV Test (Roche) Detecta 50UI/m (Qualitativo)

Teste utiliza RT para converter RNA viral em cDNA, amplifica o alvo e hibridiza para detecção

anti-HCV

Immunoblot

VERSANT HCV RNA Qualitative Assay Detecta 10UI/m (Qualitativo)

TMA: transcription-mediated

amplification. Teste usa RT para converter o RNA viral em cDNA, RNA polimerase para amplificar as cópias de RNA (que podem ser transcritas novamente em cDNA)

VERSANT HCV RNA 3.0 Assay Teste Quantitativo

bDNA: Branched DNA. Não requer amplificação. O sinal da sonda de bDNA é amplificado após sua ligação com o alvo.

(52)

Diagnóstico para Hepatite C

Genotipagem

Carga viral e

Genotipagem

Abbott RealTime HCV Genotype II Detecta 6 genótipos (1 a 6)

Usa sondas de nucleotídeos marcadas com fluoróforo específicas para cada genótipo

Acurácia varia de 83 100% anti-HCV

Immunoblot

VERSANT HCV Genotype 2.0 Assay Detecta genótipos de 1 a 6 e 15

subtipos

LiPA: Line Probe Assay PCR

(53)

Hepatite D

• HDV é um vírus de

RNA fita-simples

circular

• Co-infecção com HBV

(o HDV necessita de

envelope do HBV para

sua replicação)

(54)

Hepatite D

• Na co-infecção a

evolução é

semelhante à

hepatite B aguda

• Na super-infecção

(infecção por HDV

em indivíduos com

hepatite B crônica)

a evolução é bem

pior: maior dano

hepático, maior

cronicidade e

hepatite

(55)

Diagnóstico para Hepatite D

Detecção

• Presença do RNA

viral

• Anti-HDV IgG

• Anti-HDV IgM

• HBsAg

• Anti-HBc IgM

(co-infecção)

• Anti-HBc IgG

(superinfecção)

(56)

Hepatite E

• Vírus RNA simples-fita

• Transmissão: fecal-oral,

água contaminada por seres

humanos ou animais

infectados

• Prevalência em países em

desenvolvimento

• Hepatite auto-limitada (1 a

4% de mortalidade)

• Mais comum em

adolescentes e jovens

• Incubação de 15 a 60 dias

(57)

Diagnóstico para Hepatite E

• Sorologia (ELISA)

• Detecção de RNA viral no

soro ou fezes

• Detecção do antígeno do

HEV no fígado

(58)

Hepatite G

• Causada pelo vírus GBV-C

(Flaviviridae)

• Relacionado filogeneticamente

com HCV

• 3% da população mundial infectada

• Não evolui para crônicos

• Controversa associação com

hepatite clínica

• Triagem de doadores é

impraticável e desnecessária

(59)

Hepatites Virais

Hepatite A B C D E

Agente Etiológico HAV HBV HCV HDV HEV

Família Picornaviriae Hepadnaviridae Flaviviridae Não classificado Caliciviridae

Marcadores para Diagnóstico Anti-HAV IgM; Anti-IgG ou total HBs Ag; Anti-HBc total; Anti-HBc IgM; HBeAg; Anti-HBe; Anti-Hbs Anti-HCV; Antígeno do core HBs Ag; Anti-HBc IgM; Anti-HDV IgG; Anti-HDV IgM Anti-HEV IgM; Anti-HEV IgG Testes RT-PCR PCR; b-DNA RT-PCR; NASBA; b-DNA RT-PCR RT-PCR