CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS
Andréia Simões de Castro Cunha
Efeitos da agmatina sobre as discinesias, os déficits cognitivos e emocionais em ratos lesionados com 6-hidroxidopamina
Florianópolis 2019
Andréia Simões de Castro Cunha
Efeitos da agmatina sobre as discinesias, os déficits cognitivos e emocionais em ratos lesionados com 6-hidroxidopamina
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para a obtenção do título de doutor em Neurociências.
Orientador: Prof. Dr. Rui Daniel Schröder Prediger Coorientador:Prof. Dr. Filipe Carvalho Matheus
Florianópolis 2019
Andréia Simões de Castro Cunha
Efeitos da agmatina sobre as discinesias, os déficits cognitivos e emocionais em ratos lesionados com 6-hidroxidopamina
O presente trabalho em nível de doutorado foi avaliado e aprovado por banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Rui Daniel Schroder Prediger, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina Prof. Alexandre Pastoris Muller, Dr. Universidade do Extremo Sul Catarinense Prof.a Fernanda Cristina de Mesquita, Dr.a
IIN-ELS/ Instituto Santos Dumond Prof. Eduardo Luiz Gasnhar Moreira, Dr.
Universidade Federal de Santa Catarina Prof.a Ana Lúcia Severo Rodrigues, Dr.a Universidade Federal de Santa Catarina
Certificamos que esta é a versão original e final do trabalho de conclusão que foi julgado adequado para obtenção do título de doutor em Neurociências.
____________________________ Prof. Eduardo Luiz Gasnhar Moreira, Dr.
Coordenador do Programa ____________________________ Prof. Daniel Schröder Prediger, Dr.
Orientador Florianópolis, 2019
Rui Daniel Schroder Prediger:9522368105 3
Assinado de forma digital por Rui Daniel Schroder
Prediger:95223681053 Dados: 2020.01.31 09:12:18 -03'00' Documento assinado digitalmente
Eduardo Luiz Gasnhar Moreira Data: 31/01/2020 10:34:56-0300 CPF: 053.168.189-03
Este trabalho é dedicado à minha família e aos meus amigos queridos.
AGRADECIMENTOS
À UFSC, à CAPES e ao CNPq pelo suporte estrutural e financeiro durante o período de realização do presente estudo, essencial para a execução do trabalho.
Ao professor Dr. Rui Daniel Prediger pela oportunidade de realizar este trabalho, pela confiança e pelos ensinamentos sob a sua orientação. Pela sensibilidade e compreensão nos momentos mais difíceis do meu doutorado.
Ao professor Dr. Filipe C. Matheus pela coorientação recebida e pela contribuição e auxílio no planejamento, execução dos experimentos e correção deste documento. Por ter sido receptivo e paciente, me acompanhando desde o início do mestrado.
Aos professores Dr. Alexandre P. Muller, Dr.a Fernanda C. de Mesquita, Dr. Eduardo L. G. Moreira, Dr.a Ana Lúcia S. Rodrigues pelas contribuições para o aprimoramento deste trabalho.
Ao Laboratório de Investigação Neuroquímica (LINQ) sob responsabilidade da professora Helena I. Cimarosti e aos seus estudantes, principalmente à Stella Célio Junqueira pela colaboração, pela receptividade em seu laboratório e pelos ensinamentos.
Aos colegas e amigos do Laboratório Experimental de Doenças Neurodegenerativas (LEXDON, UFSC) pelo companheirismo, pela agradável convivência e discussões relevantes sobre os projetos, sobre a vida e a influência dos astros na nossa personalidade. Um agradecimento especial à Katiane, à Gislaine, à Samantha, à Bruna, à Cibele e à Marcela por terem contribuído diretamente com a execução de parte dos experimentos que compõem esta tese.
Ao chefe do Departamento de Farmacologia Dr. Tadeu Lemos, à Dr.a Luciana Honorato, ao Pedro P. de Souza e ao Lucas Fernandes pela ótima recepção e acolhimento no meu novo ambiente de trabalho e por compreenderem este momento de finalização do doutorado.
Aos meus pais, Maridete e Rui, meus exemplos de vida, por tudo que fizeram por mim desde que eu nasci até hoje, pela dedicação, pelo carinho, pelo amor e pelo apoio nos momentos mais críticos da minha vida. Obrigada por acreditarem em mim! Sem vocês, nada seria possível. A distância não é fácil, mas vocês me dão força para seguir em frente sempre. Sinto muito orgulho e agradeço todos os dias por vocês serem meus pais!
À minha família, em especial à minha irmã e ao meu sobrinho, pela cumplicidade, amor e carinho. Agradeço pela torcida, pelos conselhos e pela nossa união.
Ao Fábio pelo companheirismo, pelo amor, por ter acreditado em mim e suportado todas as minhas aflições durante o doutorado. Pela coragem de ter embarcado comigo nessa aventura, longe da nossa cidade e de pessoas importantes e queridas. Não foi fácil, não foi por acaso e já valeu a pena!
Aos meus amigos queridos de Salvador. Muitos estão espalhados pelo Brasil e pelo mundo, mas a distância só fortalece o nosso elo de amizade e carinho. Apesar de quase 7 anos longe, vocês permanecem na minha vida.
Aos meus amigos de Floripa por tornarem essa cidade, que me acolheu tão bem, a minha segunda casa. Por me mostrarem que existe amor em SC e fazerem do meu dia-a-dia mais leve e feliz.
“Não consigo alterar a direção do vento, mas posso ajustar as minhas velas para sempre alcançar o meu destino.” (JIMMY DEAN, 1987)
RESUMO
Classicamente, a Doença de Parkinson (DP) está associada à neurodegeneração dopaminérgica na via nigroestriatal e aos sintomas motores. No entanto, tem sido demonstrado o comprometimento de diferentes regiões encefálicas e de sistemas de neurotransmissores relacionados à presença de uma variedade de sintomas não motores, caracterizando-se como uma doença multissistêmica. Alguns destes podem se manifestar muitos anos antes dos sintomas motores, reduzindo significativamente a qualidade de vida dos pacientes. Embora os tratamentos atuais promovam uma melhoria transitória nos sintomas motores, eles não impedem a progressão da doença e, com o decorrer do tempo, a eficácia dos fármacos é reduzida. Desde 1960, a levodopa (L-DOPA) permanece como o fármaco “padrão ouro” para o tratamento da DP. No entanto, o tratamento crônico da DP com este fármaco promove o surgimento de efeitos adversos, incluindo as discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs). Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da administração crônica da agmatina, uma poliamina endógena considerada um neuromodulador com ação antioxidante, neuroprotetora e neurorestauradora, sobre as discinesias, os déficits cognitivos e os comportamentos tipo anedônico e depressivo em modelos da DP induzidos pela lesão com 6-hidroxidopamina (6-OHDA) em ratos. Inicialmente, foi avaliado as doses 3 e 30 mg/kg de agmatina sobre a LID e outros sintomas motores em ratos lesionados com 6-OHDA no feixe prosencefálico medial (MFB), modelando fases mais avançadas da DP. A lesão por 6-OHDA aumentou o número de rotações contralateral à lesão no teste de rotação induzida por apomorfina, reduziu cerca de 90% no imunoconteúdo de TH estriatal e, consequentemente, induziu déficits motores observados no teste do cilindro e no teste do campo aberto. O tratamento com L-DOPA em ratos hemiparkinsonianos melhorou alguns parâmetros motores e induziu a LID, no entanto a agmatina não apresentou um efeito antidiscinético, bem como não atenuou os sintomas motores. Posteriormente, avaliou-se o efeito da agmatina (10 mg/kg) sobre a memória de curto prazo em ratos lesionados bilateralmente com 6-OHDA no estriado dorsolateral (EDL), mimetizando as fases iniciais da DP. Neste modelo, a imunohistoquímica e a técnica de Western Blot indicaram um leve grau de degeneração da via nigroestriatal avaliadas 7 e 21 dias após a lesão. A redução no imunoconteúdo de TH foi totalmente revertido pela agmatina no 7° dia e parcialmente no 21° dia em comparação ao grupo apenas lesionado. A 6-OHDA não induziu prejuízo na memória social avaliada 14 dias após a lesão no teste do reconhecimento social, no entanto, promoveu déficits na memória espacial de curto prazo após 21 dias, avaliados nos testes do labirinto em Y elevado modificado e do reconhecimento de objeto. Em contrapartida, a agmatina não alterou os déficits na memória espacial induzidos pela neurotoxina. Por fim, foi realizada a avaliação do efeito da agmatina (10 mg/kg) sobre os comportamentos tipo anedônico e depressivo 7 e 21 dias após a lesão, respectivamente, em ratos lesionados bilateralmente com 6-OHDA no EDL, analisando o imunoconteúdo de BDNF e TrkB no córtex pré-frontal. A 6-6-OHDA induziu comportamento tipo anedônico no teste de preferência por sacarose 7 dias após a lesão, o qual não foi revertido pela agmatina. No entanto, ela reduziu o tempo de imobilidade quando comparado ao grupo apenas lesionado, exibindo um efeito tipo antidepressivo no teste do nado forçado. Além disso, a agmatina reduziu o aumento do imunoconteúdo de BDNF induzido pela 6-OHDA, não sendo observadas alterações no imunoconteúdo das isoformas de trkB entre os grupos avaliados. Em conjunto, os resultados indicam o potencial da agmatina como um adjuvante no tratamento dos sintomas depressivos na DP, além de não prejudicar a ação da L-DOPA sobre os sintomas motores observados no modelo de injeção unilateral da 6-OHDA no MFB. Em contrapartida, a presente dose de agmatina não alterou os déficits cognitivos apresentados por ratos lesionados com 6-OHDA no EDL.
Palavras-chave: Doença de Parkinson; Agmatina; 6-OHDA; L-DOPA; BDNF; Discinesias;
ABSTRACT
Classically, Parkinson's disease (PD) is related to dopaminergic neurodegeneration in the nigrostriatal pathway and motor impairments. However, the involvement of different brain regions and neurotransmitter systems related to a diversity of non-motor symptoms has been demonstrated, characterizing PD as a multisystemic disease. Damage in these pathways is associated with a diversity of non-motor symptoms that may manifest many years before motor symptoms, reducing patients' quality of life. Although current treatments promote a transient improvement in motor symptoms, they do not prevent disease progression and, thereafter, drug efficacy is reduced. Since 1960, levodopa (L-DOPA) has remained the “gold standard” drug in PD treatment. However, chronic PD treatment with this drug promotes the onset of some adverse effects, including L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs). Therefore, the aim of this study was to investigate the effects of chronic administration of agmatine, an endogenous polyamine considered a neuromodulator with antioxidant, neuroprotective and neurorestaurant properties, on dyskinesias, cognitive deficits and anhedonic- and depressive-like behaviors in PD models induced by 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in rats. Initially, it was evaluated the effects of agmatine, at doses of 3 and 30 mg/kg, on LIDs and on other motor symptoms in OHDA-lesioned rats in the medial forebrain bundle (MFB), modeling advanced stages of PD. The 6-OHDA lesion increased the number of contralateral rotations in the apomorphine-induced rotation test, as well as reduced about 90% the striatal TH immunocontent and induced motor deficits observed in the cylinder and open field tests. L-DOPA treatment improved motor parameters and induced LIDs in hemiparkinsonian rats. Agmatine had no antidiskinetic effect and also did not improve the motor impairments. Subsequently, the effect of agmatine (10 mg/kg) on short-term memory in rats bilaterally lesioned with 6-OHDA in the dorsolateral striatum (EDL) was evaluated, mimicking the early stages of PD. In this model, immunohistochemistry and the Western Blot techniques indicated a mild nigrostriatal degeneration assessed on days 7 and 21 after injury. The reduction of TH imumunocontent was fully reversed on day 7 and partially reversed on day 21 compared to the 6-OHDA-lesioned group. Furthermore, 6-OHDA did not induce impairment in social memory assessed 14 days after lesion in the social recognition test. On the other hand, it promoted short-term spatial memory deficits at 21 days as assessed in the modified Y-maze and object recognition tasks. In contrast, agmatine did not alter neurotoxin-induced spatial memory deficits. Finally, the effects of agmatine (10 mg/kg) on anhedonic- and depressive-like behaviors were evaluated 7 and 21 days after injury, respectively, in 6-OHDA-bilaterally injured rats in EDL, associated with the evaluation of BDNF and TrkB immunocontents in the prefrontal cortex. 6-OHDA induced anhedonic-like behaviors in the sucrose preference test 7 days after injury, which was not reversed by agmatine. However, agmatine reduced immobility time compared to the 6-OHDA-injured group, exhibiting an antidepressant-like effect on the forced swimming test. In addition, agmatine attenuated the 6-OHDA-induced increase in BDNF immunocontent, while no changes in trkB isoforms immunocontent were observed between groups. Taken together, these results indicate the agmatine potential as an adjuvant in the treatment of depressive symptoms in PD while it did not alter the L-DOPA benefits when associated with this drug in the 6-OHDA unilateral injection in MFB model. Moreover, the present tested doses of agmatine did not change the cognitive deficits exhibited by 6-OHDA-injured rats in EDL.
Keywords: Parkinson's disease; Agmatine; 6-OHDA; L-DOPA; BDNF; Dyskinesias; Depression;
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Principais alterações neuropatológicas da doença de Parkinson. ... 23
Figura 2 – Ilustração esquemática das alterações da circuitaria dos núcleos da base observadas na doença de Parkinson ... 25
Figura 3 – Fármacos e alvos farmacológicos utilizados no tratamento da doença de Parkinson ... 27
Figura 4- Subdivisões clínicas das discinesias induzidas por L-DOPA ... 31
Figura 5 – Mecanismos moleculares pré-sinápticos e pós-sinápticos associados às discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs) ... 33
Figura 6 – Alterações na circuitaria dos núcleos da base observadas nas discinesias induzida por L-DOPA (LIDs) ... 36
Figura 7 – Relação entre a progressão dos sintomas clínicos da doença de Parkinson e a distribuição dos agregados de α-sinucleína segundo a hipótese de Braak ... 39
Figura 8 – Ilustração dos déficits cognitivos observados na doença de Parkinson ... 41
Figura 9 - Fatores que podem influenciar o desenvolvimento da depressão em pacientes com a doença de Parkinson ... 44
Figura 10 - Vias de sinalização implicados na depressão na doença de Parkinson... 46
Figura 11 - Regiões do encéfalo implicadas na motivação, apatia e anedonia ... 49
Figura 12 - Metabolismo e os ligantes pré- e pós-sinápticos da agmatina ... 53
Figura 13 – Ilustração esquemática das vias de sinalização potencialmente associadas aos efeitos antidepressivos da agmatina ... 57
Figura 14 - Protocolo experimental referente à avaliação do efeito da agmatina (AGM) sobre os movimentos involuntários anormais (AIMs) induzidos pela administração crônica da L-DOPA e outros sintomas motores após a lesão unilateral de 6-hidroxidopamina no feixe prosencefálico medial (MFB) ... 63
Figura 15 - Desenho esquemático do protocolo experimental referente à avaliação do efeito da agmatina (AGM) sobre a memória de curto prazo em ratos lesionados bilateralmente com 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no estriado dorsolateral (EDL) ... 64
Figura 16 - Desenho esquemático do protocolo experimental referente à avaliação do efeito da agmatina (AGM) sobre os comportamentos do tipo anedônico e depressivos induzidos pela lesão bilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no estriado dorsolateral ... 65
Figura 17 – Desenho ilustrativo da cirurgia estereotáxica e os sítios de injeção de
6-hidroxidopamina (6-OHDA) em ratos ... 66
Figura 18 – Desenho esquemático do teste de rotação induzida por R(-)-apomorfina ... 67
Figura 19 – Parâmetros de movimentos involuntários anormais (AIMs) avaliados nas discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs) ... 68
Figura 20 - Ilustração dos aparatos utilizados nos testes de avaliação dos sintomas motores . 70 Figura 21 – Protocolo utilizado no teste do reconhecimento social ... 71
Figura 22 – Desenho esquemático do protocolo utilizado no teste do reconhecimento de objeto ... 72
Figura 23– Desenho esquemático do protocolo do teste do labirinto em Y modificado ... 73
Figura 24 – Protocolo utilizado no teste de preferência à sacarose ... 73
Figura 25 – Teste da borrifada com sacarose ... 74
Figura 26 – Comportamentos avaliados durante o teste do nado forçado ... 75
Figura 27 – Avaliação do número de rotações contralaterais induzidas por R(-)-apomorfina e do imunoconteúdo para tirosina hidroxilase (TH) como parâmetros indicativos do grau de lesão induzida por 6-OHDA no MFB ... 79
Figura 28 - Avaliação do efeito da agmatina sobre os movimentos involuntários anormais (AIMs) administrada 30 min antes da L-DOPA durante um período de 14 dias em ratos hemiparkinsonianos ... 82
Figura 29 Avaliação do efeito da agmatina sobre a assimetria das patas induzida pela lesão unilateral por 6-OHDA no MFB ... 84
Figura 30 - Efeito da agmatina sobre a distância percorrida no teste do campo aberto ... 85
Figura 31 - Efeitos da agmatina sobre a coordenação motora e o equilíbrio avaliados no teste do rotarod em ratos lesionados por 6-OHDA no MFB. ... 86
Figura 32 - Efeito da agmatina na dose de 10 mg/kg sobre a degeneração promovida pela administração da 6-OHDA no EDL analisada por imunofluorescência para tirosina hidroxilase (TH) no estriado ... 87
Figura 33 - Efeito da agmatina na dose de 10 mg/kg sobre o imunoconteúdo de tirosina hidroxilase (TH) estriatal promovida pela administração da 6-OHDA no EDL ... 88
Figura 34 - Avaliação do efeito da agmatina (10 mg/kg) sobre a memória social de curto prazo no teste de reconhecimento social em ratos lesionados bilateralmente por 6-OHDA no EDL ... 89
Figura 35 - Avaliação do efeito da agmatina (10 mg/kg) sobre a memória espacial de curto prazo avaliada 21 dias após a lesão bilateral no EDL em ratos ... 90
Figura 36 - Avaliação do efeito da agmatina (10 mg/kg) sobre a memória espacial de curto prazo avaliado 21 dias após a lesão bilateral no EDL em ratos ... 91 Figura 37 - Avaliação do efeito da agmatina (10 mg/kg) sobre os comportamentos tipo anedônicos avaliados 7 dias após a lesão bilateral no EDL em ratos ... 93 Figura 38 - Avaliação do efeito da agmatina (10 mg/kg) sobre os comportamentos tipo depressivos avaliados 21 dias após a lesão bilateral no EDL em ratos ... 94 Figura 39 - Efeito da administração da 6-OHDA no EDL e do tratamento com agmatina (10 mg/kg) sobre o imunoconteúdo de BDNF e pró-BDNF no córtex pré-frontal de ratos ... 95 Figura 40 - Efeito da administração da 6-OHDA no EDL e do tratamento com agmatina (10 mg/kg) sobre o imunoconteúdo das isoformas completa e truncada do TrkB no córtex pré-frontal de ratos ... 96
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 5-HT: serotonina
6-OHDA: 6-hidroxidopamina 7-NI: 7-Nitroindazol
A2AR: receptores para adenosina do tipo A2A ACh: acetilcolina
ADC: arginina descarboxilase AGM: sulfato de agmatina
AIMs: movimentos involuntários anormais AMPc: 3´5´-adenosina-monofosfato-cíclico ANOVA: Análise de Variância
arg: L-arginina
ATP: Adenosina Trifosfato (do inglês, adenosine triphosphate)
BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (do inglês, Brain-Derived Neurotrophic
Factor)
CaMKII: quinase dependente de cálcio/calmodulina CEUA: Comissão de Ética no Uso de Animais CPF: Córtex Pré-Frontal
CREB: Proteína de ligação responsiva ao AMP cíclico D.O.: densidade óptica
D1R: Receptor para a Dopamina do Tipo 1 D2R: Receptor para a Dopamina do tipo 2 D3R: Receptor para a Dopamina do tipo 3 DA: Dopamina
DARPP-32: fosfoproteína regulada por DA e AMPc de 32 kDa DAT: Transportador de Dopamina (do inglês, dopamine transporter) DBS: estimulação profunda do cérebro (do inglês, deep brain stimulation) DCAA: enzima descarboxilase de aminoácidos aromáticos
dMSNs: neurônios espinais médios da via direta DOPAC: ácido 3,4-dihidroxifenilacético
DP: Doença de Parkinson
DSM: Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (do inglês, Diagnostic and
DT: discinesia tardia
E.P.M.: Erro Padrão da Média eCB: endocanabinoide
EDL: estriado dorsolateral
EDTA: ácido etileno-dinitrilo-tetra-acético
ERK1/2: quinase regulada por sinal extracelular 1/2 GABA: Ácido Gama-Aminobutírico
GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
GCLc: Subunidade catalítica da enzima glutamato cisteína ligase GP: globo pálido
GPCR: receptores acoplados a proteína G (do inglês, G-protein–coupled receptors) GPe: globo pálido externo
GPi: globo pálido interno
GSK-3β: Glicogênio sintase quinase-3β HO-1: Hemoxigenase-1
i.p.: via intraperitoneal
iMSNs: neurônios espinais médios da via indireta
IRSN: Inibidor da Recaptação de Serotonina e de Noradrenalina ISRS: Inibidores Seletivos da Recaptação de Serotonina
kDa: quilodalton L-DOPA: Levodopa
LID: discinesia induzida por levodopa (do inglês, levodopa-induced dyskinesia) LTD: depressão de longa duração
LTP: potenciação de longa duração MAO-B: Monoamino Oxidase B
MFB: feixe prosencefálico medial (do inglês, medial forebrain bundle) MPP+: 1-Methyl-4-phenylpyridinium
MPTP: 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina MSNs: neurônios espinais médios
mTOR: do inglês, mammalian target of rapamycin NFκB: fator nuclear kappa B
NMDA: N-metil-D-aspartato
NO: óxido nítrico
NOS: óxido nítrico sintase (do inglês, nitric oxide synthase) Nrf-2: fator relacionado ao fator nuclear do eritroide-2 NST: núcleo subtalâmico
PBS: tampão fosfato-salina (do inglês, phosphate buffered saline) PI-3K: Fosfatidilinositol 3’-quinase
PKA: proteína quinase A
PSD-95: proteína de densidade pós-sináptica-95 PVC: policloreto de vinila
RNAm: RNA mensageiro rpm: rotações por minuto SDS: dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS SN: Substância negra
SNC: sistema nervoso central
SNpc: substância negra parte compacta SNr: substância negra parte reticulada
TBS: tampão tris-salina (do inglês, tris-buffered saline)
TBS-T: tampão tris salina com tween 20 (do inglês, tris-buffered saline with tween 20) TH: tirosina hidroxilase
TNF-α: fator de necrose tumoral TrkB: tropomiosina quinase B
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 21
1.1 A DOENÇA DE PARKINSON ... 21
1.1.1 Epidemiologia e etiopatologia ... 21
1.1.2 Alterações neuropatológicas e os sintomas motores ... 22
1.1.3 Tratamento farmacológico: ênfase na Levodopa (L-DOPA) ... 26
1.1.4 Discinesia induzida por L-DOPA ... 30
1.1.4.1 Classificação das LIDs ... 30
1.1.4.2 Mecanismos envolvidos nas LIDs ... 32
1.1.4.3 Estratégias antidiscinéticas ... 36
1.1.5 Sintomas não motores: ênfase nos déficits cognitivos ... 37
1.1.6 Sintomas não motores: ênfase na anedonia e depressão ... 42
1.2 AGMATINA E SEU POTENCIAL NA DP ... 51
1.3 JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE ... 58 1.4 OBJETIVO GERAL ... 59 1.5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 60 2. MATERIAL E MÉTODOS ... 61 2.1 ANIMAIS ... 61 2.2 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS ... 61
2.2.1 Bloco experimental 1: Avaliação do efeito da agmatina sobre as LIDs em ratos lesionados com 6-OHDA no MFB ... 61
2.2.2 Bloco experimental 2: Avaliação do efeito da agmatina sobre os déficits cognitivos em ratos lesionados bilateralmente com 6-OHDA no estriado dorsolateral ... 63
2.2.3 Bloco experimental 3: Avaliação do efeito da agmatina sobre os comportamentos tipo anedônico e depressivos em ratos lesionados bilateralmente com 6-OHDA no EDL ... 64
2.4 TESTE DO COMPORTAMENTO ROTATÓRIO INDUZIDO POR
HIDROCLORETO DE R(-)-APOMORFINA ... 66
2.5 INDUÇÃO E AVALIAÇÃO DAS LIDs ... 67
2.6 TESTES PARA AVALIAÇÃO MOTORA ... 68
2.6.1 Testes do cilindro ... 68
2.6.2 Testes do campo aberto ... 69
2.6.3 Teste do rotarod ... 69
2.7 TESTES PARA AVALIAÇÃO DOS SINTOMAS NÃO MOTORES ... 70
2.7.1 Teste do reconhecimento social ... 70
2.7.2 Teste do reconhecimento de objeto ... 71
2.7.3 Teste do labirinto em Y modificado ... 72
2.7.4 Teste de preferência à sacarose ... 73
2.7.5 Teste da borrifada com sacarose ... 74
2.7.6 Teste do nado forçado ... 74
2.8 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 75
2.8.1 Eletroforese seguida de imunodetecção de proteínas pela técnica de “Western blot” 75 2.8.2 Imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH) ... 76
2.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 77
3 RESULTADOS ... 78
3.1 BLOCO EXPERIMENTAL 1: AVALIAÇÃO DO EFEITO DA AGMATINA SOBRE AS LIDs EM RATOS LESIONADOS COM 6-OHDA NO MFB ... 78
3.1.1 Avaliação da efetividade da lesão induzida por 6-OHDA no MFB ... 78
3.1.2 Efeito da agmatina sobre as LIDs em ratos hemiparkinsonianos... 80
3.1.3 Efeito da agmatina sobre os prejuízos motores induzidos pela 6-OHDA no MFB83 3.2 BLOCO EXPERIMENTAL 2: AVALIAÇÃO DO EFEITO DA AGMATINA SOBRE OS DÉFICITS COGNITIVOS EM RATOS LESIONADOS BILATERALMENTE COM 6-OHDA NO EDL ... 86
3.2.1 Avaliação do grau de degeneração da via dopaminérgica nigroestriatal em ratos
lesionados com 6-OHDA no EDL ... 86
3.2.2 Efeito da agmatina sobre a memória social de curto prazo ... 88
3.2.3 Efeito da agmatina sobre a memória espacial de curto prazo ... 89
3.3 BLOCO EXPERIMENTAL 3: AVALIAÇÃO DO EFEITO DA AGMATINA SOBRE OS COMPORTAMENTOS TIPO ANEDÔNICOS E DEPRESSIVOS EM RATOS LESIONADOS BILATERALMENTE COM 6-OHDA NO EDL ... 92
3.3.1 Efeito da agmatina sobre os comportamentos tipo anedônicos ... 92
3.3.2 Efeito da agmatina sobre os comportamentos tipo depressivos ... 93
3.3.3 Efeito da agmatina sobre o imunoconteúdo de BDNF e TrkB no córtex pré-frontal em ratos lesionados com 6-OHDA no EDL ... 94
4 DISCUSSÃO ... 97
5 CONCLUSÃO ... 108
1. INTRODUÇÃO
1.1 A DOENÇA DE PARKINSON
Há cerca de duzentos anos, James Parkinson (1775-1824), médico neurologista da cidade de Londres, publicou o trabalho intitulado “Um ensaio sobre a paralisia agitante” (1817), do inglês “An Essay on The Shaking Palsy”, no qual ele descreveu seis casos de pacientes que desenvolveram tremores involuntários, lentidão dos movimentos (bradicinesia), fraqueza, postura inclinada e marcha festinante, caracterizada por passos simétricos rápidos e de pouca amplitude e com uma leve flexão da bacia e dos joelhos (PARKINSON, 1817; OBESO et al., 2017). Em meados do século XIX, o neurologista francês Jean-Martin Charcot refinou estas descrições e foi o primeiro a sugerir o uso do termo "Doença de Parkinson" (DP), após distinguir esta doença da esclerose múltipla e de outros distúrbios caracterizados por tremor. Charcot foi o responsável por estabelecer os sinais cardinais da doença como rigidez muscular, bradicinesia e tremor de repouso, além de contribuir para a introdução do primeiro tratamento farmacológico baseado na utilização de fármacos anticolinérgicos (GOETZ, 2011).
1.1.1 Epidemiologia e etiopatologia
Atualmente, a DP é considerada a segunda doença neurodegenerativa mais prevalente no mundo afetando 1-2% da população acima dos 65 anos, aumentando para 3% em indivíduos com mais de 80 anos de idade (POEWE et al., 2017). No Brasil, a prevalência da DP é de 3,4% dos indivíduos acima dos 60 anos (BARBOSA et al., 2006), sendo esperado que este número possa dobrar até 2030 em virtude do envelhecimento da população (DORSEY et al., 2007). O fator etiológico primário da DP permanece desconhecido, no entanto, acredita-se que a doença seja multifatorial e pode ser resultado da interação entre fatores genéticos e ambientais (POEWE et al., 2017).
Existem evidências da participação de fatores genéticos na etiologia da DP, já tendo sido identificadas 11 formas de parkinsonismo genético que apresentam características clínicas distintas da forma esporádica da doença (BARTELS e LEENDERS, 2009). Mutações
no gene parkin no parkinsonismo juvenil recessivo autossômico foram descobertas em 1998 e finalmente, entre 2002 a 2005, mutações nos genes DJ-1, PINK1 e as mutações mais comuns no gene LRRK2 foram identificadas em famílias japonesas e europeias (HOULDEN e SINGLETON, 2012). Contudo, 90% dos casos da DP não têm causa genética identificável, sendo considerados como DP idiopática associada a combinação de possível predisposição genética e fatores ambientais. Além do envelhecimento, a exposição a contaminantes ambientais como pesticidas (paraquat, rotenona e maneb) e metais pesados (ferro, manganês, cobre, alumínio e zinco), o estilo de vida (consumo de álcool e dieta rica em lipídeos), as infecções virais e o traumatismo craniano estão entre os principais fatores de risco para o desenvolvimento da DP (ASCHERIO e SCHWARZSCHILD, 2016).
1.1.2 Alterações neuropatológicas e os sintomas motores
Do ponto de vista neuropatológico, a DP é uma doença neurodegenerativa crônica caracterizada pela perda progressiva de neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal e pela presença de corpos de Lewy (OBESO et al., 2000) (Figura 1). O envolvimento da substância negra (SN) na patologia da DP foi proposto somente em 1893 por Bloq e Marinesco (1893), posteriormente corroborado por outros estudos como o realizado por Constantin Trétiakoff em 1919. Através de estudos post-mortem realizados em encéfalos de pacientes parkinsonianos foi identificada uma perda acentuada de neurônios pigmentados da SN parte compacta (SNpc) (BARTELS e LEENDERS, 2009). Em 1912, Friedrich Heinrich Lewy descreveu pela primeira vez os corpos de inclusão considerados atualmente como indicadores patológicos da DP idiopática (BARTELS e LEENDERS, 2009). Estes corpos consistem em inclusões eosinofílicas intracelulares constituídas principalmente de neurofilamentos, agregados de α-sinucleína e ubiquitina (Figura 1), encontrados em neurônios em processo de degeneração e podem estar localizados em diversas regiões encefálicas (SPILLANTINI et al., 1997). Estes agregados proteicos podem surgir devido a falhas nos mecanismos de degradação de proteínas, como autofagia e o sistema ubiquitina-proteassoma (UPS, do inglês
Figura 1- Principais alterações neuropatológicas da doença de Parkinson.
Legenda: Representação esquemática da via nigrostriatal normal e em degeneração na doença de Parkinson (DP) (em vermelho). Esta via é composta por neurônios dopaminérgicos cujos corpos celulares estão localizados na substância negra parte compacta (SNpc) e se projetam para o corpo estriado (isto é, núcleo caudado e putâmen) (A). A ilustração representa a pigmentação normal da SNpc (à esquerda), produzida pela neuromelanina nos neurônios dopaminérgicos e a despigmentação da SNpc observados em pacientes DP devido à perda acentuada desses neurônios (B). A marcação com imunohistoquímica da α-sinucleína mostra a presença de Corpos de Lewy esferoides e intracitoplasmáticos, depósitos granulares mais difusos e pontos extracelulares de α-sinucleína, respectivamente (da esquerda para a direta) (C). Fonte: Adaptado de (DAUER e PRZEDBORSKI, 2003; POEWE et al., 2017)
Em seguida, na década de 1950, Arvid Carlsson observou que 80% da dopamina (DA) no encéfalo está localizada nos núcleos da base (CARLSSON, 1959). Ele fez a conexão entre a depleção de DA e a DP, achado posteriormente confirmado por estudos bioquímicos
post-mortem mostrando níveis reduzidos de DA e de seus metabólitos nos núcleos caudado e
putâmen, núcleo accumbens, SN e globo pálido (GP) de pacientes com a DP (HORNYKIEWICZ, 2006). Conforme ilustrado na Figura 2, a degeneração dos neurônios dopaminérgicos na SNpc, com a consequente perda da inervação dopaminérgica e redução dos níveis de DA no estriado dorsal, resultam em distúrbios motores, visto que comprometem o funcionamento apropriado dos circuitos neurais dos núcleos da base, os quais têm importância crucial no controle motor (OBESO et al., 2000). O estriado e o núcleo subtalâmico (NST) recebem aferências excitatórias do córtex cerebral. Cerca de 95% dos neurônios estriatais são neurônios espinhais médios (MSNs) GABAérgicos, enquanto que o NST é composto por neurônios glutamatérgicos excitatórios (SANO et al., 2013). Os MSNs
da via direta (dMSNs) que expressam, predominantemente, receptores dopaminérgicos do tipo D1 (D1R) que exibem um aumento de atividade em resposta a DA e se projetam diretamente para regiões de saída dos núcleos da base, inibindo-as. Como consequência, ocorre uma desinibição do tálamo e estimulação de áreas corticais, promovendo o movimento.
Por outro lado, os MSNs da via indireta estriato-palidal (iMSNs) expressam principalmente os receptores dopaminérgicos do tipo D2 (D2R) e exibem uma diminuição da atividade em resposta a DA. Eles influenciam os núcleos da base indiretamente, enviando projeções até o globo pálido externo (GPe), levando a sua inibição. Deste modo, os neurônios do NST são desinibidos, ativando os núcleos de saída, o segmento interno do globo pálido (GPi) e a SN parte reticulada (SNpr). Estes núcleos inibem o tálamo com a consequente inibição do movimento. Portanto, a DA promove o movimento por ativar os dMSNs que expressam D1R e pela inibição de iMSNs que expressam D2R (HEIMAN et al., 2014). Esta complexa modulação dos núcleos da base permite sequências de movimentos coordenados, inibindo movimentos concorrentes. Além disso, os núcleos da base permitem que movimentos e ações sejam modificados através do aprendizado por reforço (CENCI e LINDGREN, 2007). Na DP, a perda de estímulo dopaminérgico da SNpc leva à um aumento na atividade dos neurônios GABAérgicos localizados no GPi e na SNpr decorrente tanto da inibição da via direta como da facilitação da via indireta. Dessa forma, ocorre o aumento da inibição tônica do tálamo e essas mudanças no padrão de disparo a partir do GPi e da SNpr diminuem a ativação do córtex motor, e, possivelmente, supressão do sistema inibitório do tônus muscular e a inibição do sistema de execução dos movimentos (JENNER, 2008).
Figura 2 – Ilustração esquemática das alterações da circuitaria dos núcleos da base observadas na doença de Parkinson
Legenda: Desenho esquemático mostrando o funcionamento normal dos circuitos dos núcleos da base (lado esquerdo) e suas alterações na doença de Parkinson (DP) (lado direito). Em condições fisiológicas (esquerda), os neurônios aferentes dopaminérgicos da substância negra parte compacta (SNpc) fazem sinapses com os neurônios GABAérgicos que exibem receptores dopaminérgicos D1 ou D2. Essas populações GABAérgicas se projetam diretamente (setas vermelhas) ou indiretamente (setas azuis) através do globo pálido externo (GPe) e núcleo subtalâmico (STN) ao globo pálido interno (GPi). A saída do GPi (setas verdes) para o tálamo (Th) é inibitória e modula a função motora normal. Na DP (direita), a perda de neurônios dopaminérgicos na SNpc e a depleção da dopamina estriatal levam a um aumento da inibição do GPi sobre o tálamo, causando redução na função motora normal. As entradas inibitórias e excitatórias são marcadas como (-) e (+), respectivamente. A intensidade das entradas é marcada com a espessura das linhas. Str, estriado; Th, tálamo. Fonte: Adaptado de (SUBRAMANIAM e FEDEROFF, 2017).
Para avaliar o processo neurodegenerativo na DP, alguns modelos animais são utilizados como ferramentas de estudo, visto que reproduzem os principais processos celulares da doença como estresse oxidativo, neurodegeneração, neuroinflamação e morte celular (HERNANDEZ-BALTAZAR, ZAVALA-FLORES e VILLANUEVA-OLIVO, 2017). A 6-OHDA é um análogo da dopamina e da noradrenalina altamente oxidável que pode ser capturada através dos transportadores de monoaminas nos terminais neuronais, o que confere especificidade a neurotoxina para afetar os neurônios monoaminérgicos, como os neurônios dopaminérgicos da SNpc (BLANDINI e ARMENTERO, 2012). Os efeitos citotóxicos desta neurotoxina são causados pela inibição direta do complexo mitocondrial I e da auto-oxidação intra ou extracelular da 6-OHDA, produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs), como
radicais superóxido, radicais hidroxila e peróxido de hidrogênio (KONNOVA e SWANBERG, 2018). O estresse oxidativo gerado pode ser amplificado pelo aumento do cálcio livre no citoplasma, produto da excitotoxicidade do glutamato, ou pela perda da permeabilidade da membrana mitocondrial, induzindo a morte celular (SINGH, KUMAR e DIKSHIT, 2010).
A 6-OHDA não atravessa a barreira hematoencefálica e precisa ser administrada diretamente no cérebro para induzir a neurodegeneração. Em 1968, Ungerstedt foi o primeiro a mostrar que a injeção estereotática intracerebral de 6-OHDA causa degeneração da via nigrostriatal (UNGERSTEDT, 1968). Além disso, para aumentar a seletividade para os neurônios dopaminérgicos, a desipramina, um inibidor não seletivo dos transportadores de noradrenalina e serotonina, pode ser administrada por via intraperitoneal 30 min antes da injeção estereotáxica da 6-OHDA (BLANDINI, ARMENTERO e MARTIGNONI, 2008). Os efeitos e mecanismos envolvidos no processo neurodegenerativo promovido pela 6-OHDA semelhantes a DP podem ser avaliados por diferentes modelos de lesão unilateral ou bilateral em regiões encefálicas como o do feixe prosencefálico medial (MFB), a SNpc e o estriado (HEUER et al., 2012). A lesão do MFB e a lesão intranigral causam uma degeneração rápida e generalizada do núcleo lesionado (JACKSON-LEWIS, BLESA e PRZEDBORSKI, 2012). No entanto, o modelo de lesão intraestriatal causa perda progressiva dos neurônios dopaminérgicos do SNpc, mimetizando o dano nigrostriatal observado na DP. Além de não ultrapassar a barreira hematoencefálica, outra limitação do modelo é que a 6-OHDA não induz a formação dos corpos de Lewy (LINDGREN, LELOS e DUNNETT, 2012).
1.1.3 Tratamento farmacológico: ênfase na Levodopa (L-DOPA)
A descoberta da deficiência dopaminérgica estriatal pelo pesquisador Arvid Carlsson em 1959 foi essencial para o desenvolvimento de fármacos para o tratamento da DP, levando à introdução da L-DOPA, precursor da DA, e de agonistas dopaminérgicos como o pramipexol e a apomorfina (CARLSSON, 1959). Com exceção dos anticolinérgicos e da amantadina (antagonista dos receptores N-metil-D-Aspartato, NMDA, para glutamato), todos os outros fármacos posteriormente desenvolvidos (inibidores da dopa-descarboxilase, inibidores da monoamina oxidase, inibidores da catecol-O-metiltransferase) atuam indiretamente por meio de mecanismos dopaminérgicos pré- ou pós-sinápticos a fim de
aumentar a disponibilidade da DA no sistema nervoso central (SNC) (GOETZ et al., 2005) (Figura 3).
Figura 3 – Fármacos e alvos farmacológicos utilizados no tratamento da doença de Parkinson
Legenda: O fármaco precursor de dopamina (DA) levodopa (L-DOPA) combinado com inibidores periféricos da descarboxilase de aminoácidos aromáticos (DCAA) ou catecol-O-metiltransferase (COMT) atravessa a barreira hematoencefálica (seta tracejada). A tirosina hidroxilase (TH) converte L-DOPA em DA nos neurônios dopaminérgicos. Os inibidores da enzima monoamina oxidase tipo B (MAO-B) evitam a degradação da DA na fenda sináptica e aumentam a disponibilidade da DA (endógena e exógena), enquanto que os agonistas DA atuam pós-sinapticamente através da ativação dos receptores D1 e D2. A seta tracejada através do transportador de DA (DAT) indica a recaptação de DA na fenda sináptica. 3-O-M-DOPA, 3-O-metil-DOPA; DOPAC, ácido 3,4-dixihidroxifenil acético. Fonte: Adaptado de (POEWE et al., 2017).
A L-DOPA é um isômero L que ocorre naturalmente a partir do aminoácido D, L-di-hidroxifenilalanina. Foi isolada pela primeira vez a partir de uma leguminosa (Vicia faba) em 1910 por Torquato Torquati, enquanto que a sua estrutura química foi estabelecida por Markus Guggenheim em 1913 (HORNYKIEWICZ, 2010). No entanto, o momento crucial na sua história foi em 1938 quando Peter Holtz descobriu a enzima DCAA que converte a L-DOPA, biologicamente inerte, em DA, biologicamente ativa. Naquela época, tanto a L-DOPA como a DA eram consideradas somente como metabólitos intermediários na síntese de noradrenalina e adrenalina (HORNYKIEWICZ, 2010). Em 1957, a DA foi encontrada no cérebro de mamíferos e, posteriormente, observou-se que o corpo estriado era a região encefálica com a maior concentração desta monoamina. Baseado nestes estudos, foi
considerada a hipótese de que DA poderia atuar como neurotransmissor e desempenharia um papel relevante no controle da função motora (PARENT e PARENT, 2010). No mesmo ano, Carlsson e colaboradores demonstraram que a terapia com a L-DOPA em animais tratados com reserpina, um inibidor do transportador vesicular de monoaminas do tipo 2 (VMAT-2), levando à depleção destes neurotransmissores nos terminais nervosos, reduziu a imobilidade desses animais e restaurou preferencialmente os níveis de DA quando comparada com as demais catecolaminas (CARLSSON et al., 1958; WEIL-MALHERBE e BONE, 1958).
Após essas descobertas, Ehringer e Hornykiewicz iniciaram um estudo post-mortem, em 1960, com cérebros de pacientes com distúrbios dos núcleos da base, incluindo a DP,
demonstrando um grave déficit de DA nos núcleos caudado e putâmen em pacientes com a DP (EHRINGER e HORNYKIEWICZ, 1960). Consequentemente, o
primeiro ensaio clínico de grande sucesso foi publicado por Hornykiewicz e Birkmayer (1961), no qual o tratamento agudo com a L-DOPA via intravenosa melhorou consideravelmente a acinesia desses pacientes (BIRKMAYER e HORNYKIEWICZ, 1962). A utilização da L-DOPA na rotina clínica como medicamento antiparkinsoniano de maior eficácia foi definitivamente estabelecido em 1967, quando Cotzias e colaboradores (COTZIAS, VAN WOERT e SCHIFFER, 1967) introduziram o tratamento crônico com altas doses de L-DOPA via oral. Devido ao aparecimento de efeitos adversos como distúrbios gastrointestinais (anorexia, náuseas e vômitos), eles propuseram um protocolo de administração, praticado até os dias atuais, no qual as dosagens de L-DOPA aumentavam gradualmente. Com este novo procedimento, houve uma redução destes efeitos secundários e um aumento na duração dos benefícios da L-DOPA sobre os sintomas motores (COTZIAS, PAPAVASILIOU e GELLENE, 1968).
Neste mesmo período, Cotzias e colaboradores utilizaram a alfa-metildopa-hidrazina (mais tarde conhecida como carbidopa), um inibidor periférico da DDCA, em uma tentativa de potencializar as ações a nível cerebral da L-DOPA administrada por via oral, reduzindo o metabolismo periférico deste fármaco (PAPAVASILIOU et al., 1972). Estes estudos mostraram que doses menores de L-DOPA eram suficientes para o controle dos sintomas e sua ação era mais rápida sobre os prejuízos motores, com redução dos efeitos colaterais cardiovasculares e gastrointestinais. Por outro lado, os movimentos involuntários e distúrbios mentais provaram ser de origem cerebral, pois permaneceram inalterados. A publicação de Papavasiliou e colaboradores em 1972 (PAPAVASILIOU et al., 1972) estabeleceu o uso combinado de L-DOPA e um inibidor periférico da DDCA, resultando em um aumento dos
níveis deste fármaco no cérebro. Até o momento, esta associação segue como o tratamento padrão ouro para a DP (LEES, TOLOSA e OLANOW, 2015).
Embora o benefício do tratamento através da reposição da DA seja incontestável, ela promove uma melhoria transitória nos sintomas motores e não impede a progressão da doença. Além disso, com o decorrer do tempo, a eficácia dos fármacos é reduzida (ALLAIN, BENTUE-FERRER e AKWA, 2008). Recentemente, novas formulações orais mais eficazes ou vias alternativas de administração (infusão intestinal, L-DOPA transcutânea ou inalada) têm sido desenvolvidas para melhorar a biodisponibilidade da L-DOPA (GUPTA, LYONS e PAHWA, 2019). Os motivos comuns por trás das variações nos níveis plasmáticos deste fármaco incluem atraso no esvaziamento gástrico, o crescimento excessivo de bactérias no intestino delgado e a interação das proteínas com a absorção da L-DOPA (GUPTA, LYONS e PAHWA, 2019). O IPX066 é uma nova formulação oral de L-DOPA-carbidopa, combinando a de liberação imediata com a de liberação prolongada, aprovada nos Estados Unidos e na União Europeia (YAO et al., 2016). Outra terapia é o gel intestinal de que consiste em uma suspensão de L-DOPA e carbidopa injetada diretamente no jejuno proximal através de um tubo de gastrojejunostomia endoscópica percutânea através de uma bomba de infusão portátil (AQUILONIUS e NYHOLM, 2017).
Estudos clínicos em andamento estão avaliando também a “pílula acordeão” , uma formulação de liberação prolongada com propriedades gastrorretentivas, na qual o medicamento está presente em filmes poliméricos biodegradáveis que são então colocados dentro de uma cápsula, permitindo um perfil farmacocinético adequado (NAVON et al., 2018). O ND0612 é uma formulação líquida que permite a administração subcutânea por meio de um pequeno dispositivo de bomba de remendo e o CVT-301 consiste em um pó para inalação de L-DOPA com rápido início de ação (LUINSTRA et al., 2015; VAN WAMELEN
et al., 2018). Apesar dos avanços tecnológicos na administração e formulação de
medicamentos contendo L-DOPA, a eficácia na redução dos efeitos adversos ainda permanece limitada e mais estudos são necessários para determinar os benefícios e o perfil de segurança destes medicamentos (FREITAS, RUIZ-LOPEZ e FOX, 2016).
Adicionalmente, fármacos não dopaminérgicos que atuam nos receptores para adenosina, glutamato, adrenérgicos e serotonina têm sido investigados para o tratamento dos pacientes em estágios distintos da DP (SCHAPIRA, 2005). Além das novas formulações para
a redução dos efeitos adversos promovidos pelos medicamentos utilizados na clínica, os principais desafios terapêuticos na DP são o desenvolvimento de tratamentos modificadores da doença para retardar ou prevenir a progressão da neurodegeneração e fármacos eficazes no tratamento dos sintomas não motores (SCHAPIRA, 2005).
1.1.4 Discinesia induzida por L-DOPA
Desde a década de 1960, a L-DOPA permanece como o fármaco “padrão ouro” para o tratamento da DP. No entanto, o tratamento crônico da DP com este fármaco promove o surgimento de efeitos colaterais limitantes da qualidade de vida do paciente, incluindo distúrbios psiquiátricos, flutuações motoras do tipo “liga e desliga” e os movimentos involuntários anormais (AIMs do inglês “Abnormal Involuntary Movements”) (TOLOSA et
al., 1998), também mencionado como discinesias induzidas por L-DOPA, do inglês “L-DOPA-Induced Dyskinesias” (LIDs). A LID foi descrita pela primeira vez em 1972 por
Cotzias e colaboradores e a sua prevalência em pacientes parkinsonianos tratados com L-DOPA durante cinco anos é cerca de 50%, aumentando para 90% após dez anos de tratamento. O desenvolvimento deste distúrbio motor é dose-dependente, está associado ao início precoce da doença e à progressão da neurodegeneração da via nigroestriatal (BHIDE et
al., 2013).
1.1.4.1 Classificação das LIDs
Clinicamente, são observados três tipos principais de LIDs: as discinesias de período “on” (pico de dose), as discinesias difásicas e as distonias de período “off” (Figura 4). Elas são descritas em relação à duração da resposta e a efetividade da L-DOPA, ou seja, estão associadas ao grau de atividade dopaminérgica e ao estado motor do paciente parkinsoniano (OBESO et al., 2007; GURIDI, GONZALEZ-REDONDO e OBESO, 2012; DEL-BEL et al., 2015).
As discinesias de período “on” ou de pico de dose coincidem com a concentração mais elevada da L-DOPA no plasma e com seu benefício clínico máximo. Geralmente, os movimentos são de natureza coreiforme e envolvem, principalmente, o pescoço, o tronco e os membros superiores, porém movimentos distônicos também podem ser observados. Durante as fases iniciais e finais do efeito da L-DOPA podem ocorrer as discinesias difásicas que
coincidem com concentrações baixas ou intermediárias do fármaco no plasma. Elas são caracterizadas por movimentos lentos repetitivos e estereotipados dos membros inferiores e tremores dos membros superiores, indicando que os pacientes não estão sob o efeito máximo da L-DOPA. Em casos graves, ocorrem movimentos de grande amplitude das pernas, abruptos, contínuos e ritmados, semelhantes ao balismo. Em alguns casos, as discinesias difásicas podem interferir drasticamente na marcha, gerando um padrão característico (OBESO et al., 2007; GURIDI, GONZALEZ-REDONDO e OBESO, 2012).
Diferente das discinesias, as distonias de período “off” são caracterizadas por posturas fixas e dolorosas, causadas pela contração simultânea e sustentada de músculos agonistas e antagonistas. Elas podem apresentar uma distribuição generalizada ou podem ser localizadas, como a extensão do pé ou flexão dos dedos dos pés. Estas manifestações foram observadas em pacientes com a DP antes do surgimento do tratamento com a L-DOPA, porém elas são mais frequentes e características de períodos “off” do fármaco (OBESO et al., 2007; GURIDI, GONZALEZ-REDONDO e OBESO, 2012).
Figura 4- Subdivisões clínicas das discinesias induzidas por L-DOPA
Legenda: Diferentes tipos de discinesias classificadas de acordo com os níveis plasmáticos de L-DOPA (discinesia de pico de dose, bifásica, distonia de período off). Fonte: Adaptado de (CALABRESI et al., 2010).
1.1.4.2 Mecanismos envolvidos nas LIDs
A expressão e manutenção das LIDs envolvem mecanismos complexos e diversos sistemas de neurotransmissão. Evidências indicam que eventos dopaminérgicos pré- e pós-sinápticos contribuem para o desenvolvimento das LIDs (BORDIA, MCINTOSH e QUIK, 2013). A perda dopaminérgica na via nigroestriatal reduz a capacidade de recaptação de DA pelo transportador de dopamina (DAT) e o tratamento com a L-DOPA via oral leva a um aumento e uma maior flutuação dos níveis desse neurotransmissor na fenda sináptica, observados no estriado de pacientes acometidos pelas LIDs e em modelos animais (BORDIA, MCINTOSH e QUIK, 2013). Além disso, neurônios serotoninérgicos exibem a maquinaria enzimática de descarboxilação da L-DOPA e produção de DA. No entanto, não possuem mecanismos de controle dopaminérgico promovidos pelo receptor pré-sináptico do tipo D2 e pela recaptação da DA pelo DAT (CARTA e BEZARD, 2011).
Esse excesso de DA extracelular sensibiliza os receptores pós-sinápticos do tipo D2, com ativação de vias que levam a transcrição de genes associados às LIDs nos MSNs GABAérgicos, como a via de sinalização a AMPc/PKA/DARPP-32 (CARTA e BEZARD, 2011; FRANCARDO e CENCI, 2014; HEIMAN et al., 2014). A DARPP-32 (fosfoproteína regulada por AMPc de 32 KDa) é um componente chave da integração dos sinais neurotransmissores e moduladores no estriado em resposta à DA e ao glutamato (FERNANDEZ et al., 2006). Este desequilíbrio neuroquímico ocasiona padrões de disparo anormais dos neurônios nos núcleos da base que representam o código neural para o desenvolvimento e manutenção das LIDs (CENCI e LINDGREN, 2007) (Figura 5). As projeções GABAérgicas dos dMSN para os núcleos de saída dos núcleos da base tornam-se hiperativas, inibindo o GPi e o SNpr. Esta redução pronunciada na atividade dos neurônios GABAérgicos do GPi desinibe o tálamo, aumentando a ativação dos neurônios glutamatérgicos do córtex motor e, consequentemente, o aparecimento de movimentos hipercinéticos característicos das LIDs (JENNER, 2008; PORRAS et al., 2014) (Figura 6).
Figura 5 – Mecanismos moleculares pré-sinápticos e pós-sinápticos associados às discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs)
Legenda: A perda dopaminérgica nigroestriatal na DP associada com o tratamento com a L-DOPA leva a um aumento na variação dos níveis da dopamina (DA) na fenda sináptica. Os neurônios serotoninérgicos passam a produzir e liberar DA, entretanto, não possuem mecanismos de controle dopaminérgico promovidos pelo receptor D2 e pela recaptação de DA pelo transportador de dopamina (DAT). Em consequência, o excesso DA extracelular sensibiliza o receptor pós-sináptico D1 com ativação de vias que levam a transcrição de genes associados às LIDs nos neurônios espinhais médios (MSNs), como a via de sinalização da DARPP-32/ ERK/pCREB. O excesso de glutamato na fenda sináptica também pode estar relacionado às LIDs. A liberação de glutamato é regulada pelos endocanabinoides (eCB) ativada pelo aumento das concentrações intracelulares de cálcio (Ca2+). Outro
modulador da liberação de glutamato é o óxido nítrico (NO). Ele é produzido a partir de L-arginina pela enzima óxido nítrico sintase (NOS) após a ativação do receptor NMDA e o influxo de cálcio. O NO se difunde pela membrana e ativa a liberação do glutamato de forma retrógrada via PKG, a qual estimula a hiperfosforilação via ERK/pCREB. Um desequilíbrio nessa regulação neuroquímica pode exercer efeitos a longo prazo através de mudanças na síntese de proteínas que atuam no desenvolvimento e manutenção da LID. Fonte: Adaptado de (CALABRESI et al., 2010; EGUCHI et al., 2012).
O glutamato liberado em terminais corticoestriatais se liga a receptores glutamatérgicos ionotrópicos e metabotrópicos. A hiperativação do receptor ionotrópico do tipo NMDA (NMDAR) e do receptor metabotrópico do tipo 5 (mGluR5) leva à ativação da via de sinalização ERK1/2 e alterações na transcrição de genes, através da fosforilação de fatores de transcrição e de histonas (HEIMAN et al., 2014). Em sinapses glutamatérgicas, os
NMDAR estão concentrados na densidade pós-sináptica (PSD), os quais interagem de maneira específica, formando um complexo dinâmico que é crítico na determinação da força sináptica da transmissão. Este complexo também inclui o D1R e ele se liga diretamente a subunidade NR1 do NMDAR e essa interação influencia o tráfego, a sinalização e a dessensibilização de ambos os receptores. Análises bioquímicas revelaram alta concentração da subunidade NR2A e baixa concentração da subunidade NR2B em ratos discinéticos tratados com L-DOPA em comparação com aqueles não discinéticos. A ativação simultânea de D1R e NMDAR é decisiva para determinar a eficácia da transmissão corticostriatal e, provavelmente, contribui no desenvolvimento das disfunções motoras (GARDONI et al., 2006).
A sinalização via óxido nítrico (NO) também tem um papel importante na integração da informação transmitida através da via corticoestriatal (DEL BEL et al., 2005). Padovan-Neto e colaboradores (2013, 2015) observaram que a administração aguda ou crônica de 7-Nitroindazol (7-NI), um inibidor preferencial da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), reduz a LID, atenua a redução de neurônios positivos para nNOS e atenua a expressão de FosB/ΔFosB estriatal em ratos lesionados no estriado por 6-OHDA (PADOVAN-NETO et
al., 2013; PADOVAN-NETO et al., 2015). Neste modelo, foi também observado um aumento
pronunciado na concentração de DA no estriado não lesionado em comparação com os animais falso operados. O 7-NI reduziu a concentração do ácido 3,4-dihidroxifenilacético (DOPAC) e da razão DOPAC/DA no estriado contralateral a lesão dos ratos discinéticos e este efeito parece interferir na disponibilidade de DA no estriado lesionado e contribuir para o seu efeito antidiscinético (DEL-BEL et al., 2014).
Outros trabalhos mostraram que a administração crônica deste inibidor de nNOS reduz a LID com a diminuição nos níveis de pERK, além de reduzir a fosfoacetilação da histona 3 (H3), sem afetar o efeito terapêutico da L-DOPA no estriado em camundongos deficientes de Pitx3, um fator de transcrição envolvido no desenvolvimento dos neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo (SOLIS et al., 2015). Além disso, o 7-NI foi capaz de bloquear a ativação microglial no estriado de ratos lesionados com 6-OHDA, que está associada à perda de neurônios dopaminérgicos na SNpc (BORTOLANZA et al., 2015).
A administração repetida da L-DOPA em ratos hemiparkinsonianos também pode desencadear a superexpressão do D3R no núcleo accumbens e no estriado (BORDET et al., 1997). Este aumento na expressão do D3R demonstrou ser responsável pelo desenvolvimento da sensibilização à L-DOPA e está correlacionado com a ocorrência e a gravidade da LID.
Além disso, esta indução da expressão do D3R no estriado é induzida por um aumento dependente do Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF), do inglês Brain-Derived
Neurotrophic Factor), uma neurotrofina importante na regulação da plasticidade sináptica que
pertence a uma família de proteínas relacionadas ao fator de crescimento nervoso, responsáveis pela proliferação, sobrevivência e diferenciação de neurônios córticoestriatais (GUILLIN et al., 2001; GUILLIN et al., 2003).
Com a interrupção do tratamento com a L-DOPA, as discinesias desaparecem, mas podem retornar rapidamente após a reintrodução do fármaco na terapia. É como se houvesse uma memória química da ação do medicamento sobre o corpo. Um dos mecanismos descritos para este fenômeno, denominado de “priming”, seria causado por uma hipersensibilidade induzida por L-DOPA. O “priming” tem sido estudado extensivamente por ser uma ferramenta interessante para entender os eventos moleculares que causam as discinesias (TANG e COTZIAS, 1977).
Figura 6 – Alterações na circuitaria dos núcleos da base observadas nas discinesias induzida por L-DOPA (LIDs)
Legenda: A administração crônica de L-DOPA promove uma hiperativação dos neurônios espinhais médios (MSNs) GABAérgicos da via direta devido a sensibilização dos receptores D1, inibindo o globo pálido interno (GPi) e a substância negra parte reticulada (SNr). Concomitantemente, há uma menor ativação da via indireta que leva a hiperativação dos neurônios inibitórios do globo pálido externo (GPe), a inibição do núcleo subtalâmico (STN), seguida de uma menor estimulação dos núcleos de saída (GPi e SNr). Como resultado, ocorre a desinibição do tálamo, aumentando a ativação dos neurônios do córtex motor e, consequentemente, o aparecimento de movimentos hipercinéticos característicos da LID. Fonte: Adaptado de (SHARMA, LYONS e PAHWA, 2018).
1.1.4.3 Estratégias antidiscinéticas
Uma das estratégias de tratamento das LIDs na DP é a utilização de agonistas dopaminérgicos como o pramipexol, postergando o início do uso da L-DOPA e, consequentemente, retardando o desenvolvimento das LIDs e das flutuações motoras. Outras alternativas para minimizar os efeitos do fármaco incluem a redução da dose do precursor dopaminérgico, o aumento do tempo no intervalo entre as administrações e o tratamento com a amantadina (THANVI, LO e ROBINSON, 2007). A amantadina é o único fármaco antidiscinético aprovado pela FDA (do inglês, Food and Drug Administration) que melhora
tanto os sintomas motores quanto reduz a severidade das LIDs. No entanto, ela apresenta diversos efeitos adversos como a perda da libido, delírios e alucinações em pacientes idosos que comprometem a adesão ao tratamento (POSTMA e VAN TILBURG, 1975; METMAN et
al., 1999; NEAGOE, 2013).
Em casos mais severos, a opção terapêutica recomendada é a estimulação cerebral profunda (DBS do inglês, Deep Brain Stimulation) através da inserção de um microeletrodo em uma das estruturas cerebrais dos núcleos da base como, por exemplo, o NST ou GPi (TERZIC e ABOSCH, 2012). Apesar do DBS apresentar uma melhora substancial dos movimentos involuntários, representa uma alternativa cara, invasiva e não pode ser oferecida a todos os pacientes com a DP (THANVI, LO e ROBINSON, 2007). Além disso, pode causar efeitos adversos relevantes como compulsões por sexo e jogos de azar (MCINTOSH, 2011). 1.1.5 Sintomas não motores: ênfase nos déficits cognitivos
Classicamente, a DP é associada à neurodegeneração dopaminérgica na via nigroestriatal e aos prejuízos motores. No entanto, estudos mais recentes têm reportado o comprometimento de diferentes regiões encefálicas, consequentemente, envolve diversos neurotransmissores como a acetilcolina, a serotonina e a noradrenalina, caracterizando-se como uma doença multissistêmica (SCHAPIRA e TOLOSA, 2010). Dentre as estruturas encefálicas afetadas na DP estão o núcleo da rafe, lócus coeruleus, amígdala, bulbo olfatório, hipocampo e o córtex cerebral. Os mecanismos associados com a neurodegeneração nessas regiões podem ser causados por alterações celulares como a disfunção mitocondrial, desregulação da homeostase proteica da α-sinucleína, estresse oxidativo, excitotoxicidade glutamatérgica e neuroinflamação (DORSEY et al., 2007). Os danos provocados nestas vias estão relacionados à presença de uma variedade de sintomas não motores como hiposmia, distúrbios do sono, distúrbios gastrointestinais, dor, parestesias e distúrbios neuropsiquiátricos (demência, alucinações, ansiedade, anedonia e depressão) (BRAAK et al., 2004; SCHAPIRA, CHAUDHURI e JENNER, 2017).
Braak e colaboradores estagiaram a DP através da utilização de marcadores neuropatológicos como os corpos de Lewy, imunopositivas para α-sinucleína. A partir desta análise, foram definidos seis estágios evolutivos da DP a partir da distribuição dos corpos de
Lewy (Figura 7A) (BRAAK et al., 2004). Segundo a hipótese de Braak, os corpos de Lewy aparecem inicialmente na medula inferior e nos nervos olfativos e se espalham de maneira ascendente via tronco cerebral (núcleo dorsal da Rafe e locus coeruleus) até o mesencéfalo, onde a neurodegeneração característica dos neurônios dopaminérgicos da SNpc ocorre no estágio 3, quando os sintomas motores da DP ficam mais evidentes. Posteriormente, há envolvimento dos córtices frontal e occipital, associado a muitos dos problemas cognitivos associados à DP avançada (BRAAK et al., 2004; GOEDERT et al., 2013).
O esquema de estadiamento é consistente com o fato de que os sintomas não motores como a disfunção autonômica, a hiposmia, a depressão e o distúrbio do sono REM (do inglês,
Rapid Eye Movement) precedem os sintomas motores e podem ser predominantes à medida
que a doença progride, reduzindo significativamente a qualidade de vida dos pacientes (SCHAPIRA e TOLOSA, 2010). Esta fase da DP, que ocorre cerca de 10 a 20 anos antes do aparecimento dos sinais cardinais da doença, é chamada de fase prodrômica. No entanto, os sinais e sintomas que aparecem nesta etapa são ainda considerados insuficientes para permitir o diagnóstico da DP (GOEDERT et al., 2013). O desenvolvimento dos sintomas motores e a confirmação do diagnóstico clínico ocorrem nas fases moderadas, quando a degeneração atinge aproximadamente 60-70% dos neurônios dopaminérgicos da SNpc e ocorre uma redução de 70-80% dos níveis de DA estriatal (RIEDERER e WUKETICH, 1976). Na fase tardia da doença, os sintomas não motores mais presentes são alucinações, incontinência urinária, disfunção sexual, hipotensão ortostática e demência (Figura 7B) (BRAAK et al., 2004).
Figura 7 – Relação entre a progressão dos sintomas clínicos da doença de Parkinson e a distribuição dos agregados de α-sinucleína segundo a hipótese de Braak
Legenda: Inicialmente, as inclusões de α-sinucleína ocorrem em neurônios colinérgicos e monoaminérgicos do tronco encefálico e no bulbo olfatório (estágio I e II, fase prodrômica), infiltram-se em neurônios infiltram-semelhantes no meinfiltram-sencéfalo e no proinfiltram-sencéfalo que coincidem com os sintomas motores da DP (estágio III e IV, fase inicial a moderada). Posteriormente, são encontrados em regiões cerebrais límbicas e neocorticais (estágio V e VI, fase tardia) (A). Ilustração esquemática da presença dos sintomas motores e não motores em cada estágio da Doença de Parkinson (DP). A incapacidade progressiva da DP é causada pela combinação dos problemas não motores com o aumento da gravidade dos sintomas motores cardinais, o desenvolvimento de complicações motoras induzidas por L-DOPA e a evolução das deficiências motoras não responsivas a L-DOPA, como instabilidade postural, problemas na marcha e disfagia (B). REM, movimento rápido dos olhos. Fonte: Adaptado de (BRAAK et al., 2004; POEWE et al., 2017).
