Daniela Remonatto
GLICERÓLISE ENZIMÁTICA DE ÓLEOS VEGETAIS ASSISTIDA POR ULTRASSOM EM MEIO LIVRE DE
SOLVENTE ORGÂNICO SOB AGITAÇÃO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de em Mestre em Engenharia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Jorge L. Ninow Coorientador: Prof. Dr. Débora de Oliveira
Florianópolis 2013
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária
Daniela Remonatto
GLICERÓLISE ENZIMÁTICA DE ÓLEOS VEGETAIS ASSISTIDA POR ULTRASSOM EM MEIO LIVRE DE
SOLVENTE ORGÂNICO SOB AGITAÇÃO
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Engenharia de Alimentos, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos.
Florianópolis, 27 de março de 2013. ________________________ Prof. João Borges Laurindo, Dr.
Coordenador do Curso Banca Examinadora:
_______________________ Prof. Jorge L. Ninow, Dr.
Orientador
________________________ Prof.ª Débora de Oliveira, Dr.ª
Corientadora
________________________ Prof. Marco Di Luccio, Dr. ________________________ Prof. ª Maria Manuela Camino Feltes, Dr. ª
________________________ Lindomar A. Lerin, Dr.
Dedico este trabalho à outra parte de mim, minha mãe Inide e meu pai Dorvalino, exemplos de honestidade, força e luta.
AGRADECIMENTOS
A Deus por me iluminar, pela saúde, pelas pessoas que colocou em meu caminho, enfim, por tornar tudo possível.
A minha família, meus irmãos Alcindo, Célio e Carla, meus cunhados Rodrigo e Claires, meus sobrinhos Fabrício, Aline e Arthur e especialmente aos meus pais por acreditarem em mim, me dar força e conselhos nos momentos alegres e difíceis.
Ao meu orientador Jorge L. Ninow pela confiança, dedicação, incentivo e pelas risadas.
A minha orientadora Débora de Oliveira, por toda a dedicação e conhecimentos repassados a mim neste trabalho, pelo bom-humor e paciência do dia-a-dia, obrigada por fazer parte de mais esta conquista.
Ao meu amigo Lindomar Lerin, obrigada pela amizade, conselhos e toda dedicação neste trabalho.
Aos Professores Marco Di Luccio, Maria Manuela Camino Feltes, Clarissa Dalla Rosa, José Vladmir de Oliveira e Jane Block obrigada por todo conhecimento, disponibilidade e ajuda, repassados a mim durante minha formação.
A Luciane Batistella e Claudia Trentin pela força, ajuda e conselho nos momentos difíceis em frente ao GC.
A “colonada”, Mara e Leandro, Daiane e Flaviano, Helmut, Josamaique, Raquel, Alessandra e Mirian por se tornarem minha segunda família.
A Karen, Neto e Patrícia, obrigado pela incansável colaboração, pelo incentivo nos momentos difíceis, pelos momentos de descontração em meio às dificuldades, vocês com certeza são “Os melhores”.
Aos meus mais que colegas, super amigos Jean, Stéphanie, Glenise, Pedro, Rossana e Fernanda, juntos superamos dificuldades, partilhamos alegrias e amadurecemos nessa caminhada, obrigada por fazerem parte de minha vida.
A Rafaela e André por dividirem, além do apê, a amizade, as risadas e a compreensão nos momentos de desânimo.
Aos meus colegas e amigos do Engebio, Andréia, Denise, Rosana, Jonathan, Francisca, Kellen, Ana Paula, Kelin, Silvana, Mélodi, Wilian e Américo, obrigado pelo carinho e pelas cuias de mate.
A Andressa, Moara e Sibele pela acolhida em Florianópolis e pela imensa amizade construída.
Ao Daniel, Raquel, Rúbia e Leila, obrigado pela disponibilidade, competência e, principalmente, amizade.
A CAPES e PGEA-UFSC pelo apoio financeiro e de infraestrutura, que permitiu a realização deste trabalho.
Mera mudança não é crescimento. Crescimento é a síntese de mudança e continuidade, e onde não há continuidade não há crescimento.
RESUMO
Este trabalho apresenta dados experimentais referentes à glicerólise de óleo de soja e óleo de canola utilizando como catalisador a enzima Novozym 435 em sistema livre de solvente e em ultrassom, para a produção de emulsificantes, monoacilgliceróis (MAGs) e diacilgliceróis (DAGs). Os experimentos com ambos os óleos foram realizados em modo batelada visando o estudo do efeito das variáveis de processo: temperatura (40 a 70 ºC), concentração de enzima imobilizada (2,5 a 10%, m/m, em relação aos substratos), relação molar de glicerol: óleo (0,8:1 a 3:1), agitação (0 a 1200 rpm) e potência do ultrassom (0 a 100%) na produção dos compostos de interesse. O ultrassom e a agitação foram estudados com o intuito de melhorar o contato entre os substratos imiscíveis (óleo e glicerol) e a enzima. Os resultados mostraram que a glicerólise catalisada por lipase em meio livre de solvente com auxílio do ultrassom pode ser uma potencial rota para a produção de altos conteúdos de MAGs e DAGs. Os resultados também mostraram que os maiores níveis de produtos, MAGs + DAGs, foram obtidos quando a razão molar utilizada foi de 0,8:1, para ambos os óleos estudados. Altos conteúdos de MAGs e DAGs foram obtidos usando relação molar de glicerol:óleo de 0,8:1 e concentrações de enzima de 10% (m/m), em 3 horas de reação, 70 ºC, 600 rpm e 40% de potência de ultrassom. Os maiores conteúdos da mistura de MAGs + DAGs (~75% m/m) foram obtidos utilizando relação molar de glicerol:óleo de 0,8:1, 70 ºC, 900 rpm, 120 minutos de reação, concentração de enzima de 10% (m/m) e 40% de potência de ultrassom, para o óleo de canola. Já o óleo de soja teve seus melhores resultados de conteúdo de MAGs + DAGs (~65% m/m) quando se utilizou a relação molar de glicerol:óleo de 0,8:1, 70 ºC, 900 rpm, 90 minutos de reação, concentração de enzima de 10% (m/m) e 40% de potência de ultrassom. Este estudo descreve a viabilidade da produção de compostos de alto valor agregado, monoacilgliceróis e/ou diacilgliceróis, utilizando óleos de relativo baixo custo e com ótimas características nutricionais.
Palavras-chave: Lipase. Monoacilgliceróis. Diacilgliceróis. Óleo de canola. Óleo de soja. Ultrassom.
ABSTRACT
This work presents experimental data referred to the glycerolysis of soybean and canola oils, using Novozym 435 as catalyst, in a solvent-free system under the effect of ultrasound bath, for the obtainment of monoacylcglycerols (MAGs) and diacylglycerols (DAGs) emulsifiers. The experiments with both oils were carried out in batch mode, focusing the study of the process variables: temperature (40 to 70 degree Celsius), concentration of the immobilized enzyme (2.5 to 10% w/w, related to the substrate amount), glycerol:oil molar ratio (0.8:1 to 3:1), agitation (0 to 1200 rpm) and ultrasound potency (0 to 100%) in the production of the compounds of interest. The ultrasound and the agitation effects were analyzed in order to improve the interaction between the immiscible substrates (oil and glycerol) and the enzyme. The results showed that glycerolysis catalyzed by lipase in a system without solvent with the application of ultrasound can be a potential route for the production of high contents of MAGs and DAGs. The results also revealed that higher levels of the desired products, MAGs + DAGs, were obtained when the molar ratio applied was 0.8:1 to both studied oils. High contents of MAGs and DAGs were obtained using this molar ratio and the enzyme concentration of 10% (m/m), during 3 hours of reaction, 70 degree Celsius, 600 rpm and 40% of ultrasound potency. The highest content of the MAGs + DAGs mixture (~75% m/m) was obtained utilizing the molar ratio glycerol:oil of 0.8:1, 70 °C, 900 rpm, 120 minutes of reaction, enzyme concentration of 10% (w/w) and 40% of the ultrasound potency, for the canola oil. For the soybean oil, the better results of the MAGs + DAGs mixture (~65% w/w) were obtained when it was used the molar ratio glycerol:oil of 0.8:1, 70 °C, 900 rpm, 90 minutes of reaction, enzyme concentration of 10% (w/w) and 40% of the ultrasound potency. This study therefore described the viability of the production of compounds of high value (mono and/or diacylglycerols), using relatively cheap oils with great nutritional characteristics.
Keywords: Lipase. Monoacylglycerols. Diacylglycerols. Canola oil.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estrutura genérica de um triacilglicerol...28 Figura 2 – Estrutura de uma molécula de glicerol...35 Figura 3 – Estrutura tridimensional da lipase de Candida antarctica fração B (PDB, 2011) ...39 Figura 4 - Esquema da reação de obtenção de monoacilgliceróis e diacilgliceróis, por glicerólise enzimática...47 Figura 5 - Etapas da reação de glicerólise (1 – 3) e hidrólise (4 – 6)...48 Figura 6 - Formas isoméricas dos monoacilgliceróis ... 50 Figura 7- Formas isoméricas dos diacilgliceróis. ... 52 Figura 8 – Unidade experimental para produção enzimática de MAG e DAG em ultrassom. ... 59 Figura 9: Curva padrão para determinação da concentração de monooleína. ... 68 Figura 10: Curva padrão para determinação da concentração de dioleína68 Figura 11: Gráfico de Pareto para a produção enzimática de mono- e diacilgliceróis utilizando a lipase Novozym 435 em sistema livre de solvente em banho de ultrassom utilizando como substrato o óleo de soja em função das variáveis independentes. ... 72 Figura 12: Gráfico de Pareto para a produção enzimática de mono- e diacilgliceróis utilizando a lipase Novozym 435 em sistema livre de solvente em banho de ultrassom utilizando como substrato o óleo de soja em função das variáveis independentes ... 73 Figura 13: Gráfico de Pareto para a produção enzimática de mono- e diacilgliceróis utilizando como substrato o óleo de soja em função das variáveis independentes temperatura, potência de ultrassom e agitação.75 Figura 14: Gráfico de Pareto para a produção enzimática de mono- e diacilgliceróis utilizando como substrato o óleo de canola em função das variáveis independentes potência e agitação.. ... 77 Figura 15: Avaliação cinética da reação de glicerólise enzimática de óleo de soja em função da agitação em termos de conversão de MAG e DAG, na condição maximizada de produção (70 °C, razão molar dos
substratos de 0,8:1, concentração de enzima 10% (m/m) e potência do ultrassom de 100%). ... 81 Figura 16: Avaliação cinética da reação de glicerólise enzimática de óleo de canola em função da agitação em termos de conversão de MAG e DAG, na condição maximizada de produção (70 °C, razão molar dos substratos de 0,8:1, concentração de enzima 10% (m/m) e potência do ultrassom de 100%). ... 84 Figura 17: Avaliação cinética da reação de glicerólise de óleo de soja em função da potência do ultrassom, em termos de conversão de MAG e DAG, na condição maximizada de produção (70 °C, razão molar dos substratos de 0,8:1, concentração de enzima 10% (m/m) e agitação mecânica em 600 rpm). ... 85
Tabela 1 - Conteúdo de gorduras e ácidos graxos em alguns óleos comestíveis. ... 32 Tabela 2 - Programação dos solventes para as injeções em HPLC. ... 58 Tabela 3 - Preparação das soluções de calibração dos glicerídeos ... 61 Tabela 4 - Faixa de estudo das variáveis independentes da matriz do planejamento para a conversão de mono e diacilgliceróis, através de glicerólise enzimática em sistema livre de solvente em banho de ultrassom ... 63 Tabela 5 - Caracterização de óleos refinados comerciais de soja e canola, quanto ao índice de acidez e peróxido. ... 65 Tabela 6 - Perfil de ácidos graxos dos óleos de canola e soja comerciais refinados ... 66 Tabela 7 - Matriz do planejamento do tipo Plackett & Burman (valores codificados e reais) com resposta em termos de teor de monoacilgliceróis (MAG) e diacilgliceróis (DAG) (%, m/m) para óleo de soja e de canola. ... 69 Tabela 8 - Matriz do planejamento de experimentos (valores reais e codificados) com resposta em termos de teor de monoacilgliceróis (MAG) e diacilgliceróis (DAG) (%, m/m) para óleo de soja. ... 74 Tabela 9 - Matriz do planejamento de experimentos (valores reais e codificados) com resposta em termos de teor de monoacilgliceróis (MAG) e diacilgliceróis (DAG) (%, m/m) para óleo de canola. ... 76 Tabela 10 - Velocidades iniciais de reação e atividades residuais dos estudos cinéticos, após 4 horas de reação dos óleos de soja e canola à 70 o
C, razão molar de 0,8:1 (glicerol:óleo), 10% (m/m) de enzima e 100% potência ultrassônica. ... 82 Tabela 11 - Atividades residuais dos estudos cinéticos, após 4 horas de reação de óleo de soja à 70 °C, razão molar de 0,8:1 (glicerol:óleo), 600 rpm e 10% (m/m) de enzima. ... 85
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AGL Ácidos Graxos Livres
ºC Graus Celsius μL Microlitro μmol Micromol
CG Cromatógrafo gasoso
DCC Delineamento composto central DAG Diacilgliceróis
G:O Glicerol:óleo g Grama
h Hora
HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência I.A. Índice de acidez
I.P Índice de peróxido Kg Quilograma L Litro m Metro MAG Monoacilgliceróis mL Mililitro min Minutos mg Miligrama mm Milímetro m/m Massa/massa m/v Massa/volume ppm Parte por milhão rpm Rotação por minuto
SONAR Sound navigation and ranging TAG Triacilgliceróis
THF Tetraidrofurano U A Unidade de área v/v/v Volume/volume/volume
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...23 1.1 OBJETIVOS ...25 1.1.1 Objetivo Geral...25 1.1.2 Objetivos Específicos...25 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...26
2.1 MODIFICAÇÃO DE ÓLEOS E GORDURAS...26
2.2 ÓLEOS E GORDURAS... ....27 2.2.1 Ácidos Graxos...28 2.2.2 Óleo de Canola...29 2.2.3 Óleo de Soja...33 2.3 GLICEROL...34 2.4 ENZIMAS... ....36
2.4.1 Lipases como Catalisadores... ....37
2.4.2 Enzimas Imobilizadas... ....39
2.5 ULTRASSOM... ....40
2.5.1 Catálise Enzimática em Ultrassom... ....43
2.6 PRODUÇÃO DE EMULSIFICANTES... ....45 2.6.1 Glicerólise Enzimática... ....46 _Toc278224212 2.6.2 Monoacilgliceróis... ....49 2.6.3 Diacilgliceróis... ....51 2.7 CONSIDERAÇÕES FINAIS... ....53 3. MATERIAL E MÉTODOS... ....55 3.1 MATERIAIS... ....55
3.2 CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS... ....56
3.3 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA EM ULTRASSOM...58
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... ....65
4.1 CARACTERIZAÇÃOS DOS ÓLEOS VEGETAIS ...65
4.2 CONSTRUÇÃO DAS CURVAS PADRÃO DE MAG E DAG...67
4.3 AVALIAÇÃO DO EFEITO DAS VARIÁVEIS DE PROCESSO NA PRODUÇÃO DE MAG E DAG... ...68
4.4 CINÉTICA DA PRODUÇÃO DE MONO E DIACILGLICERÓIS EM SISTEMA LIVRE DE SOLVENTE EM BANHO DE ULTRASSOM... ....80
4.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS... ....87 5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES... ....88 5.1 CONCLUSÕES...88 5.2 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS... ..89 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... ..90 APÊNDICE – ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS... 110
1 INTRODUÇÃO
A preocupação com a saúde e com uma melhor qualidade de vida vem ganhando cada vez mais espaço no cenário mundial (AWADALLAK, 2012). Sabe-se que a dieta apresenta um papel importante nas quatro principais classes de doenças da sociedade atual (doenças cardiovasculares, câncer, hipertensão e obesidade) (GOLDBERG, 1994). Óleos e gorduras têm papel fundamental na dieta, como fonte de calorias, veículos de vitaminas lipossolúveis e no fornecimento de ácidos graxos essenciais. Porém, as tendências de transição nutricional ocorridas neste século direcionam para uma dieta mais ocidentalizada, rica em gordura, a qual, aliada à diminuição progressiva da atividade física, converge para o aumento no número de casos de obesidade (AWADALLAK, 2012; FRANCISCHI et al., 2000) e doenças cardiovasculares (CHEONG et al., 2007).
Juntamente com a busca por produtos mais saudáveis, o uso de enzimas para modificar a estrutura e a composição de óleos e gorduras vem crescendo consideravelmente, caracterizando-se em avanços significativos na área de biotransformação (RENDÓN et al., 2001). Diversas pesquisas têm sido focadas na modificação de óleos e gorduras para a obtenção de produtos que aliem propriedades funcionais e/ou de saúde, bem como propriedades tecnológicas que permitam sua utilização nas linhas de processamento (XU, 2004; FELTES et al., 2009). Entre as técnicas existentes, a glicerólise enzimática, para a produção de monoacilgliceróis (MAGs) e diacilgliceróis (DAGs), tem sido alvo de muitos estudos, pois estes glicerídeos são excelentes emulsificantes e moléculas condicionadoras utilizadas na indústria. Além disso, os DAGs têm grande aplicação como aditivo funcional em alimentos, trazendo benefícios para a saúde, tal como a redução da gordura abdominal visceral (CHEONG et al., 2007).
A busca por processos alternativos para a síntese de produtos de interesse para a indústria de alimentos, farmacêutica e cosmética, que não causem ou reduzam os danos ao ambiente, despertou grande interesse dos pesquisadores em todo o mundo, nos últimos anos. Uma alternativa é a síntese enzimática, que apresenta muitas vantagens em relação à síntese química (LERIN, 2010). A biocatálise é a área que apresenta maior crescimento no mercado industrial de moléculas biologicamente ativas. Estima-se que, até o ano de 2025, cerca de 50% dos processos químicos possam ser substituídos por processos biotecnológicos isolados, ou mesmo pela integração entre catálise enzimática e reações químicas (ANTUNES, 2005).
A catálise enzimática, tradicionalmente, limitava-se ao estudo de reações em meio aquoso, o que restringia em muito as possibilidades de aplicações industriais (LERIN, 2010). A partir da observação de que muitas enzimas, tais como as lipases, atuam in vivo em ambientes ricos em lipídeos, constatou-se que os ambientes com restrição de água também poderiam ser meios adequados à catálise enzimática (Baron, 2003). Com isso, as pesquisas com lipases foram se ampliando e demonstrando seu grande potencial tecnológico.
As lipases (triacilglicerol hidrolases, EC 3.1.1.3) são uma família de hidrolases que atuam em ligações de ésteres carboxílicos. Entre os processos de maior interesse industrial estão as reações de hidrólise, síntese e interesterificação de lipídeos por meio destes biocatalisadores. As razões do enorme potencial biotecnológico das enzimas pertencentes a esta classe incluem fatos relacionados com: i) sua alta estabilidade em solventes orgânicos; ii) não requererem a presença de co-fatores; iii) sua larga seletividade pelo substrato e, por isso, iv) sua alta enantiosseletividade (CASTRO et al., 2004).
Os monoacilgliceróis (MAGs), diacilgliceróis (DAGs) ou misturas destes, representam cerca de 70% de todos os emulsificantes sintéticos utilizados nas indústrias alimentícia, farmacêutica e cosmética. Os MAGs e DAGs podem ser obtidos enzimática ou quimicamente. Entre os métodos de produção destes compostos a glicerólise de óleos e gorduras catalisada por lipases tem atraído interesse em diversas pesquisas e também na indústria. As condições brandas de pH e temperatura diminuem o consumo energético e minimizam a ocorrência de reações indesejadas de polimerização (CHEW et al., 2008). Além destas vantagens, pesquisadores podem explorar a seletividade das lipases em relação aos ácidos graxos e sua regioseletividade pela primeira posição das moléculas de glicerol (posição α) em relação à segunda (posição β) (KRÜGER, 2010).
Porém, o uso de enzimas em processos industriais possui alguns inconvenientes, um dos principais é seu alto custo. Uma alternativa é o uso de enzimas imobilizadas que possibilitam a minimização dos custos, pois podem ser reutilizadas, podendo assim tornar estes processos economicamente viáveis. Deve-se, no entanto, levar em consideração que a enzima pode ter sua atividade diminuída após sucessivos ciclos de uso devido, principalmente, à dessorção da enzima do suporte ou mesmo inativação por excesso de substratos e de produtos (BATISTELLA, 2011; BAJAJ et al., 2010).
Outro inconveniente no caso específico da glicerólise é a imiscibilidade dos substratos, que prejudica os rendimentos da reação.
Os efeitos físicos do ultrassom, como o aumento da temperatura, a transferência de massa, a cavitação estável e a transitória vêm a contribuir para o aumento da miscibilidade das fases óleo e glicerol, assim é possível reduzir o tempo de reação e maximizar a produção de monoacilgliceróis e diacilgliceróis. A influência das ondas ultrassônicas na atividade e estabilidade de enzimas tem demonstrado ser específica para cada enzima e dependente dos parâmetros de sonicação (MARTINEZ et al., 2000).
1.1 OBJETIVOS 1.1.1 Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo geral avaliar a potencialidade da produção enzimática de emulsificantes de grau alimentício, monoacilgliceróis e diacilgliceróis, através da glicerólise de óleos vegetais, canola e soja, e glicerol, em meio livre de solvente em sistema de ultrassom, utilizando uma lipase comercial imobilizada, Novozym® 435, como biocatalisador, em modo batelada.
1.1.2 Objetivos Específicos
a) Estudar o efeito das variáveis do processo (temperatura, concentração de enzima, razão molar (glicerol: óleo), agitação e potência do ultrassom) em sistema de ultrassom sobre a obtenção de mono e diacilgliceróis, através da utilização de planejamentos experimentais sequenciais;
b) Estudo cinético para avaliação do efeito de variáveis significativas na conversão do processo, utilizando a condição experimental maximizada na etapa anterior.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Este capítulo tem por finalidade reunir informações específicas sobre reações de glicerólise para obtenção de monoacilgliceróis e diacilgliceróis, por via enzimática, em sistema livre de solvente orgânico utilizando ultrassom, tema central do presente trabalho. Informações fundamentais referentes ao tema também são apresentadas como forma de oferecer subsídio para o entendimento dos resultados obtidos.
2.1 MODIFICAÇÃO DE ÓLEOS E GORDURAS
O desenvolvimento de métodos para melhorar as propriedades nutricionais e funcionais de óleos e gorduras é de grande interesse para a indústria de alimentos (AKOH; MIN, 2008). A relação entre as propriedades físico-químicas dos óleos e gorduras e as suas funções na melhoria da saúde criou maior interesse na modificação destas matérias- primas (GOLDEBERG, 1994). Óleos e gorduras são ésteres de ácidos carboxílicos esterificados em cada uma das hidroxilas da molécula do glicerol, denominados triglicerídeos ou triacilgliceróis (TAG), substâncias constituídas por uma molécula de glicerol ligada a três moléculas de ácidos graxos. A natureza dos seus constituintes, peso molecular, grau de insaturação, distribuição e posição dos ácidos graxos esterificados ao glicerol na estrutura do triacilgliceróis são os principais fatores que determinam as propriedades físicas dos óleos e gorduras. Os TAGs são os principais componentes de qualquer gordura animal ou vegetal. Dependendo da origem do óleo, o conteúdo em TAGs e ácidos graxos (AG) podem variar significativamente (MORETTO; FETT, 1998; AKOH; MIN, 2008).
A estrutura básica dos óleos e gorduras pode ser alterada, pela modificação química dos ácidos graxos (hidrogenação), pela reversão da ligação éster (hidrólise) e reorganização dos ácidos graxos na cadeia principal do TAG (interesterificação) (HAMMOND; GLATZ, 1988). Entre estas tecnologias de modificação, as reações de interesterificação merecem destaque, pois permitem a obtenção de lipídeos específicos, construídos para apresentarem propriedades otimizadas em relação às moléculas originais (OSBORN, 2002; XU, 2004).
Através da interesterificação enzimática é possível maior controle da composição do produto final, e misturas de glicerídeos que não podem ser obtidas utilizando interesterificação química (MACRAE, 1983; GUNSTONE, 1994). Atualmente, a randomização da distribuição
dos grupos acil usando interesterificação química é usada para produzir mudança na estrutura cristalina, conteúdo de gordura sólida, e ponto de fusão de gorduras. Interesterificação utilizando lipases com especificidades particulares tem sido usada para produzir gorduras para fins específicos, tais como substitutos de manteiga de cacau e gorduras de confeitaria (HAUMANN, 1994).
2.2 ÓLEOS E GORDURAS
Óleos e gorduras são reconhecidos como nutrientes essenciais tanto na dieta humana como animal. Além de fornecer a fonte mais concentrada de energia de todos os alimentos, 9 Kcal/g, também fornecem ácidos graxos essenciais, componentes bioativos como antioxidantes, agem como veículo para as vitaminas lipossolúveis, como A, D, E, e K (CLAUSS, 1996) e contribuem com várias características sensoriais dos alimentos, além de apresentarem um importante papel tecnológico (BAILEY, 1979; PIGOTT; TUCKER, 1990; ISEO, 2006).
Óleos e gorduras diferem na medida em que as gorduras são sólidas ou pastosas à temperatura ambiente, enquanto que os óleos são líquidos sob condições similares. O Conselho Nacional de Normas e Padrões para Alimentos define 20 °C como o limite inferior para o ponto de fusão de gorduras (RDC N° 270, 22 SETEMBRO DE 2005). Óleos e gorduras são substâncias hidrofóbicas (insolúveis em água), que pertencem à classe química dos lipídeos, podendo ser de origem animal, vegetal, marinha ou microbiana. Não existe uma definição exata para lipídeos. Moschidis (1985) os define como uma variedade de produtos naturais, incluindo os ácidos graxos e seus derivados, esteróides, terpenos, carotenóides e ácidos biliáticos.
Os óleos vegetais são obtidos por três principais métodos de extração, prensa hidráulica por batelada, prensa mecânica contínua (expeller) e extração por meio de solventes (PIGHINELLI, 2008; AWADALLAK, 2012). O óleo extraído pode conter diversas impurezas como gomas, ceras e ácidos graxos livres, os quais podem prejudicar sua qualidade e estabilidade. No caso de óleos comestíveis efetua-se um processo chamado refino, processo considerado simples, envolvendo a remoção do solvente, a degomagem, o branqueamento, a desacidificação e a desodorização do óleo (BATISTA et al., 1999). Porém, este processo pode causar a perda uma parte do óleo neutro e vitaminas (PEIXOTO et al., 2005).
As propriedades funcionais e características da qualidade das gorduras e dos óleos são diretamente relacionados com o tipo de
triacilglicerol (TAG), que é determinado pela composição de ácidos graxos e a distribuição estereoespecífica de ácidos graxos em suas moléculas. Os TAGs são os maiores constituintes dos óleos e gorduras, mais de 95%. A fração restante é composta principalmente por monoacilgliceróis (MAG), diacilgliceróis (DAG), ácidos graxos livres, proteínas, esteróis, vitaminas e tocoferóis (FARIA et al. 2003; HIDALGO; ZAMORA, 2003). Na Figura 1 é apresentada a estrutura genérica de um TAG. A maioria dos TAGs encontrados em óleos são mistos, ou seja, os resíduos de ácidos graxos (R1, R2, R3) são todos diferentes ou somente dois são iguais, podendo ser saturados ou insaturados.
Figura 1 – Estrutura genérica de um triacilglicerol.
Fonte: Krüger (2010).
2.2.1 Ácidos Graxos
Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos, geralmente monocarboxílicos, com cadeia alifática longa, não ramificada, saturada, monoinsaturada ou poli-insaturada (CURI et al., 2002; BACKES, 2011). Os ácidos graxos saturados, que apresentam apenas ligações simples, são encontrados em alimentos de origem animal, como carne, ovos, queijo, leite, manteiga, gorduras vegetais hidrogenadas e em vegetais
como óleos de coco e palma. Entre os ácidos monoinsaturados, que apresentam uma única ligação dupla na cadeia, o ácido oleico possui destaque, estando presente na maioria das gorduras e carnes animais, incluindo aves e bovinos, bem como azeitonas, sementes e nozes. Os ácidos poli-insaturados, mais de uma dupla ligação na cadeia, representados pelos ácidos linoleico e linolênico, estão presentes em óleos vegetais como o óleo de girassol, milho, soja, algodão, canola, linhaça e peixes de origem marinha (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; CURI et al., 2002).
A posição da dupla ligação na cadeia difere ácidos graxos de igual número de carbonos (BABICZ, 2009). Há ainda a possibilidade de formação de isômeros cis e trans. Na natureza, a grande maioria das duplas ligações nos AG está na conformação cis e dificilmente é encontrado o isômero trans, o qual é amplamente aceito como prejudicial à saúde. Estes compostos podem ser formados devido ao aquecimento, como no caso de frituras. A solubilidade do ácido graxo em água decresce com o aumento da cadeia, em função da sua alta apolaridade, o que se deve ao grupamento carboxílico (AWADALLAK, 2012).
Em relação ao ponto de fusão, ele aumenta com o crescimento da cadeia e decresce com as insaturações. As insaturações em configurações cis, provocam uma “dobra” na cadeia molecular, dessa forma o ácido graxo se organiza em uma configuração curvada, reduzindo sua capacidade de empacotamento e gerando interações de Van der Waals mais fracas, implicando em menor energia para a quebra desse arranjo e consequentemente menores pontos de fusão, o que deixa o lipídeo mais líquido. Quanto mais duplas ligações forem adicionadas, mais curvada se tornará a molécula, mais fracas as interações de Van der Waals e menor o ponto de fusão (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010).
Por outro lado, em ácidos graxos saturados, a cadeia hidrocarbonada existe, geralmente, sob uma forma estendida, uma vez que a conformação linear é o estado de menor energia, permitindo melhor empacotamento dos mesmos, fazendo com que as moléculas fiquem mais próximas umas das outras, e com isso, aumentando o ponto de fusão, quando comparado com os ácidos insaturados (BIESALKI; GRIMM, 2007; CURI et al., 2002). Os ácidos graxos insaturados na configuração trans são mais lineares que os ácidos graxos na configuração cis, assim apresentam pontos de fusão próximos aos dos ácidos graxos saturados, devido ao empacotamento mais forte das
moléculas (BAYLE’S, 2005; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; AWADALLAK, 2012).
Na nomenclatura dos ácidos graxos, verifica-se o uso do sistema ômega (ω) (em alguns casos, designado pela notação taquigráfica de “n”). Esse sistema de numeração alternativo indica a posição das ligações duplas a partir do grupo metil terminal do ácido graxo. O sistema ω é útil em alguns casos, pois pode agrupar os ácidos graxos, com base em sua atividade biológica e sua origem biossintética, já que muitas enzimas os reconhecem a partir da terminação metil da molécula, quando esterificada ao glicerol (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA, 2010; MORETTO; FETT, 1998; BACKES, 2011). Com isso, ácidos graxos de uma mesma família atuam como precursores de outros ácidos graxos da mesma família, a partir daqueles oferecidos na dieta. Por exemplo, o ácido araquidônico é sintetizado a partir do ácido linoleico (18:2). Contudo, os ácidos graxos de uma determinada classe não podem ser biologicamente convertidos em outra classe; isto é, nenhum membro da família ω-9 (ácido oleico) pode ser convertido em ω-6 (ácido linoleico) (CURI et al., 2002; BACKES, 2011).
O uso do termo “essencial” refere-se ao fato de que estes AG desempenham importantes funções e não podem ser sintetizados pelo organismo por meio de precursores (HASLER, 2002). Isso ocorre porque o organismo dos animais é capaz de sintetizar os seus próprios ácidos graxos, mas não consegue introduzir ligações duplas além do C-9. Dessa forma, os ácidos graxos essenciais mais importantes são o ácido linoleico e -linolênico, precursores de ácidos graxos da classe ω-6 e ω-3, respectivamente. Assim, podem-se formar ácidos graxos poli-insaturados mais longos a partir desses dois precursores, pela extensão da dessaturação da cadeia, formando ácidos com pelo menos 20-22 carbonos, como por exemplo, o ácido araquidônico (ω-6), o eicosapentaenóico (EPA) (ω-3) e docosaexaenóico (DHA) (ω-3) (BIESALKI; GRIMM, 2007; BACKES, 2011). Os ácidos graxos essenciais são necessários para manter, sob condições normais, as membranas celulares, as funções cerebrais e a transmissão de impulsos nervosos. Além disso, esses ácidos graxos também participam da transferência do oxigênio atmosférico para o plasma sanguíneo, da síntese da hemoglobina e da divisão celular (MARTIN et al., 2006).
2.2.2 Óleo de canola
Durante as décadas de 90 e 2000, a produção de canola aumentou, tornando-se uma das principais fontes de óleo vegetal no
mundo (BAILEY’S, 2005). Em função da excelente composição de ácidos graxos, o óleo de canola se tornou uma alternativa viável para as pessoas interessadas em uma dieta saudável. Além de conter em torno de 7% de ácidos graxos saturados, cerca da metade do nível presente no azeite de oliva, óleo de soja e milho, esse óleo também apresenta elevados níveis de ácidos graxos monoinsaturados, principalmente o ácido oleico (18:1, ω-9), e uma das maiores fontes de ácido linolênico (18:3, ω-3) (O’BRIEN, 1998; TOMM, 2007; KAMAL-ELDIN; ANDERSSON, 1997).
Canola é um termo genérico internacional, utilizado para designar sementes geneticamente modificadas de colza. A colza é um dos mais antigos óleos vegetais conhecidos, mas seu uso como alimento era limitado devido ao elevado nível de ácidos graxos erúcico (C 22:1) e glucosinolatos. A presença dos glucosinolatos nos alimentos diminui seu o valor nutritivo, pois os produtos hidrolisados de glucosinolatos, chamados de isotiocianatos e outros compostos contendo enxofre, interferem na absorção de iodo pela glândula tireóide, também contribuem para doenças do fígado e reduzem o crescimento e ganho de peso em animais (BAYLE’S, 2005). Em 1970, o Rapeseed Congress Meeting, em Quebec, informou que o conteúdo alto de ácido erúcico era suspeito de causar lesões no coração e formar uma camada de gordura ao redor do coração de alguns animais experimentais (CARR, 1990).
Na década de 60, o óleo de colza começou a despertar interesse, com isso iniciaram-se programas de melhoramentos de plantas no Canadá. Estes estudos resultaram na identificação de uma linha de colza contendo níveis baixos de ácido erúcico. Isto levou ao cultivo da primeira variedade de Brassica napus com baixos níveis de ácido erúcico, em 1968 (BAYLE’S, 2005). Só em 1974, o Dr. Baldur Stefansson, um fitogenista da Universidade de Manitoba, no Canadá, desenvolveu a primeira variedade de colza “double low”, que apresentava menos de 2% de ácido erúcico e menos de 30 mmol/g de glucosinolatos, da qual se pode extrair o óleo ideal para consumo humano (MORETTO; FETT, 1998). O nome canola (Canadian Oil Low Acid) foi oficialmente aceito pela Canadian Grain Comission em 1987, para referir-se ao óleo da torta e semente, proveniente de variedades contendo menos de 2% de ácido erúcico e 3 mg de glucosinolato (TOMM, 2000; ALBUQUERQUE, 2006).
Existem relatos de que as sementes colza eram cultivadas na Índia quase 4000 anos atrás. Mas o plantio em grande escala foi relatado pela primeira vez na Europa, no século XIII. A canola faz parte da família das crucíferas e pertence ao gênero Brassica (BAYLE’S, 2005).
No Brasil, cultiva-se apenas canola de primavera, da espécie Brassica napus L. var. oleifera, a qual possui em torno de 24% a 27% de proteína e de 34 a 40% de óleo. Constitui, hoje, uma das melhores alternativas para diversificação de culturas de inverno e geração de renda pela produção de grãos no Sul do Brasil (TOMM, 2007).
A produção de óleo de canola é a terceira maior em termos mundiais, segundo dados do USDA (United States Department of Agriculture) . Na safra de 2011/2012, a produção do óleo correspondeu a 15% dos óleo vegetais, atrás apenas do óleo palma com 33,2% e do óleo de soja com 28,6%. Além disso, a canola é considerada a terceira maior commodity mundial. Os principais produtores de grãos de canola no mundo são Estados Unidos, Canadá, China e Índia. No Brasil, as principais regiões produtoras são as regiões Centro-Oeste e Sul (CONAB, 2012).
Tabela 1 - Perfil ácidos graxos em alguns óleos comestíveis.
Canola Soja Girassol Milho
Ácidos graxos
Palmítico (%) 5,0 14,1 6,5 13,5
Oleico (g/100g) 62,2 23,4 28,0 35,3
Linoleico (g/100g) 21,4 53,3 61,5 47,6
Linolênico (%) 6,2 4,9 - 0,7
Fonte: Scherr e Ribeiro (2010).
O óleo de canola é caracterizado por um baixo nível de ácidos graxos saturados e níveis elevados de ácido oleico (monoinsaturados) e moderados de -linolênico (poli-insaturados), como pode ser observado na Tabela 1. O ácido graxo mais expressivo em sua composição é o ácido oleico, que ganha destaque, devido a bons resultados na redução do nível de colesterol plasmático e de lipoproteínas de baixa densidade (LDL), quando comparado com ácidos graxos poli-insaturados. Por outro lado, quanto ao teor de ácidos graxos poli-insaturados, o óleo de canola apresenta níveis intermediários, com menor concentração quando comparado com óleo de soja, milho, girassol e algodão (O’BRIEN, 1998). Em estudo realizado por Scherr e Ribeiro (2010), avaliando
diferentes óleos vegetais produzidos no Brasil, quanto aos tipos de gordura, ácidos graxos e colesterol, os autores constataram que o óleo de canola é o ideal para ser consumido, quando levado em consideração a saúde do consumidor. Assim, além de contribuir com ácidos graxos insaturados, o óleo de canola, através do tocoferol, desempenha um papel importante através de mecanismos antioxidantes de tecidos animais, contribuindo para a prevenção de doenças neurodegenerativas, aterosclerose, inflamação crônica, câncer e envelhecimento precoce (GUINAZ et al., 2009).
2.2.3 Óleo de soja
A soja representa 55% da produção mundial de oleaginosas. Os principais países produtores de soja em ordem decrescente são os Estados Unidos, o Brasil e a Argentina, que juntos representam mais de 80% da produção mundial de semente de soja. Em nível nacional, a produção da safra 2011/2012 foi de 162,6 milhões de toneladas e para 2012/ 2013 estima-se safra recorde, com aumento de 10% na produção do grão (CONAB, 2012).
A soja pertence à família Leguminosae e a forma cultivada é a Glycine max (L.) Merrill., o grão de soja contém entre 17 e 22% de óleo em sua composição e 40% de proteína (MARCOS FILHO, 1987). A soja é uma cultura com várias características favoráveis. Primeiro, a soja tem a capacidade de fixar nitrogênio, o que faz com que ela se constitua em uma boa opção de rotação de cultura. Em segundo lugar, a soja é adaptável a uma vasta gama de solos e climas. Em terceiro lugar, a soja tem a notável capacidade de produzir proteína comestível, mais que qualquer outra leguminosa conhecida (LIU, 2004). Considerando-se toda a produção mundial de soja, 16,21% tornam-se óleo. Explica-se esta diferença por que parte da soja é consumida in natura na alimentação humana e animal, apesar do consumo ser preponderantemente industrial (ALAMBERT, 2010).
As evidências históricas e geográficas indicam que a soja teve origem no norte da China, e seu cultivo na região começou há cerca de 5000 anos. Gradualmente, a soja foi transformada em vários alimentos pelos chineses, incluindo tofu, leite de soja, pasta de soja e molho de soja, entre outros. Assim, o cultivo da soja foi introduzido no Japão, Coréia, entre outros países do Extremo Oriente há cerca de 1.100 anos atrás. A soja foi introduzida pela primeira vez na Europa e América do Norte no século 18. No entanto, somente em meados de 1900 que a produção começou a despertar interesse nos Estados Unidos. Milhares
de novas variedades foram trazidas, principalmente da China, durante este período. Até 1954, a China liderou o mundo na produção de soja. Desde então, os Estados Unidos tornou-se o líder mundial (LIU, 2004). No Brasil, a soja foi introduzida na Bahia em 1882 e levada para São Paulo em 1892. No Rio Grande do Sul foi cultivada pela primeira vez em 1900 e em 1936 ocorre o início da expansão desta cultura no estado (COSTA, 1996). Na década de 1980 foi introduzida na região dos Cerrados, tornando-se a cultura anual de maior área plantada no país (ALAMBERT, 2010).
O óleo de soja contém cerca de 23% do monoinsaturados (ácido oleico) e 60% de poli-insaturados (linoleico e linolênico), sendo 4,9% -3), como mostra a Tabela 1. Estudos têm demonstrado que a taxa de oxidação do ácido oleico é muito mais lenta do que a dos ácidos graxos polinsaturados, linoleico e linolênico (WHITE, 2000; FATEMI, 1980). Estes últimos se oxidam rapidamente, provavelmente pela configuração menos estável da molécula, conferindo ao óleo de soja uma menor estabilidade ao armazenamento, comparado por exemplo ao óleo de canola, rico em monoinsaturados. Os lípidos da dieta desempenham um papel no bem-estar da população, bem como são fundamentais no combate a doenças cardiovasculares, doenças patogênicas, entre outros distúrbios. Esse papel depende do comprimento da cadeia carbonada e do número e da geometria das ligações duplas. Em geral, ácidos graxos saturados elevam os níveis de colesterol total enquanto que mono e poli-insaturados apresentam efeito na redução destes níveis. O risco de doença coronária se eleva com o aumento das concentrações de lipoproteína de baixa densidade (LDL) e diminui com o aumento dos níveis de lipoproteína de alta densidade (HDL). Devido ao óleo de soja oferecer baixo teor de ácidos graxos saturados, cerca de 10% do total e ser rico em ácidos graxos insaturados, cerca de 85% total deste óleo pode ser considerado um óleo saudável (BAILEY’S, 2005).
2.3 GLICEROL
O glicerol (1,2,3-propanotriol) (Figura 2) pode ser encontrado em todas as gorduras e óleos, sendo um importante intermediário no metabolismo dos seres vivos. O termo glicerol aplica-se geralmente ao composto puro, enquanto o termo glicerina aplica-se aos produtos comerciais que contenham 95% (m/m) ou mais de glicerol na sua composição. Eles diferem um pouco em seu conteúdo de glicerol e em outras características, tais como cor, odor e impurezas. O glicerol é
hidrofílico, insolúvel em óleos e muito viscoso, fazendo com que em reações com enzimas imobilizadas acabe sendo facilmente adsorvido em sua superfície, podendo prejudicar a atividade da enzima e a estabilidade da reação (Su e Wei, 2008; KRÜGER, 2011).
Figura 2 – Estrutura de uma molécula de glicerol.
Do ponto de vista físico-químico, o glicerol é um líquido incolor, inodoro, viscoso e de sabor adocicado, solúvel em água e álcool em todas as proporções, pouco solúvel em éter, acetato de etila e dioxano e insolúvel em hidrocarbonetos (LÓPES et al., 1999). É atóxico, o que o torna bastante utilizado como aditivo alimentar, atuando como estabilizante, antioxidante, sequestrante, emulsificante e umectante (ARRUDA et al., 2007).
O glicerol pode ser obtido através do processo de manufatura de sabões ou durante a síntese do propeno. É uma matéria-prima bastante versátil, utilizado tradicionalmente nas indústrias de cosméticos, sabões, fármacos e alimentos (FELTES, 2011). Nos últimos anos, a indústria de biodiesel vem se expandindo e com ela o aumento da quantidade da chamada “glicerina loira”, que é a glicerina oriunda dos processos de produção do biocombustível. Em geral, esta glicerina contém cerca de 80% (m/m) de glicerol, além de água, metanol e sais dissolvidos (MOTA et al., 2009). Essa crescente oferta de glicerol, produzido como subproduto da produção de biodiesel, nos últimos anos, ocasionou uma diminuição no seu preço de mercado. Tornou-se, desta forma, necessário buscar novas aplicações para a utilização da glicerina (KRÜGER 2010; FELIZARDO, 2003).
2.4 ENZIMAS
Enzimas são, em sua maioria, moléculas de proteína complexas, atuando como biocatalisadores em diversas reações bioquímicas. Com exceção de certo grupo de moléculas de RNA que apresentam propriedades catalíticas, todas as enzimas são proteínas
(LEHNINGNER; NIELSON; COX, 1995) com uma estrutura especial contendo um centro ativo, chamado de apoenzima, e algumas vezes um grupo não proteico, chamado coenzima e/ou um cofator (AWADALLAK, 2012). Tal funcionalidade e importância atribuída às enzimas podem ser comprovadas através dos sistemas vivos, já que neles as transformações químicas que ocorrem são promovidas por centenas de milhares de enzimas que atuam catalisando a conversão de um conjunto de substratos em produtos específicos (RODRIGUES, 2011). A utilização de enzimas pelo homem remonta aos períodos mais antigos da civilização onde importantes atividades humanas em comunidades primitivas como a produção de certos tipos de alimentos e bebidas, e o curtimento de peles para produzir couro para o vestuário, envolviam a aplicação de atividades enzimáticas, mesmo que inconscientemente. Contudo, apenas a partir do século 19, a natureza das enzimas e a maneira como atuam começou a ser esclarecida. Durante o século 20, o reconhecimento das enzimas como proteínas juntamente com o design de técnicas para a sua purificação e análise, abriram caminho para o desenvolvimento de processos voltados à sua produção e utilização industrial (LOTTI; ALBERGHINA, 2007).
Até os anos 60, as vendas totais de enzimas eram de apenas uns poucos milhões de dólares anuais, mas o mercado tem crescido de forma considerável. Devido ao melhor entendimento da bioquímica de produção, dos processos fermentativos, e dos métodos de recuperação, tornou-se possível a produção de um crescente número de enzimas de forma acessível e sua introdução em produtos e processos industriais reais. Ainda, devido às diferentes transformações que as enzimas podem catalisar, o número de enzimas utilizadas comercialmente continua a se multiplicar, adaptadas às diferentes condições de processo, permitindo uma expansão do seu uso industrial (SHARMA, et al., 2001; KIRK, et al., 2002; SMANIOTTO, 2010).
A busca por tecnologias “limpas” e processos mais sofisticados vem estimulando o uso de enzimas em diversos setores industriais (MATOS, 2010). A alta qualidade dos produtos obtidos em função da alta especificidade das enzimas, formando menos subprodutos indesejáveis, e utilizando condições mais amenas de temperatura e pressão. Em relação ao uso dos catalisadores inorgânicos como ácidos, bases, óxidos e metais, que além que gerar subprodutos indesejáveis, ainda podem apresentar grande dificuldade de separação dos produtos após a reação e necessitam de elevados valores de temperatura e pressão (BON, et al., 1999). Apesar de todas as vantagens quanto ao aumento da velocidade de reação, formação de produtos com maior valor agregado,
uso de condições mais brandas de processos e serem catalisadores biológicos, o custo das enzimas ainda é muito elevado se comparado aos catalisadores químicos convencionais.
Hoje, a catálise enzimática desponta como um dos mais promissores campos dentro das novas tecnologias para síntese de compostos de alto valor agregado, visto que a natureza quiral das enzimas resulta na formação de produtos de maneira altamente estéreo e regiosseletiva, em condições neutras e aquosas, apresentando ainda possibilidade de desenvolvimento de elevado número de ciclos catalíticos (RODRIGUES, 2011). Além disso, os biocatalisadores permitem a biotransformação de compostos polifuncionalizados e sensíveis em condições amenas, ao contrário das variantes químicas correspondentes que exigem condições reacionais severas (GOLDBECK, 2008; OLIVEIRA; MANTOVANI, 2009). Cerca de 4000 enzimas são conhecidas, e destas cerca de 200 são usadas comercialmente, sendo que a maioria das enzimas é de origem microbiana (SHARMA et al., 2001).
2.4.1 Lipases como catalisadores
Uma das classes de enzimas que são mais utilizadas em síntese orgânica são as lipases, enzimas que atuam em reações de hidrólise/esterificação (JONES, 1986). As hidrolases, incluindo as lipases, consistem em uma das classes de enzimas mais utilizadas por não necessitarem de coenzimas, o que reduz o custo do processo (SCHNEIDER et al., 1984). As lipases, triacilglicerol éster hidrolases, E.C. 3.1.1.3, são enzimas que catalisam a hidrólise de gorduras e óleos liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. Estas enzimas são encontradas em tecidos animais, vegetais e em micro-organismos, tendo papel fundamental no metabolismo de lipídeos destes seres vivos: como enzimas digestivas, na deposição e mobilização dos tecidos de reservas energéticas e no metabolismo intracelular, atuando sobre as membranas celulares (VILLENEUVE et al., 2000).
As lipases de origem microbiana são as mais utilizadas, isto porque, na sua grande maioria, não são nocivas à saúde humana, sendo reconhecidas como Generally Regarded As Save (GRAS) (GUTARRA et al., 2005). Do ponto de vista industrial, os fungos são especialmente valorizados porque as enzimas por eles produzidas normalmente são extracelulares, o que facilita sua recuperação do meio de fermentação (VULFSON, 1994). As lipases podem catalisar reações de esterificação, interesterificação, alcoólise, acidólise, aminólise e também possuem
atividade hidrolítica sobre os triacilgliceróis. Novas aplicações biotecnológicas têm sido estabelecidas com sucesso utilizando lipases, como a síntese de biopolímeros, produção de biodiesel, produção de produtos farmacêuticos, agroquímicos, compostos enantiopuros, e modificação do flavor de muitos alimentos (HASAN et al., 2009). Na obtenção de fármacos ou insumos para a indústria farmacêutica em sua forma enantiomérica com elevada pureza ótica, o uso das lipases tem merecido destaque, devido à capacidade dessas enzimas de reconhecer moléculas quirais e atuar seletivamente em um dos isômeros de uma mistura racêmica (HASAN et al., 2006).
As lipases apresentam características muito particulares, tornando seu campo de aplicação na área biotecnológica muito mais amplo, alta especificidade ou seletividade em relação a um substrato (quimio), à posição (regio) e a isômeros (estéreo). A quimioespecificidade está relacionada com as diferentes valores de atividade enzimática apresentada por uma mesma lipase em relação a substratos variados. As lipases podem apresentar especificidade por tri, di e monoacilgliceróis e outros ésteres de ácido graxo formados pela mesma molécula de ácido carboxílico, também podem diferenciar moléculas de ácido graxo de diferentes tamanhos de cadeia, de diferentes níveis e posição de insaturação, entre outros (PINHEIRO,1992; LERIN, 2010). A regioespecificidade se refere às diferentes modo de ação apresentada pela mesma lipase sobre as distintas posições do ácido graxo no triacilglicerol (VILLENEUVE, 2003). Por outro lado, a estereoespecificidade está relacionada com as diferentes taxas de atividade enzimática apresentadas por uma mesma lipase sobre distintos isômeros de uma molécula (PINHEIRO, 1992).
Quanto às condições ótimas para a atividade e estabilidade das lipases, a maioria apresenta uma faixa ótima de atividade e estabilidade entre pH 6,0 e 8,0 e não requerem cofator (GHANEM; ABOUL-ENEIN, 2005), apresentando temperatura ótima para atividade máxima entre 30 e 60 ºC, embora sua termoestabilidade varie consideravelmente em função de sua origem (MACRAE; HAMMOND, 1985). Estas propriedades, entretanto, podem variar significativamente, dependendo da origem, ou mesmo entre isoformas produzidas por um mesmo micro-organismo (BATISTELLA, 2011). Estas variações também dependem do método e do substrato utilizado e das condições do ensaio, como pH e temperatura, tornando a comparação difícil (Freitas, 2006).
A lipase de C. antarctica contém duas frações, A e B (BOSLEY et al., 1997). A fração B desta lipase é bastante versátil, apresentando especificidade frente a inúmeros substratos, o que a torna flexível para
aplicações em diferentes setores industriais (FORDE; O´FAGAIN, 2008; FELTES, 2011). Esta lipase é usada na indústria de óleos e gorduras em reações de esterificação e rearranjo de ácidos graxos nos triacilgliceróis (NOVOZYMES, 2010b; FELTES, 2010). Na Figura 3 está apresentada a estrutura tridimensional da lipase de C. antarctica B. Figura 3 – Estrutura tridimensional da lipase de Candida antarctica fração B (PDB, 2011) .
A lipase comercial Novozym® 435 de C. antarctica B é produzida por fermentação submersa de um micro-organismo geneticamente modificado (Aspergillus oryzae) (NOVOZYMES, 2010a). Após sua produção, a enzima purificada é imobilizada na resina acrílica macroporosa Lewatit VP OC 1600, desenvolvida pela Bayer AG para a Novozymes (NOVOZYMES, 2010b; FELTES, 2011). Sua faixa de temperatura de atuação é entre 40 e 70 ºC (DAMSTRUP et al., 2006a).
2.4.2 Enzimas Imobilizadas
A imobilização de enzimas tem um importante papel dentro da biotecnologia aplicada, pois o principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à sua forma livre (MACRAE; HAMMOND, 1985). Através da imobilização da lipase é possível minimizar o problema de alto custo destas enzimas, uma vez
que assim, torna-se fácil a separação dos produtos e podem ser reutilizadas várias vezes ou ainda utilizadas em processos contínuos (H-KITTIKUN et al., 2000; KAEWTHONG et al., 2005). As propriedades das enzimas imobilizadas são determinadas tanto pelas características da enzima como pelas do suporte utilizado. A interação entre os dois irá resultar em um derivado enzimático com propriedades químicas, bioquímicas e mecânicas específicas (TISCHER; KASCHE, 1999). Como para outros processos físicos ou químicos, tanto a velocidade como o rendimento de imobilização estão determinados por vários parâmetros, incluindo: o tipo de suporte, o método de imobilização, a concentração de enzima e de grupos reativos no suporte, o pH, a temperatura e o tempo de reação (BUCHHOLZ, 1979).
Existem duas categorias básicas de métodos para imobilização de enzimas, através da adsorção ou ligação em um material insolúvel, pelo uso de um reagente multifuncional através de ligações cruzadas, confinamento em matrizes formadas por géis poliméricos ou encapsulação através de uma membrana polimérica (DALLA-VECCHIA et al., 2004). A imobilização por ligação em suportes pode ser realizada através da ligação da enzima ao suporte por adsorção, onde a enzima é imobilizada em um suporte sólido por ligações de baixa energia, tais como interações hidrofóbicas, ligações iônicas, etc; através de seus grupos funcionais, que não são essenciais para a atividade catalítica (D’SOUZA, 1999).
Os suportes utilizados para a imobilização das enzimas constituídos de material hidrofílico permitem a manutenção de um microambiente de alta atividade de água em torno das moléculas de enzima (ILLANES, 1994). A imobilização geralmente aumenta a estabilidade térmica e química da lipase, permitindo melhor controle do processo e da qualidade do produto (MALCATA et al., 1990). A seleção da técnica e suporte empregados depende da aplicação a que o biocatalisador se destina. Apesar de ser objeto de estudo de pesquisas científicas há bastante tempo, a imobilização de lipases ainda demanda investigações adicionais sobre os efeitos exercidos pelas diferentes técnicas de imobilização sobre a estrutura destas enzimas, e sobre o emprego de novos materiais como suportes (DALLA-VECCHIA et al., 2004).
2.5 ULTRASSOM
A tecnologia ultrassônica consiste na utilização de alta intensidade de energia acústica no processo de materiais e tornou-se
uma via favorável para o processamento de nanomateriais com funções biológicas (GUISEPPI-ELIEA et al., 2009). O ultrassom tem atraído cada vez mais atenção na área de Ciência e Tecnologia de Alimentos, podendo ser classificado de acordo com o nível de frequência em: ultrassom de alta frequência e ultrassom de baixa frequência. A alta frequência do ultrassom (1-10 MHz) causa permanente mudança física e química porque produz cavitação e microfluxos nos líquidos, aquecimento e ruptura nos sólidos e instabilidade na superfície da interface de sistemas líquido-líquido e líquido-gás. Por isso é geralmente utilizada como uma técnica analítica para garantia da qualidade, inspeção e controle de processos não destrutivos (BABICZ, 2009; MA et al., 2011).
Algumas áreas de aplicação das ondas sonoras de alta potência são: Biologia (homogeneização, rompimento de células), Engenharia (limpeza de metal, soldagem, refinamento de metal, perfuração), Geologia (localização do mineral, depósito de óleo), Industrial (filtração, degaseificação, cristalização, dispersão de sólidos, emulsificação, etc), Medicina (esterilização, fisioterapia, inalações), Física (cavitação, fenômeno de ondas acústicas, velocidade do som) e Polímeros (polimerização, despolimerização, degradação do peso molecular) (MARTINEZ et al., 2000).
A aplicação do ultrassom de baixa frequência (20-100 kHz) na indústria de alimentos é relativamente recente ( MA et al., 2011), já nos campos da ciência, engenharia e medicina para testes e diagnósticos técnicos é bastante empregada. Nestas áreas as ondas ultrassonoras são empregadas em exames de feto, inspeções de solda, medidas de espessuras. Também são usadas por morcegos, pássaros noturnos e animais marinhos, para sua localização através do eco (BABICZ, 2009). Em laboratório, tem sido utilizada para melhorar propriedades físicas de alimentos em diversas áreas, como preparação de nanoemulsão (KENTISH et al., 2008), extração assistida por ultrassom (MA et al., 2008) e melhoria das propriedades de formação de espuma (Jambrak et al., 2008).
O ultrassom foi descoberto em 1880 por Curie enquanto este estudava o efeito piezoelétrico e 14 anos depois Thornycroft e Barnaby observaram que, na propulsão de mísseis, uma fonte de vibração era gerada causando implosão de bolhas e cavidades na água, fenômeno que ficou conhecido como cavitação. Entretanto, foi somente em 1912 quando Langevin desenvolveu o SONAR (Sound Navigation and Ranging), um aparelho capaz de medir a profundidade do mar, que as ondas na frequência de ultrassom foram aplicadas comercialmente. Em
1927, os efeitos destas ondas foram observados em sistemas químicos e biológicos e, em 1950, os primeiros aparelhos geradores de ultrassom foram comercializados (MARTINEZ et al., 2000).
Existem dois aparelhos geradores de ondas ultrassonoras, o banho e sonda de ultrassom. A fonte de energia ultrassonora é uma cerâmica piezoelétrica disposta entre duas chapas metálicas, este sistema constitui o transdutor piezoelétrico. O gerador de frequência transmite um sinal à cerâmica piezoelétrica, que transforma ondas elétricas em ondas mecânicas; as chapas metálicas amplificam estes sinais; o transdutor transmite os impulsos ultrassonoros ao meio reacional (BARBOSA; SERRA, 1992; LERIN, 2010).
A ação do ultrassom em líquidos pode causar efeitos da cavitação. As ondas de ultrassom são geradas por periódicos movimentos mecânicos de uma sonda que transfere energia ultrassônica em um meio fluido e provoca alterações muito elevadas de pressão, levando à formação de pequenas bolhas que crescem rapidamente, se expandindo e implodindo violentamente, liberando calor e pressão muito elevados em curtos intervalos (MA et al., 2011; MASON, 1990). Quando bolhas de cavitação entram em colapso perto do limite das fase de dois líquidos imiscíveis, a onda de choque resultante pode proporcionar uma agitação muito eficiente ou mistura das camadas (LIU et al., 2008). A cavitação pode ser afetada por alguns fatores como: presença de gás dissolvido, frequência de irradiação, temperatura, viscosidade, tensão superficial, pressão externa e presença de partículas em solução (RASO et al., 1999).
Atualmente, a sonoquímica é uma oportunidade de desenvolver novas metodologias de sínteses limpas e rápidas. Devido a estes relatos e ao ultrassom apresentar alta eficiência, baixos requisitos instrumentais, redução significativa do tempo de processamento em comparação com outras técnicas convencionais e por, geralmente, possuir um desempenho economicamente viável, muitos autores consideram o ultrassom uma tecnologia "verde" (LERIN, 2010; MASON, 2007).
Recentemente, surgiu grande interesse na área da tecnologia de alimentos pela utilização de ultrassom para alterar a atividade enzimática, em reações catalíticas. Apesar dos efeitos do ultrassom sobre a atividade da enzima incluírem sua ativação e inativação, o ultrassom vem se mostrando uma ferramenta eficiente a ser utilizada, pois ele pode perturbar ligações fracas e induzir a mudanças conformacionais na estrutura das proteínas (GEBICKA, 1997; BASHARI, 2012).
2.5.1 Catálise enzimática em ultrassom
O processo enzimático utilizando a irradiação com ultrassom é um método alternativo para reduzir as limitações de transferência de massa em reações enzimáticas (VULFSON et al., 1991; YACHMENEV et al., 2004). Isto porque as lipases têm sido empregadas com sucesso como biocatalisadores em meios com solventes (KLIBANOV, 2001; PERSSON et al., 2002; WU et al., 2001). Porém, a utilização de solventes ou co-solventes traz algumas desvantagens, como: elevado valor do solvente, toxicidade, são inflamáveis e implica altos custos de investimento para atender a requisitos de segurança (LIU et al., 2008). Um sistema isento de solvente, que é uma simples mistura de reagentes, pode oferecer mais segurança, o aumento das concentrações de reagentes, reduzir os riscos ambientais e permite a recuperação de produtos, sem complexos passos de purificação (DOSSAT et al., 2002; CHATTERJEE, 1998; GHAMGUI et al., 2004).
A utilização de um sistema livre de solventes induz em uma maior viscosidade e imiscibilidade de substratos, se comparados com um sistema com solvente (DOSSAT et al., 2002), e portanto em algumas reações enzimáticas sem solvente a velocidade da reação pode ser controlada pela limitações de transferência de massa (ROMERO et al., 2007). A ação do ultrassom nos líquidos pode provocar efeitos de cavitação, ou seja, colapso de bolhas perto da fronteira de duas fases imiscíveis, diminuindo as limitações à transferência de massa dos reagentes. Devido aos efeitos da cavitação, o ultrassom pode melhorar reações heterogêneas (catalisador sólido com substrato líquido) e também formas transitórias de espécies reativas, podendo tornar-se uma útil ferramenta em reações enzimáticas (YACHMENEV et al., 2004, YOSHIMOTO et al., 2005).
Os poucos estudos disponíveis na literatura sobre os efeitos de ultrassom em reações enzimáticas podem ser categorizados em dois grupos principais: a primeira abordagem faz uso de ultrassom como pré-tratamento enzimático para reduzir o tamanho de partícula (TIAN et al., 2004). Em tais casos, redução da dimensão das partículas e consequente aumento da área de superfície catalítica são úteis para reduzir as limitações de transferência de massa. A segunda abordagem envolve a utilização do ultrassom ao longo da reação. Neste caso, a energia de cavitação é utilizada para acelerar a velocidade de reação, mas o mecanismo pelo qual isto ocorre ainda não está bem estabelecido na literatura (BASHARI et al., 2012).
Em estudo realizado por Yachmenev et al. (2008) utilizando a ação combinada de bioprocessamento com enzima e a utilização de ultrassom, concluiu-se que: (a) os efeitos da cavitação agem melhorando o transporte de macromoléculas de enzima até a superfície do substrato, (b) impactos mecânicos, produzidos pelo colapso de bolhas de cavitação, proporcionar um benefício importante da "abertura" da superfície de substratos sólidos para a ação de enzimas, (c) o efeito de cavitação é muito maior em sistemas heterogêneos do que nos homogêneos, e (d) em água, os efeitos máximos da cavitação ocorrem em cerca de 50 °C, que é a temperatura ótima para muitas enzimas.
Alguns trabalhos da literatura sobre o efeito do ultrassom na aceleração de reações enzimáticas incluem o de Jian et al. (2008) que relatou que o ultrassom pode acelerar a hidrólise enzimática de resíduo sólido de couro e o de Lee et al. (2008), que também observou o aumento da atividade enzimática quando trabalhou com lipase para a síntese de ésteres utilizando exposições curtas ao ultrassom. No que diz respeito aos efeitos da irradiação de ultrassom sobre a estrutura de enzimas, alguns trabalhos encontrados na literatura, como Bashari et al. (2012), quando investigaram os efeitos da irradiação de ultrassom sobre a atividade de hidrólise por dextranase, observaram que a atividade máxima da enzima foi verificada quando as amostras foram tratadas com ultrassom de baixa intensidade. A irradiação com ultrassom aumentou o número de triptofano na superfície da dextranase e também -hélice em 15,74% e reduziu “randon coil” em 5,41%, quando comparada à proteína dextranase tratada com ultrassom com a controle, sem tratamento. O aumento de triptofano na superfície da enzima indica que o tratamento com ultrassom pode induzir ao desdobramento molecular e desnaturação das proteínas, destruindo interações hidrófobicas das moléculas de proteína, causando o movimento de grupos hidrofóbicos, tais como grupos de triptofano, do interior da molécula para o exterior dela (JAMBRAK et al., 2008; GULSEREN et al., 2007). Já as modificações nas estruturas, como aumento da fração de -hélice pode ser explicado pela liberação da pressão de superfície da enzima (DAI et al., 1999), induzindo transformações estruturais, que podem afetar o sítio ativo da enzima. Estas mudanças poporcionam à enzima maior regularidade e flexibilidade, o que faz com que os substratos tenham mais acesso ao sítio ativo da enzima. Essas leves mudanças conformacionas na enzima são úteis para a melhoria da sua atividade (BASHARI et al., 2012). No entanto, essas são apenas hipóteses, pois os estudos nesta área ainda são muito recentes.
