EFEITO DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DE ECTOENZIMAS E NO PERFIL OXIDATIVO EM PLAQUETAS DE RATOS COM HIPOTIREOIDISMO

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA TOXICOLÓGICA. EFEITO DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DE ECTOENZIMAS E NO PERFIL OXIDATIVO EM PLAQUETAS DE RATOS COM HIPOTIREOIDISMO. DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. Jucimara Baldissarelli. Santa Maria, RS, Brasil 2013.

(2) EFEITO DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DE ECTOENZIMAS E NO PERFIL OXIDATIVO EM PLAQUETAS DE RATOS COM HIPOTIREOIDISMO. Jucimara Baldissarelli. Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica. Orientadora: Profª. Dra. Maria Rosa Chitolina Schetinger Co-orientadora: Dra. Roberta Schmatz. Santa Maria, RS, Brasil 2013.

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(4) À minha família amada: pai, mãe, mana, por me amarem e apoiarem sempre. Ao Pablo, pelo carinho e amor que tanto me fazem bem. Este é o resultado dos nossos esforços e poder dedicar a vocês enche a minha vida de alegria!.

(5) Agradecimentos Agradecer é fundamental, nada somos sozinhos e nada somos sem valorizar àqueles que dedicaram um pouco ou muito do seu tempo em nosso favor... Agradeço à Deus, que está sempre presente, em cada passo, em cada decisão, em cada etapa concluída... a força Dele nos leva longe! À minha orientadora, professora Maria Rosa, por ter me aceitado há bastante tempo como IC e por acreditar que eu poderia chegar aqui, e também pela dedicação ao ensino e à pesquisa e pelo incentivo e disponibilidade em auxiliar no que fosse necessário. Obrigada profe! À professora Vera que também esteve sempre presente, pela disposição em auxiliar, pelos ensinamentos e pelo exemplo de profissionalismo. À minha co-orientadora Roberta, a quem eu admiro muito por ser essa pessoa otimista, sincera, inteligente, dedicada e generosa, agradeço por dividir seus conhecimentos e auxiliar imensamente no meu crescimento! Obrigada Roby, além de tudo, pela amizade! Aos meus pais Ana e Clademir, obrigada de coração por estarem sempre presentes apesar da distância, por acreditarem e confiarem em mim e nos meus sonhos e fazerem o possível para ajudar a realizá-los! Amo vocês! À Maiara, que foi meu sonho de criança realizado e de quem foi muito difícil ficar longe e também para quem inicialmente foi muito difícil explicar a ausência. “Irmãos são um pedaço de nós”, a mana te ama! Ao Pablo, meu maior incentivador, meu amigo, meu ouvinte, meu amor! Obrigada por existir na minha vida, por estar sempre comigo e despertar em mim os melhores sentimentos que me fazem sempre querer ir mais além! Te amo! Às queridas colegas que a Farmácia me trouxe, amigas para toda a vida, por saber que torcemos sinceramente uma pela outra e que a amizade é verdadeira e para sempre, obrigada! À Chris, minha irmãzinha de coração que esteve sempre comigo, com quem dividi sonhos, medos, reclamações, realizações, mates e muita alegria no dia-a-dia, obrigada por ser quem és! À professora Vânia e às meninas do lab de Bioquímica Adaptativa que estiveram sempre dispostas a auxiliar, apesar de “estranharem os nossos animaizinhos”, especialmente a Adri, parceira nesse trabalho, que a convivência diária fez tornar-se uma grande amiga!.

(6) Aos meus colegas de Enzitox, por cada dia longo de trabalho e por cada risada que anima esses dias, por cada sugestão e ajuda e por cada expectativa de colher os melhores frutos desse trabalho, vocês são os melhores colegas que eu poderia ter, obrigada Lú, Gustavo, Fátima, Nice, Naiara, Juliano, Nadia, Javed, Victor, Jessié, Carla, Marília, Pauline, Diéssica, Luana, Lizi, Karine, Dani e Eduardo. Agradeço ainda a todos com quem convivi no período em que passaram pelo laboratório, especialmente a Maísa, que foi quem me acolheu na bioquímica e me ensinou muito do que sei hoje. E um super obrigada também às minhas “trombadinhas da apirase”: Carolzinha, Dani e Déia por toda a ajuda sempre e por todo o carinho e amizade que fazem tudo parecer mais fácil, adoro vocês! À todos os amigos e pessoas que de alguma forma me ajudaram, meu agradecimento a todos. À UFSM e ao curso de Mestrado em Bioquímica Toxicológica, pela oportunidade. Ao CNPq pela bolsa concedida..

(7) RESUMO Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil EFEITO DA QUERCETINA NA ATIVIDADE DE ECTOENZIMAS E NO PERFIL OXIDATIVO EM PLAQUETAS DE RATOS COM HIPOTIREOIDISMO Autora: Jucimara Baldissarelli Orientadora: Prof.ª. Drª. Maria Rosa Chitolina Schetinger Co-orientadora: Drª. Roberta Schmatz Data e Local da Defesa: Santa Maria, 18 de fevereiro de 2013. O hipotireoidismo é uma patologia que pode causar manifestações em diversos sistemas e tecidos, entre eles, alterações nos marcadores de funções endoteliais, contribuindo para uma maior incidência de doenças cardiovasculares. Além disso, o hipotireoidismo tem relação com a formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), as quais tem a capacidade de gerar danos ao organismo. Os nucleotídeos extracelulares ATP, ADP e o nucleosídeo adenosina regulam processos fisiológicos no sistema vascular, entre eles, a agregação plaquetária, o tônus vascular e as funções cardíacas. Os compostos flavonoides como a quercetina exercem várias funções terapêuticas destacando-se a sua capacidade antioxidante, antiagregante e anti-inflamatória. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi verificar o efeito da quercetina na atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeos de adenina, na agregação plaquetária e no perfil oxidativo em plaquetas de ratos machos adultos com hipotireoidismo induzido por metimazol 0,02mg/mL. Os animais receberam somente metimazol 0,02 mg/mL durante 30 dias e em seguida passaram a receber também quercetina 10 e 25 mg/kg durante 60 dias. Os resultados obtidos demonstraram que a atividade da NTPDase com ATP como substrato foi aumentada no grupo hipotireoideo e o tratamento com quercetina 25 mg/kg reverteu esse aumento. Não foram observadas alterações significativas na hidrólise do ADP. Já a atividade da 5'-nucleotidase foi reduzida no grupo de animais com hipotireoidismo. Não foram observadas diferenças na atividade ADA no grupo com hipotireoidismo, mas o tratamento com quercetina 25 mg/kg reduziu significativamente sua atividade. Os resultados obtidos indicaram também um aumento na agregação plaquetária no grupo hipotireóideo. A administração de quercetina 25 mg/kg reverteu esse aumento. Além disso, houve um aumento nos níveis de peroxidação lipídica em ratos hipotireóideos e o tratamento com quercetina reverteu este aumento. A atividade da catalase (CAT) encontrou-se diminuída nos animais com hipotireoidismo, mas o tratamento com quercetina reverteu esse decréscimo. Estes resultados sugerem que a quercetina é capaz de modular a atividade das ectoenzimas e diminuir a agregação plaquetária em ratos com hipotireoidismo, o que pode contribuir para a prevenção de alterações plaquetárias, e consequentemente complicações vasculares, bem como proporcionar proteção contra o estresse oxidativo apresentado no estado hipotireoideo. Palavras-chave: Hipotireoidismo. Plaquetas. Ectoenzimas. Estresse oxidativo. Quercetina..

(8) ABSTRACT Dissertation of Master’s Degree Post-Graduating Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry Federal University of Santa Maria, RS, Brazil EFFECTS OF QUERCETIN IN ACTIVITY OF ECTOENZYMES AND IN OXIDATIVE PROFILE OF PLATELETS OF RATS WITH HYPOTHYROIDISM. Author: Jucimara Baldissarelli Adviser: Maria Rosa Chitolina Schetinger Co-adviser: Roberta Schmatz Date and place of the defense: Santa Maria, February, 18 th, 2013. Hypothyroidism is a pathology that can cause manifestations in several systems and tissues, including, changes in markers of endothelial functions, contribute to increase in incidence of cardiovascular disease. Furthermore, hypothyroidism has relation with the formation of reactive oxygen species (ROS), which has the ability to generate damage to the body. The extracellular adenine nucleotides ATP, ADP and the nucleoside adenosine regulating many physiological processes in the vascular system, including platelet aggregation, vascular tone and cardiac function. The flavonoids compounds such as quercetin exert multiple functions therapeutic highlighting its antioxidant, antiplatelet and anti-inflammatory capacity. In this context, the objective of this study was to investigate the effect of quercetin on the activity of enzymes that hydrolyze adenine nucleotides and nucleosides, on platelet aggregation and oxidative profile in platelet of adult male rats with hypothyroidism induced by methimazole 0.02 mg/mL. The animals received only methimazole 0.02 mg/ml for 30 days, and then began to receive also quercetin 10 and 25mg/kg for 60 days. The results showed that the activity of NTPDase with ATP as substrate was increased in hypothyroid group and treatment with quercetin 25mg/kg reversed this increase. No significant changes were observed in the hydrolysis of ADP. The activity of 5'-nucleotidase was reduced in the group of animals with hypothyroidism. No difference was observed in ADA activity in the group with hypothyroidism, but treatment with quercetin 25 mg/kg significantly reduced its activity. The results also indicated an increase in platelet aggregation in the hypothyroid group. The administration of quercetin 25 mg/kg reversed this increase. Furthermore, there was an increase in the levels of lipid peroxidation in hypothyroid rats and the treatment with quercetin reversed the increase. The activity of catalase (CAT) was decreased in rats with hypothyroidism, but treatment with quercetin reversed this decrease. These results suggested that quercetin is able of modulate the activity of ectoenzymes and decrease platelet aggregation in rats with hypothyroidism, which can contribute to the prevention of platelet changes, and consequently, vascular complications as well as providing protection against oxidative stress presented in hypothyroid state. Keywords: Hypothyroidism. Platelets. Ectoenzymes. Oxidative stress. Quercetin..

(9) Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem medo, e nunca se arrepende.... Leonardo Da Vinci.

(10) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. INTRODUÇÃO. Figura 1 - Representação e localização da glândula tireoide....................................14 Figura 2 - Esquema da produção dos hormônios tireoidianos T3 e T4....................15 Figura 3 - Estrutura química dos hormônios da tireoide............................................16 Figura 4 - Cascata de ectoenzimas responsáveis pela hidrólise de nucleotídeos e nucleosídeos de adenina........................................................................22 Figura 5 - Membros da família das enzimas NTPDases............................................23 Figura 6 - Estrutura das enzimas NTPDases.............................................................24 Figura 7 - Estrutura da enzima 5'-nucleotidase..........................................................25 Figura 8 - Principais espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e seus alvos biológicos ..................................................................................................27 Figura 9 - Formação de espécies reativas de oxigênio..............................................28 Figura 10 - Mecanismo enzimático antioxidante........................................................30 Figura 11 - Estrutura química dos flavonoides...........................................................32 Figura 12 - Estrutura do flavonoide quercetina..........................................................33.

(11) LISTA DE ILUSTRAÇÕES MANUSCRITO. Figura 1 -. Efeitos da quercetina sobre a NTPDase usando ATP (A) e ADP (B) como substrato e ecto-5'-nucleotidase usando AMP (C) como substrato, em plaquetas de ratos com hipotireoidismo induzido por metimazol..............................................................................................67. Figura 2 -. Efeitos da quercetina na atividade da ADA em plaquetas de ratos com hipotireoidismo induzido por metimazol .......................................68. Figura 3 -. Perfil de agregação plaquetária em ratos hipotireoideos. A agregação de plaquetas foi avaliada utilizando como agonista ADP, em concentrações de 2,5 (A) e 5 μM (B).....................................69. Figura 4 -. Níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em plaquetas de ratos hipotireoideos e aqueles tratados com quercetina .............................................................................................70. Figura 5 -. Efeitos da quercetina na atividade da CAT em plaquetas de ratos com hipotireoidismo induzido por metimazol........................................71.

(12) LISTA DE ABREVIAÇÕES ADA - adenosina desaminase ADP - adenosina difosfato AMP - adenosina monofosfato ANOVA - análise de variância ATP - adenosina trifosfato CAT - catalase EDTA - ácido etilenodiaminotetracético E-NTPDase - ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase H2O2 - peróxido de hidrogênio HTs - hormônios tireoidianos MDA - malondialdeído MTZ - metimazol PRP - plasma rico em plaquetas SNP - sistema nervoso periférico SNC - sistema nervoso central TBARS - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TPO - tireoperoxidase TRH - hormônio liberador de tireotrofina TSH - hormônio estimulante da tireoide T3 - triiodotireonina T4 - tiroxina.

(13) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 14 2. OBJETIVOS........................................................................................................ 35 2.1 Objetivo Geral................................................................................................... 35 2.2 Objetivos Específicos........................................................................................ 35 3. MANUSCRITO……………………………………………………………….............. 36 4. CONCLUSÕES................................................................................................... 73 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................... 74.

(14) APRESENTAÇÃO Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a forma de um manuscrito, o qual se encontra no item Manuscrito. As seções Materiais e Métodos, Resultados, Discussão e Referências encontram-se no próprio manuscrito e representam a íntegra deste estudo. O item Conclusões encontra-se no final desta dissertação e apresenta interpretações e comentários gerais sobre o manuscrito contido neste trabalho. As referências referem-se somente às citações que aparecem no item Introdução desta dissertação. O manuscrito está estruturado de acordo com as normas da revista científica para o qual foi submetido..

(15) 14. 1. INTRODUÇÃO A tireoide é uma pequena glândula localizada anterior e lateralmente à traqueia que possui dois lobos, um direito e um esquerdo, unidos por uma banda de tecido glandular denominado istmo (Figura 1A e 1B) (UTIGER, 2001). Em humanos adultos normais, pesa cerca de 10 a 25 gramas. A estrutura morfofuncional da glândula é o folículo, uma estrutura ovoide formada por uma camada de células chamadas tireócitos, circundando grande quantidade de coloide (GRIFFIN, 2000). A tireoide desempenha importante papel no controle do metabolismo através da produção, armazenagem e liberação dos hormônios tireoidianos tiroxina (T4) e triiodotironina (T3) (Figura 2) na corrente sanguínea (GUYTON; HALL, 2002). Os hormônios da tireoide (HTs) são formados dentro das células foliculares da glândula e são liberados na circulação sistêmica em resposta ao hormônio estimulante da tireoide (TSH) (SMITH et al., 2002). A síntese ocorre como parte de uma grande molécula precursora, a tireoglobulina, e eles são armazenados no coloide, que serve como um reservatório intracelular (SMITH et al., 2002; GRANNER, 2003).. FIGURA 1A - Localização da glândula tireoide.. FIGURA 1B: Representação da glândula tireoide.. (Adaptado de NETTER, 2011). O iodeto proveniente da dieta é absorvido no trato gastrointestinal e transportado e concentrado na glândula tireoide através de um cotransportador. Após atravessar a célula, ocorre a oxidação do iodeto pela tireoperoxidase (TPO), uma hemoglicoproteína que se encontra na membrana plasmática apical da célula.

(16) 15. folicular, com seu domínio catalítico voltado para o coloide. A oxidação do iodeto pela TPO ocorre na presença de peróxido de hidrogênio e posteriormente há a incorporação da molécula oxidada aos resíduos de tirosina presentes na molécula de tireoglobulina, reação também catalisada pela peroxidase (YEN, 2001; FARWELL; BRAVERMAN, 2006). A tireoglobulina age como uma grande molécula pró-hormônio na síntese de T3 e T4. É uma glicoproteína, contendo cerca de 115 resíduos de tirosina, cada um sendo um potencial sítio de iodetação. É sintetizada glicosilada, e a seguir, secretada para dentro da luz do folículo, onde ocorre a iodetação dos resíduos de tirosina (RANG, 1997). A iodetação de resíduos de tirosina na tireoglobulina resulta na formação da monoiodotirosina (MIT) e da diiodotirosina (DIT) que armazenam aproximadamente 70% do iodo na tireoglobulina, enquanto 30% está nos resíduos iodotironil, T3 e T4. A T4 é formada pelo acoplamento de dois resíduos DIT, enquanto que o acoplamento de um resíduo DIT com um resíduo MIT forma a T3 (Figura 2) (HENRY, 1999).. Figura 2 – Esquema representativo da produção dos hormônios tireoidianos T3 e T4.. A maior parte dos hormônios secretados pela glândula tireoide são T4, enquanto que apenas cerca de 10% são T3, porém, uma grande porção de T4 é convertida em T3 nos tecidos periféricos pela ação da desiodase 2, sendo que ambas as formas são muito importantes funcionalmente diferindo apenas na intensidade da ação. O T3 é cerca de quatro vezes mais potente que o T4, mas está presente no sangue em quantidades menores e permanece durante tempo bem mais curto que o T4 (GUYTON; HALL, 2002)..

(17) 16. 3,3’,5 –Triiodotironina (T3). 3,3’,5,5’ Tetraiodotironina (T4). Figura 3 - Estrutura química dos hormônios da tireoide. (Fonte: MURRAY, 2003.). Os hormônios da tireoide exercem efeitos nos diferentes órgãos, sendo reguladores-chave do metabolismo, desenvolvimento e crescimento (CINGOLANI, 2004; MOLINA, 2007). Seus efeitos também estão relacionados ao metabolismo de proteínas, carboidratos, lipídios e vitaminas, e no controle de diversas funções cerebrais, cardíacas, musculares, hepáticas e ósseas podendo regular outras vias endócrinas através da alteração das taxas de síntese e degradação de outros hormônios e fatores de crescimento (JAMESON; DEGROOT, 2001; BARRA, 2004; LARSEN et al., 2008). A síntese e secreção dos hormônios da tireoide são estimuladas pelo hormônio estimulante da tireoide (TSH) e é rigidamente regulada por um sistema de feedback negativo entre o hipotálamo, a hipófise e a glândula tireoide. O hormônio liberador de tireotrofina (TRH) é sintetizado no núcleo paraventricular do hipotálamo e transportado por axônios para a eminência média e depois para a hipófise anterior via plexo capilar portal. O TRH liga-se a seus receptores nos tireótrofos, uma subpopulação de células secretoras do TSH na hipófise. A estimulação pelo TRH leva à síntese e liberação de TSH pela hipófise. Tanto o TRH, quanto o TSH são negativamente regulados pelos hormônios da tireoide (YEN, 2001). Assim, quando os níveis de T4 caem, a glândula pituitária aumenta a secreção do TSH, favorecendo a produção de mais T4 pela tireoide (NOGUEIRA et al., 2011). Além disso, a somatostatina e a dopamina secretadas pelo hipotálamo podem regular negativamente a secreção de TSH (YEN, 2001)..

(18) 17. Alterações na síntese dos hormônios da tireoide T3 e T4 podem levar ao desenvolvimento do hipotireoidismo. O hipotireoidismo representa a patologia endócrina mais comum e afeta milhões de indivíduos em todo o mundo, a prevalência varia de país para país, alterada por fatores como idade e sexo. Além disso, as principais etiologias para o hipotireoidismo podem ser doença autoimune da tireoide, deficiência de iodo, redução do tecido tireoidiano por iodo radioativo (algumas vezes utilizado como terapia em casos de outras desordens da glândula), uso de alguns medicamentos como o carbonato de lítio (que inibe a síntese dos hormônios tireoidianos), ou por cirurgia de remoção da tireoide (WOEBER, 2000). Estudos estimam prevalência entre 1 a 2% em áreas com suprimento suficiente de iodo e 4 a 5% em áreas com deficiência de iodo (VANDERPUMP et al., 2009), acometendo cerca de 8 vezes mais o sexo feminino do que o masculino, iniciando com maior frequência entre os 20 e 50 anos de idade (CENCI et al., 2006). O hipotireoidismo pode ser classificado como primário ou central. A forma primária é a mais comum que se refere à desordem na tireoide, resultando na redução da síntese e secreção dos hormônios tireoidianos. Já o hipotireoidismo central é caracterizado por desordens do eixo hipotalâmico-pituitário e divide-se em secundário, caracterizando-se por desordem da glândula pituitária e terciário onde a disfunção ocorre no hipotálamo, levando à redução da secreção de TSH ou redução da atividade biológica deste (DEVDHAR; OUSMAN; BURMAN, 2007). O indivíduo com hipotireoidismo apresenta manifestações em diversos sistemas e tecidos, que incluem pele seca e pálida, unhas fracas e quebradiças, redução do apetite, irregularidades menstruais, sensibilidade ao frio, fraqueza, rouquidão, ganho de peso, além de sonolência, lentidão no processamento de informação e diminuição dos reflexos, e ainda, problemas de memória (HEYMANN, 1992; BURMEISTER et al., 2001; LARSEN et al., 2008). Estudos têm reconhecido que o estado metabólico anormal que acompanha o hipotireoidismo é responsável pelas disfunções vasculares observadas nesta patologia. Pode ocorrer hipertensão, hipercolesterolemia, aumento de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) e de apolipoproteína (KLEIN; DANZI, 2007). Estes fatores favorecem um acentuado estado pró-trombótico sendo capazes de alterar propriedades funcionais de múltiplos tipos de células, incluindo o endotélio e as plaquetas, com consequente aumento da susceptibilidade para o desenvolvimento de aterotrombose (MUDALIAR, 2004)..

(19) 18. O. tratamento. dos. pacientes. com. hipotireoidismo. é. realizado. pela. administração de levotiroxina (T4) para a qual existem vários nomes comerciais. A etiologia do hipotireoidismo pode influenciar a dose necessária de tiroxina e é importante que o paciente receba a dosagem correta do hormônio. Parte da tiroxina irá se transformar em triiodotironina (T3). A possibilidade de benefício do tratamento do hipotireoidismo com combinações de T4 e T3 tem sido investigada, porém estudos já demonstraram que o tratamento com a combinação de T4/ T3 não produz melhora no bem-estar, na função cognitiva ou na qualidade de vida, quando comparado ao tratamento só com T4 (WALSH et al., 2003; CLYDE et al., 2003.) Observando a crescente incidência do hipotireoidismo, nas últimas décadas modelos experimentais têm sido utilizados a fim de contribuir para melhorar o entendimento das causas, consequências e tratamento desta desordem metabólica. (SUBUDHI et al., 2009; JENA et al., 2012; DIAS et al., 2012). Agentes antitireoidianos como o Metimazol (MTZ) e o Propiltiouracil (PTU), reproduzem nos animais o quadro de alterações metabólicas e sinais clínicos semelhantes aos que ocorrem na enfermidade naturalmente adquirida. Tais drogas caracterizam-se por seu efeito de inibição da síntese dos hormônios tireoidianos T3 e T4 (RANG; DALE, 2012). O MTZ faz parte de um grupo de fármacos denominados tioureilenos, clinicamente usado no controle do hipertireoidismo. Quimicamente, eles se relacionam com a tioureia, e o grupo tiocarbamida (S-C-N) é essencial para a atividade antitireoidiana. Os tioureilenos reduzem a liberação de hormônios tireoidianos. Seu mecanismo de ação não é completamente compreendido, mas há evidências de que eles inibem a iodetação dos resíduos de tirosil na tireoglobulina. Imagina-se que eles paralisem as reações de oxidação catalisadas pela tireoperoxidase por atuarem como substratos para o suposto complexo peroxidaseiodo, inibindo competitivamente a interação com a tirosina (RANG; DALE, 2012). Assim,. similarmente. a. pacientes. hipotireoideos,. os. animais. com. hipotireoidismo induzido por MTZ podem desenvolver danos em diversos locais, como no cérebro e no sistema vascular, constituindo dessa forma um importante modelo para o estudo de complicações causadas pelo hipotireoidismo (SERRANOLOZANO, et al., 2005; DIAS, et al., 2012). Neste contexto, várias pesquisas tanto em humanos quanto em modelos experimentais, têm demonstrado que o sistema cardiovascular é alvo específico de.

(20) 19. ação dos hormônios tireoidianos e que o hipotireoidismo, assim como outras doenças endócrinas, está associado a maior mortalidade ou maior incidência de doenças cardiovasculares, como aterosclerose e até mesmo insuficiência cardíaca. (DÖRR; VOLZKE, 2005). As plaquetas e o endotélio têm sido reconhecidos como componentes patológicos-chave, associados à trombose e à inflamação, situações que ocorrem nas doenças vasculares. As plaquetas são células anucleadas que desempenham importantes funções no processo hemostático, através de mecanismos de adesão, agregação e subsequente formação de trombos em locais de injúria vascular (HARKER, 1997; MARCUS et al., 2003; WAGNER; BURGER, 2003). Sob condições fisiológicas normais, as plaquetas circulam em estreito contato com a mucosa das células endoteliais da parede dos vasos sanguíneos e, somente quando há uma lesão, elas aderem ao local lesionado (SALLES et al., 2008). Essa adesão é mediada por receptores de adesão plaquetários, estes receptores ligam-se ao colágeno e ao fator de von Willebrand. As invaginações da membrana plasmática das plaquetas aumentam a área de superfície para a absorção das proteínas de coagulação. A ativação das plaquetas resulta na liberação do conteúdo estocado nos grânulos alfa e grânulos densos presentes no citoplasma (NASH et al., 2002). Os grânulos alfa contém glicoproteínas, fatores da coagulação e muitos fatores pró e antiangiogênicos (NASH et al., 2001). Os grânulos densos possuem íons cálcio, serotonina, ATP e ADP, requeridos para a agregação plaquetária (NASH et al., 2002; ZAGO et al., 2004). A sinalização intercelular mediada por purinas como os nucleotídeos ATP, ADP, AMP e o nucleosídeo adenosina está presente desde cedo na evolução e, portanto, é uma rota amplamente distribuída para comunicação célula-célula (BURNSTOCK, 2008). Atualmente, essa sinalização constitui-se em um importante alvo de estudos devido ao seu papel em modular uma variedade de processos biológicos incluindo a tromborregulação, a inflamação e a neurotransmissão (BURNSTOCK, 2006; ROBSON et al., 2006; DI VIRGILIO, 2007; SCHETINGER et al., 2007). No sistema vascular a sinalização purinérgica tem o potencial de influenciar funções cardíacas, participar de respostas vasomotoras e controlar as funções plaquetárias e os processos inflamatórios (BURNSTOCK, 2002). O sistema purinérgico envolve três componentes principais: os nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares, os receptores através dos quais estes nucleotídeos e.

(21) 20. nucleosídeos exercem seus efeitos e as ectoenzimas responsáveis pelo controle dos níveis extracelulares destas moléculas (YEGUTKIN, 2008). Os nucleosídeos são moléculas resultantes da união de uma base púrica ou pirimídica a uma pentose. Quando os nucleosídeos são fosforilados por quinases específicas ocorre a formação dos nucleotídeos. Os nucleosídeos e nucleotídeos derivados de purinas exercem um papel de moléculas sinalizadoras extracelulares em vários tecidos, através dos receptores purinérgicos (ABBRACCIO et al., 2009; BURNSTOCK & KNIGHT, 2004). Sendo assim, os nucleotídeos ATP, ADP, AMP e seu nucleosídeo correspondente, a adenosina, possuem uma multiplicidade de funções teciduais incluindo desenvolvimento, fluxo sanguíneo, secreção, inflamação e tromborregulação (ROBSON et al., 2006), além de regular a resposta vascular ao dano endotelial por exercerem uma variedade de efeitos nas plaquetas (BIRK et al., 2002). Além de serem liberados no meio extracelular por células sanguíneas e vasculares, como eritrócitos, plaquetas, e endotélio (LUTHJE, 1989; DUBYAK et al., 1993), os nucleotídeos podem também ser liberados frente à injúria celular, nos sítios inflamatórios ou de estresse oxidativo, onde há um aumento da liberação de nucleotídeos. Já a adenosina pode ser liberada no meio extracelular como resultado da degradação do ATP e ADP por enzimas específicas (HUNSUCKER et al., 2005; YEGUTKIN, 2008), ou através de transportadores na membrana das células que transportam a adenosina de dentro das células para o meio extracelular (BOROWIEC et al., 2006). Os nucleotídeos de adenina constituem 90% dos nucleotídeos plaquetários e encontram-se distribuídos em dois pools distintos: o pool metabólico, utilizado na manutenção das funções celulares, constituído principalmente por ATP, e o pool de armazenamento, que contém ATP e ADP para a liberação durante a secreção plaquetária (LEE et al., 1998). O ATP exerce influência sobre o sistema vascular, onde pode interferir no processo de agregação plaquetária, mediar vasoconstrição via receptores do subtipo P2X1 e promover proliferação de células musculares lisas e células endoteliais (RALEVIC; BURNSTOCK, 2003). Juntamente com o ADP, o ATP é liberado dos grânulos plaquetários no momento em que estas células sofrem o processo de ativação e possui um duplo efeito sobre a agregação das plaquetas: em baixas concentrações pode aumentar a agregação plaquetária induzida pelo colágeno,.

(22) 21. trombina e tromboxano A2, enquanto que em altas concentrações provoca a inibição deste fenômeno (SOSLAU; YOUNGPRAPAKORN, 1997; ROZALSKI et al., 2005). O ADP é reconhecidamente o principal agente indutor da agregação de plaquetas. Quando ocorre um evento que desencadeie a agregação plaquetária este nucleotídeo é liberado destas células e recruta novas plaquetas vindas da circulação de forma a amplificar o sinal agregatório (BAKKER et al., 1994). A adenosina, resultante da hidrólise dos nucleotídeos de adenina, é um potente inibidor da agregação plaquetária e também atua como modulador do tônus vascular (ANFONSSI et al., 2002). Estudos descreveram a vasodilatação coronária mediada por este nucleosídeo durante hipóxia como tentativa de aumentar o fluxo sanguíneo e restaurar o suprimento de oxigênio ao tecido cardíaco (RALEVIC; BURNSTOCK, 2003). Foram descritos 4 receptores através dos quais a adenosina exerce suas funções: A1, A2A, A2B e A3, todos os receptores são glicoproteínas transmembrana acopladas à proteína G. Sabe-se que a vasodilatação induzida pela adenosina é resultado da ativação dos receptores A2 que são expressos em praticamente todo o sistema vascular dos mamíferos (BURNSTOCK, 2003). As concentrações de ATP, ADP, AMP e adenosina são influenciadas por vários fatores, tais como: secreção e/ou lise celulares, efeito da diluição no espaço extracelular e pela ação catalítica de uma variedade de enzimas ancoradas na membrana celular ou localizadas no meio intersticial de forma solúvel (MALMSJO et al., 2000; ZIMMERMANN et al., 2007). Dentre estas enzimas podem-se destacar as E-NTPDases (Ecto-nucleotídeo trifosfato difosfoidrolase, EC 3.6.1.5), a família das E-NPPs (Ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases, EC 3.6.1.5), a ecto-5’nucleotidase (E.C. 3.1.3.5) e ecto-adenosina desaminase (ADA, EC 3.5.4.4) (ROBSON et al., 2006; YEGUTKIN, 2008). Juntas estas enzimas compõe uma cadeia enzimática cuja atuação tem início com a ação da E-NTPDase e da E-NPP, as quais catalisam a hidrólise do ATP e do ADP formando AMP. Em seguida a enzima 5’-nucleotidase hidrolisa a molécula do AMP formando adenosina, que por fim é degradada pela ADA gerando inosina (Figura 4) (GODING, 2000; ZIMMERMANN, 2001)..

(23) 22. Figura 4 - Cascata de ectoenzimas responsáveis pela hidrólise de nucleotídeos de adenina e adenosina (Adaptado de YEGUTKIN, 2008).. E-NTPDase (ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) é o termo genérico para designar uma família de enzimas presentes na membrana plasmática de diversos tecidos, que catalisam a hidrólise de nucleotídeos di e trifosfatos até suas formas monofosfato (ZIMMERMANN, et al., 2007). Atualmente, oito membros da família das E-NTPDases já foram identificadas, as quais são denominadas NTPDases 1-8 e diferem entre si quanto à especificidade ao substrato (NDP ou NTP) e a cátions divalentes (ROBSON et al., 2006). Quatro das NTPDases são enzimas tipicamente localizadas na membrana celular com um sítio catalítico na face extracelular (NTPDase 1, 2, 3 e 8) e quatro delas exibem localização intracelular (NTPDases 4, 5, 6 e 7) (Figura 5) (ROBSON et al., 2006). Os diferentes subtipos de NTPDase diferem quanto à localização celular e às propriedades funcionais. As quatro formas localizadas na superfície celular (NTPDase 1,2,3,8) podem ser diferenciadas de acordo com a preferência pelo substrato, uso de cátion divalente e formação de produto. Todas as NTPDases localizadas na superfície requerem Ca2+ ou Mg2+ para sua máxima atividade (ZIMMERMANN, 2001; KUKULSKI et al., 2005)..

(24) 23. Figura 5 - Membros da família das enzimas E-NTPDases (Adaptado de ROBSON et al., 2006).. A NTPDase-1 (Apirase, CD39), a qual hidrolisa tanto ATP como ADP formando AMP na presença de íons Ca2+ e Mg2+, foi a primeira enzima da família das NTPDases a ser descrita, e está ancorada na superfície celular através de duas regiões transmembrana próximas ao grupamento amino e carboxi terminal, com o seu sítio catalítico voltado para o meio extracelular (Figura 6) (ZIMMERMANN, 2001). Uma expressão abundante foi encontrada no endotélio vascular, nas células da musculatura lisa, no pâncreas, nas células dendríticas e em células sanguíneas como linfócitos, plaquetas e eritrócitos, bem como no plasma (FRASSETO et al., 1993; SARKIS et al., 1995; PILLA et al., 1996; ZIMMERMANN, 2001; YEGUTKIN, 2008). A NTPDase-1 de plaquetas intactas de humanos pode estar envolvida na regulação da concentração dos nucleotídeos, na circulação e no tônus vascular (ENJYOJI,et al., 1999). Estudos demonstraram que a NTPDase-1 inibe a agregação plaquetária por participar da cascada de degradação dos nucleotídeos ATP e ADP e, juntamente, com a 5'-nucleotidase promover a formação de adenosina, um metabólito antiagregante, além de inibir a glicoproteína GPIIb/IIIa (SCHETINGER et al., 2008). As respostas tromborregulatórias da NTPDase também podem ser observadas em estudos in vivo e in vitro que demonstraram sua participação na.

(25) 24. hemostasia através de um potente efeito antitrombótico (MARCUS et al., 2003; MARCUS et al., 2005).. Figura 6- Estrutura das enzimas E-NTPDases (Adaptado de ZIMMERMANN, 2001).. A NTPDase-2 é particularmente associada com o sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP) e a enzima presente no sistema vascular pode regular ou inibir a agregação plaquetária induzida pelo ADP ou ATP (YEGUTKIN, 2008). A NTPDase-3 está associada com estruturas neuronais, onde ela pode atuar regulando os níveis de ATP nos locais pré-sinápticos e coordenar a homeostase de processos como a fome e o sono. As NTPDases 5 e 6 têm uma localização intracelular e podem ser clivadas formando uma proteína solúvel. As NTPDases 4 e 7 estão localizadas completamente no meio intracelular com face para o lúmen de organelas citoplasmáticas (ZIMMERMANN, 2001). A NTPDase-8, última a ser caracterizada, mostrou uma grande expressão no fígado com níveis menores da enzima detectados nos rins e jejuno. A enzima também demonstrou envolvimento na regulação da secreção da bile (YEGUTKIN, 2008). A ecto-5'-nucleotidase é uma glicoproteína ligada a membrana via um glicosilfosfatidilinositol (GPI) com seu sítio catalítico voltado para o meio extracelular (Figura 7) que catalisa a hidrólise éster fosfórica do 5'-ribonucleotídeo para o correspondente nucleosídeo e fosfato. Geralmente o nucleotídeo mais susceptível a hidrólise é o AMP, o qual formará a adenosina (ZIMMERMANN, 2001). O.

(26) 25. ancoramento da enzima pode ser clivado por uma fosfolipase C específica para GPI dando origem às formas solúveis da enzima (ZIMMERMANN, 1992).. Figura 7 - Estrutura da enzima 5'-nucleotidase (Adaptado de ZIMMERMANN, 2001).. A ecto-5'-nucleotidase é expressa em uma variedade de tecidos como o nervoso, o renal e o hepático e em diferentes tipos celulares entre os quais as plaquetas (ZIMMERMANN, 1992). Sete membros já foram caracterizados, apresentando diferentes localizações: cinco deles localizam-se no citosol, um na matriz mitocondrial e um ancorado na membrana plasmática. Todas as formas citoplasmáticas são dependentes de Mg2+. Os sete membros diferem entre si através das suas propriedades moleculares e cinéticas, bem como de sua especificidade pelo substrato (BOROWIEC et al., 2006). A ecto-5’-nucleotidase pode exercer uma ampla variedade de funções dependendo de sua expressão tecidual e celular. O principal papel fisiológico atribuído a ecto-5’-nucleotidase, é a formação de adenosina a partir do AMP extracelular. No sistema nervoso, ativação dos receptores P1 resulta principalmente na inibição da liberação de neurotransmissores excitatórios (BRUNDEGE; DUNWIDIE, 1997), enquanto que em sistema vascular, resulta em vasodilatação e na inibição da agregação plaquetária (KAWASHIMA et al., 2000). A ADA também faz parte do conjunto de enzimas responsáveis pela cadeia de inativação das purinas. A ADA é responsável por catalisar a desaminação irreversível de adenosina e 2'-deoxioadenosina para inosina e 2'-deoxiinosina,.

(27) 26. respectivamente. Desta forma a ADA, é responsável por regular as concentrações extracelulares de adenosina (YEGUTKIN, 2008). Em humanos, três formas moleculares da ADA já foram encontradas: a ADA1, a ADA1+ CP, a qual é formada por duas moléculas de ADA1 combinadas por uma proteína de ligação (CP), e a ADA2 codificada por um gene separado de posição ainda desconhecida. Essas formas da enzima diferem entre si através de características como peso molecular, propriedades cinéticas e distribuição tecidual (HIRSCHHORN; RATECH, 1980; UNEGERER et al., 1992). As duas primeiras possuem similaridades nas subunidades catalíticas e não diferem significativamente em suas propriedades cinéticas. Em contraste, a ADA2 tem menor afinidade para adenosina e menor atividade catalítica com a deoxiadenosina que a ADA1 (VAN DER WEYDEN et al., 1976; RATECH et al., 1981). A ADA1 está presente em todos os tecidos humanos e representa a maior parte da atividade da ADA total, enquanto que a ADA2 é a isoenzima predominante no soro (ZUKKERMAN et al., 1980). Nos últimos anos, diversos estudos desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa têm evidenciado a importância das ecto-enzimas NTPDase, E-NPP, 5’nucleotidase e ADA no processo de tromborregulação em várias condições patológicas, como o câncer (ARAÚJO et al., 2005, MALDONADO et al., 2010; ZANINI, et al., 2012), insuficiência renal (SILVA et al., 2005), esclerose múltipla (SPANEVELLO et al., 2010), artrite reumatoide (BECKER et al., 2010), infarto agudo do miocárdio (BAGATINI et al., 2011) e diabetes (LUNKES et al., 2003, 2004, 2008; SCHMATZ et al., 2009). Do mesmo modo, estudos envolvendo a atividade das ectonucleotidases no hipotireoidismo e no hipertireoidismo também vêm sendo realizados e seus resultados demonstram alterações enzimáticas, evidenciando a suscetibilidade destas enzimas a variações nos níveis dos hormônios tireoidianos (BRUNO, 2003; BRUNO, 2005; COTOMACCI, 2012). Considerando-se tais trabalhos que sugerem uma possível participação do sistema purinérgico na patofisiologia de várias doenças, entre elas patologias endócrinas, como é o caso do hipotireoidismo, torna-se extremamente interessante elucidar as possíveis relações entre o sistema purinérgico e as patologias associadas ao hipotireoidismo decorrentes de alterações plaquetárias, tão frequentes nos pacientes portadores desta doença..

(28) 27. Cabe ressaltar que alguns estudos têm sugerido que o estresse oxidativo que acompanha o hipotireoidismo pode induzir disfunção endotelial e aumentar a reatividade plaquetária através de efeitos diretos sobre as plaquetas, tais como um aumento da peroxidação lipídica e depleção de sistemas de defesa antioxidantes (FREEDMAN, 2008). Em conjunto, estes mecanismos podem contribuir para o aumento do potencial trombótico evidenciado no hipotireoidismo (COLWELL; NESTO, 2003; GRANT, 2007). O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio dos sistemas pró-oxidantes e antioxidantes em células intactas, gerando danos oxidativos a lipídios, proteínas e ácidos nucléicos (BAE et al., 2001; RÉDON et al., 2003), que se não forem reparados, alterarão a funcionalidade de células, tecidos e órgãos (BARREIROS; DAVID, 2006) (Figura 8).. Figura 8 – Principais espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e seus alvos biológicos. (Adaptado de TORRES, 2003).. A oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do metabolismo e, assim, as espécies reativas são produzidas naturalmente ou por alguma disfunção biológica (BARREIROS et al., 2006). Os radicais derivados do oxigênio e nitrogênio, mais conhecidos como espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs), são moléculas altamente instáveis, com meia-vida curta e, quimicamente,. muito. reativas,. pois. apresentam. desemparelhados em seus orbitais externos.. um. ou. mais. elétrons.

(29) 28. Os radicais derivados do oxigênio representam a classe mais importante de espécies radicais geradas nos sistemas vivos. O ânion superóxido (O2.-), é a EROs primária, resultante da redução monovalente do O2 até H2O e pode reagir com outras moléculas para gerar EROs secundárias (VALKO et al., 2007). O (O2.-) é considerado um radical pouco reativo, entretanto, pode estar associado a lesões biológicas secundárias (FERREIRA; MATSUBARA, 1997). O radical hidroxil (OH-) tem uma alta reatividade, com uma meia vida bem curta de aproximadamente 10-9s. Outra ERO, gerada nos sistemas vivos, é o radical peroxil (ROO-). Os peroxissomos são conhecidos por produzir o peróxido de hidrogênio (H2O2), sob condições fisiológicas, onde o consumo de oxigênio leva à produção de H2O2, o qual participa da oxidação de uma variedade de moléculas (VALKO et al., 2007).. Figura 9 - Formação de espécies reativas de oxigênio (Adaptado de NORDBERG; ARNER, 2001).. O alvo primário das espécies reativas depende do tipo de célula, da natureza do estresse imposto, do sítio de geração, da proximidade das EROs de um alvo específico e da gravidade do estresse produzido (DALLE-DONNE et al., 2006). Dos componentes celulares, a membrana é a mais susceptível à ação deletéria das espécies reativas, devido à peroxidação lipídica que acarreta em alteração na estrutura e na permeabilidade da membrana celular, com perda da fluidez e consequente perda de seletividade nas trocas iônicas com liberação do conteúdo de organelas, levando à formação de produtos citotóxicos e até a morte celular (DMITRIEV; TITOV, 2010). Um dos produtos da lipoperoxidação bem conhecidos é o malondialdeído (MDA), que é o produto final da degradação não enzimática de ácidos graxos poliinsaturados (CHERUBINI et al., 2005). Altos níveis de MDA elevam a formação de lipoperóxidos e indicam um aumento da lipoperoxidação (KASHYAP et al., 2005)..

(30) 29. As moléculas proteicas também podem sofrer importantes alterações por meio da ação danosa das espécies reativas, desencadeando o processo de oxidação dos aminoácidos e alterando, assim, a capacidade funcional das proteínas (LEVINE et al., 1990; XU et al., 1997). Além disso, há evidências de que as espécies reativas podem danificar o DNA, gerando mutações decorrentes da divisão celular não reparada. Se ocorrerem alterações em genes críticos, tais como oncogênese e genes supressores tumorais, podem resultar em iniciação ou progressão de tumores (MEYDANI et al., 1986). Os níveis de peroxidação lipídica são frequentemente utilizados como marcadores de dano oxidativo em diversas patologias, entre elas o hipotireoidismo. Diversos estudos relatam o aumento desses biomarcadores em pacientes hipotireóideos, indicando um aumento na produção de EROs e consequente estresse oxidativo nessa endocrinopatia (BASKOL et al., 2007; NANDA, et al., 2008; TORUN, et al., 2009) Para neutralizar os efeitos e evitar os danos causados nas biomoléculas pela produção excessiva de EROs, o organismo humano apresenta mecanismos de defesa intrínsecos e extrínsecos, denominados antioxidantes. Os antioxidantes são definidos como qualquer substância que retarde, previna ou remova o dano oxidativo a uma molécula (HALLIWELL, 2007). Eles promovem a supressão direta de radicais livres (pró-oxidantes), fornecendo a proteção máxima para os sítios biológicos (MASUTANI, 2000). As defesas antioxidantes inerentes a uma célula incluem defesas enzimáticas e não enzimáticas. A defesa enzimática envolve a ação cooperativa de três principais enzimas intracelulares: a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx), que agem juntas na neutralização das EROs (NORDBERG et al., 2001) (Figura 10). A SOD é uma enzima antioxidante que catalisa a dismutação do ânion radical superóxido a oxigênio molecular (OBERLEY; BUETTNER, 1979). Já a CAT promove a conversão de peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio molecular e a GPx, que contém selênio em seu sitio ativo, também auxilia na remoção do H2O2 (MANOHARAN, KALANJIAPPAN; KAYALVIZHI, 2004)..

(31) 30. Figura 10 - Mecanismo enzimático antioxidante (Adaptado de NORDBERG; ARNER, 2001).. A CAT é uma enzima tetramérica constituída de 4 subunidades de 60 KDa e cada uma das subunidades é composta por um grupamento ferro-protoporfirina. Esta enzima é responsável pela degradação do 2H2O2 em altas concentrações, conduzindo a formação de 2H2O + O2 (MATÉS; SANCHEZ-JIMÉNEZ, 1999; MATES et al., 1999).Esta enzima possui uma das mais altas taxas de renovação, sendo que uma molécula de CAT pode converter cerca de 6 milhões de moléculas de H 2O2 em H2O e O2 a cada minuto (HALLIWELL, 2000). A CAT está presente nas células de plantas, animais e bactérias aeróbicas. Encontra-se localizada em uma organela celular denominada peroxissomo. Quando os peroxissomos são danificados, podem causar alterações nas suas atividades enzimáticas, liberando o H2O2 no citosol (VALKO et al., 2006; VALKO et al., 2007). O H2O2 tem vida longa, é capaz de atravessar camadas lipídicas, podendo reagir com a membrana eritrocitária e com proteínas ligadas ao Fe 2+. Apesar de não ser um radical livre, pela ausência de elétrons desemparelhados na última camada, o H 2O2 é um metabólito do oxigênio extremamente deletério, porque participa da reação que produz o radical OH• (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2000, WIERNSPERGER, 2003). Por outro lado, buscando a cura, a melhora ou mesmo a prevenção de diversas patologias, nos últimos anos tem sido atribuída aos alimentos, além da função nutricional e de prover apelo sensorial, uma terceira função relacionada à resposta fisiológica específica produzida por alguns alimentos. Estes têm sido estudados com total atenção e interesse, aumentando cada vez mais o embasamento científico para novos estudos (LEIFERT; ABEYWARDENA, 2008; IRITI & FAORO, 2009). Neste contexto, o uso de compostos naturais provenientes da dieta como os flavonoides vem sendo amplamente estudado..

(32) 31. Alguns estudos têm evidenciado os efeitos benéficos de uma dieta rica em flavonoides e suportam a ideia de que as propriedades antioxidantes desses compostos podem reduzir as reações de peroxidação lipídica e retardar o processo de aterogênese. Hertog et al. (1993), através de um estudo epidemiológico demonstraram que a incidência de doença coronariana em homens idosos é inversamente proporcional ao consumo de flavonoides, evidenciando então os benefícios de uma dieta rica nestes compostos. Os efeitos benéficos para a saúde associados ao consumo dos flavonoides tem sido atribuídos às inúmeras propriedades farmacológicas que estes compostos possuem além dos seus efeitos antioxidantes bem estabelecidos, tais como: propriedades anticarcinogênica, vasodilatadora, anti-inflamatória, antimicrobiana, imunoestimulante, antialérgica, vasoprotetora, neuroprotetora, entre outras (COOK & SAMMAN 1996; RICE-EVANS et al., 1996; ZUANAZZI, 2002; MIDDLETON et al., 2000; CHO et al., 2003; PRIOR, 2003; KANG et al., 2005). Os flavonoides são compostos polifenólicos cuja síntese não ocorre nos animais. São biossintetizados a partir da via dos fenilpropanoides e do acetato, precursores de outros grupos principalmente como aminoácidos alifáticos e terpenoides (MANN, 1987). A estrutura básica dos flavonoides consiste em um núcleo fundamental, constituído por 15 átomos de carbono, com estrutura básica C6C3C6 (Figura 11), onde os dois anéis C6 são necessariamente aromáticos (A e B) conectados por uma ponte de 3 carbonos, que geralmente contem um átomo de oxigênio (anel C) (RICE-EVANS, 2004; MANACH, et al., 2004). Os flavonoides diferem entre si pelas características particulares na sua estrutura química, como nos tipos de ligações, nas quantidades de grupamentos hidroxilas e na presença ou não de grupos cetonas (SIMÕES et al., 1999; NIJVELDT, et al., 2001). Esta grande diversidade estrutural permite a classificação dos flavonoides em diferentes classes, tais como flavonas, flavononas, flavanóis, flavonóis, diidroflavonóis e antocianidinas (HASVSTEEN, 2002)..

(33) 32. Figura 11 – Estrutura química dos flavonoides (Adaptado de DI CARLO et al., 1999).. A estrutura química dos flavonoides prediz sua atividade sequestradora de radicais livres, podendo prevenir lesões causadas pelas EROs e ERNs através de vários mecanismos. Estes compostos agem quelando espécies reativas e estabilizando-as quimicamente. O mecanismo mais provável para esta ação seria a elevada reatividade do grupo hidroxila presente na estrutura da maioria dos flavonoides (HANASAKI et al., 1994). Os flavonoides podem ser encontrados em duas formas: livres (agliconas) ou ligados. a. açúcares. (glicosídeos).. São. considerados. substâncias. lipo. e. hidrossolúveis, sendo as formas livres de açúcares, mais apolares, e as formas glicosiladas, mais polares (BRAVO,1998). Sabe-se que a forma intacta glicosilada é dificilmente absorvida no intestino delgado devido ao favorecimento da sua hidrofilicidade (CRESPY, et al.,1999). Os flavonoides são os compostos mais diversificados no reino vegetal. Estes compostos são universalmente encontrados em uma grande variedade de frutas, vegetais e algumas bebidas, incluindo chá e vinho, e por isso, são largamente consumidos na dieta humana (KIM et al., 2006; HERTOG et al., 1993). Entre os flavonoides, a quercetina é um dos mais abundantes representando aproximadamente 95% do total de flavonoides ingeridos na dieta humana, sendo que a cebola, maçã e o brócolis são as suas principais fontes (MUROTA; TERAO, 2003). É classificada como um flavonol típico e a sua denominação científica é 2(3,4diidroxifenil)-3,5,7-triidroxil-4H-1-benzo-piran-4-ona, ou também denominada de 3,5,7,3’,4’- pentahidroxiflavona pela Organização Internacional de Química pura e aplicada (IUPAC), do inglês: International Union of Pure and Applied Chemistry..

(34) 33. A quercetina apresenta capacidade de unir-se a polímeros biológicos, tais como enzimas, transportadores de hormônios e DNA, podendo quelar íons metálicos de transição, tais como Fe2+ e Cu2+, catalisar transporte de elétrons e depurar radicais livres (SILVA et al., 2006). Considera-se que a quercetina tem excelente potencial. antioxidante. por. suas. propriedades. de. eliminar. radicais. livres,. especialmente radicais hidroxil e superóxido (RICE EVANS & MILLER, 1996; VAN HOORN et al., 2002). Essa atividade antioxidante e farmacológica é devida a determinados grupamentos em sua estrutura (Figura 12) destacando o grupamento catecol como o mais importante, além da presença de instauração e função 4-oxo no anel C (SPENCER et al., 2003).. Figura 12 - Estrutura do flavonoide Quercetina. Em destaque: O grupamento catecol que é o mais importante (amarelo), presença de insaturação no anel C (vermelho), presença de função 4-oxo no anel C (verde). O grupo catecol e as outras funções (azul) possuem a habilidade em quelar metais de transição como o cobre e o ferro. (Adaptado de SPENCER et al., 2003).. Geralmente, a quercetina é encontrada na forma glicosilada e a digestão da maior parte dos glicosídeos de quercetina inicia na cavidade oral com a clivagem dos glicosídeos catalisada por β-glicosidases (WALLE et al., 2005). Uma vez aglicosilada torna-se um composto facilmente absorvido por pequenas células intestinais onde sofre hidrólise para posteriormente entrar na corrente sanguínea. (MUROTA & TERAO, 2003). Seus metabólitos não utilizáveis são excretados pela urina. Uma vez atingida a corrente sanguínea, este flavonoide, como todos os demais, será metabolizado no fígado e distribuído através da circulação sanguínea.

(35) 34. para todos os tecidos e poderá então realizar uma gama de efeitos, em sua grande maioria, benéficos (MUROTA & TERAO, 2003; MANACH et al., 2005). Por tratar-se de um composto amplamente distribuído nos produtos alimentares, a estimativa de ingesta diária é de aproximadamente 25 mg/dia e a toxicidade é baixa (COOK & SAMMAN, 1996; CHOI et al., 2003). Em um estudo conduzido pelo “National Toxicology Program” em 1992, ratos foram submetidos a uma dieta com quercetina em doses que se assemelhavam a estas da dieta estabelecida para humanos por um período de 6 meses e não foram encontrados indícios de efeito tóxico. Estudos realizados nos últimos anos têm demonstrado que o consumo diário da quercetina pode estar associado com um risco diminuído de doença cardiovascular, desenvolvimento de tumor, doenças neurodegenerativas e acidente vascular cerebral (RATNAM, 2006; SOLEAS, 2006). Além disso, vários estudos têm demonstrado que a quercetina protege contra dano oxidativo ao DNA (FAROMBI, 2006), peroxidação de lipídios (YAMAMOTO; OUE, 2006) e liberação da inibição de mediadores inflamatórios (CHO et al., 2003; MAMANI-MATSUDA et al., 2006). Em muitas. situações,. essas. ações. provavelmente. envolvem. sua. propriedade. antioxidante (PRIOR, 2003). Deste modo, considerando-se os inúmeros efeitos benéficos da quercetina e a elevada incidência de hipotireoidismo na população e pelo fato destes pacientes apresentarem uma série de alterações fisiológicas, torna-se relevante um estudo da atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeos de adenina, da agregação plaquetária e do estresse oxidativo em plaquetas em um modelo experimental de ratos com hipotireoidismo tratados com quercetina a fim de esclarecer os mecanismos envolvidos nesta patologia e também contribuir para a busca de terapias complementares que possam beneficiar pacientes com esta endocrinopatia..

(36) 35. 2. OBJETIVOS. 2.1 . Objetivo geral. Avaliar o efeito do tratamento com quercetina na atividade das enzimas que hidrolisam nucleotídeos e nucleosídeos de adenina, bem como nos biomarcadores de estresse oxidativo e na agregação plaquetária de ratos com hipotireoidismo induzido por metimazol.. 2.2. Objetivos específicos  Determinar o efeito do tratamento com quercetina na atividade das enzimas NTPDase, 5’-nucleotidase e adenosina desaminase em plaquetas de ratos hipotireoideos.  Verificar o efeito do tratamento com quercetina na agregação plaquetária de ratos hipotireoideos.  Verificar o efeito do tratamento com quercetina nos níveis de peroxidação lipídica e na atividade da enzima catalase em plaquetas de ratos com hipotireoidismo..

(37) 36. 3. MANUSCRITO. Efeitos da quercetina na atividade de ectoenzimas e no perfil oxidativo em plaquetas de ratos com hipotireoidismo.. Effects of quercetin in activity of ectoenzymes and in oxidative profile of platelets of rats with hypothyroidism.. Jucimara Baldissarelli1, Adriana Santi1, Roberta Schmatz1, Caroline C. Martins1, Daniela Zanini1, Andréia M. Cardoso1, Gustavo R. Thomé1, Glaecir R. M. Dias1, Camila Murussi1, Carla R. N. Polachini1, Diéssica P. Delenogare1, Cássia B. da Silva2, Vânia L. Loro1, Vera M. Morsch1, Maria R. C. Schetinger1*. Submetido à revista Biochimie.

(38) 37. Effects of quercetin in activity of ectoenzymes and in oxidative profile of platelets of rats with hypothyroidism.. Jucimara Baldissarelli1, Adriana Santi1, Roberta Schmatz1, Caroline C. Martins1, Daniela Zanini1, Andréia M. Cardoso1, Gustavo R. Thomé1, Glaecir R. M. Dias1, Camila Murussi1, Carla R. N. Polachini1, Diéssica P. Delenogare1, Cássia B. da Silva2, Vânia L. Loro1, Vera M. Morsch1, Maria R. C. Schetinger1*. 1. Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica,. Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade Federal de Santa Maria, Campus Universitário, Camobi, 97105-900 Santa Maria, RS, Brasil. 2. Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Departamento de Clínica de. Pequenos Animais, Setor de Patologia Clínica Veterinária,Universidade Federal de Santa Maria, Campus Universitário, Camobi, 97105-900 Santa Maria, RS, Brasil..

(39) 38. Abstract. The present study investigates the effect of quercetin, a flavonoid compound with antioxidant, anti-platelet and anti-inflammatory properties on NTPDase, 5'nucleotidase and adenosine deaminase (ADA) activity, as well as the platelet aggregation and oxidative profile in platelets of methimazole (MTZ) - induced hypothyroidism rats. The animal were divided into 6 groups (n=10). The methimazole at a concentration of 20 mg/100mL was administered for 90 days. In the 30th day dosing was performed to demonstrate hormonal induction of hypothyroidism and then the animals were treated with quercetin 10 mg/kg and 25 mg/kg for 60 days. The results demonstrate that NTPDase activity with ATP as substrate was significantly increased in MTZ/W group and treatment with quercetin decreased ATP hydrolysis in MTZ/Q25 group when compared to MTZ/W group. No significant alterations were observed in ADP hydrolysis in MTZ/W group when compared to CT/W group. On the other hand, 5’-nucleotidase activity was decreased in MTZ/W group when compared to MTZ/W group. No significant differences were observed in ADA activity in MTZ/W group, but the treatment with quercetin 25 mg/kg decreased significantly the ADA activity. The results obtained also showed an increase in platelet aggregation in MTZ/W group when compared to control group. When the quercetin was administered reversed the increase in the platelet aggregation in MTZ/Q25 group. The levels of lipid peroxidation in the group of hypothyroid rats were increased, but treatment with quercetin 10 and 25 mg/kg reverted lipid peroxidation to control levels. The evaluation of catalase activity showed a significantly decreased in MTZ/W group when compared to the control group and presented a decrease by treatment with quercetin 10 and 25 mg/kg. In conclusion, this study demonstrated that quercetin interferes with nucleoside and nucleotide hydrolysis adenine and platelet aggregation in MTZ - induced hypothyroidism rats contributing to the prevention of platelet changes, as well as providing protection against oxidative stress presented in this disease.. Keywords: hypothyroidism, quercetin, platelets, ecto-nucleotidases, oxidative stress..

(40) 39. 1. Introduction Thyroid hormones regulate the basal metabolism in mammals and control a variety of physiological processes [1]. Among the alterations most frequent in the thyroid gland, can cite the hypothyroidism, which is a disease relatively common resulting from reduction in the synthesis of thyroid hormones (thyroxine -T4 e triiodotireonine-T3) or of the reduction of action of these hormones in the peripheral tissues [2]. In the presence of hypothyroidism, manifestations can be observed in various organs and tissues, including the cardiovascular system, with increase in systemic vascular resistance, decrease in tissue perfusion and peripheral hypertension [3]. Furthermore, have been reported that hypothyroid patients also presented hypercholesterolemia, increased low density lipoprotein (LDL) and apolipoprotein B [4]. These factors can contribute to a thrombotic condition, since that have demonstrated are able to alter the functional properties of various cell types, including endothelial cells and platelets, with a consequent increase in susceptibility for developing atherothrombosis [5]. Platelets are one of the most important components of blood, participating in the maintenance of vascular integrity via adhesion, aggregation and subsequent thrombus formation at the site of vascular damage. Moreover, blood platelets generate reactive oxygen species (ROS) that can be involved in regulation and modulation of their functions [6, 7]. In fact, is suggested that increased of free radicals plays a role in lipid peroxidation and protein oxidation of cellular structures contributing to damage in vascular system in several pathologies, including the hypothyroidism [8, 9, 10]..

(41) 40. Extracellular adenine nucleotides, such as adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP), and their metabolite adenosine can modulate multiple effects on the vascular system by interacting with specific receptors in platelets and endothelial cells [11]. It is known that micromolar concentrations of ADP are sufficient to induce platelet aggregation, while adenosine is a potent inhibitor of this aggregation and an important modulator of vasculartonus [12]. Studies have suggested a complex role of ATP in the regulation of platelet aggregation [13]. In vitro studies showed that high concentrations of ATP inhibit ADP-induced platelet aggregation [14]. Platelets express a multienzymatic complex on their surface, which is responsible for extracellular nucleotide and nucleoside hydrolysis. This complex includes the enzymes NTPDase (ecto-nucleoside triphosphate phosphohydrolase), ecto-5′-nucleotidase and ecto-adenosine deaminase. (ADA). [15].. NTPDases. hydrolyze ATP and ADP to AMP [16], which is subsequently hydrolyzed to adenosine by ecto5'-nucleotidase [17, 18]. After interacting with specific receptors the adenosine suffers irreversible deamination by ecto-adenosine deaminase (ecto-ADA) leading to inosine production [19].The association these enzymes constitutes a cascade highly organized, which has a very important role in maintaining normal homeostasis and prevent excessive platelet aggregation by regulating the concentration of extracellular adenine nucleotides and nucleosides [20]. The flavonoids constitute the largest and most important group of polyphenolic compounds from plants and are found in fruits, vegetables, grains, flowers, tea and wine. [21].. Among. the. flavonoids. standout. the. quercetin. (3,5,7,3',. 4'-. pentahidroxiflavona), which represents about 95% of the total flavonoids ingested in the diet and is primarily found in apple, bulb and broccoli [22]. Its daily consumption.

(42) 41. may be associated with decreased risk of cardiovascular diseases, tumor development, neurodegenerative diseases and stroke [23, 24]. Furthermore, several studies have demonstrated that the quercetin protect against oxidative DNA damage [25], lipid peroxidation [26, 27] and inhibiting release of inflammatory mediators [28, 29] in many situations, these actions probably involve its antioxidant property [30]. In this context, considering the high incidence of hypothyroidism in the population and the fact that these patients have a series of physiological changes in vascular system, this study aims to evaluate the effects of quercetin in the activity of the enzymes that hydrolyze adenine nucleotides and nucleosides, platelet aggregation and oxidative stress in platelets from methimazole (MTZ) - induced hypothyroid rats, in order to investigate the potentially therapeutic of this compound in hemostatic disorders occurring in the hypothyroidism.. 2. Materials and methods. 2.1. Chemicals The substrates ATP, ADP, AMP, adenosine, as well as trizma base, sodium azide, 4 - (2-hydroxyethyl) -1 - piperazinaetano sulfonic acid (HEPES), malachite green, 95% quercetin (3,5,7,3 ', 4'-pentahidroxiflavone - C15H10O7, approximately 95% purity) , 5,5 '-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid (DTNB), thiobarbituric acid (TBA), trichloroacetic acid (TCA), malondialdehyde (MDA) and Coomassie brilliant blue G were obtained from Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA) and bovine serum albumin, Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous (K2HPO4) ,from Reagen (Colombo, PR, Brazil). All the other chemicals used in this experiment were of the highest purity..