UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA PósENQ – Programa de Pós-graduação em Engenharia Química LABSIN – Laboratório de Simulação Numérica de Sistemas Químicos
LABMASSA – Laboratório de Transferência de Massa
LIBERAÇÃO ENZIMÁTICA DE FÓSFORO FÍTICO E SUA CORRELAÇÃO COM A FORMA DE FERTILIZAÇÃO, ASPECTOS FISIOLÓGICOS E COMPOSIÇÃO QUÍMICA
DE AMOSTRAS DE MILHO
Florianópolis 2019
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Santa Catarina.
Nome completo da Aluna: Andressa Cristina De Rossi.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Débora de Oliveira.
Andressa Cristina De Rossi
LIBERAÇÃO ENZIMÁTICA DE FÓSFORO FÍTICO E SUA CORRELAÇÃO COM A FORMA DE FERTILIZAÇÃO, ASPECTOS FISIOLÓGICOS E COMPOSIÇÃO QUÍMICA
DE AMOSTRAS DE MILHO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Débora De Oliveira.
Coorientador: Dr. Everton Luis Krabbe
Florianópolis 2019
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Rossi, Andressa Cristina de
Liberação Enzimática de Fósforo Fítico e sua Correlação com a Forma de Fertilização, Aspectos Fisiológicos e Composição Química de Amostras de Milho / Andressa Cristina De Rossi ; orientadora, Débora de Oliveira ; coorientador, Everton Luis Krabbe. Florianópolis, SC, 2018.
119 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.
Inclui referências.
1. Engenharia Química. 2. Milho. 3. Ácido Fítico. 4. Fitase. I. Oliveira, Débora de. II. Krabbe, Everton Luis. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. III. Título.
Andressa Cristina De Rossi
LIBERAÇÃO ENZIMÁTICA DE FÓSFORO FÍTICO E SUA CORRELAÇÃO COM A FORMA DE FERTILIZAÇÃO, ASPECTOS FISIOLÓGICOS E COMPOSIÇÃO QUÍMICA
DE AMOSTRAS DE MILHO
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-graduação em Engenharia Química.
Florianópolis, 20 de fevereiro de 2019.
______________________________________ Prof. Cíntia Soares, Dr. ª
Coordenadora do Curso
______________________________________ Prof. ª Débora de Oliveira, Dr. ª
Orientadora
Universidade Federal de Santa Catarina
______________________________________ Everton Luis Krabbe, Dr.
Coorientador
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - CNPSA
Banca Examinadora:
______________________________________ Prof. Cristiano de Andrade, Dr.
Universidade Federal de Santa Catarina
______________________________________ Prof. Acácio Antonio F. Zielinski, Dr. Universidade Federal de Santa Catarina
Este trabalho é dedicado aos meus queridos pais, meu irmão e meu esposo.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente а Deus que iluminou e guiou os meus passos e permitiu a realização de cada uma de minhas conquistas e não somente nestes dois anos, mas que em todos os momentos, é o maior mestre que alguém pode conhecer.
Аоs meus pais, Altemir e Ameri e ao meu irmão Anderson, pelo apoio incondicional, pelo carinho com que me incentivaram e apoiaram mais esse sonho. Vocês nunca duvidaram da minha capacidade e não mediram esforços para que eu pudesse alcançar esse objetivo. A toda minha família, que mesmo à distância, sempre estiverem presentes. Obrigada por me fazer sentir tão especial e querida.
Ao meu esposo, Guilherme Graff, por acalentar minhas tristezas, por me aconselhar, por acreditar em meu sonho e me incentivar incondicionalmente. Por me esperar com um lindo sorriso nos intermináveis retornos a casa, entender meus momentos de estresse e cansaço. E, principalmente, por demostrar a cada dia como nosso amor é sincero e verdadeiro, nem mesmo todos os obstáculos e a distância foram capazes de nos separar.
As minhas amigas e colegas de mestrado, pelas conversas entre uma aula e outra, pelas dificuldades, angustias, alegrias e sonhos compartilhados. Por fazer meus dias em Floripa mais leves e acalentar a saudade de casa. Agradeço em especial à Regilene, por se tornar mais que uma colega de apartamento, por dividir comigo suas angustias, por me deixar fazer parte de sua história e se tornar nosso apê um verdadeiro lar. Com vocês, meu caminho se tornou mais leve, fácil e inesquecível.
As amigas que a Embrapa me presenteou, Maiara, Valquíria e Edinayane. Por mais árduo que o caminho passa parecer ele se torna leve e divertido quando compartilhado com quem amamos. Obrigada pelas risadas, pelos desabafos e por fazerem de um período tão curto os mais felizes de meu 2017.
À UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina e ao PósENQ – Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, pela infraestrutura e auxilio em cada um dos momentos desse curto período de aprendizagem. Assim como, a todo corpo docente por todo о conhecimento transmitido e não apenas acadêmico, mas o conhecimento racional e humano. Obrigada por mostrar-me que o saber sempre será maior quando compartilhado. А palavra mestre, nunca fará justiça аоs professores dedicados аоs quais sem nominar terão o meu eterno agradecimento.
e a realização desse projeto de pesquisa.
À Embrapa, pela infraestrutura concedida para a realização dos experimentos e a confiança em mim depositada. E a todos os colaboradores por me receberem tão bem e sempre estar solícitos as minhas dúvidas e questionamentos.
Nessa caminhada, pode contar com pessoas que dedicaram um pouco do seu precioso tempo para me instruir e fazer desse projeto um estudo capaz de ser realizado. Meus queridos orientadores.
À minha orientadora, Prof. Dr.ª Débora de Oliveira, obrigada pela oportunidade e confiança em aceitar minhas ideias, permitir que esse projeto fosse realizado fora da UFSC e mesmo abrangendo uma área que não era totalmente de seu domínio se mostrou sempre disponível para sanar meus questionamentos e guiar meu caminho.
Ao pesquisador Everton Luis Krabbe, meu coorientador, por acreditar em mim, no meu trabalho, permitir que eu fizesse parte de sua pesquisa e estar sempre disponível para guiar e responder aos meus questionamentos.
Aos analistas Gizelle Bedendo e Diego Surek, por me orientarem em cada passo desse projeto mesmo em meio a tantos outros afazeres sempre disponibilizavam tempo para me ouvir e orientar. Obrigada por cada minuto dedicado no laboratório, por cada discussão de dados, por estarem sempre presentes e solícitos.
Com toda certeza, esse trabalho só foi possível graças ao apoio, conhecimento e dedicação de vocês.
Ao pesquisador Rodrigo Nicoloso, por ceder parte de suas amostras para a realização desse projeto, bem como, pela disponibilidade em auxiliar em todas as dúvidas que surgiram durante a realização do mesmo.
Aos técnicos da Embrapa que participaram da coleta e preparo das amostras de milho, bem como estiveram sempre presente para o deslocamento das amostras de um laboratório para outro, em especial à Levino Bassi, que além de colega por alguns meses se tornou um grande amigo. Aos colaboradores do LAFQ, Gilberto pela atenção e auxílio na moagem das amostras. Lindamar pelo auxílio na preparação do regente de cor. Eva, Teresinha e Vicky, por estarem sempre prestativas e solicitas. Enfim, a todos aqueles que de alguma forma estiveram е estão próximos a mim, fazendo minha vida valer cada vez mais а pena, por entenderem minhas ausências, pelos compromissos aos quais não fui. Pelos aniversários que só pude me fazer presente por mensagem ou
Skype. E acima de tudo, obrigada por distraírem meus dias com muitas risadas e pensamentos positivos.
A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.
RESUMO
O milho é o cereal mais utilizado na nutrição animal contribuindo com 50 a 70% do peso final da ração. O custo despendido com a alimentação animal corresponde à cerca de 70% do custo do produto final. Apesar de ser altamente nutritivo e conter grande potencial energético, apresenta variação na sua composição nutricional, além da presença de fatores antinutricionais que dificultam a utilização de nutrientes. Sendo assim, o presente estudo tem por objetivo avaliar a liberação in vitro de fósforo presente na forma de ácido fítico (AF) em amostras de milho produzido sob diferentes regimes de fertilização e segregados de acordo com a localização dos grãos na espiga, pela ação da enzima fitase. De modo a definir como a fertilização influencia na deposição de fósforo total, fósforo inorgânico e fitato e sua liberação pela ação da fitase ao longo da espiga bem como, nos parâmetros de densidade, proteína e amido. Contudo, pensando na aplicabilidade resultados, foi considerado neste estudo também a relação entre o AF e esses parâmetros. O regime de fertilização aplicado à cultura do milho afeta a deposição de fósforo, seja ele na forma orgânica ou inorgânica assim como no teor de proteína e valor do peso específico dos grãos. Entre as fertilizações estudadas, destaca-se o fertilizante DLS (dejeto líquido de suíno) que apresentou as maiores médias e COMP (compostagem de dejetos de suínos) que apresentou as menores médias para a maioria dos parâmetros. Demostrou-se também que a deposição de nutrientes é maior na região basal do que no topo da espiga para a maioria dos parâmetros e a região apical apresentou os menores valores de fósforo total, fósforo insolúvel e densidade. Contudo, não houve efeito da região na deposição de fitato, assim como na atuação da fitase. Apesar do regime de fertilização e do posicionamento dos grãos ao longo da espiga não influenciarem o teor de amido, esse parâmetro apresentou correlação significativa e negativa com o teor de AF, além de apresentar correlação negativa com a proteína, somados à correlação significativa e positiva do AF com o teor de proteína. Ainda, constatou-se a correlação significativa e positiva entre densidade dos grãos e fósforo fítico. Diante disso, a interação entre as variáveis possibilita a classificação/segregação do milho de acordo com o teor desejado de cada parâmetro, aumentando o aproveitamento dos grãos de milho e tornando essa matéria prima mais sustentável e com maior eficiência nutricional, otimizando a eficiência da fitase na indústria de alimentação animal.
ABSTRACT
The maize is the cereal most used in animal nutrition contributing 50 to 70% of the final weight of the feed. The cost of animal feed corresponds to about 70% of the cost of the final product. Although it is highly nutritive and contains great energetic potential, it presents variation in its nutritional composition, besides the presence of antinutritional factors that hinder the use of nutrients. The aim of the present study was to evaluate the in vitro release of phosphorus present in the form of phytic acid (PA) in samples of maize produced under different fertilization regimes and segregated according to the location of the grains in the ear, by the action of phytase enzyme. In order to define how fertilization influences the deposition of total phosphorus, inorganic phosphorus and phytate and their release by the action of phytase along the spike as well as in the parameters of density, protein and starch. However, considering the applicability results, this study also considered the relationship between PA and these parameters. The fertilization regime applied to the corn crop affects the deposition of phosphorus, be it in organic or inorganic form as well as in the protein content and value of the specific weight of the grains. Among the studied fertilizations, we highlight the DLS fertilizer (liquid pig waste) that presented the highest averages and COMP (composting of swine manure) that presented the lowest averages for most parameters. It was also shown that nutrient deposition is higher in the basal region than in the top of the spike for most of the parameters and the apical region presented the lowest values of total phosphorus, insoluble phosphorus and density. However, there was no effect of the region on phytate deposition, as well as phytase performance. Although the fertilization regime and grain placement along the spike did not influence the starch content, this parameter had a significant negative correlation with the FA content, as well as a negative correlation with the protein, in addition to the significant and positive correlation AF with the protein content. Also, a significant and positive correlation between grain density and phytic phosphorus was observed. In this way, the interaction between the variables allows the classification/segregation of corn according to the desired content of each parameter, increasing the use of maize grains and making this raw material more sustainable and with greater nutritional efficiency, optimizing the phytase efficiency in the animal feed industry.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura anatômica do grão de milho. ... 33
Figura 2 – Tipos de milho e as relativas proporções do endosperma farináceo e vítreo. ... 34
Figura 3 – Quantidades de produção de milho por país (média 1994-2016). ... 36
Figura 4 – Estrutura química do ácido fítico (A) e da fitina (B). ... 39
Figura 5 – Vias bioquímicas de 6-fosfato de glicose para fosfato de mio-inositol (3) [InsP3] e de InsP3 para inositol hexakis-fosfato [Ins(1,2,3,4,5, 6)P6 ou ácido fítico]... 42
Figura 6 – Estruturas gerais de enzimas HAP de (A) A. niger (ID PDB: 1IHP) e (B) E. coli (ID PDB: 1DKN). ... 53
Figura 7 – A estrutura cristalina da enzima BPP de B. subtilis (PDB ID: 3AMS). ... 54
Figura 8 – Estrutura da enzima CP de S. ruminantium. ... 55
Figura 9 – Diagrama conceitual do projeto de pesquisa. ... 61
Figura 10 – Representação geográfica do plantio de milho. ... 64
Figura 11 – Média de fósforo liberado em relação a atividade de fitase. ... 70
Figura 12 – Teor de fósforo total (PTotal), fósforo solúvel (PSol), fósforo liberado pela adição de fitase (PFitase), liberação total de fósforo (PSol+Fit), fósforo insolúvel (PInsol) e fósforo fítico (PFítico) para os cinco fertilizantes fertilizante (BIO, COMP, CTR, DLS e NPK). ... 73
Figura 13 – Percentual de fósforo solúvel (%PSol), fósforo insolúvel (%PInsol), fósforo fítico (%PFítico) e fósforo liberado pela adição de fitase (%PFitase) em relação ao fósforo total para os cinco regimes de fertilização (BIO, COMP, CTR, DLS e NPK). ... 75
Figura 14 – Valor de densidade das amostras para as médias da interação entre fertilizante (NPK, DLS, CTR, COMP e BIO) e região (Apical, Intermediária e Basal). ... 76
Figura 15 – Teor de proteína das amostras para as médias da interação entre fertilizante (NPK, DLS, CTR, COMP e BIO) e região (Apical, Intermediária e Basal). ... 77
Figura 16 – Teor de fósforo total (PTotal), fósforo solúvel (PSol), fósforo liberado pela adição de fitase (PFitase), liberação total de fósforo (PSol+Fit), fósforo insolúvel (PInsol) e fósforo fítico (PFítico) para as três regiões da espiga (Apical, Intermediária e Basal). ... 79 Figura 17 – Percentual de fósforo solúvel (%PSol), fósforo insolúvel (%PInsol), fósforo fítico (%PFítico) e fósforo liberado pela adição de
Figura 18 – Interação entre fertilização e região da espiga para o teor de fósforo total (PTotal), fósforo solúvel (PSol), fósforo fítico (PFítico), fósforo liberado pela adição de fitase (PFitase) e liberação total de fósforo (PSol+Fit). ... 82 Figura 19 – Percentual de fósforo solúvel (%PSol), fósforo insolúvel (%PInsol), fósforo fítico (%PFítico) e fósforo liberado pela adição de fitase (%PFitase) em relação ao fósforo total para a interação entre fertilizante (BIO, COMP, CTR, DLS e NPK) e região (Apical, Intermediária e Basal). ... 83 Figura 20 – Teor de amido das amostras para as médias da interação entre fertilizante (BIO, COMP, CTR, DLS e NPK) e região (Apical, Intermediária e Basal). ... 84
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Composição química média do grão maduro de milho e de seus componentes. ... 34 Tabela 2 – Produtos derivados do milho ou que contêm seus componentes isolados ou transformados industrialmente. ... 37 Tabela 3 – Características físico-químicas e cinéticas das fitases de diferentes fontes. ... 49 Tabela 4 – Correlação teores de amido, densidade, proteína, PFitase, PFítico, PInsol, PSol, PSol+Fit e PTotal nas amostras estudadas. ... 85 Tabela 5 – Diluições da curva de calibração. ... 111 Tabela 6 – Conteúdo de fósforo total (PTotal), fósforo solúvel (PSol), liberação enzimática de fósforo (PFitase), fósforo insolúvel (PInsol) e total de fósforo liberado (PSol+Fit) de grãos de milho produzidos sob cinco condições de fertilização e três regiões da espiga de milho (média ± erro padrão da média). ... 113 Tabela 7 – Porcentual de fósforo solúvel (%PSol), fósforo liberado pela fitase (%Fitase), total de fósforo liberado (%Sol+Fit), fósforo fítico (%PFítico) de grãos de milho produzidos sob cinco regime de fertilização e três regiões da espiga de milho. Dados relativos ao teor de fósforo total (média ± erro padrão da média). ... 115 Tabela 8 – Comparação entre as médias para o conteúdo de fósforo fítico (PFítico), Proteína, Amido e Densidade de grãos de milho produzidos sob cinco regimes de fertilização e três regiões da espiga de milho (média ± erro padrão da média). ... 116 Tabela 9 – Características dos fertilizantes usados nos tratamentos para cultura de milho da safra de 2017/2018. ... 119
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABIMILHO – Associação Brasileira das Indústrias do Milho AF – Ácido Fítico
AP – Região apical
ATCC – American Type Culture Collection. ATP – Adenosina Trifosfato
ANOVA – Análise de Variância BA – Região basal
BIO – Chorume de biodigestor
COMP – Compostagem de dejeto de suíno CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CNPSA – Centro Nacional de Pesquisa em Suínos e Aves CRT – Grupo controle (sem fertilização)
DLS – Chorume digerido
DNA – Ácido desoxirribonucleico EC – Enzyme Commission Numbers EDTA –Ethylenediamine tetraacetic acid
EGTA – Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
FANs – Fatores Antinutricionais.
FAOSTAT – Food and Agriculture Organization of the United Nations – Statistic
FTIR – Espectroscopia no infravermelho médio com transformada de Fourier
FTU/FYU/U/PU – Atividade Enzimática da Fitase ICP – Plasma por Acoplamento Indutivo
IN – Região intermediária Ins – Inositol
IP1 ou InsP1 – inositol fosfato
IP2 ou InsP2 – inositol bifosfato
IP3 ou InsP3 – inositol trifosfato
IP4 ou InsP4 – inositol tetrafosfato
IP5 ou InsP5 – inositol pentafosfato
IP6 ou InsP6- inositol hexafosfato
IUPAC – União Internacional de Química Pura e Aplicada (Tradução do inglês International Union of Pure and Applied Chemistry
K –Potássio
LABINA – Laboratório de Biotecnologia e Nanotecnologia LAFQ – Laboratório de Análises Físico-Químcias
Bioquímica e Biologia Molecular (tradução do inglês Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)
NIR – Espectroscopia de infravermelho na região do próximo NPK – Ureia (fertilizante químico à base de NPK)
P – Fósforo
PC – Preparo convensional PD – Plantio Direto
PFitase – teor de fósforo liberado pela adição de fitase PFítico – teor de fósforo fítico
pH – Potencial hidrogeniônico PH – Peso Hectolítrico
PInsol – teor de fósforo insolúvel PSol – teor de fósforo insolúvel
PSol+Fit – teor total de fósforo liberado PTFE – Politetrafluoretileno
PTotal – teor de fósforo total
%PFitase – percentual de fósforo liberado pela adição de fitase %PFítico – percentual de fósforo fítico
%PInsol – percentual de fósforo insolúvel %PSol – percentual de fósforo solúvel
%PSol+Fit – percentual total de fósforo liberado RMN – Ressonância Magnética Nuclear
RNA – Ácido ribonucleico
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 27 1.1 OBJETIVOS... 29 1.1.1 Objetivo Geral...29 1.1.2 Objetivos Específicos... 29 1.2 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO...29 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 31 2.1 A CULTURA DO MILHO... 31 2.1.1 Classificação do Milho...32 2.1.2 Características Químicas e Físicas do Grão de Milho...32 2.1.3 Produção e Aplicações...35
2.2 ÁCIDO FÍTICO... 38 2.2.1 Nomenclatura do Ácido Fítico... 39 2.2.2 Características Físico-Químicas e Biossíntese do Ácido
Fítico... 39 2.2.3 Deposição de Ácido Fítico nas Sementes... 43 2.2.4 Funcionalidade e Problemática do Ácido Fítico... 44 2.2.5 Melhoramento Genético e Uso de Fitase... 45
2.3 FITASE... 46 2.3.1 Características Físico-Químicas... 47 2.3.2 Mecanismo de Ação e Parâmetros Cinéticos... 47 2.3.3 Classificação... 51
2.3.3.1 Classificação pela posição de hidrólise... 52 2.3.3.2 Classificação pelo mecanismo catalítico... 53 2.3.3.3 Classificação pelo pH ótimo... 55
2.3.4 Fontes de Fitase...55
2.3.4.1 Fitases de origem vegetal... 55 2.3.4.2 Fitases de origem microbiana... 56 2.3.4.3 Fitases da mucosa e microflora intestinal... 57
2.3.5 Aplicações da Fitase...57 2.3.6 Avanços Tecnológicos...58
2.4 ESTADO DA ARTE...60 3 METODOLOGIA...63
3.1 AMOSTRAS... 63
3.2 AMOSTRAGEM E PREPARO DA AMOSTRA... 65
3.3.3 Liberação In Vitro de Fósforo Fítico...66 3.3.4 Análise de Fósforo Inorgânico...67 3.3.5 Determinação de Fósforo Total... 67 3.3.6 Determinação da Densidade do Grão de Milho... 67 3.3.7 Determinação do pH...67 3.3.8 Análise por NIR... 68
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 68 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...69
4.1 TESTE DE ATIVIDADE DA FITASE... 70
4.2 FERTILIZAÇÃO... 70
4.3 REGIÃO DA ESPIGA...77
4.4 INTERAÇÃO FERTILIZAÇÃO X REGIÃO DA ESPIGA... 80
4.5 CORRELAÇÃO DOS DADOS...84 5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS
FUTUROS... 91
5.1 CONCLUSÕES... 91
5.2 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS... 92 REFERÊNCIAS………...95 APÊNDICE A – Preparo de Soluções e Lavagens dos
Materiais... 109 APÊNDICE B – Diluições da Curva de Calibração... 111 APÊNDICE C – Tabelas de Análise de Variância...113 ANEXO A – Características dos Fertilizantes... 119
1 INTRODUÇÃO
O milho é o quinto cereal mais produzido no mundo estando o Brasil na terceira posição dos países de maior produção deste grão (FAOESTAT, 2018). A maior parcela do milho utilizado no país e destinado para a produção animal, sendo que a avicultura e a suinocultura requerem as maiores demandas do cereal (ABIMILHO, 2018). O milho é a base das rações animais, variando de 50 a 70 % do peso final da ração e, corresponde à 70% do custo do seu custo final. Apesar de ser altamente nutritivo e apresentar grande potencial energético, apresenta grande variação na sua composição nutricional e dos teores energéticos (REGINA, 2010). Além é claro, de conter componentes chamados de fatores antinutricionais (FANs), que dificultam a utilização de nutrientes como proteínas, vitaminas e minerais. Os FANs ocorrem naturalmente em vegetais e seus principais exemplos são fitatos, compostos fenólicos (taninos), lecitina, inibidores de enzimas (tripsina e amilase), saponinas e oxalato (NIKMARAM et al., 2017).
O ácido fítico (1,2,3,4,5,6-hexa-di-hidrogenofosfato de mio-inositol) por muitos anos, foi considerado apenas uma forma de armazenamento vegetal de fósforo e outros minerais (RABOY, 2009) até que suas propriedades fizeram-no aparecer em diversos relatos como um vilão capaz de diminuir a biodisponibilidade de fósforo e minerais (BRINCH-PEDERSEN; SORENSEN & HOLM, 2002; COMINELLI et al., 2018; RABOY, 2001) além de ser precursor do aumento da excreção desses na água e no solo o que aumenta consideravelmente a poluição ambiental pelo excesso de fósforo e danos à saúde animal e humana pela deficiência nutricional desse mineral nos organismos (BENEVIDES et al., 2011; COWIESON et al., 2016; JAIN & SINGH, 2016). Os inúmeros avanços biotecnológicos permitiram utilizar o fitato como uma fonte abundante de fósforo, seja para animais de criação (porcos, aves e peixes) como na indústria alimentícia (BALABAN et al., 2017).
O seu efeito antinutricional motivou o isolamento de uma subclasse de fosfatases capaz de desfosforilar gradualmente o ácido fítico liberando fósforo inorgânico e os intermediários do fosfato de mio-inositol (BALWANI; CHAKRAVARTY & GAUR, 2017). As primeiras fitases foram isoladas do farelo de arroz (SUZUKI; YOSHIMURA & TAKAISHI, 1907) e hoje, muitas outras fitases já foram isoladas e aplicadas na nutrição humana (KUMAR et al., 2010) e animal (COWIESON et al., 2016). Trazendo, assim, benefícios econômicos pela redução dos custos de formulação e produção de ração e alimentos com
maior valor nutricional e diminuindo a poluição ambiental (JAIN & SINGH, 2016; SINGHA & SATYANARAYANA, 2011).
O efeito da fertilização sobre o aumento da produção de cereais já é conhecido na literatura. Diferentes combinações de fertilizantes químicos e fertilizantes orgânicos vêm sendo utilizado como alternativa sustentável para aumentar a deposição de nutrientes, a qualidade e a produção desses cereais além de diminuir o uso recursos naturais e preservar a qualidade de solos e mananciais (ASADU et al., 2018; WANG et al., 2017). A forma de fertilização sobre a deposição de AF já foi explorada para cereais como soja (RABOY & DICKINSON, 1993), trigo (LIU et al., 2006), cevada (DAI et al., 2007) e arroz (NING et al., 2009) demostrando que a dosagem de fertilizantes pode aumentar ou diminuir a deposição do fitato nas plantas.
Estudos demostraram que deposição de nutrientes não é homogênea ao decorrer das espiguetas de trigo (LIU et al., 2006) e da panícula de arroz (LIU et al., 2005). Porém, para milho, ainda há poucas evidências na literatura sobre a influência da região sobre a deposição de N, P e AF. O efeito da interação entre fertilização e região da espiga foi explorada por Shen, Huang e Li (2017), onde três variedades de híbridos de milho foram cultivadas em diferentes níveis de fertilizantes nitrogenados. No entanto, somente o efeito sobre a região apical foi determinada e reagiu de maneira diferente para cada dosagem de N para número de grãos, peso de grãos e rendimento de grãos. Demonstrando que a fertilização pode influenciar em certos parâmetros para as diferentes regiões da espiga de milho dependendo de sua variedade genética a da dosagem de N administrada.
Sendo assim, o presente estudo tem por objetivo avaliar a liberação in vitro de fósforo presente na forma de ácido fítico em amostras de milho pela ação da enzima fitase para duas variáveis, fertilização e posição dos grãos na espiga. As amostras foram cultivadas sob cinco fertilizações onde diferentes fontes de N orgânico e mineral foram testadas: ureia (fertilizante químico à base de NPK), chorume de biodigestor (BIO), chorume digerido (DLS), Compostagem de dejeto de suíno (COMP), além de um tratamento controle (CTR) sem adubação. Somados ao efeito da influência da posição dos grãos em três regiões da espiga, 1/3 da porção superior, 1/3 da porção intermediária e 1/3 da porção basal. De modo a definir como a fertilização influencia na deposição de fósforo total, fósforo inorgânico e fitato e sua liberação pela ação da fitase ao longo da espiga bem como, nos parâmetros de densidade, proteína e amido. Além de determinar a relação entre o AF e esses parâmetros.
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo Geral
Avaliar a liberação in vitro de fósforo fítico em amostras de milho cultivados empregando cinco fontes de fertilização (BIO, CTR, COMP, DLS e NPK) e divididas de acordo com sua localização na espiga (apical, intermediária e basal) pela ação da enzima fitase.
1.1.2 Objetivos Específicos
quantificar e avaliar teor de fósforo total;
quantificar e avaliar a ação da enzima fitase;
quantificar e avaliar o teor de fósforo fítico, proteína e amido, por espectrometria de infravermelho na região do próximo (NIR);
quantificar e avaliar o valor de densidade;
estudar a relação entre fósforo fítico e o teor de proteína, amido, densidade e fósforo liberado pela ação da enzima fitase.
1.2 ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
Com o intuito de melhorar a compreensão do leitor sobre o conteúdo desta dissertação, a sua estrutura é apresentada a seguir.
No capítulo dois foi realizado um levantamento bibliográfico dividido em três seções: A cultura do milho, Ácido fítico e Fitase.
Na primeira seção, foi discutido sobre as características físico-químicas do grão de milho, seu uso e aplicações, bem como, sua situação comercial e econômica no Brasil e no mundo.
Na segunda seção, foi apresentado um dos maiores problemas encontrados no uso do milho na alimentação humana e animal, a presença do ácido fítico como fator antinutricional. Nessa seção também foram descritas suas características e funcionalidades bem como, a problemática envolvida com seus diversos usos. Assim como, formas de diminuir o seu efeito antinutricional e promover seu uso de maneira ambientalmente correta e explorando ao máximo suas funcionalidades.
Na última seção, foi apresentado uma das formas mais clássicas de combater o efeito antinutricional do ácido fítico, o uso da fitase. Também é apresentado suas características físico-químicas e cinéticas, seu mecanismo de ação sobre o ácido fítico bem como, suas fontes e principais aplicações.
No terceiro capítulo foram descritos os materiais empregados e as metodologias analíticas aplicadas ao processo de liberação in vitro de fósforo fítico através do uso da fitase. Encontram-se descritas as metodologias para determinação da concentração de fósforo total e fítico, proteína, densidade e amido. Os ensaios foram analisados estatisticamente através do software STATISTIX ® 10.0, conforme exposto, ainda neste capítulo.
No capítulo seguinte, os resultados obtidos para a liberação enzimática de fósforo fítico bem como os dados obtidos para fósforo total e fítico, proteína, densidade e amido foram descritos e discutidos cuidadosamente. Além disso, foram apresentadas as comparações entre as médias e as correlações obtidas entre as variáveis estudadas.
Com isso, no capítulo cinco são apresentadas as conclusões obtidas nesse trabalho e as sugestões para o desenvolvimento de trabalhos complementares.
Finalmente, nos Apêndices foram disponibilizados o preparo das soluções usadas nesse trabalho e a diluição da curva de calibração da solução padrão de fósforo além, das tabelas de análise de variância para todas as variáveis discutidas. E nos Anexos foram apresentadas as características dos fertilizantes usados nos tratamentos durante a safra de 2017/2018 com os quais foram cultivadas as amostras de milho utilizadas nesse estudo.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Neste capítulo foi apresentado o levantamento bibliográfico feito para a contextualização de aspectos relevantes a este estudo. Para facilitar a compreensão, o presente capítulo é dividido em três seções: a cultura do milho, ácido fítico e fitase. Sendo assim, incialmente discorre-se sobre evolução da cultura e sua ampla adaptabilidade a diferentes ambientes, suas características físico-químicas do grão de milho, seu uso e aplicações, bem como, sua situação comercial e econômica no Brasil e no mundo. Posteriormente é apresentado a problemática envolvida na utilização do milho, a presença de FANs como o fitato que diminuem a biodisponibilidade de minerais e proteínas além de aumentar consideravelmente a poluição ambiental. É descrito, ainda suas características e funcionalidades bem como, a problemática envolvida com seus diversos usos. Assim como, formas de diminuir o seu efeito antinutricional. Já na última seção, é apresentado o uso da fitase como forma de degradar o ácido fítico e biodisponibilizar o fósforo fítico para os organismos. Também foi apresentado suas características físico-químicas e cinéticas, seu mecanismo de ação sobre o ácido fítico, bem como, sua classificação, principais fontes de produção de fitase e os avanços tecnológicos para aumentar a eficiência dessa enzima.
2.1 A CULTURA DO MILHO
A cultura do milho é uma cultura do chamado “Novo Mundo” e uma das mais recentes da história da humanidade. Datada entre sete e dez mil anos atrás, a origem e desenvolvimento da cultura do milho deu-se no centro do sul do México e da América Central e foi cultivada primeiramente pelas civilizações incas, maias e astecas. Após a colonização da América, o milho foi difundido na Espanha e em toda a Europa por Colombo e é hoje, uma cultura produzida no mundo todo (BÜLL & CANTARELLA, 1993; OECD, 2003).
A grande adaptabilidade do milho ao clima, permite que seja cultivado do Equador até os limites das áreas de clima temperado, que compreende as latitudes entre 58° N até 40° S, desde o nível do mar até altitudes superiores aos 3600 metros. Dependente de volumes pluviométricos bem distribuídos durante o plantio, é melhor adaptada à climas temperados, porém é passível de cultura em climas tropicais e subtropicais (BÜLL & CANTARELLA, 1993; CRUZ et al., 2008; OECD, 2003).
2.1.1 Classificação do Milho
As civilizações da América Central, deixaram como legado mais de 300 espécies de milho o que torna esse cereal a espécie de maior diversidade genética existente na natureza. Apesar de sua grande variabilidade genética e seus múltiplos usos, sua origem ainda não é bem definida (BÜLL & CANTARELLA, 1993; DEVOS et al., 2018). A evolução genética do milho é oriunda da seleção humana do teosinto Zea mays, subespécie parviglumis. O aumento da produção, emparelhamento das espiguetas, redução do número de espigas, presença de palhas, evolução para a ráquis rígida, hábito anual e aumento no tamanho de grãos são o resultado da seleção de fenótipos mais confiáveis e produtivos herdados dos povos primitivos (BORÉM; GALVÃO & PIMENTEL, 2015).
Em sua classificação botânica, o milho é representado como uma espécie diplóide, alógama, anemófila e protântrica, pertencente à ordem Gramineae, família Poacea, sendo o gênero Zea e a espécie Zea mays L. o principal táxon domesticado (BÜLL & CANTARELLA, 1993; DEVOS et al., 2018).
O gênero Zea é atualmente classificado em nove taxa dentro de seis espécies em duas seções: Zea e Luxuriantes. Na seção Zea, há apenas uma espécie, Zea mays que inclui quatro subespécies: mays, mexicana, parviglumis e huehuetenangensis. Já a seção Luxuriantes incluí quatro espécies identificadas: diploperennis, luxurians, nicaraguenses e perennis. Há também, o gênero Tripsacum, que incluí 16 espécies diferentes: andersonii, australe, bravum, cundinamarce, dactyloides, floridanum, intermedium, manisuroides, latifolium, pereuvianum, zopilotense, jalapense, lanceolatum, laxum, maizar e pilosum (OECD, 2003).
2.1.2 Características Químicas e Físicas do Grão de Milho
Os grãos de milho podem apresentar coloração que variam do amarelo ao laranja, no entanto existem espécies que variam sua coloração do vermelho ao preto (BORÉM; GALVÃO & PIMENTEL, 2015). Apresentam peso entre 250 a 300 mg e sua composição, em base de matéria seca, é constituída por amido (72%), proteínas (9,5%), fibra (9%) e óleo (4%). O grão de milho, anatomicamente, é dividido em quatro estruturas físicas: endosperma, gérmen, pericarpo (casca) e ponta (GEHRING et al., 2013; PAES, 2006). A Figura 1, representa a estrutura anatômica do grão de milho.
Figura 1 – Estrutura anatômica do grão de milho.
Fonte: Adaptado de ENCYCLOPEDIA BRITANNICA (2018).
O Endosperma representa 83% em peso do grão e é basicamente formado de amido (88%) e de proteínas de reserva (8%). E também estão presentes os caroteinóides que conferem a coloração aos grãos (zeaxantrinas, luteínas, beta-criptoxantina, alfa e betacaroteno). O gérmen representa 10% da estrutura do grão e nele podem ser encontrados 83% dos lipídeos (óleos e vitamina E), minerais (78%), proteínas (26%) e açúcares (70%). O pericarpo é a estrutura que protege o grão da umidade exterior bem como, dos insetos e microrganismos que possam deteriorar sua estrutura interior e representa em média, 5% do peso total do grão. É formado basicamente por polissacarídeos do tipo hemicelulose (67%) e celulose (23%) e uma pequena parcela de lignina (0,1%). Já a ponta, responsável por manter o grão unido ao sabugo, é a única parcela não envolvida pelo pericarpo. É composta unicamente por material lignocelulósico. E representa 2% da estrutura do grão (GEHRING et al., 2013; PAES, 2006). A composição química do grão de milho inteiro e de cada uma das quatro porções está resumida na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição química média do grão maduro de milho e de seus componentes. Fração Grão (%) Amido (%) Proteína (%) Lipídeos (%) Açúcares (%) Cinza (%) Grão Inteiro 100,0 73,5 9,0 4,3 1,9 1,5 Endosperma 82,6 87,6 7,9 0,83 0,62 0,33 Embrião 11,1 8,0 18,3 33,5 10,5 10,6 Pericarpo 5,4 7,2 3,6 1,03 0,36 0,85 Ponta 0,8 5,3 9,1 3,8 1,61 1,59
Fonte: BORÉM; GALVÃO & PIMENTEL (2015).
As características estruturais do grão de milho, tamanho e forma, são definidas pela estrutura do endosperma e pelo tamanho do gérmen. De acordo com essas características, o grão pode ser agrupado em cinco classes ou tipos: dentado, duro, farináceo, pipoca e doce (PAES, 2006). A Figura 2, mostra cada uma das cinco classes que o grão de milho pode apresentar.
Figura 2 – Tipos de milho e as relativas proporções do endosperma farináceo e vítreo.
Fonte: PAES (2006).
A classificação do milho quanto a sua textura é realizada com os grãos secos e ainda aderidos ao sabugo. Isso porque, durante a secagem, ocorre o encolhimento do endosperma farináceo o que modifica a estrutura do grão. Em uma espiga é possível que haja mais do que um tipo de grão, de modo que a classificação é dada pelo tipo de grão predominante (PAES, 2006).
A diferenciação entre os tipos de grãos está na quantidade de endosperma farináceo e vítreo presente bem como, com a continuidade da matriz proteica, como a quantidade e tamanho dos corpos proteicos e
grânulos de amido (BORÉM; GALVÃO & PIMENTEL, 2015). O milho duro possui um volume contínuo de endosperma vítreo o que gera grãos lisos, arredondados e de aparência dura e vítrea (PAES, 2006).
O grão dentado apresenta o endosperma farináceo na região central do grão (entre a ponta e o extremo superior) e as laterais e a parte inferior do grão são revestidas pelo endosperma vítreo. A nomenclatura “dentado” é dada pela formação de uma indentação na parte superior do grão oriunda do encolhimento do endosperma farináceo. Esse processo ocorre durante a secagem do grão. Os grãos do tipo farináceo apresentam todo o endosperma na forma farinácea, possui a endentação do tipo dentado e aparência opaca. Já o milho tipo pipoca possui o pericarpo mais espesso e endosperma na forma vítrea. No entanto, os grãos são menores e arredondados. E, o milho tipo doce, quando seco, tem a aparência enrugada (PAES, 2006).
2.1.3 Produção e Aplicações
O milho é o quinto produto mais produzido no mundo estando o Brasil na terceira posição dos países de maior produção deste grão, perdendo apenas para Estados Unidos e China. A Figura 3 demostra a produção de milho em todos os países do mundo (FAOESTAT, 2018). A produção de milho da safra 2017/18 fechou em 80 milhões de toneladas métricas (MMT), uma queda de cerca de 16% em relação à safra 2016/17, fato que não ocorria em nove anos. Já a produção de 2018/19 está prevista para 90 MMT (CONAB, 2018; HAMILTON, CLAY & GELLER, 2018).
Figura 3 – Quantidades de produção de milho por país (média 1994-2016).
Fonte: (FAOESTAT, 2018).
O Brasil exporta grande parte de sua produção para Irã, Egito e Japão e importa milho principalmente da Argentina e do Paraguai (HAMILTON, CLAY & GELLER, 2018). Os maiores produtores de milho encontram-se na região centro-oeste, sul e sudeste respectivamente. Sendo que para a safra de 2017/18 o país apresentou uma área plantada de mais de 16 milhões de hectares (CONAB, 2018).
De acordo com a AbiMilho, da safra 2017/18 foi destinada mais de 50 mil toneladas de milho para a produção animal e menos de duas mil toneladas para consumo humano. Sendo que a avicultura tanto para aves de corte (25 mil toneladas) quanto postura (4,5 mil toneladas) bem como, a suinocultura (13 mil toneladas) apresentam as maiores demandas deste grão (ABIMILHO, 2018).
A utilização do milho in natura quando os grãos ainda estão verdes e leitosos, ou mesmo para a fabricação de amido ou farinha de milho para alimento humano e para animais na forma de ração, já não são os únicos usos dados ao grão. Hoje o uso dessa matéria-prima vai muito além e já pode ser considerado um produto alto valor agregado. Na Tabela 2 estão descritos alguns dos derivados do milho.
Tabela 2 – Produtos derivados do milho ou que contêm seus componentes isolados ou transformados industrialmente.
Destinação Forma/Produto Final
Uso Animal Direto silagem, grãos (inteiro/desintegrado) para aves, suínos e bovinos
Uso Humano Direto espiga assada ou cozida, curau, pipoca, pães, bolos. broas, cuscuz, polenta, angus, sopas, farofa
Indústria de Ração fabricação de ração para uso animal (aves, suínos, bovinos)
Indústria de
Alimento
amidos, fubá, farinhas comuns, pré-cozidas, flocadas, canjicas, óleo, creme, pipocas, glicose, dextrose, sêmola, semolina, farelo de gérmen, iogurtes, queijo, requeijão cremoso, maionese, ketchup, mostarda preparada, cereais matinais, margarinas, cafés e chás instantâneos, vegetais enlatados, whisky, salgadinhos tipo chips, tortilhas e outros, óleos comestíveis
Xarope de glucose balas duras e mastigáveis, gomas de mascar, doce em pasta, salsicha, salame, mortadelas, hambúrguer, frutas cristalizadas, compotas, xaropes, sorvetes, polimento de arroz, cerveja, frutose
Corante Caramelo refrigerantes, cervejas, bebidas alcoólicas, molhos Maltodextrinas aromas e essências, sopas desidratadas, pó para
sorvete, complexos vitamínicos, produtos achocolatados
Amidos alimentícios biscoitos, pães, melhoradores de farinha, pó para pudim, fermento em pó, macarrão, produtos farmacêuticos, balas de goma
Amidos industriais fabricação de papel e papelão, adesivos, fitas domadas, briquetes de carvão, engomagens de tecidos, beneficiamento de minérios
Pré-Gelatinizados fundição de peças de metal
Dextrinas adesivos, tubos e tubetes, barricas de fibra, lixas, abrasivos, sacos de papel, multifoliados, estampagem de tecidos, cartonagem, beneficiamento de minérios
Adesivos rotulagem de garrafas e latas, sacos, tubos e tubetes, fechamento de caixas de papelão, colagem de papel, madeira e tecidos, mucilagens, goma
Medicamentos antibióticos (penicilina), aspirina
Automóveis volante, estofamento, cabeça do cilindro, pneus, acabamento de borrachas sintéticas, bateria
Defensivos Agrícolas
Indústria de Cosméticos
creme dental, creme de barbear, fraldas descartáveis Indústria acetato de cálcio e magnésio, giz para quadro negro, lápis de cor e de cera, asbestos para materiais de condicionamento térmico, plásticos degradáveis, tintas para impressão, pigmentos, álcool (etílico, butílico), alumínio, escurecedor de couro, plásticos degradáveis, explosivos e fogos de artifício, copos e pratos de papel, filmes fotográficos, combustível (etanol), couro acabado, fibra de vidro
Fonte: Adaptado de GARCIA e colaboradores (2006) e PAES (2006).
No entanto, a maior parcela de utilização do milho é para a formulação de dietas para suínos e aves (ABIMILHO, 2018) e corresponde a 70% do custo final da ração. E apesar de ser altamente nutritivo e apresentar grande potencial energético, ele apresenta grande variação na sua composição nutricional e variação dos teores energéticos (REGINA, 2010). Além é claro, de conter componentes que dificultam a utilização de nutrientes como proteínas, vitaminas e minerais, compostos esses chamados de fatores antinutricionais. Os FANs ocorrem naturalmente em vegetais e seus principais exemplos são fitatos, compostos fenólicos (taninos), lecitina, inibidores de enzimas (tripsina e amilase), saponinas e oxalato. No entanto os efeitos dos FANs podem ser amenizados por diferentes métodos de processamento do alimento como aquecimento, utilização de enzimas, irradiação de ultrassom ou micro-ondas, descascamento, moagem e alta pressão (NIKMARAM et al., 2017).
2.2 ÁCIDO FÍTICO
Em 1850, Scherer isolou a molécula de mio-inositol a partir de extrato muscular e despertou o interesse no composto quanto a sua ocorrência natural, suas propriedades químicas e estruturais, seus inúmeros derivados e estereoisômeros (LOEWUS & MURTHY, 2000). Por muitos anos, foi considerado apenas uma forma de armazenamento vegetal de fósforo e outros minerais (RABOY, 2009) até que suas propriedades fizeram-no aparecer em diversos relatos como um vilão capaz de diminuir a biodisponibilidade de fósforo e minerais (BRINCH-PEDERSEN; SORENSEN & HOLM, 2002; COMINELLI et al., 2018; RABOY, 2001) além de ser precursor do aumento da excreção desses minerais na água e no solo o que aumenta consideravelmente a poluição ambiental e danos à saúde animal e humana (BENEVIDES et al., 2011;
COWIESON et al., 2016; JAIN & SINGH, 2016), o que o caracterizou como um fator antinutricional (NIKMARAM et al., 2017). Porém em pesquisas mais recentes, o composto aparece com propriedades aquém das já conhecidas como atividade antioxidante (FOX & EBERL, 2002) e anticancerígena (GRAF & EATON, 1990).
2.2.1 Nomenclatura do Ácido Fítico
O ácido fítico (1,2,3,4,5,6-hexa-di-hidrogenofosfato de mio-inositol ou InsP6) é formado por um anel mio-inositol ligado à seis grupos
ortofosfatos (RABOY, 2009). As nomenclaturas dadas ao ácido fítico não são claras na literatura (LOEWUS & MURTHY, 2000) e se confundem entre si. Em geral, o ácido fítico é o termo dado ao ácido livre totalmente protonado (Figura 4A). E quando na forma de sais mistos associados à minerais como Mg2+, K+, Ca2+, Fe2+ e Zn2+, são comumente chamados de
fitato ou fitina (Figura 4B) (COWIESON et al., 2016).
Figura 4 – Estrutura química do ácido fítico (A) e da fitina (B).
Fonte: Adaptado de BALABAN e colaboradores (2017).
2.2.2 Características Físico-Químicas e Biossíntese do Ácido Fítico
O ácido fítico é um composto aromático formado pelo inositol ligado ao átomo de fósforo. Quanto à sua classificação química, o inositol é um açúcar homocíclico onde os fosfatos estão ligados ao anel por ligações de éster. Ao anel podem estar ligados de 1 a 6 átomos de fósforo dando origem ao inositol fosfato (IP1 ou InsP1), inositol bifosfato (IP2 ou
InsP4), inositol pentafosfato (IP5 ou InsP5) e inositol hexafosfato (IP6 ou
InsP6), respectivamente (CARDOSO; TSAI & NEVES, 1992). Os grupos
fosfatos estão ligados ao anel com alinhamento equatorial nas posições 1, 3, 4, 5 e 6 e alinhamento axial na posição 2 (RABOY, 2009).
O hexafosfato é isômero predominante na natureza, seguido pelo pentafosfato e os demais compostos aparecem em pequenas quantidades (CARDOSO; TSAI & NEVES, 1992). Cada composto de inositol pode apresentar diversas formas isoméricas somando um total de 63 isômeros, no entanto, apenas uma pequena fração desses já foram identificados (KONIETZNY & GREINER, 2003). Na busca pela identificação de novos isômeros bem como, na sua separação e classificação muitas técnicas analíticas estão sendo estudadas, porém essa ainda não é tarefa fácil e completamente elucidada (CHEN & LI, 2003; QU et al., 2018; TALAMOND et al., 2000).
Na sua forma livre, o ácido fítico é um líquido xaroposo que apresenta coloração variando do amarelo claro à castanho claro. É solúvel em solventes polares como água, álcoois, acetona, tetrahidrofurano e insolúvel em solventes não polares como benzeno, tolueno, hexano e clorofórmio. Quando na forma de sal, o ácido fítico torna-se um composto muito estável. Os grupos fosfato do anel de mio-inositol podem ser removidos por hidrolise enzimática, ácida ou por ação da temperatura (KONIETZNY & GREINER, 2003).
A rota bioquímica para síntese do ácido fítico ocorre pela fosforilação gradual do anel de mio-inositol, descrita em 1887 por Maquenne e aprimorada em 1945 por Fisher. Porém, só pode ser
verdadeiramente elucidada em 1962 (BRINCH-PEDERSEN;
SORENSEN & HOLM, 2002; LOEWUS & MURTHY, 2000). A biossíntese do InsP6 já foi detalhada por diversos pesquisadores como
Loewus e Murthy (2000), Brinch-Pedersen, Sorensen e Holm (2002), Raboy (2009) e Potter (1990).
A síntese do mio-inositol inicia-se com a conversão da d-glicose-6-P em um inositol monofosfato específico, o Ins-3P, onde no anel mio-inositol há apenas um fosfato de éster, localizado no carbono 3. A reação de síntese é catalisada pela enzima mio-inositol-3-P 1 sintase (MIPS) (RABOY, 2009). Posteriormente ocorre a perda do grupo fosfato pela ação da inositol monofosfatase, que libera mio-inositol e fósforo inorgânico. Essa é primeira etapa da síntese e é o único caminho da biossíntese em cianobactérias, algas, fungos, plantas e animais (LOEWUS & MURTHY, 2000).
Duas vias independente foram propostas para as etapas subsequentes da formação do InsP6, uma via dependente de lipídios e uma
via independente de lipídios. A duas vias diferem apenas nos intermediários que levam do inositol ao inositol trifosfato (MATSUNO & FUJIMURA, 2014). A via lipídica é a principal forma de sintetização de ácido fítico em células eucarióticas e tecidos vegetativos já para sementes, a via independe de lipídios se mostrou mais representativa (RABOY, 2009).
Na via dependente de lipídios (Figura 5, superior direita) InsP é primeiro transformado em fosfatidilinositol (PtdIns) e posteriormente é fosforilado para produzir PtdIns-4,5-P2. Pela ação de uma fosfolipase
específica ocorre a fosforilação do Ins-1,4,5-P3 que é fosforilado
novamente e produz ácido fítico. A produção do ácido fítico é dada pela ação de três diferentes inositol polifosfato quinases específicas para cada posição da ligação no anel, Ins: 5/6-cinases, 3/6-cinases e Ins polifosfato 2-quinases. Para a síntese do ácido fítico em milho, a 5/6-quinase é utilizada. Já na segunda via, independente de lipídios (Figura 5, em cima à esquerda), o inositol livre é sequencialmente fosforilado em ácido fítico através da formação de uma série de fosfatos de inositol insolúveis. Uma das possíveis formas para essa sequência de fosforilação procede da seguinte forma: Ins → Ins (3)P1 → Ins (3,4)P2 → Ins(3,4,6)P3 →
Ins(1,3,4,6)P4 → Ins(1,3,4,5,6)P5 → Ins(1,2,3,4,5,6)P6. Os intermediários
gerados para a formação do ácido fítico dependem da quinase que os hidrolisa e esses, ainda não são bem definidos na literatura (RABOY, 2009).
Figura 5 – Vias bioquímicas de 6-fosfato de glicose para fosfato de mio-inositol (3) [InsP3] e de InsP3 para inositol hexakis-fosfato [Ins(1,2,3,4,5, 6)P6 ou ácido
fítico].
2.2.3 Deposição de Ácido Fítico nas Sementes
O fósforo é um macronutriente essencial para o desenvolvimento vegetal e animal (BRINCH-PEDERSEN; SORENSEN & HOLM, 2002). Ele participa como parte dos compostos estruturais e de diversos processos bioquímicos importantes para as plantas, sendo o principal processo o da fotossíntese. Onde a luz solar é convertida em energia livre para as plantas na forma da molécula de ATP (adenosina trifosfato), na qual o fósforo está presente. O fósforo é uma peça importante também no núcleo das células onde faz parte tanto do DNA, como do RNA além de ser um dos compostos de ligação dessas duas estruturas (COMINELLI et al., 2018).
As plantas costumam acumular mais fósforo do que realmente utilizam como forma de reserva. No entanto, a quantidade de fósforo inorgânico disponível para utilização livre das plantas é pequena já que a maior reserva de fósforo está armazenada na forma de ácido fítico (RABOY, 2009). Na literatura, as quantidades de fósforo armazenado na forma de ácido fítico variam entre 60 e 90% (BRINCH-PEDERSEN; SORENSEN & HOLM, 2002; COMINELLI et al., 2018; JAIN & SINGH, 2016; RABOY, 2009).
As plantas armazenam ácido fítico na forma de fitina que é depositado na forma de cristais globóides associados à corpos de proteínas denominados fitídeos-proteínas globóides dentro dos vacúolos (COMINELLI et al., 2018; COWIESON et al., 2016). A distribuição da fitina ocorre em locais diferentes da estrutura da semente dependendo de cada espécie incluindo a camada de endosperma, gérmen e aleurona. Para cereais que possuem grão pequenos como cevada, trigo e arroz, ocorre a deposição de 80 a 90% do fósforo fítico na aleurona e restantes no escutelo com exceção do milho, onde 90% do ácido fítico está localizado no escutelo e os 10% restantes estão na aleurona. Para dicotiledôneas a deposição ocorre no endosperma e no cotilédone. Nas leguminosas, os cotilédones são responsáveis por armazenar mais de 95% do InsP6
(BRINCH-PEDERSEN; SORENSEN & HOLM, 2002; COMINELLI et al., 2018).
O InsP6 pode ser encontrado em grande parte dos vegetais, no
entanto, as maiores concentrações são encontradas em semente com teores que variam de 5 a 60 g∙kg-1 (COWIESON et al., 2009). Para as
sementes de milho o InsP6 está presente em concentrações de cerca de 7
e 8 g∙kg-1 (COWIESON et al., 2016). Embora ele apareça em baixas
concentrações se comparadas com proteínas, amido, fibras e lipídeos ele é fundamental na biodisponibilização de minerais, principalmente fósforo
e cálcio, aminoácidos e carboidratos (COWIESON et al., 2009). A deposição de ácido fítico está intimamente ligada à fase quiescente das sementes, mas pode ser encontrado ainda em tecidos vegetais e pólen (BRINCH-PEDERSEN; SORENSEN & HOLM, 2002).
2.2.4 Funcionalidade e Problemática do Ácido Fítico
O grande interesse no InsP6 não se limita à nutrição animal, mas
também na saúde humana. Isso se deve ao fato do InsP6 ser um composto
quelante forte de cátions minerais como, ferro, cálcio e zinco (RABOY, 2009). A propriedade de quelar minerais na forma de sais mistos insolúveis diminui consideravelmente a solubilidade e biodisponibilidade de minerais de importância nutricional (TALAMOND et al., 2000).
Sua capacidade quelante vem do seu grande potencial de perder os íons fosfatos do anel mio-inositol e formar uma molécula com carga negativa. Essa molécula aniônica se liga à íons de carga positiva para tornar-se novamente uma molécula neutra e estável. O ácido fítico, em pH próximos a 1, encontra-se totalmente protonado (carga neutra), a medida que o pH aumenta para pH=3-4 o InsP6 apesenta carga iónica de
-4. Com o aumento do pH para 6-7, próximo do ambiente neutro, o ácido fítico adquire a carga -6 e só estará totalmente desprotonado em pH maior que 13 (COWIESON et al., 2016).
Como o trato gastrointestinal apresenta baixos valores de pH, o InsP6 encontra-se parcialmente desprotonado o que favorece a formação
de fitina. Fato esse, que implica na redução da solubilidade e digestibilidade de P, Ca, Fe e Zn (COWIESON et al., 2016) e ainda interage com as proteínas diminuindo sua digestão (JAIN & SINGH, 2016). Esses compostos são excretados pelos organismos e contribuem para deficiência de ferro e zinco na população mundial, principalmente em crianças e mulheres grávidas (RABOY, 2001), na deficiência nutricional de P e Ca de animais monogástricos, aumento da poluição ambiental tanto na eutrofização dos afluentes como na contaminação dos solos (JAIN & SINGH, 2016) e por fim, aumenta a preocupação com a gestão de resíduos agrícolas (RABOY, 2009).
Todos esses fatores contribuíram para que o ácido fítico seja considerado um fator antinutricional (FAN). Um fator antinutricional nada mais é do que um composto que ocorre naturalmente em alimentos de origem vegetal, que ao serem consumidos reduzem o seu valor nutricional. Eles atuam ligando-se a certos nutrientes (proteínas, vitaminas e minerais) interferindo na sua absorção, utilização ou digestibilidade no trato gastrointestinal e podem acarretar em sérios danos
à saúde desse organismo (BENEVIDES et al., 2011; NIKMARAM et al., 2017).
Na literatura é possível encontrar diversos estudos que demostram as propriedades antinutricionais do ácido fítico em diferentes organismos (COWIESON et al., 2009; RASID et al., 2017; SOKRAB; AHMED & BABIKER, 2012) bem como, sua alta concentração nas sementes de milho (BRINCH-PEDERSEN; SORENSEN & HOLM, 2002; COMINELLI et al., 2018; COWIESON et al., 2009, 2016; SANDBERG & SCHEERS, 2016). O que aumenta a preocupação com a formulação de ração para animais monogástricos e na utilização desse alimento para a saúde humana.
No entanto, o ácido fítico mostrou que mesmo sendo um composto não desejado nos alimentos de origem vegetal ele pode contribuir com propriedades singulares para a saúde humana e animal. Seja para prevenir ou reverter atividades cancerígena nas células (FOX & EBERL, 2002; SHAMSUDDIN, 2002). Ou atuar como agente antioxidante para preservação e conservação de sementes e reduzir a incidência de radicais livres em tecidos animais (GRAF & EATON, 1990).
E ainda, estudos preliminares em ratos já comprovaram a eficácia do ácido fítico para diminuir e prevenir a calcificação dos tecidos da aorta, coração (GRASES et al., 2006) e dos rins (GRASES et al., 2000) além do ácido fítico apresentar propriedades antidiabéticas (KIM; HAN & KIM, 2014) e reduzir os níveis lipídicos no soro e no fígado de ratos diabéticos (LEE et al., 2005).
2.2.5 Melhoramento Genético e Uso de Fitase
Em vista de todos os pontos negativos trazidos pelo efeito antinutricional do ácido fítico, os pesquisadores há muito vêm buscando alternativas que ao passo que diminuam o efeito antinutricional do composto aumentem a biodisponibilidade dos nutrientes inibidos por ele. Os inúmeros avanços biotecnológicos permitiram utilizar o fitato como uma fonte abundante de fósforo, seja para animais de criação (porcos, aves e peixes) como na indústria de alimento (BALABAN et al., 2017).
A utilização de fitase, merece destaque dentre essas atividades. As fitases pertencem a classe de enzimas fosfatases e são capazes de hidrolisar as ligações do fosfato com o anel de mio-inositol liberando o P presente na molécula e diminuindo seu efeito quelante sobre os minerais
catiônicos (BALWANI; CHAKRAVARTY & GAUR, 2017;
COMINELLI et al., 2018). Inúmeros estudos vêm aprimorando o uso das fitases para melhorar e ampliar seu efeito na formulação de ração para
animais monogástricos bem como, testando seu efeito combinado com outras enzimas como xilanases, amilase, carbohidrases e proteases (COWIESON et al., 2016; SANTOS et al., 2017; STEFANELLO et al., 2017).
Outra forma efetiva de aumentar a biodisponibilidade de fósforo e outros minerais vem do uso da engenharia genética. Com ela, os cereais estão sendo selecionados geneticamente para que as sementes contenham níveis normais de fósforo total, mas com níveis muito reduzidos de ácido fítico (DORSCH et al., 2003). Esses híbridos são denominados de sementes de baixo teor de ácido fítico (RABOY, 2009).
Além de pesquisas onde as plantas projetadas podem secretar enzimas extracelulares para a rizosfera degradando o fitato do solo, aumentando a acumulação de fósforo nas plantas e no aumento da biomassa (BALABAN et al., 2017).
Como o milho é uma das culturas de cereais mais importantes em todo o mundo tanto na forma de alimento como para formulação de rações essa cultura está entre os principais alvos de melhoramento genético e biotecnológico (CHEN et al., 2016; RABOY, 2001; SOKRAB; AHMED & BABIKER, 2012). Outras tecnologias descritas na literatura incluem o pré-processamento dos grãos como forma de ativar as fitases endógenas, mutações em genes do metabolismo de fitatos, aumentando a sua biodisponibilização e diminuindo o seu metabolismo Além do uso de animais geneticamente modificados que produzem fitases já na saliva, diminuindo a necessidade de adicionar fitase às dietas (BALABAN et al., 2017).
2.3 FITASE
O efeito antinutricional do ácido fítico motivou o isolamento de uma subclasse de fosfatases capaz de desfosforilar gradualmente o ácido fítico liberando fósforo inorgânico e os intermediários do fosfato de mio-inositol (BALWANI; CHAKRAVARTY & GAUR, 2017). As primeiras fitases foram isoladas do farelo de arroz (SUZUKI; YOSHIMURA & TAKAISHI, 1907) e sangue de bezerros (MCCOLLUM & HART, 1908) e hoje sua presença já é conhecida em diferentes fontes como tecido vegetal, fungos, leveduras e bactérias. Além de sua presença na mucosa e microflora intestinal humana e animal. No segundo grupo, são consideradas fitases endógenas e geralmente, ocorrem em níveis pequenos se comparados com fitases vegetais e microbianas (JAIN & SINGH, 2016; KUMAR et al., 2010; VASUDEVAN et al., 2017).
Muitas pesquisas e avanço tecnológico ocorreram até que as fitases pudessem ser produzidas em escala comercial. Apenas em 1991, a primeira fitase fúngica, Natuphos®, foi lançada no mercado pela BASF SE (Badische Anilin & Soda Fabrik) produzida a partir da Aspergillus niger (KUMAR et al., 2010). Além da sua grande aceitação como suplemento de ração animal, a fitase tem contribuições positivas na nutrição humana, na agricultura e também na aquicultura (BALWANI; CHAKRAVARTY & GAUR, 2017) o que tornou a fitase um objeto de estudo por muitos anos. Hoje, a engenharia genética estuda como aumentar o rendimento das fitases em plantas transgênicas (VASUDEVAN et al., 2017).
2.3.1 Características Físico-Químicas
As fitases são pertencentes a uma subclasse de fosfatases, quimicamente denominadas de mio-inositol (1,2,3,4,5,6) hexa-kis-fosfato fosfohidrolase (KUMAR et al., 2010). Dependendo da fonte de origem, as fitases apresentam variações nas propriedades físico-químicas como a constante de Michaelis Menten (Km), pH ótimo e termoestabilidade além de variação na massa molecular. As fitases são ativas dentro do intervalo de pH=2,5–8,0, no entanto, abaixo de pH=3,0 e acima de pH=7,5 a estabilidade enzimática é diminuída drasticamente. Essa variação pode ser associada à estrutura molecular ou na estereoespecificidade da enzima de diferentes fontes. As enzimas apresentam temperatura ótima para a atividade enzimática entre 35-77 °C. E apresentam valores estimados de 35 a 700 kDa para massa molecular (LIU et al., 1998; VATS; BENERJEE, 2004).
2.3.2 Mecanismo de Ação e Parâmetros Cinéticos
O mecanismo de ação das fitases baseia-se na hidrólise do ácido fítico através de reações sucessivas de desfosforilação por passos, produzindo uma série de ésteres inferiores de fosfatos de mio-inositol (IP6
→ IP5 → IP4 → IP3 → IP2 → IP1) e unidades fosfatos inorgânicas (JAIN
& SINGH, 2016; KUMAR et al., 2010; SELLE & RAVINDRANB, 2007). Além de biodisponibilizar cálcio, magnésio, proteínas e lipídeos (KUMAR et al., 2010), sob determinadas condições de ensaio as fitases são bastantes específicas para desfosforilação de mio-inositol, sendo possível distingui-la das demais fosfatases ácidas que são incapazes de hidrolisar o fitato (LIU et al., 1998; VATS & BENERJEE, 2004).
Cada enzima apresenta diferentes ordens e taxas de reação para liberação dos grupos fosfato que são influenciados pela origem da enzima
bem como, pela sua estereoespecificidade (BALWANI;
CHAKRAVARTY & GAUR, 2017). As fitases ácidas de histidina após a desfosforilação do primeiro grupo fosfato do anel de mio-inositol catalisam a liberação de fosfatos adjacentes ao grupo hidroxila livre. Nas fitases de origem vegetal o fosfato na posição 6 é liberado primeiro, seguido pelos fosfatos das posições 5 e 4, ou 1 e 3 ou 1 e 4. Já as fitase microbianas, costumam hidrolisar primeiro o fosfato da posição 1 ou 3, com exceção para a enzima de E. coli, onde a degradação inicia na posição 6 (BALWANI; CHAKRAVARTY & GAUR, 2017; LIU et al., 1998).
A taxa de hidrólise enzimática das fitases mostrou uma cinética clássica de Michaelis-Menten, de modo que, a liberação de P inorgânico dependente da concentração de substrato utilizado na reação (LIU et al., 1998). Tanto a constante de Michaelis-Menten (Km) para o ácido fítico quanto para a fitase dependem de sua origem. Em dados revisados por Liu e colaboradores (1998) a os valores de Km para a hidrólise do fitato de sódio por diferentes fitases podem apresentar valores de 0,65 mM para fitase de feijão mung, 91 μM em semente de milho, 48 μM para semente de soja e 17 μM para Typha latifolia L. (Tabela 3) corroborando com dados apresentados por Vats e Banerjee (2004) e Jain e Singh (2016).
