FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
HANAN CHWEIH
AVALIAÇÃO DO PAPEL DAS PLAQUETAS NA ANEMIA FALCIFORME
CAMPINAS
2019
AVALIAÇÃO DO PAPEL DAS PLAQUETAS NA ANEMIA FALCIFORME
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências
ORIENTADORA: PROFa. DRa. NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
HANAN CHWEIH, E ORIENTADA PELA
PROFA. DRA. NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO.
CAMPINAS
2019
HANAN CHWEIH
ORIENTADOR: PROFA. DRA.NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO
MEMBROS:
1. PROFA. DRA.NICOLA AMANDA CONRAN ZORZETTO
2. PROFA. DRA. CRISTINA PONTES VICENTE
3. PROFA. DRA. ALESSANDRA GAMBERO
4. PROFA. DRA. CLAUDIA REGINA BONINI DOMINGOS
5. PROFA. DRA. SANDRA FÁTIMA MENOSI GUALANDRO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM.
Agradeço primeiramente a minha orientadora Nicola Conran (Nic), uma pessoa extremamente dedicada e batalhadora, que conseguiu atingir um patamar muito respeitado na pesquisa por total mérito dela. Ela nos incentiva a cada dia a sermos o melhor, gostaria de agradecê-la por toda dedicação, paciência, disponibilidade e até algumas broncas de mãe as vezes que me fizeram crescer muito nesses 4 anos juntas.
Ao professor Fernando Ferreira Costa agradeço por disponibilizar todo o apoio físico e financeiro envolvido em meu projeto. E ao professor e amigo Kleber Fertrin, por todas as conversas e ajudas sempre muito esclarecedoras em momentos importantes.
Meu muito obrigado aos colegas e amigas do laboratório, as orientadas pela Nic: Lediana, Pamela, Erika, Lidiane, Fernanda, Caroline, Flavia Garcia. E aos orientados por outros professores e que passaram tempo conosco no laboratório: Japa, Athos, Álvaro, Ingrid, Flavia Recife, Leticia, Tamires. Obrigada por todos os momentos compartilhados durante esses 4 anos, com certeza a convivência diária com todos, fez do nosso ambiente de trabalho muito mais alegre e leve.
Agradeço em especial a Flavia Boca, Ucha, Carol Lanaro, Dul Simone e Adriana por todos os abraços, conversas e conselhos que obtive nesse período, obrigada por sempre me ouvirem e por todo o carinho concedido a mim nesse tempo.
Agradeço a Juliete pela ajuda durante o projeto, por ter me auxiliado e apresentado a microscopia confocal e mesmo de longe estar sempre disposta a ajudar.
Agradeço aos funcionários em geral, e ao Márcio e Arnaldo por cuidar dos nossos animais no biotério e estarem sempre atentos e dispostos a nos ajudar.
Agradeço a FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo suporte financeiro através do processo nº 2015/18369-6.
Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
Agradeço a minha amiga Vanessa, que sempre foi mais que amiga, muitas vezes irmã e esteve presente em todos os momentos de alegria e angústia, me ouvindo e muitas vezes chorando comigo.
Agradeço aos meus padrinhos Carol e Thales que se tornaram família pra mim e sempre estiveram ao meu lado, agradeço por todas as viagens, encontros passeios e conversas que fizeram da minha vida em Campinas muito especial.
Todos que me conhecem sabem da admiração que tenho pelos meu pais, Samira Zeinedin Chweih e Hermes Chweih, e portanto pra eles nada do que eu agradecer será suficiente, pois graças a eles estou aqui hoje, eles não me deram somente a vida, eles me ensinaram sobre a vida e me ensinam todos os dias como devemos seguir, meus pais são pra mim motivo de orgulho, admiração e muito respeito. Gostaria muito de agradecê-los por sempre estarem presentes e entenderem os vários momentos bons e ruins que eu não pude estar junto e muitas vezes mesmo nos piores momentos estarem sempre me apoiando, gostaria de pedir perdão por muitas vezes não poder dar a atenção necessária mais dizer que a minha vida perde o sentido se vocês não estivessem comigo.
A minha irmã Luana Chweih, eu dispenso comentários, ela é a pessoa que carrega meu coração, conhece meus defeitos e sabe exatamente o que eu preciso ouvir em cada momento, obrigada por estar comigo e por vir sempre que podia me visitar e me trazer tanto carinho, eu te amo muito.
Ao meu esposo Felipe Vendrame, tudo que eu agradecer é pouco, ele esteve comigo desde o início desta jornada, foi meu maior incentivador nessa carreira, eu sei que muitas vezes abdicou de sentimentos e vontades para estar ao meu lado me segurando mesmo quando o que eu mais queria era desistir, se existe alguém nesse mundo que
apoio, e por todas as vezes que sofreu comigo, mas mesmo assim foi forte e me fez seguir em frente, sem você eu jamais teria chego até aqui, você é meu parceiro de vida, e o presente que Deus me deu nessa vida, eu te amo demais!
A FÉ move montanhas e a minha me trouxe até aqui, se não fosse pela minha fé e pelo Deus que me sustenta, nada disso seria possível, por isso finalizo agradecendo a Deus pelo dom da vida, e por guiar a minha vida, quando mais precisei foi pra ele que recorria em choros e orações e pra ele hoje que agradeço de joelhos por todas as bençãos e conquistas nesse período.
Por fim, não só agradeço como também dedico esta tese aos meus avós maternos (in memorian) que mesmo sofrendo muito entenderam que eu não pude estar com eles no
momento que mais precisavam, eu sinto muito por isso, mas sei que onde estiverem estão olhando por mim.
A anemia falciforme (AF) resulta da homozigose de uma mutação de ponta no gene HBB, resultando na produção da cadeia β-globina alterada (βS). A doença é caracterizada por anemia hemolítica crônica, crises dolorosas de vaso-oclusão, lesões de órgãos-alvo e um estado inflamatório crônico. Pacientes com AF apresentam contagens elevadas de leucócitos, e evidências indicam a participação dos leucócitos no início e propagação dos processos vaso-oclusivos, pois estas células são relativamente grandes e rígidas, fazendo com que seu recrutamento para a microcirculação reduza o fluxo sanguíneo nos vasos. O papel das plaquetas no processo vaso-oclusivo é pouco conhecido, apesar de sabermos que há ativação das plaquetas na AF. Sendo assim, este projeto teve como principal objetivo avaliar o papel das plaquetas no processo vaso-oclusivo, estimulado pela citocina TNF, em camundongos quimeras para AF, visualizando e diferenciando as células participantes deste processo inflamatório. Adicionalmente, o efeito da depleção ou diminuição da atividade das plaquetas na resposta inflamatória causada por TNF em camundongos com AF foi verificado. No decorrer deste projeto, realizamos as técnicas de transplante de medula óssea de camundongos transgênicos Berkeley para camundongos C56BL/6 (com o intuito de produzir camundongos quimeras por AF e aumentar a colônia de animais com AF), além de microscopia convencional intravital e microscopia intravital confocal da microcirculação do musculo cremaster com marcação fluorescente para plaquetas e leucócitos. Nós verificamos que, após estímulo dos animais AF com TNF, a plaqueta atua como primeiro sinal da resposta inflamatória, possuindo a função de recobrir o endotélio inflamado da microcirculação e então recrutando leucócitos (com ambos, alta e baixa expressão da molécula Ly6G), tanto em animais controles como em animais AF. Além disso, em associação ao aumento da adesão de plaquetas a parede vascular, houve uma redução da velocidade do fluxo sanguíneo destes animais e da sua sobrevida. Verificamos que tratamentos capazes de diminuir a quantidade de plaquetas ou a ativação plaquetária (uso de anticorpo anti-CD42b e prasugrel, respectivamente) foram capazes de reduzir, ou até reverter, o recrutamento de plaquetas e leucócitos na microcirculação e, portanto, os processos vaso-oclusivos em camundongos AF. A administração de hidroxiureia em animais AF reduziu o recrutamento das plaquetas e dos leucócitos e a formação de agregados plaquetas/ leucócitos na microcirculação, melhorando a velocidade de fluxo nos mesmos. Finalmente, comparamos o mecanismo de vaso-oclusão, estimulado por processos de hipóxia e reperfusão, com a vaso-oclusão induzida por TNF; apesar de um maior recrutamento de leucócitos na microcirculação destes camundongos AF, verificamos um menor recrutamento das plaquetas com menor diminuição do fluxo sanguíneo. Esses dados nos levam a concluir que a plaqueta possui um papel importante nos processos inflamatórios induzidos por TNF, iniciando e propagando os processos vaso-oclusivos em animais com AF. Apesar dos dados decepcionantes do primeiro ensaio clinico multicêntrico com prasugrel na AF, agentes antiplaquetários ainda devem ser estudados como forma de terapia em combinação, ou não, com a hidroxiureia para diminuir a frequência das crises vaso-oclusivas ou até para uso em pacientes hospitalizados por este motivo.
Sickle cell anemia (SCA) results from a homozygotic mutation in the HBB gene, resulting in the production of the altered β-globin (βS) chain. The disease is characterized by chronic hemolytic anemia, painful vaso-occlusive crises, target organ damage and a chronic inflammatory state. Patients with SCA have high leukocyte counts, and evidence indicates the participation of leukocytes in the triggering and propagation of vaso-occlusive processes, as these cells are relatively large and rigid, causing their recruitment to blood vessel walls in the microcirculation and reducing blood flow. The role of platelets in the vaso-occlusive process is poorly understood, although we know that platelet activation occurs in SCA. Thus, this project aimed to evaluate the role of platelets in vaso-occlusive processes, stimulated by TNF cytokine, in chimeric mice with SCA, visualizing and differentiating the cells participating in this inflammatory process. Additionally, the effect of the depletion of platelets or the inhibition of their activity on the inflammatory response caused by TNF in mice with SCA was evaluated. For this project, we produced chimeric SCA mice by transplanting the bone marrow of SCA Berkeley transgenic mice into C56BL/6 mice (in order to increase the SCA mouse colony size), in addition to conventional intravital microscopy and intravital confocal microscopy of the cremaster muscle microcirculation, with fluorescent labeling for platelets and leukocytes. We found that, after stimulation of SCA animals with TNF, the platelets act as a primary response signal, covering the inflamed endothelium of microcirculation and subsequently recruiting leukocytes (with both high and low expressions of the Ly6G adhesion molecule), both in Control (CON) and SCA animals. Moreover, in association with increased platelet adhesion to the vascular wall, there was a reduction in blood flow velocity and animal survival. We found that treatments capable of decreasing platelet count or platelet activation (use of anti-CD42b antibody or prasugrel, respectively) were able to reduce, or even reverse, the recruitment of platelets and leukocytes in the microcirculation, and thus vaso-occlusive processes in SCA mice. Administration of hydroxyurea in SCA animals reduced platelet and leukocyte recruitment and the formation of platelet / leukocyte aggregates in the microcirculation, therefore improving blood flow rate. Finally, we compared the mechanism of vaso-occlusion, when stimulated by hypoxia and reperfusion processes, with TNF-induced vaso-occlusion in SCA mice; despite an increased recruitment of leukocytes in the microcirculation of the SCA mice subjected to hypoxia/reperfusion, we observed less platelet recruitment with a less significant decrease in blood flow. These data lead us to conclude that the platelet plays an important role in TNF-induced inflammatory processes, initiating and propagating vaso-occlusive mechanisms in animals with SCA. Despite the disappointing data from the first multicenter clinical trial of prasugrel in SCA, antiplatelet agents should still be studied as a form of therapy for the disease, in combination or not with hydroxyurea, to decrease the frequency of vaso-occlusive episodes or even for use in patients hospitalized for acute vaso-occlusive crisis.
ADP - Adenosina difosfato AF - Anemia falciforme ATP - Adenosina trifosfato AVC - Acidente vascular cerebral CON – Controle
DF- Doenças falciformes
eNOS - Óxido nítrico sintase endotelial
ET-1 - Endotelina-1
FAP - Fator ativador de plaquetas FT -Fator tecidual
FvW - Fator de von Willebrand
GATA – GATA binding factor
Hb - Hemoglogina
HbF - Hemoglobina Fetal HO-1 - Heme-Oxigenase-1
ICAM-1 - Molécula de adesão intercelular-1 IL - Interleucina
IPEN - Instituto de Pesquisas Nucleares da USP – SP
Ly6G - Lymphocyte antigen 6 complex locus G6D Mac-1 - Macrophage-1 antigen
M-CSF - Fator estimulador de colônia de macrófagos NO - Oxido nítrico
OMS - Organização Mundial da Saúde PBS - Phosphate-buffered saline
PSGL-1 - P-selectin glycoprotein ligand-1 ROS - espécies reativas de oxigênio
Figura 2 Interações heterocelulares de neutrófilo-plaqueta 26
Figura 3 Fenotipagem dos camundongos AF quimeras 35
Figura 5 Rolamento, adesão, extravasamento e velocidade de rolamento de leucócitos na
microvasculatura do músculo cremaster de camundongos CON e AF 45
Figura 6 Imagens representativas de vênulas da microcirculação do musculo cremaster de
camundongos CON e AF 46
Figura 7 Visualização de leucócitos, neutrófilos e plaquetas na microvasculatura do músculo
cremaster em camundongos CON e AF por microscopia intravital confocal 48
Figura 8 Quantificação da adesão de leucócitos Ly6G High e Ly6G Low do músculo cremaster de
camundongos CON e AF e quantificação de cluster de plaquetas nas vênulas 50
Figura 9 Comparação de leucócitos Ly6G High e Low aderidos a parede vascular da
microcirculação em co-localização, ou não, com plaquetas em animais CON e AF 51
Figura 10 Fluxo sanguíneo nas vênulas do musculo cremaster em camundongos CON e AF 52
Figura 11 Curva representativa da concentração de plaquetas em sangue de camundongo 53
Figura 12 Efeito da depleção de plaquetas no recrutamento de leucócitos á microvasculatura em
camundongos quimeras COM 55
Figura 13 Efeito da depleção de plaquetas no recrutamento de leucócitos a microvasculatura em
camundongos quimeras AF 57
Figura 14 Visualização de leucócitos, neutrófilos e plaquetas na microvasculatura do músculo
cremaster em camundongos CON e AF por microscopia intravital confocal 59
Figura 15 Adesão de leucócitos não neutrófilos e neutrófilos na microvasculatura do músculo
cremaster de camundongos CON e AF 61
Figura 16 Efeito do tratamento agudo de camundongos CON e AF com prasugrel (1mg/kg) 1h antes
do estimulo por TNF no recrutamento de leucócitos á microvasculatura 62
Figura 17 Visualização de leucócitos, neutrófilos e plaquetas na microvasculatura do músculo
cremaster de camundongos CON e AF tratados, ou não, com prasugrel 64
Figura 18 Efeito do tratamento agudo com prasugrel na microvasculatura de camundongos CON e
AF 65
Figura 19 Efeito do tratamento agudo com prasugrel nos números e recrutamento de plaquetas na
microvasculatura de camundongos CON e AF 67
Figura 20 Avaliação do efeito da administração de prasugrel (1mg/kg, administração única) na
velocidade do fluxo sanguíneo na microcirculação cremaster de camundongos CON e AF 69
Figura 21 Efeito do tratamento crônico de prasugrel no recrutamento de leucócitos á
Figura 23 Efeito do tratamento com prasugrel 1 hora após TNF na microvasculatura de camundongos
CON e AF 74
Figura 24 Efeito do tratamento com prasugrel na % de adesão de plaquetas na microvasculatura de
camundongos CON e AF 75
Figura 25 Visualização de leucócitos Ly6G High, Ly6G Low e plaquetas na microvasculatura do
músculo cremaster de camundongos CON e AF tratados, ou não, com HU 77
Figura 26 Efeito do tratamento agudo com HU na microvasculatura de camundongos CON e AF 78
Figura 27
Visualização do efeito da depleção de neutrófilos Ly6G high no recrutamento e adesão de plaquetas ao endotélio na microvasculatura do músculo cremaster em camundongos CON e AF por microscopia intravital confocal
81
Figura 28 Efeito da depleção de neutrófilos na microvasculatura de camundongos CON e AF 83
Figura 29 Avaliação da velocidade do fluxo sanguíneo de camundongos CON e AF 84
Figura 30 Efeito do processo de isquemia/reperfusão no recrutamento de leucócitos à
microvasculatura em camundongos CON e AF 86
Figura 31
Visualização do efeito da I/R no recrutamento e adesão de leucócitos Ly6G High e Ly6G Low plaquetas ao endotélio na microvasculatura do músculo cremaster em camundongos CON e AF por microscopia intravital confocal
88
Figura 32 Efeito da I/R na microvasculatura de camundongos CON e AF 89
Figura 33 Avaliação da velocidade do fluxo sanguíneo de camundongos CON e AF 90
Figura 34 Marcação de monócitos microvasculatura do músculo cremaster em camundongos CON e
AF por microscopia intravital confocal 92
Figura 35 Quantificação do número de monócitos e Ly6G Low aderidos na microvasculatura do
cremaster de camundongos CON e AF 93
Figura 36 Porcentagem de neutrófilos positivos para Ly6G na medula óssea (MO) e sangue periférico
de camundongos CON ou AF 94
Figura 37 Papel das plaquetas na iniciação do processo vaso-oclusivo e o efeito do prasugrel neste
1 INTRODUÇÃO 16
1.1 Fisiopatologia da anemia falciforme e o processo vaso-oclusivo 17
1.2 Modelos de animais transgênicos para anemia falciforme 19
1.3 Função endotelial na anemia falciforme e vaso – oclusão 20
1.4 Papel da inflamação e leucócitos na anemia falciforme 21
1.5 Plaquetas e a anemia falciforme 22
1.6 Interações heterocelulares de neutrófilo-plaqueta 24
1.7 Medicamentos utilizados para terapia na anemia falciforme 26
1.8 Medicamentos antiplaquetárias em desenvolvimento para uso na anemia
falciforme 27 2 JUSTIFICATIVA 30 3 OBJETIVO 31 3.1 Objetivos específicos 31 4 METODOLOGIA 32
4.1 Obtenção de camundongos quimeras por transplante de medula 32
4.1.1 Procedimento de Irradiação 33
4.1.2 Coleta da Medula Óssea 33
4.1.3 Gel de fenotipagem 34
4.2 Microscopia intravital 35
4.2.1 Traqueostomia 35
4.2.2 Cirurgia de exteriorização do cremaster 35
4.2.3 Microscopia Convencional Intravital 36
4.2.4 Microscopia Confocal Intravital 36
4.2.5 Análise das vênulas 37
4.3 Uso do anticorpo depletor de plaquetas 37
4.4 Uso do prasugrel 38
4.5 Uso do anticorpo depletor de neutrófilos 38
4.6 Indução de hipóxia e reoxigenação em camundongos 39
4.7 Citometria de sangue periférico e medula óssea de camundongos CON e AF 39
5 PROTOCOLOS DE MICROSCOPIA INTRAVITAL E CONFOCAL 41
6 RESULTADOS 44
6.1 Avaliação do processo de recrutamento de leucócitos na microvasculatura,
após indução de processo inflamatório, em camundongos quimeras
controles e AF 44
6.2 Visualização e diferenciação de células participantes nos processos
vaso-oclusivos na microcirculação de camundongos CON e AF 46
6.3 Quantificação do número de leucócitos Ly6gHigh, Ly6GLow e plaquetas na
microvasculatura dos camundongos quimeras CON e AF após estimulo inflamatorio por TNF.
49
6.4 Quantificação de agregados Ly6G High e Ly6G Low com plaquetas na
6.6 Depleção de plaquetas reduz os efeitos causados por estímulo
inflamatório em camundongos CON e AF, mas com efeitos deletérios em animais AF
53
6.7 A depleção de plaquetas diminui o recrutamento de leucócitos após
estímulo inflamatório em camundongos CON e AF
57
6.8 Efeitos do tratamento agudo com o inibidor de ativação plaquetária
(prasugrel) sobre processos inflamatórios e vaso-oclusivos na microcirculação de camundongos CON e AF.
61
6.9 Visualização do efeito do tratamento agudo com única dose de
prasugrel no processo vaso-oclusivo de camundongos por microscopia confocal
63
6.10 Avaliação da velocidade de fluxo sanguíneo nos animais após
tratamento agudo com prasugrel, seguido de estímulo inflamatório, por microscopia confocal intravital
68
6.11 Visualização do efeito do tratamento crônico de prasugrel no
processo vaso - oclusivo de camundongos por microscopia confocal 69
6.12 Efeito do prasugrel quando administrado após indução de inflamação por
TNF em camundongos CON e AF 70
6.13 Visualização do efeito do tratamento agudo de hidroxiureia no processo
vaso - oclusivo de camundongos por microscopia confocal 75
6.14 Depleção de leucócitos Ly6G high diminui a adesão plaquetária após
indução do processo inflamatório em animais AF 79
6.15 Efeitos da isquemia/reperfusão no recrutamento de leucócitos e adesão de
plaquetas 85
6.16 Identificação e diferenciação da população de leucócitos Ly6G Low na
microvasculatura de camundongos CON e AF 90
6.17 Identificação da porcentagem de Ly6G Low e Ly6G High na população
neutrófilos no sangue periférico e na medula óssea de camundongos CON e AF 93 7 DISCUSSÃO 94 8 CONCLUSÕES 102 9 REFERÊNCIAS 103 10 ANEXOS 110
1. INTRODUÇÃO
A eritropoiese é um processo biológico onde ocorre a produção de hemácias pela medula óssea. Uma das etapas mais importantes desse processo é a hemoglobinização, em que os precursores eritróides acumulam hemoglobina (Hb); esta proteína é responsável pelo transporte de gases, como oxigênio e dióxido de carbono, pelo organismo [1]. A Hb possui em sua composição quatro cadeias globínicas e quatro grupamentos heme contendo um átomo de ferro cada. Nos adultos, a hemoglobina predominante é a HbA, composta de duas cadeias de globinas α e duas de globina β (α2β2), enquanto na fase fetal até o sexto mês de vida, se predomina a hemoglobina
fetal (HbF), composta de duas cadeias α e duas γ (α2γ2). Os genes HBA1 e HBA2 que
codificam as cadeias α estão localizados no cromossomo 16, e os genes que codificam as cadeias β (HBB) e γ (HBG1 e HBG2), no cromossomo 11 [2].
As hemoglobinopatias são doenças que resultam de mutações nos genes que são responsáveis por codificar as cadeias de globina que compõem a Hb. Dentre estas doenças, destacam-se, na população brasileira, as doenças falciformes (DF). As doenças falciformes são caracterizadas por anemia hemolítica crônica, crises dolorosas de vaso-oclusão e lesões de órgãos-alvo, relacionadas à herança da mutação E6V do gene HBB, gerando a produção da hemoglobina S (HbS), uma hemoglobina anômala, com a substituição de um resíduo de ácido glutâmico por uma valina [3]. Quando em homozigose, a mutação causa a anemia falciforme (AF), mas a herança em heterozigose dupla da mutação da HbS com outra alteração da globina beta pode gerar outras doenças falciformes, como a S-beta talassemia e a hemoglobinopatia SC.
A AF apresenta prevalência que varia de 20 a 45% no continente africano segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) [4]. No Brasil, a heterogeneidade étnica leva a variação de incidência de estado para estado. No ano de 2016, 1.071 recém-nascidos brasileiros apresentavam DF e mais de 60.000 eram heterozigotos para o alelo βS. No total, há aproximadamente 30.000 pessoas com DF em todo o país.
Estimativas indicam que no mundo mais de 300.000 crianças por ano nascem com AF. Essas doenças se encontram em maior prevalência nos lugares que possuem maior concentração de afrodescendentes, além disso acredita-se que em 2050 haverá cerca de 400.000 crianças nascidas com AF anualmente [5-12].
1.1 Fisiopatologia da anemia falciforme e o processo vaso-oclusivo
A fisiopatologia da AF é caracterizada e iniciada pela falcização das hemácias. Em condições de hipóxia ou acidose, a HbS se polimeriza e esses polímeros então levam a uma deformação típica das células (falcização) que assumem formato de foice, rígida e inflexível, causando anemia hemolítica crônica[13]. As hemácias falcizadas também causam danos e a ativação das células endoteliais, levando a um aumento das propriedades adesivas do endotélio e gerando um estado inflamatório crônico devido à interação com outros tipos celulares, tais como neutrófilos e monócitos[14, 15]. O processo hemolítico tem, como consequência, a geração de hemoglobina livre e heme livre na circulação. Este conjunto de fatores (alterações nas hemácias, geração de inflamação e hemólise) resultam em processos recorrentes de isquemia, reperfusão e vaso-oclusão [16, 17]. Além disso, devido a fisiologia alterada das células endoteliais e a presença de Hb livre no plasma há uma redução na biodisponiblidade de oxido nítrico (NO) no interior do vaso e a geração de estresse oxidativo, que são mecanismos que favorecem a vaso-constrição e ativação celular [14, 18] .
O processo vaso-oclusivo é um evento multifatorial que ocorre principalmente em órgãos onde a tensão de oxigênio é baixa e o fluxo sanguíneo é lento (Figura 1), e geralmente na microcirculação [19, 20]. Os processos vaso-oclusivos são uma das manifestações mais características da doença, levando a danos nos tecidos e podendo desencadear as chamadas crises de dor aguda. Por sua vez, o processo vaso-oclusivo contribui para muitas das complicações da doença [21]. Um mecanismo complexo e estimulado por processos inflamatórios culmina na adesão de células vermelhas, leucócitos e plaquetas ao endotélio e à parede vascular. Já foi sugerido que o processo
vaso-oclusivo é desencadeado inicialmente pela adesão de leucócitos, em especial dos neutrófilos, à parede vascular [19, 22]. Os neutrófilos são células grandes (12-15 µm) e relativamente rígidas e, portanto, a sua adesão pode criar uma obstrução física no vaso, adicionalmente os leucócitos aderidos podem intermediar a adesão secundária de hemácias à parede vascular, e a combinação desses episódios, inicia o processo vaso-oclusivo, uma vez que ocorre a obstrução física dos pequenos vasos [20].
Figura 1. Mecanismo de vaso-oclusão na anemia falciforme: O contato direto das
hemácias falcizadas e a presença de hemólise intravascular levam à ativação das células endoteliais que revestem o vaso; a hemoglobina livre presente na circulação tem efeito deletério no vaso e, além disso, consome o óxido nítrico (NO), sintetizado pelas células endoteliais. Juntamente com a presença de espécies reativas de oxigênio (ROS), a hipóxia e os vasoconstritores como endotelina-1 (ET-1), esses mecanismos contribuem para a ativação das células endoteliais. O estado de hipercoagulabilidade eleva os níveis de fator tecidual (FT), fator ativador de plaquetas (FAP), fator de von Willebrand (FvW) e resulta em ativação plaquetária. A presença das plaquetas ativadas no vaso sanguíneo também contribua para a ativação endotelial devido a sua adesão à parede vascular. Após sua ativação, as células endoteliais aumentam a expressão das moléculas de adesão (como ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina) na superfície do vaso e também liberam mais citocinas e quimiocinas como as IL-8, IL-6 e IL-1β, que juntamente ao TNF-α, contribuem para a inflamação vascular e a ativação das células sanguíneas. Os leucócitos e as hemácias aderem à parede vascular devido à sua ativação e expressão de moléculas de adesão e, podem também, haver interações heterotípicas entre leucócitos aderidos e hemácias. A vasoconstrição elevada e a obstrução física do vaso ocasionam uma redução no fluxo sanguíneo com consequente hipóxia e falcização das hemácias, dificultando a passagem do sangue, e finalmente resultando na vaso-oclusão. Figura adaptada de Zago, 2013 [20].
As células vermelhas, principalmente os reticulócitos, de indivíduos com AF apresentam maior capacidade adesiva devido ao grande número de moléculas de adesão expressas na sua superfície. Estas células expressam a integrina VLA-4
(integrina α4β1), CD36, ICAM-4 e BCAM/Lu, que interagem com as moléculas subendoteliais da parede vascular (laminina, trombospondina, fibronectina etc.) ou com as moléculas das células endoteliais (CD36, VCAM-1, BCAM/Lu, P-selectina, entre outras) [23-25]. Os leucócitos, geralmente encontrados em estado ativado na circulação de indivíduos com AF, também aderem com mais facilidade ao endotélio vascular, principalmente na presença de um estímulo inflamatório [26, 27]. As interações dos leucócitos com o endotélio são intermediada, na maior parte, pelas integrinas Mac-1 e LFA-1, além de algumas moléculas como a L-selectina, e ligantes da E-selectina na superfície dos leucócitos que, por sua vez, interagem com as moléculas ICAM-1, P-selectina e E-P-selectina presentes na superfície das células endoteliais [26].
1.2 Modelos de animais transgênicos para anemia falciforme
O desenvolvimento de camundongos transgênicos portadores de HbS, vem auxiliando no estudo dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia da AF, trazendo uma abertura maior para as investigações clínicas e fisiológicas da doença. Existem dois modelos utilizados com maior frequência para estudos envolvendo a fisiopatologia da AF, os camundongos transgênicos Berkeley [28] e Townes [29].
O camundongo transgênico tipo Berkeley (Berkeley (Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBAHBBs) 41Paz/J), foi desenvolvido por Paszty e colaboradores [28] e produz hemoglobina humana βS. Os animais dessa linhagem apresentam as características pontuais da doença falciforme como: anemia hemolítica, eritrócitos falcizados, inflamação crônica, estresse oxidativo, hipertensão pulmonar e priapismo [30-34]. Este modelo foi obtido por meio de uma estratégia complexa com expressão exclusiva da hemoglobina S humana devido à troca do cluster que continha as globinas endógenas α e β murinas pelo cluster que contém as globinas α, βS, γa e γg de origem humana [28].
Já o modelo animal Townes (B6.129-Hbatm1(HBA)TowHbbtm2(HBG1,HBB*) Tow/Hbbtm3(HBG1,HBB)Tow/J) é outro modelo de camundongo transgênico do tipo
Knock-in que carrega vários genes da hemoglobina humana como por exemplo α,β,ϒ, substituindo os genes endógenos murinos [29]. Contrariamente do modelo Berkeley, os camundongos Townes continuam a sintetizar a HbF humana até a terceira semana de vida quando ocorre a troca para a HbS, momento em que esses animais passam a desenvolver a doença grave [35, 36].
1.3 Função endotelial na anemia falciforme e vaso – oclusão
O endotélio tem como função separar o sangue do tecido, servindo como uma espécie de barreira. As células endoteliais podem intermediar a adesão de células sanguíneas à parede vascular, por uma série de proteínas de membranas, as quais são chamadas de moléculas de adesão celular. Quando ativadas as células endoteliais expressam proteínas como, VCAM-1 (proteína 1 de adesão celular vascular ), ICAM-1 (molécula de adesão intercelular-1), as selectinas e CD36, que capturam as células brancas e vermelhas que, por sua vez, também apresentam propriedades adesivas aumentadas [19]. Assim o endotélio desempenha um papel importante no processo inflamatório e vaso-oclusivo [37].
As células endoteliais que fazem parte dos vasos sanguíneos estão envolvidas no processo de regulação da homeostasia e na produção de NO, que é responsável pela manutenção do tônus vascular e inibição da adesão dos leucócitos ao endotélio [38]; durante a inflamação há um aumento na expressão das proteínas selectinas e outras moléculas de adesão presentes no endotélio. A P-selectina é armazenada em grânulos citoplasmáticos e em resposta à ativação celular, essa proteína é redistribuída na superfície das células endoteliais. Já a E-selectina é sintetizada em resposta a interleucina 1 (IL-1) e
Fator de Necrose Tumoral-α
(TNF-α) e produtos microbianos, sendo expressa na superfície das células endoteliais dentro de 1 a 2 horas após o estímulo inflamatório [39]. Em algumas patologias onde há inflamação vascular crônica, como na AF e na aterosclerose, as células endoteliais tem sua função prejudicada.O NO produzido pela óxido nítrico-sintase endotelial (eNOS) possui um importante efeito anti-inflamatório, reduzindo a ativação leucocitária e as interações celulares e stress oxidativo [40]. Como descrito anteriormente, indivíduos com AF podem apresentar baixa biodisponibilidade vascular de NO; essa diminuição se deve à quantidade reduzida de L-arginina (substrato para a produção de NO), também pelo consumo exacerbado de NO pelas espécies reativas de oxigênio (ROS) e devido ao sequestro de NO pela hemoglobina livre no plasma (proveniente da hemólise constante na AF). A diminuição de NO, pode facilitar mecanismos de vaso-constrição e também favorece os processos inflamatórios no local [18, 41].
1.4 Papel da inflamação e leucócitos na anemia falciforme
A anemia falciforme está, geralmente, associada a um estado inflamatório crônico que exerce um papel fundamental na ativação das células endoteliais e células sanguíneas, em especial dos leucócitos. Diversas moléculas inflamatórias estão presentes em níveis aumentados da circulação de indivíduos com AF, como, por exemplo, TNF-α, IL-1β, proteína C reativa (todos potentes ativadores do endotélio), M-CSF (fator estimulador de colônia de macrófagos), IL-3, GM-M-CSF, IL-8 e IL-6. Além disso, algumas proteínas anti-inflamatórias como a Heme-Oxigenase-1 (HO-1) e IL-10 também estão aumentadas na AF, possivelmente representando uma maneira pelo qual o organismo tenta limitar a produção de moléculas inflamatórias e a ativação endotelial na doença [42-44].
Os leucócitos são produzidos e armazenados na medula óssea; os neutrófilos por exemplo quando liberados no sangue periférico vivem por aproximadamente 3 dias quando não estão ativados em situações inflamatórias [45, 46]. Em situações de inflamação, os neutrófilos são recrutados e migram pela parede vascular até alcançar o local da inflamação [47, 48]. O recrutamento dos neutrófilos até o sítio da inflamação é mediado por uma cascata de eventos que incluem a captura, rolamento, adesão e a transmigração dos neutrófilos através das células endoteliais. Diversas citocinas
participam de todas essas etapas. Já as interações adesivas são reguladas pela expressão e função das moléculas de adesão, sendo as selectinas e as integrinas, presentes tanto nos neutrófilos (integrinas-β2, LFA-1 e Mac-1) como nas células endoteliais [49, 50].
Além da interação que ocorre entre os leucócitos e o endotélio ativado, essas células também interagem com hemácias, outros leucócitos e plaquetas, gerando uma ativação multicelular, e levando a uma maior liberação de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias e iniciando um ciclo repetitivo de ativação celular e produção de moléculas inflamatórias, ocasionando uma inflamação crônica. As células previamente imobilizadas na parede vascular recrutam outras células, entre estas os eritrócitos falcizados, ocasionando a diminuição do fluxo sanguíneo [45, 51, 52]. Isso é um processo importante e essencial na propagação do processo vaso - oclusivo uma vez que os pacientes com AF já apresentam contagens elevadas de leucócitos [53], que desempenham uma importante função na fisiopatologia da doença falciforme.
1.5 Plaquetas e a anemia falciforme
As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos anucleados, com estrutura discoide complexa [54], produzidas na medula óssea a partir dos megacariócitos. Setenta por cento das plaquetas presentes no organismo estão na circulação sanguínea e trinta por cento no baço. A meia vida das plaquetas na circulação é de aproximadamente 10 dias; e após esse período são catabolizadas pelo baço e pelo fígado [55].
A membrana plasmática das plaquetas possui receptores como glicoproteínas, da família das integrinas com domínios extracelulares transmembrana e citoplásmatico, que permitem a sua ativação durante a agregação, ocasionando a mudança da sua forma discóide para o formato esférico e liberação do conteúdo dos grânulos intraplaquetários [54]. As plaquetas apresentam dois tipos de grânulos, os grânulos alfa que contêm fribrinogênio, fibronectina, fatores V e VIII, fator de crescimento e os
grânulos densos ou corpúsculos eletrodensos, os quais armazenam adenosina difosfato (ADP), adenosina trifosfato (ATP), cálcio ionizado, histamina, serotonina e adrenalina [54]. A ativação plaquetária é considerada um processo fisiológico fundamental para a manutenção da homeostase [56]. As plaquetas desempenham um importante papel na patogênese dos eventos vasculares agudos, como no infarto do miocárdio e no acidente vascular cerebral (AVC). Quando ocorre desestabilização no fluxo sanguíneo, as moléculas de adesão plaquetária (integrinas e selectinas) são ativadas promovendo a sua adesão às células endoteliais [56].
As plaquetas carregam receptores que podem influenciar no processo inflamatório, entre eles estão a P-selectina, e a glicoproteina GPIb. A P-selectina é armazenada nos grânulos α das plaquetas em repouso e quando as mesmas são ativadas essa selectina é exposta na superfície sendo assim um importante marcador inflamatório [57]. A ligação da P-selectina plaquetária ao P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) do neutrófilo é necessária para o contato inicial entre ambas as células, além disso, a PSGL-1 de neutrófilos interage com as células endoteliais e as P e E selectinas que medeiam o rolamento dos neutrófilos [58]. Já a glicoproteina GPlb é um receptor crítico da ligação plaquetária ao fator de von Willibrand (FvW) no local da lesão vascular, iniciando assim a adesão e agregação de plaquetas [59, 60]. É composto por quatro proteínas transmembranas: GPIbα, GPIbβ, GPIX e GPV. A região N-terminal da GPIbα liga-se a vários ligantes, incluindo o FvW, integrina αMβ2, trombina e P-selectina [61-63]
As plaquetas de indivíduos com AF circulam em um estado ativado e apresentam propriedades inflamatórias, pois liberam altos níveis de fatores inflamatórios potentes, incluindo as citocinas LIGHT e CD40L [64]. Proença Ferreira et al. [65] demonstraram, in vitro, que as plaquetas de pacientes com AF apresentam maior capacidade de adesão
aos componentes da matriz extracelular e a células endoteliais, sugerindo que estas células podem contribuir com os processos vaso-oclusivos devido à produção e liberação de fatores inflamatórios no local. Adicionalmente, outros estudos do nosso
grupo de pesquisa indicam que as plaquetas de indivíduos com AF têm a capacidade de ativar células endoteliais quando entram em contato com estas; esta ativação resulta no aumento da expressão das moléculas de adesão e da produção de citocinas pelas células endoteliais [66]. Estudo realizado por Tanju et al. verificou que, em indivíduos portadores de AF com eventos vaso- oclusivos e cérebro-vasculares, o volume plaquetário médio foi significantemente maior; esse valor também era aumentado quando os pacientes apresentavam crise, com isso concluíram que o aumento de volume plaquetário médio pode estar relacionado com a heterogeneidade clínica [67].
Quando ativadas as plaquetas liberam também micropartículas derivadas da membrana. [68]. As micropartículas são pequenos fragmentos derramados da superfície das membranas das células circulantes e as mais frequentemente presentes no sangue[69]. As plaquetas liberam micropartículas durante a ativação, armazenamento e apoptose, que podem transferir algumas moléculas de adesão e outros materiais, como o ácido araquidônico [69]. As micropartículas de plaquetas foram detectadas em uma variedade de síndromes clinicas com ativação plaquetária [70], além disso elas afetam muitos processos importantes de doenças, como por exemplo: formação de tumores [71], doenças cardiovasculares [72], doenças hemolíticas (como a anemia falciforme), hepatite C crônica [73], HIV [74], artrite reumatoide [75], psoríase [76] entre outras.
1.6 Interações heterocelulares de neutrófilo-plaqueta.
Alguns estudos têm demonstrado que além da interação física direta entre neutrófilos e células endoteliais, estes agregados heterocelulares também podem ser intermediados pelas plaquetas, aumentando ainda mais a resposta inflamatória e, consequentemente a danos vasculares (Figura 2) [77-79]. A formação de agregados neutrófilo-plaquetas é bem conhecida em condições inflamatórias como a sepse e aterosclerose e é sugerido que estes agregados podem contribuir para a inflamação vascular e lesão tecidual que ocorre na AF [22, 80-87].
Figura 2: Os leucócitos são recrutados para paredes de vasos inflamados ou lesionados
através da interação com células endoteliais, plaquetas ou ambos. A adesão dos leucócitos as células endoteliais inflamadas, é iniciada através das selectinas, seguida pela ativação das integrinas dos leucócitos induzidas pelas quimiocinas que promovem uma firme adesão e consequentemente ativação celular. O FvW e o colágeno expostos nos locais de lesão da parede do vaso levarão à formação de trombo, e a fixação de plaquetas é iniciada pela P-selectina nas plaquetas e PSGL-1 nos neutrófilos, enquanto a ativação da integrina leucocitária é principalmente mediada por quimiocinas derivadas de plaquetas e outros mediadores inflamatórios, e a firme adesão celular é obtida pela integração da integrina αMβ2 (Mac-1) com fibrinogênio da superfície plaquetária, GPIb e ICAM1. Figura adaptada de Ghasemzadeh, et al 2013 [87].
Em um estudo [84] avaliando a formação dos agregados de plaquetas-neutrófilos em pacientes com AF encontrou evidências de que estas interações estão aumentadas nestes pacientes comparados a indivíduos saudáveis e que a P-selectina, expressa na superfície de plaquetas quando ativadas, pode estar envolvida nestas interações. Além disso, trabalhos do nosso grupo de pesquisa mostraram que a ativação plaquetária pode levar a um aumento da disfunção endotelial e alterações na liberação de fatores pró-inflamatórios promovendo o recrutamento de neutrófilos e monócitos e, consequentemente, sua interação a estas células [64, 65] e adicionalmente a isso, as plaquetas participam na formação de agregados heterocelulares entre hemácias de pacientes com fenótipo SS e leucócitos [27]. O estudo realizado por Bennewitz e
colaboradores [22] destacou a importância dos agregados heterocelulares de neutrófilos e plaquetas na vaso-oclusão pulmonar, uma das principais causas de morte de pacientes com AF.
1.7 Medicamentos utilizados para terapia na anemia falciforme
Mesmo possuindo uma base genética comum e fisiopatológica semelhante, os pacientes com AF tem um fenótipo clínico altamente variável. Entre os fatores conhecidos de modulação de gravidade clínica, a quantidade (%) de hemoglobina fetal (HbF) é um parâmetro crítico. A HbF é conhecida por “proteger” os pacientes da gravidade clínica; pois a sua presença nas células vermelhas inibe a polimerização da HbS. O baixo percentual de HbF em pacientes AF está associado a um maior risco de desenvolver complicações vaso-oclusivas, danos a órgãos e morte; assim, a indução farmacológica de HbF é um objetivo do tratamento da AF [53, 88].
A terapia com hidroxiuréia aumenta a produção de HbF na grande maioria dos pacientes, consequentemente diminuindo eventos vaso-oclusivos agudos, a hospitalização e a necessidade de transfusões sanguíneas em pacientes com AF[89]. A hidroxiureia é um agente citostático que pode ser também encontrado endogenamente em concentrações variadas, agindo como um agente de defesa natural contra infecções [90-95]. Porém existem algumas outras hipóteses para descrever o mecanismo pelo qual a HU aumenta a produção de HbF, tais como: modulação da via de guanilato ciclase e aumento da produção de óxido nítrico [96]; regulação de GATA-binding factor (GATA-1 e GATA-2) [89]. No entanto esta droga tem alguns efeitos imediatos e independentes da produção de HbF (como a redução de contagens de leucócitos) que possivelmente são intermediados pela liberação de NO pela droga [97-100].
Os efeitos colaterais da terapia com hidroxiureia em pacientes jovens e crianças com AF são geralmente leves e toleráveis. Raramente os pacientes descrevem dor de cabeça ou sintomas gastrointestinais leves, incluindo desconforto abdominal ou náusea.
Algumas crianças desenvolvem alterações dermatológicas, incluindo hiperpigmentação da pele ou escurecimento das unhas esporádicas e não dependentes da dose [101].
O uso de uma formulação do aminoácido, L- glutamina (Endari), foi
recentemente aprovado pelo FDA
(https://www.fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/Approved Drugs/ucm566097.htm). A
L-glutamina é um aminoácido que possui função antioxidante e melhora o potencial redox do dinucleotideo adenosina nicotinamida, (uma vez que esse é reduzido em DF [102]), diminuindo assim o dano oxidativo e a adesão das hemácias falciformes as células endoteliais [103-106].
A administração deste suplemento por 48 semanas em pacientes com AF reduziu o número de crises e eventos adversos anuais nos pacientes comparados ao grupo placebo, além do aumento do intervalo de tempo para a ocorrência da primeira crise vaso-oclusiva [107, 108].
1.8 Medicamentos antiplaquetárias em desenvolvimento para uso na anemia falciforme
Apesar do uso, agora, muito difundido da hidroxiureia [109, 110], esta droga não tem eficácia em todos os portadores da doença e, de maneira geral, apesar de diminuir a frequência das crises vaso-oclusivas, o medicamento não revoga totalmente a sua ocorrência [111, 112]. Adicionalmente, no mercado ainda não há uma droga que possa ser utilizada durante a hospitalização dos pacientes quando se apresentam crise oclusiva. Na busca de novas terapias para diminuir a frequência das crises vaso-oclusivas e tratar destes episódios, novas drogas antiplaquetárias estão em estudo com o intuito de diminuir a ativação plaquetária observado na AF, a fim de reduzir a frequência das crises e consequentemente amenizar a dor destes pacientes.
O crizanlizumab é um anticorpo inibidor de P-selectina, uma molécula de adesão que participa dos processos adesivos entre plaquetas e células endoteliais ativadas, em
situações de repouso, essa molécula é armazenada nos corpos Weibel-Palade em células endoteliais e em grânulos alfa nas plaquetas [113]. Um estudo multinacional recente com 198 pacientes participantes com DF divididos em 3 grupos (placebo, medicamento em doses baixas (2,5 mg/kg) e doses elevadas (5,0mg/kg) demonstrou uma redução de 45% nas crises anuais de dor com uso de doses elevadas de crizanlizumab [114], além de um intervalo de tempo maior entre as crises e uma redução da incidência de efeitos adversos. No entanto, 40% dos indivíduos de cada grupo estavam em uso concomitante de hidroxiureia. Os pacientes que receberam a droga e não estavam em tratamento concomitante com hidroxiureia obtiveram uma redução de 50% nos episódios de crises [113, 115].
Já a eptifibatida é um antagonista reversível altamente específico do receptor GPIlb/IIIa, que inibe a agregação plaquetária induzida por ADP [116]. Um estudo piloto com pacientes falciformes mostrou que a eptifibatida não reduziu a duração das crises vaso-oclusivas [117], no entanto alguns dados mostraram que essa droga foi capaz de inibir a formação de trombos in vitro e in vivo [118].
A agregação plaquetária é intermediada por trombina, colágeno e a ligação da ADP ao receptor P2Y12 em plaquetas [119]. O prasugrel é um membro da classe de agentes antiplaquetários tienopiridina orais que inclui ticlopidina e clopidogrel. Como outros antiplaquetários, o prasugrel é um pró-fármaco que está inativo in vitro e é metabolizado rapidamente. Essa droga também se caracteriza por ser um antagonista do receptor de ADP [85]. Estudos pré-clínicos e clínicos com prasugrel confirmam que a ação dessa droga no organismo tem início mais rápido e com potência aumentada, quando comparado com o inibidor plaquetário clopidogrel [120]. Estudos em camundongos demonstraram que o prasugrel, além de inibir a agregação das plaquetas, também diminui a ativação da integrina GPIIb/IIIa, formação de agregados plaquetas-leucócitos e a atividade pró-coagulante de plaquetas [121, 122]. Jakubowski et al. [85] observaram que, após a administração de prasugrel por 12 dias, pacientes com AF apresentaram uma redução significativa dos agregados de plaquetas-monócitos, o que
não foi observado em indivíduos saudáveis. Styles et al. [123] verificaram que pacientes AF que receberam doses diárias (0,06, 0,08, e 0,12 mg/kg), de prasugrel a cada 14±4 dias, tiveram uma inibição das plaquetas significativamente superior a 0,12 mg/kg (56,3%±7,4%) comparado com 0,06 mg/kg (33,8%±7,4%) ou 0,08 mg/kg (37,9% ± 5,6%) dos pacientes que receberam dose crescente da droga durante o mesmo período de tempo. Por outro lado, um clinical trial multicêntrico grande com 341 indivíduos entre crianças e adolescentes que receberam prasugrel por 9 a 24 meses, não obteve resultado significativo na redução das taxas de crises vaso-oclusão. Foi contabilizado um total de 736 eventos de crises de vaso-oclusivas durante este estudo. Destes eventos 67,3% ocorreram entre os 115 pacientes tratados com o prasugrel e 72,4% ocorreram entre os 123 pacientes placebo. Embora não significativa a diferença entre os grupos, os autores relataram que a dose utilizada do prasugrel foi abaixo do limite de inibição plaquetária por medidas de segurança do estudo, porém sugerem que doses aumentadas possam ter efeitos mais benéficos apesar do risco de sangramento [124] .
2. JUSTIFICATIVA
As doenças falciformes são doenças multifatoriais que podem desencadear várias complicações, entre elas as crises dolorosas vaso-oclusivas [3]. No entanto, a fisiopatologia do processo vaso-oclusivo não é completamente elucidada. Mecanismos que contribuem para o desencadeamento da vaso-oclusão incluem a diminuição da biodisponibilidade vascular de NO e intensa resposta inflamatória causada pela ativação de células endoteliais, leucócitos e plaquetas [21]. Estudos ex vivo do nosso laboratório indicam que as plaquetas circulam em um estado ativado e tem uma capacidade maior, não só de aderir aos componentes da parede vascular, mas de ativar o endotélio [65, 66], indicando um papel para a plaqueta no desencadeamento do processo vaso-oclusivo. A formação de agregados heterocelulares que envolvem plaquetas na anemia falciforme, também é conhecida [27]. Estudos in vivo de vários grupos delinearam um papel claro para o recrutamento de leucócitos à parede vascular na vaso-oclusão[22, 26, 45, 86, 125, 126]; no entanto, o papel das plaquetas neste processo ainda não foi claramente descrito. Adicionalmente, confirmando o papel das plaquetas no processo vaso-oclusivo, é de importância explorar abordagens terapêuticas para diminuir a participação das plaquetas neste mecanismo.
3.
OBJETIVO
Investigar o papel das plaquetas e a interação com outras células no processo vaso-oclusivo em modelo animal de anemia falciforme.
3.1 Objetivos específicos
- Observar e avaliar o processo de recrutamento de leucócitos na microvasculatura, após indução de processo inflamatório, em camundongos quimeras controles (CON) e camundongos com anemia falciforme (AF).
- Visualizar e diferenciar as células participantes no processo inflamatório estimulado por TNF na microcirculação do cremaster de camundongos CON e AF.
- Verificar se a depleção ou diminuição da atividade das plaquetas modula a resposta inflamatória causada por TNF em camundongos CON e AF.
- Observar alterações na velocidade de fluxo sanguíneo nos animais quimeras CON e AF.
. - Verificar o efeito da administração de HU, em camundongos CON e AF, na participação de plaquetas no recrutamento de leucócitos e processos vaso-oclusivos após estimulo inflamatório por TNF
- Avaliar se o processo de hipoxia e reperfusão promove um mesmo tipo de processo inflamatório em camundongos CON e AF com a mesma participação de plaquetas
4. METODOLOGIA
O camundongo transgênico tipo Berkeley (Berkeley (Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs)41Paz/J), desenvolvido por Paszty e colaboradores [28], produz hemoglobina humana S. Os animais apresentam as características da doença falciforme; anemia hemolítica, eritrócitos falcizadas, inflamação crônica, estresse oxidativo, hipertensão pulmonar e priapismo [30-34]. O modelo Berkeley foi obtido por meio de uma estratégia complexa que culminou na expressão exclusiva da hemoglobina falciforme humana devido à substituição do cluster que continha as globinas endógenas, ou seja α e β de murino pelo cluster que contém as globinas α, βS, γa e γg de origem
humana [28]. A linhagem de camundongos Berkeley foi importada do Jackson Laboratory (Bar-Habor, Maine, EUA). Os animais são mantidos em biotério SPF
(Specific Pathogen Free) no CEMIB, UNICAMP, com acesso livre à água e ração. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética animal do Instituto de Biologia da Unicamp, sob o número de protocolo 3909-1(Anexo).
4.1 Obtenção de camundongos quimeras por transplante de medula
Os camundongos Berkeley são bastante frágeis e nascem poucos animais homozigotos. Realizamos procedimentos de transplante de medula óssea com o intuito de aumentar o número de animais quimeras com sexo pré-determinado e idade pareada para a realização dos experimentos.
Para obtenção dos animais quimeras utilizados nos experimentos, realizamos dois transplantes: para obtenção das quimeras controle, é feito o enxerto de células da medula óssea de camundongos doadores C57BL/6 em animais receptores C57BL/6 irradiados, e para obtenção dos quimeras falciformes é feito o enxerto de células da medula óssea de camundongos doadores Berkeley homozigotos em animais receptores C57BL/6 irradiados (os quais serão denominados de camundongos AF (falciforme) e
CON (controle)). Em cada grupo de animais transplantados, obtemos no final do procedimento uma média de 6 a 8 animais quimeras.
4.1.1 Procedimento de Irradiação
Camundongos selvagem (C57BL/6) foram transportados até o IPEN (Instituto de Pesquisas Nucleares da USP – SP) onde receberam irradiação até a depleção total da medula. Para tal, os animais são mantidos nos próprios mini-isoladores onde recebem 2 cargas de irradiação (600 rads cada). A primeira sessão ocorre por aproximadamente 45 minutos e há um intervalo de 3 horas entre o início da primeira e da segunda sessão. Imediatamente após a irradiação os camundongos selvagens (medula depletada) receberem as células da medula óssea do animal doador (proveniente do camundongo doador Berkeley ou camundongo C57BL/6), dando origem às quimeras. Esses camundongos são mantidos em condições estéreis por 3 meses, quando a fenotipagem é realizada [127].
4.1.2 Coleta da Medula Óssea
Em condições totalmente estéreis, células da medula óssea foram retiradas a partir do fêmur e da tíbia do camundongo doador e mantidas em PBS estéril. Prontamente as células foram centrifugadas por 5 min, a 300 g, temperatura ambiente (TA). O sobrenadante foi desprezado e acrescentou-se tampão de lise (tampão Tris- Cloreto de Amônio- 155mM) para a retirada de hemácias contaminantes. As células foram mantidas por 5 min no gelo, em seguida foram centrifugadas a 300 g, 5 min, TA. Novamente desprezamos o sobrenadante e ressuspendemos em PBS estéril e realizamos uma última centrifugação de lavagem de 300 g por 5min. Finalmente, as células foram ressuspendidas em PBS estéril. O número de células foi contado com azul de trypan e 3x106 células (100 a 200μL) foram injetadas por via intra-orbital (i.v.) em
4.1.3 Gel de fenotipagem
Três meses após o transplante de medula óssea, é feita a fenotipagem dos animais quiméricos AF para comprovar a pega da medula nos camundongos, pela verificação da presença das hemoglobinas A e S humana. Para a fenotipagem, foi colhido uma pequena amostra de sangue da cauda dos camundongos transplantados, realizou-se a lise de hemácias (através do uso de tampão Tris- Cloreto de Amônio- 155mM) e estas passaram por eletroforese em gel de poliacrilamida de 40% (32V, 150 min). Em seguida, o gel foi corado com azul de comassie por 20 minutos. A descoloração foi realizada com 7% ácido acético e 30% metanol, diluídos em água, até que a coloração de fundo desaparecesse.
Somente camundongos que não apresentavam hemoglobina A de camundongo foram utilizados nos experimentos subsequentes.A Figura 3 mostra que a HbS humana migra junto a HbA de camundongo, entretanto, a HbA humana pode ser diferenciada da HbA de camundongo. Como controle positivo foi utilizado amostras de sangue de camundongo Berkeley homozigoto (SS) e para controle negativo amostras de camundongo selvagem. A porcentagem de pega da medula destes animais é de aproximadamente 80%.
Figura 3: Fenotipagem dos camundongos AF quimeras, através de gel de poliacrilamida de 40% onde foram aplicadas as hemácias lisadas obtidas do sangue caudal dos camundongos. Nesse gel podemos observar amostras de camundongo C57BL/6 selvagem (CON; controle negativo), camundongo transgênico Berkeley (HbSS- controle positivo) e 6 camundongos transplantados com leucócitos da medula óssea de camundongos Berkeley, sendo que os camundongos que apresentam * não foram utilizados em experimentos por apresentarem HbA de camundongo.
4.2 Microscopia intravital
4.2.1 Traqueostomia
Os camundongos foram anestesiados pela administração intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de 2% cloralose e 10% α-uretano em PBS (6mL/Kg) [127, 128]. Esse anestésico pode levar a formação de muco na traqueia e com a finalidade de facilitar a respiração espontânea, foi realizada uma traqueostomia (corte ao longo da traqueia e inserção de um tubo de 3 cm de poliuretano) em todos os camundongos.
4.2.2 Cirurgia de exteriorização do cremaster
Primeiramente realiza-se a tricotomia da região cirúrgica, um dos compartimentos da bolsa escrotal é exposto e o músculo cremaster (musculatura que envolve a bolsa escrotal) é exteriorizado. Todo o tecido conjuntivo e gorduroso que envolve o cremaster é retirado cuidadosamente. Durante todo o processo é imprescindível que o músculo permaneça umedecido para evitar a deterioração do tecido e a ruptura de vasos sanguíneos [127, 128].
4.2.3 Microscopia Convencional Intravital
A microscopia intravital é uma técnica que permite estudar a microvasculatura e a interação das células do sangue com a parede vascular. Após anestesia e traqueostomia e com a musculatura do cremaster exposta e preparada, o tecido cremaster é observado sob um microscópio (Microscopio Zeiss Imager D2), onde é possível verificar o diâmetro das vênulas; o número de rolamento, adesão e extravasamento de leucócitos in vivo [127, 128]. Foram adquiridas imagens de 5 a 10 vênulas (que variavam entre 18 e 25μM de diâmetro) por animal. As imagens foram adquiridas com uma câmera (Zeiss 503 mono) acoplada ao microscópio através do software ZEN 2, onde foram realizados vídeos de 40 frames por segundo com intervalos de 0,25 s por imagem adquirida.
4.2.4 Microscopia Confocal Intravital
Os animais foram preparados da mesma forma como utilizado na microscopia intravital convencional – no entanto os animais receberam a administração de anticorpos conjugados a fluorocromos (4-10 mg/kg i.v. pelo plexo ocular, 30 min antes do processo cirúrgico) para a identificação de moléculas e tipos celulares específicos. Uma vez preparado para a cirurgia, a microcirculação do músculo cremaster dos animais foi observado utilizando um microscópio confocal LSM780 (Carl Zeiss), localizado no Instituto de Pesquisa Científica de Campinas - INFABIC UNICAMP.
Anticorpos utilizados nesta técnica foram: Anticorpo anti-CD45 (clone 30-F11) conjugado com PE-Cy5 (eBioscience) e anticorpo anti-CD41 (clone eBioMWReg30) conjugado com PE (eBioscience) para visualização de leucócitos e plaquetas, respectivamente. Anticorpo anti-Ly6G- Gr1 (clone RB6-8C5) conjugado com Alexa 488 (eBioscience, San Diego, CA, USA) para visualização de neutrófilos e anticorpo anti- CD192 (clone SA203G11) conjugado com PE (Biolegend) para visualização de monócitos.
4.2.5. Análise das vênulas
As vênulas selecionadas para análise foram aquelas localizadas, preferencialmente, em regiões que não foram danificadas durante o processo cirúrgico. Assim, após focalizar no microscópio a vênula a ser analisada, o diâmetro foi medido com uma ferramenta do software ImageJ. Em seguida as imagens do fluxo sanguíneo foram gravadas por 1 minuto em uma velocidade de 40 frames por segundo, após as filmagens foram analisados todos os vídeos e contado o número de leucócitos que rolavam ao longo do endotélio. Também foi avaliado o número de leucócitos aderidos ao endotélio por pelo menos 30 segundos e extravasados por uma área igual a 50x100μm2 [127, 128]. Para análise das imagens obtidas por microscopia confocal, foi
utilizado um software de imagem (ImageJ) onde realizou-se a contagem de cada célula aderida nas vênulas e diferenciado os leucócitos que estavam aderidos juntamente as plaquetas. Além disso através do mesmo software, foi possível quantificar a porcentagem de plaquetas aderidas ao endotélio, através da quantificação de fluorescência marcada das mesmas. Para avaliar a velocidade do fluxo, identificamos uma plaqueta (marcada por CD41 PE) e em cada filmagem de 1 minuto calculamos manualmente a velocidade de passagem desta na vênula através do seguinte cálculo: ϕ=V.a; onde ϕ corresponde ao fluxo, V= velocidade e a= área.
4.3 Uso do anticorpo depletor de plaquetas
Para realizar a depleção plaquetária, utilizamos um anticorpo específico anti-CD42b/ GPIb (anticorpo policlonal rato anti-mouse GPIb – Emfret analytics) que corresponde a uma glicoproteína de membrana de superfície de plaquetas. A interação deste anticorpo (IgG1) com o CD42b resulta numa depleção plaquetária. Os animais receberam (via i.v.) 2 μg/g de anti-CD42b ou de um IgG1 não específico, logo após o término do processo cirúrgico de preparação para microscopia intravital, seguido de administração de TNF-α 0,5μg i.p. As vênulas foram filmadas a cada 1 hora, por um
período de 3h para verificação de possíveis diferenças no processo inflamatório após a depleção plaquetária.
4.4 Uso do prasugrel
A dose para uso foi escolhida após comparada a dose de 1 e 3 mg/kg e visto que com 1mg/kg o prasugrel já se mostrou benéfico, essas doses foram escolhidas baseadas no trabalho de Liverani 2013 [129] que utilizou uma dose de ataque de 10mg/kg e uma de manutenção de 3mg/kg, 24h após a primeira de prasugrel (Sigma-Aldrich) ou veículo (salina). Camundongos foram expostos ao tratamento agudo ou
crônico de prasugrel, onde receberam uma dose de 1 mg/kg, por gavagem, 1 hora antes de receberem o estímulo inflamatório por TNF (0,5μg i.p) no tratamento agudo, ou diariamente durante 4 semanas no tratamento cronico. Duas horas pós estimulo, foram submetidos ao processo cirúrgico de exteriorização do músculo cremaster para microscopia intravital confocal. As vênulas foram filmadas após 1 hora, para verificação de possíveis diferenças no processo inflamatório após uso do medicamento, conforme descrito no protocolo 4.2.5. Através de microscopia confocal realizamos experimentos utilizando o prasugrel 1 hora após o estímulo inflamatorio por TNF (0,5μg i.p).
4.5 Uso do anticorpo depletor de neutrófilos
A depleção de neutrófilos foi feita através de um anticorpo especifico anti-mouse Ly6G(GR-1; IgG2) clone RB6-8C5 (eBioscience) correspondente à um antígeno de diferenciação ligado a glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 21-25 kD que é expresso por células de origem mieloide. Uma hora antes do estímulo inflamatório por TNF, os animais receberam 50 µg (i.v) do anticorpo anti – Ly6G ou um anticorpo IgG2 não específico, e então dez minutos antes do processo cirúrgico os animais receberam os anticorpos marcados com fluorocromos (como descrito no protocolo 4.2.4). As vênulas foram filmadas 3 horas após estímulo inflamatório para verificação de possíveis
diferenças no processo inflamatório após a depleção de neutrófilos. O recrutamento leucócitos e observação das vênulas foi realizado conforme descrito no protocolo 4.2.5.
4.6 Indução de hipóxia e reoxigenação em camundongos
Foi padronizado um protocolo de hipóxia e reperfusão nos camundongos quimeras CON e AF. Animais foram submetidos a 60 min de hipóxia à 7% de oxigênio em uma câmara de hipóxia (A-Chamber, ProOx P110; BioSpherix, Parish, NY, EUA) e, em seguida, foram reoxigenados em ar ambiente por 60 min, conforme protocolo estabelecido por [130]. Após este processo os animais foram então submetidos a cirurgia e posterior análise das vênulas conforme descrito 4.2.5.
4.7 Citometria de sangue periférico e medula óssea de camundongos CON e AF
O sangue periférico foi coletado após o fim do experimento por microscopia confoca em tubo de EDTA; neutrófilos foram separados utilizando um gradiente de Ficoll-Hypaque de densidades 1.0771 g/ml e 1.1191 g/ml de acordo com (Assis et al., 2005). Após separação das camadas foi homogeneizado a camada dos neutrófilos e monócitos e então as células foram ressuspendidas em PBS (1x106células/ml). E para a coleta das células da medula óssea foi realizado o mesmo procedimento descrito em 4.2.1
As células foram incubadas com anticorpos monoclonais conjugados por 30 minutos à 4ºC, protegidas da luz. Após o tempo de incubação, foram lavadas com PBS 1x e fixadas em paraformaldeído 1,0% para posterior aquisição no citômetro de fluxo (BD FACSCaliburTM).
Neutrófilos foram marcados com anti-Ly6G(GR-1) Alexa 488 (marcador específico de granulócitos), para identificação das populações de monócitos, as células foram marcadas com anti- CD192 PE (receptor MCP-1 de monócitos).
Macrófagos foram incubados com CD86 PercP-Cy5.5 (marcador de ativação) e CD206 APC, para caracterização do seu estado de polarização. Células com alta expressão de anti-Ly6G foram consideradas como neutrófilos, enquanto células com baixa expressão de Ly6G foram considerados monócitos ou outra população de neutrófilo imaturo.
5 PROTOCOLOS DE MICROSCOPIA INTRAVITAL E CONFOCAL
1)
Protocolo de indução de resposta inflamatóriaAdministração de TNF-α murina: 0,5μg diluída em 250μL salina estéril
2) Protocolo de indução de resposta inflamatória para microscopia intravital confocal
3) Protocolo de administração de anticorpo depletor de plaquetas (anti-GPBIα)
ou IgG não especifico (i.v)
